WO2016083003A1 - Dispositif pour objectif de microscope, et procede d'utilisation d'un tel dispositif - Google Patents

Dispositif pour objectif de microscope, et procede d'utilisation d'un tel dispositif Download PDF

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WO2016083003A1
WO2016083003A1 PCT/EP2015/073165 EP2015073165W WO2016083003A1 WO 2016083003 A1 WO2016083003 A1 WO 2016083003A1 EP 2015073165 W EP2015073165 W EP 2015073165W WO 2016083003 A1 WO2016083003 A1 WO 2016083003A1
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WO
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sample
blade
objective
intermediate space
reservoir
Prior art date
Application number
PCT/EP2015/073165
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English (en)
Inventor
Ali TFAYLI
Alessia QUATELA
Arlette BAILLET-GUFFROY
Original Assignee
Universite Paris-Sud
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    • G—PHYSICS
    • G02—OPTICS
    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B21/00—Microscopes
    • G02B21/33—Immersion oils, or microscope systems or objectives for use with immersion fluids
    • G—PHYSICS
    • G02—OPTICS
    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B21/00—Microscopes
    • G02B21/34—Microscope slides, e.g. mounting specimens on microscope slides

Definitions

  • the present invention relates to a microscope objective device, and a method of using such a device.
  • Such a device enables a user to acquire from a sample or to transmit to a sample an optical signal, in particular with less artifact for determining the position of the focal plane of the objective in the sample and / or a better resolution and / or minimization of signal loss.
  • the field of the invention is more particularly, but in a nonlimiting manner, that of Raman microscopy, in particular for the measurement of the thickness of a sample and / or the depth of a focusing plane.
  • the purpose of the present invention is to provide a device for overcoming these same problems while allowing a better adaptability of the device according to different possible natures of the sample.
  • Another object of the present invention is to provide a method of using such a device.
  • a reservoir arranged to contain liquid and provided with two opposite ends aligned along an alignment direction, of which:
  • a spacing device situated on the opposite side of the blade with respect to the reservoir, and arranged, when the spacing device is placed against a flat surface of a sample, to create an intermediate space between the blade and the blade; sample.
  • the device according to the invention can be devoid of means for creating a vacuum in the intermediate space.
  • the blade is preferably rigid, that is to say with a Young's modulus greater than 3 GPa (preferably greater than 6 GPa, preferably 70 GPa), preferably between 3 GPa and 200 GPa ( preferably between 6 GPa and 200 GPa, preferably between 70 GPa and 200 GPa).
  • the spacing device is a first measuring the spacing device
  • this spacing device can include means for adjusting a height, along the alignment direction, of this spacing device, and / or
  • the blade may be a first spacing device and be interchangeable, and the device according to the invention may furthermore be accompanied by at least one other spacing device of height different from that of the first spacing device.
  • the blade preferably has a thickness greater than or equal to 100 micrometers, preferably 130 micrometers.
  • the blade may have a thickness less than or equal to 500 micrometers.
  • the reservoir is filled with immersion liquid and a distal end of a microscope objective is inserted into the reservoir through the open end of the reservoir, so that the distal end of the objective and the blade are connected by the liquid,
  • the spacing device is placed against a surface of a sample or around the sample so as to create an intermediate space between the blade and the sample,
  • an optical signal is transported through the objective, this optical signal transport comprising an acquisition of the signal from the sample via the objective or a routing of the optical signal to the sample via the objective, preferably with a distance (not zero) between the blade and the sample.
  • the method according to the invention comprises no depressurization in the intermediate space between the creation of the intermediate space and the transport of the signal.
  • the method according to the invention does not include any deformation of the blade between the creation of the intermediate space and the transport of the signal.
  • the method according to the invention may comprise an adjustment of a height, along the alignment direction, of the spacing device, and / or
  • the spacing device may be a first spacing device
  • the method according to the invention may comprise a interchanging (or replacing) the first spacing device with another spacing device of different height from that of the first spacing device. This interchange or replacement step is typically implemented before the step of transporting the optical signal through the lens.
  • the difference in the refractive index of the liquid, with respect to the refractive index of the portion of the sample in which the focal plane of the objective at the moment of signal transport is located, is preferably less than twenty percent.
  • the difference in the refractive index of the blade, with respect to the refractive index of the part of the sample in which the focal plane of the objective at the moment of signal transport is located, is preferably lower than at twenty percent.
  • the refractive index of the liquid is preferably between 1.3 and 1.7.
  • the distance between the slide and the sample is:
  • the method according to the invention may comprise a measurement of a thickness of the sample from the acquisition of the signal.
  • FIG. 1 illustrates an objective 80 and a sample 11 according to the prior art
  • FIG. 2 illustrates a use of the assembly
  • FIG. 3 illustrates Raman data acquired according to the use of the objective 80 of FIGS. 1 and 2,
  • FIG. 4 is a profile sectional view of a first device embodiment 1 according to the invention in use on a sample 11
  • FIG. 5 is a profile sectional view of a first variant of the device according to the invention of FIG. 4,
  • FIG. 6 is a sectional sectional view of a second variant of the device according to the invention of FIG. 4 (this second variant being combinable with the first variant of FIG. 5),
  • FIG. 7 illustrates a movement of the objective 8 of the device 1 according to the invention of FIGS. 4 to 6,
  • FIGS. 8 and 9 illustrate Raman data obtained with the device 1 according to the invention of FIGS. 4 to 6 for a thickness measurement of the sample 11,
  • FIG. 10 illustrates Raman data obtained with the device 1 according to the invention of FIGS. 4 to 6 for a determination of the resolution at the upper surface of the sample 11, and
  • FIG. 11 illustrates Raman data obtained with the device 1 according to the invention of FIGS. 4 to 6 for a determination of depth resolution
  • FIG. 12 is a table which gives different values of a correction factor F between the actual displacement of the focusing plane of the objective 8 and the nominal displacement d of the focusing plane of the objective 8.
  • variants of the invention comprising only a selection of characteristics described or illustrated subsequently isolated from the other characteristics described or illustrated (even if this selection is isolated within a sentence including these other characteristics), if this selection of features is sufficient to confer a technical advantage or to differentiate the invention from the state of the prior art.
  • This selection comprises at least one preferably functional characteristic without structural details, and / or with only a part of the structural details if this part alone is sufficient to confer a technical advantage or to differentiate the invention from the state of the art. earlier.
  • Figure 1 shows the state of the art.
  • Figures 1 and 2 illustrate an objective 80 and a sample 11 (of refractive index n s ) separated by air index n a .
  • Sample 11 is a polymer layer of TOPAS 8007® with a thickness of 165 ⁇ m measured with a MITUTOYO micrometer (model 15610110).
  • the 80 lens is Olympus' 0.9 numerical aperture and MPLFLN 100X reference lens.
  • d is different from d.
  • d is not an affine function of d, and it is not easy to determine d depending on d.
  • FIG. 3 illustrates the confocal Raman profile collected with this objective 80 on the sample 11 by moving the objective 80 along the Z axis.
  • the abscissa axis of the graph of FIG. 3 is the nominal position.
  • a first embodiment of device or tip or cap 1 according to the invention and a method according to the invention for using this device or tip or cap 1 will now be described with reference to FIGS. 4 to 12.
  • the device 1 goes against the technical teaching of the article by Tomba et al. titled “Avoiding Coupling Fluid-Sample Interaction in Confocal Raman Depth Profiling with Immersion Objectives ", and overcomes the technical prejudices of this article that it is absolutely necessary to eliminate all air between the microscope objective and the sample and it is necessary to insert between the objective and the sample only media with a refraction very close to that of the sample (typically a coupling oil of index 1.50 and a PE film of index 1.51 for a PP sample with index 1.49).
  • a coupling oil of index 1.50 and a PE film of index 1.51 for a PP sample with index 1.49 typically a coupling oil of index 1.50 and a PE film of index 1.51 for a PP sample with index 1.49.
  • the device 1 according to the invention for a microscope objective comprises a blade 2.
  • the blade 2 is flat.
  • the blade 2 is a double-sided blade parallel. Thus, it limits the optical effects of this blade.
  • the device 1 comprises a reservoir 3 arranged to contain liquid 4, that is to say to retain the liquid 4 without the liquid 4 spilling out of the tank 3.
  • the reservoir 3 is provided with two opposite ends aligned along an alignment direction 5, of which:
  • the device 1 comprises a spacing device 10, located on the side of the blade 2 opposite to the reservoir 3, and arranged for, when the spacer device 10 is placed against a flat surface of a sample 11, to create a intermediate space 12 between the blade 2 and the sample 11.
  • the device 1 is devoid of means for creating a vacuum in the intermediate space 12. Vacuum means any pressure inside the space 12 less than 0.8 atmosphere.
  • the device 1 is devoid of means arranged to suck a gas from the intermediate space 12 or at least devoid of means arranged to suck a gas from the intermediate space 12 without replacing it with another gas.
  • the device 1 is devoid of means for deforming the blade 2.
  • the spacing device 10 has a height greater than or equal to 10 microns, preferably less than or equal to 1 millimeter. According to the variant envisaged, the spacing device 10 may be provided with:
  • the device 1 may comprise means for replacing the contents of the intermediate space 12 (for example replacing an initial air content with a neutral gas or any other gas or gas mixture with which it is desired to put in contact sample 11).
  • the blade 2 is rigid. Thus, it maintains the volume of the intermediate space 12.
  • E 3 GPa
  • the Young's modulus of Schott® conventional glass for microscope slides is 72.9 GPa.
  • the blade 2 has a Knoop H K100 hardness greater than or equal to 590.
  • the blade 2 is made of glass or polymer.
  • the spacing device 10 is interchangeable.
  • the spacing device 10 is a first interchangeable spacing device 101.
  • Device 1 is accompanied (for example in the form of a "kit", typically in its form marketed) of at least one other spacing device 102 (preferably several other spacers) of height (defined, like all the other heights of this description, parallel to the alignment direction 5 or to the optical axis of the objective 8 which is parallel to this direction 5) different from that of the first spacing device 101.
  • the interchangeable spacing device 101 of Figure 4 can thus be replaced by the spacing device 102 (plus top) as shown in Figure 5, and vice versa. This allows a better adaptability to the sample 11 according to:
  • the reference 11 would be a support (like a microscope slide) and the reference 18 the sample placed on this support).
  • Each spacing device 10 among the different interchangeable spacers 101, 102, etc. may for example be a ring or washer made of polymer and / or anodized metal and / or glass.
  • each spacing device 10 among the different interchangeable spacers 101, 102, etc. is arranged to be preferably held by a mechanical force (wedged, clipped, or clamped) or magnetic (magnetization) on the reservoir 3 or, less preferably, simply placed or brought into contact with the reservoir 3.
  • the spacing device 10 comprises means 13 for adjusting (without interchanging this device 10) a height 14, along the alignment direction 5, of this spacing device 10
  • These adjustment means 13 are arranged to allow different (preferably at least 5) non-zero and time-stable values of the height 14 of the spacing device 10. This allows a better adaptability to the sample 11 as a function of:
  • the heights of the reliefs 18 of the sample 11, or the height of the sample for example in a variant where in FIGS. 4 to 6 the reference 11 would be a support (like a microscope slide) and the reference 18 the sample placed on this support).
  • the spacing device 10 may for example be a pair of rings or washers 21, 22 provided with means for spacing these two rings or washers 21, 22 relative to each other.
  • These adjustment means 13 or spacing may for example include:
  • At least one (preferably several) guide rods 20 free to slide through the upper ring or washer (e) 21 and which is fixed to the lower ring or washer (e) 22.
  • the rings or washers 21, 22 are moved apart or brought closer together, while the translational movement, parallel to the direction 5, of the ring or upper washer (e) 21 with respect to the lower ring or washer (e) 22 is guided by the at least one guide rod 20.
  • the tank 3 is filled with immersion liquid 4,
  • a distal end 7 (ie the end intended to be oriented towards a sample 11 for its observation) is inserted from the microscope objective 8 into the reservoir 3 by the open end 6 of the reservoir 3, so that the distal end 7 of the objective 8 and the blade 2 are connected (preferably only) by the liquid 4, the spacing device 10 is placed against a surface of the sample 11 (or around the sample, for example in a variant where in FIGS. 4 to 6 reference 11 would be a support (such as a microscope slide) and the reference 18 the sample placed on this support) so as to create the intermediate space 12 between the blade 2 and the sample 11.
  • the intermediate space 12 is a gas space, preferably air. Then, at least one optical signal is carried through the objective 8, this transport of at least one optical signal comprising:
  • an acquisition of an optical signal coming from the sample 11 via the objective 8 for example a fluorescence signal of the sample, a Raman signal of the sample, a signal of observation of the sample in white light, etc.
  • a storage typically in a computer or electronic memory
  • data relating to this signal and / or a display of these data (typically on a screen, or on a digital display or on a display). analog dial with needle, etc.); and or
  • the part of the sample 11 on which this optical signal is projected or from which this optical signal originates is not in contact with the blade 2 and even not in contact with any part of the device 1.
  • the blade 2 is transparent, that is to say that it passes at least 50% (preferably at least 90%) of the light intensity of the optical signal.
  • This embodiment of the method according to the invention does not include any depressurization (in particular no gas suction or no suction gas without replacing it with another gas) in the intermediate space 12 between the spacing device placement step 10 (i.e. the moment of creation of the intermediate space 12) and the transport of the optical signal.
  • depressurization is preferably meant any step of decreasing the pressure within the space 12 to a value less than 0.8 atmosphere.
  • the sample for example biological sample, skin or other
  • the sample for example biological sample, skin or other
  • the device according to the invention avoids an interaction of the observed part of the sample 11 with an external element such as an immersion liquid, or the blade 2, which is important for example in the case of diffusion of light through the skin. This avoids creating "unnatural" interactions with the sample 11 and thus generating measurement artifacts, which is important for example for the study of the absorption of drugs or cosmetics on a skin sample 11 .
  • This method embodiment of the invention does not include any deformation of the blade 2 between the creation of the intermediate space 12 and the transport of the optical signal.
  • different spacers 101, 102 can be interchanged as explained above.
  • This Interchange or replacement step is typically performed before the step of transporting the optical signal through the lens.
  • the method according to the invention comprises a height adjustment 14, along the alignment direction 5, of the spacing device 10, this adjustment step being performed via the adjustment means 13 as explained previously.
  • the refractive index is used in the present description to speak of the refractive index.
  • the difference of the refractive index n m of the liquid 4 (at ⁇ ,), with respect to the refractive index n s (at ⁇ ,) of the portion of the sample 11 in which the focal plane (position of the focal plane at ⁇ ,) of the objective 8 is located at the time of signal transport, is less than twenty percent:
  • the difference in the refractive index n g (at ⁇ ,) of the plate 2, with respect to the refractive index n s (at ⁇ ,) of the part of the sample 11 in which the plane is located focal point (position of the focal plane at ⁇ ,) of the objective 8 at the time of transport of the optical signal, is less than twenty percent:
  • the refractive index of the liquid 4 is between 1.3 and 1.7.
  • the distance 15 (ie, over the entire plane of the blade 2 oriented on the sample side, the length of the shortest segment connecting the blade 2 to the reliefs 18 of the sample 11) between the blade 2 and the sample 11 is greater than or equal to 10 micrometers.
  • the distance 15 between the blade 2 and the sample 11 is less than or equal to 1 millimeter.
  • the intermediate space is a blade (of gas, or preferably of air) with parallel faces, which is true if:
  • the blade 2 is a parallel-faced blade, or at least the blade 2 has an outer face facing the sample 11 (that is to say the face of the blade 2 opposite to the reservoir 3) which is plane and perpendicular to the optical axis (direction 5) of the objective 8, and
  • n s ⁇ n m ( ⁇ n g ) preferably preferably preferably preferably preferably preferably preferably preferably preferably preferably preferably preferably preferably preferably preferably preferably preferably preferably preferably preferably preferably preferably preferably preferably preferably preferably preferably preferably preferably preferably preferably preferably preferably preferably preferably preferably preferably preferably preferably preferably preferably preferably preferably preferably preferably preferably preferably
  • the intermediate space is a blade (of gas, or preferably of air) with parallel faces, which is true if:
  • o the blade 2 is a parallel-faced blade, or at least the blade 2 has an outer face facing the sample 11 (that is to say the face of the blade 2 opposite to the reservoir 3) which is plane and perpendicular to the optical axis of the objective 8 (and therefore to the direction 5), and o the reliefs 18 are small (typically a few micrometers, their heights being deliberately very exaggerated in Figures 4 to 6 to discern them ) relative to the distance between the blade 2 and the sample 11 (typically a few tenths of a millimeter), then d but there is a proportionality between d and d '.
  • d is an affine function of d, and it is easy to determine d depending on d.
  • This embodiment of the method according to the invention preferably comprises a measurement of a thickness 17 of the sample 11 from the acquisition of the optical signal which is preferably a Raman signal.
  • the blade 2 is made of Schott® glass, with a thickness of 130 ⁇ m, and a refractive index of 1.51.
  • the side walls of the tank 3 are of cylindrical shape, with an internal diameter of 25 millimeters.
  • the side walls of the tank 3 are made of plastic, typically PVC.
  • the spacing means 10 are a teflon or plastic ring such as PVC or glass and of a height equal to 130 pm
  • the immersion liquid 4 comprises a mixture of 100 to 0% of 2,2'-thiodiethanol (TDE, ACROS Organics 420861000) with 0 to 100% of solutions (for example water), so as to adapt the refractive index of the liquid 4 between 1.33 and 1.6 preferably as close as possible to the refractive index of the sample.
  • TDE 2,2'-thiodiethanol
  • solutions for example water
  • the refractive index of the TDE is 1.5206 ⁇ 0.0005 measured with an Abbe refractometer (Zeiss 144865).
  • the refractive index of water is 1.33.
  • Lens 8 is a Olympus LUMPLFLN60XW water immersion lens with a numerical aperture of 1.00.
  • Sample 11 is a TOPAS 8007® polymer layer (refractive index 1.53) with a thickness of 165 ⁇ m measured with a MITUTOYO micrometer (model 15610110) with an accuracy of ⁇ 1 ⁇ m, with a refractive index close to Stratum Corneum.
  • the intermediate space 12 is filled with air at atmospheric pressure.
  • the Raman data of FIGS. 8 and 9 are acquired with a Labram HR Evolution microspectrometer (Horiba Jobin-Yvon) equipped with a 632.8 nm excitation He-Ne laser with a diffraction grating at 600 lines per millimeter.
  • An Olympus microscope (on which the objective 8 is mounted) is optically connected to the spectrometer, and is equipped with a filtering hole (for system confocality) adjusted to 500 ⁇ m.
  • the objective 8 is mounted on a high precision displacement stage allowing steps of 100 nanometers parallel to the direction 5.
  • the Raman data of FIGS. 8 and 9 are obtained by moving the position of the focusing plane of the objective 8 through the sample 11 at different heights along the direction 5 and recording a spectrum at each position of this plane of view. focusing. Each spectrum is measured between 500 cm -1 and 1500 cm -1 , with an acquisition time of 5 seconds and 10 accumulations. Each spectrum is smoothed using a five-point floating average smoothing and a baseline correction by an automatic polynomial function.
  • the width at half height (FWHM) of the curve obtained by following the variation of the integrated intensity of the band at 930 cm “ -1 of TOPAS 8007® (used because it does not correspond to any vibration band of the TDE) was determined as a function of the nominal position ⁇ of the focal plane of the objective 8 in the sample using a Matlab script, the graphs of Figures 8 and 9 are obtained.
  • the curve 23 illustrates the data obtained with immersion liquid 4 is only water
  • curve 24 illustrates the data obtained with immersion liquid 4 consisting solely of TDE.
  • the symbol ⁇ refers to the nominal depth of the focusing plane of the objective 8 as controlled by the Labspec 6.0 software, and which may be different from the actual depth Z of the focusing plane of the lens. objective 8 in sample 11.
  • FIGS. 8 and 9 By comparison of FIGS. 8 and 9 with FIG. 3 (the graph of FIG. 3 having been acquired with the same conditions as the graphs of FIGS. 8 and 9 but without the device according to the invention as illustrated in FIG. 1), one notices according to the invention, it is possible to avoid or limit the positioning accuracy problems of the focal plane of the objective 8 (the thickness of the sample determined at 166 ⁇ m in the case of the curve 23 of FIG. of intensity of measurement (the evolution of the intensity of the signal Raman 23 or 24 presents an intermediate plateau with a gain and a signal loss (at the input and the output of the sample 11) that is almost symmetrical with respect to a central axis 25 or 26 respectively.
  • the focal plane of the objective 8 the thickness of the sample determined at 166 ⁇ m in the case of the curve 23 of FIG. of intensity of measurement
  • the evolution of the intensity of the signal Raman 23 or 24 presents an intermediate plateau with a gain and a signal loss (at the input and the output of the sample 11) that is almost symmetrical with
  • FIGS. 10 and 11 were acquired on the same principle as the data of FIGS. 8 and 9, but by measuring the intensity of the 521 cm -1 band typical of silicon (instead of 930 cm -1 ) for different nominal depths ⁇ of the objective 8.
  • Sample 11 of TOPAS 8007® is deposited on a silicon wafer. Measurements are made with the focal plane of objective 8:

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Abstract

La présente invention concerne un dispositif (1) pour objectif de microscope, comprenant : - une lame (2), - un réservoir (3) agencé pour contenir du liquide (4) et muni de deux extrémités opposées alignées le long d'une direction d'alignement (5), dont : o une extrémité ouverte (6), prévue pour l'insertion d'une extrémité distale (7) d'un objectif (8) de microscope, et o une extrémité fermée (9) par la lame (2), un dispositif d'espacement (10), situé du côté opposé de la lame (2) par rapport au réservoir (3), et agencé pour, lorsque le dispositif d'espacement (10) est placé contre une surface plane d'un échantillon (11), créer un espace intermédiaire (12) entre la lame (2) et l'échantillon (11).

Description

«Dispositif pour objectif de microscope, et procédé d'utilisation d'un tel dispositif» Domaine technique
La présente invention concerne un dispositif pour objectif de microscope, et un procédé d'utilisation d'un tel dispositif.
Un tel dispositif permet à un utilisateur d'acquérir à partir d'un échantillon ou de transmettre à un échantillon un signal optique notamment avec moins d'artefact de détermination de position du plan focal de l'objectif dans l'échantillon et/ou une meilleure résolution et/ou une minimisation de perte de signal. Le domaine de l'invention est plus particulièrement, mais de manière non limitative, celui de la microscopie Raman, notamment pour la mesure d'épaisseur d'un échantillon et/ou de la profondeur d'un plan de focalisation.
Etat de la technique antérieure
On connaît l'article de Tomba et al . intitulé « Avoiding Coupling Fluid- Sample Interaction in Confocal Raman Depth Profiling with Immersion Objectives » et paru en 2008 dans le volume 62, n°7, de la revue Applied Spectroscopy.
Cet article décrit un dispositif ayant pour objectif et pour résultat :
- d'éliminer toute interface d'air ou de gaz (de faible indice de réfraction, autour de 1) entre un objectif de microscope et un échantillon (d'indice de réfraction environ égal à 1,5), et
- de n'intercaler entre l'objectif et l'échantillon exclusivement des milieux ayant un indice de réfraction très proche de celui de l'échantillon (typiquement une huile de couplage d'indice 1,50 et un film en polyéthylène (PE) d'indice 1,51 pour un échantillon en polypropylène (PP) d'indice 1,49), ceci afin de profiter au maximum de la bonne ouverture numérique de l'objectif de microscope et d'éviter des problèmes de résolution, de détermination de profondeur du plan de focalisation de l'objectif, et de réduction de l'intensité Raman avec l'augmentation de la profondeur de focalisation de l'objectif. Le but de la présente invention est de proposer un dispositif permettant de s'affranchir de ces mêmes problèmes tout en permettant une meilleure adaptabilité du dispositif en fonction de différentes natures possibles de l'échantillon.
Un autre but de la présente invention est de proposer un procédé d'utilisation d'un tel dispositif.
Exposé de l'invention
Cet objectif est atteint avec un dispositif pour objectif de microscope, comprenant :
- une lame,
- un réservoir agencé pour contenir du liquide et muni de deux extrémités opposées alignées le long d'une direction d'alignement, dont :
o une extrémité ouverte, prévue pour l'insertion d'une extrémité distale d'un objectif de microscope, et
o une extrémité fermée par la lame,
- un dispositif d'espacement, situé du côté opposé de la lame par rapport au réservoir, et agencé pour, lorsque le dispositif d'espacement est placé contre une surface plane d'un échantillon, créer un espace intermédiaire entre la lame et l'échantillon.
Le dispositif selon l'invention peut être dénué de moyens pour créer une dépression dans l'espace intermédiaire.
La lame est de préférence rigide, c'est-à-dire avec un module d'Young supérieur à 3 GPa (de préférence supérieur à 6 GPa, de manière préférentielle à 70 GPa), de préférence compris entre 3 GPa et 200 GPa (de préférence entre 6 GPa et 200 GPa, de préférence entre 70 GPa et 200 GPa).
Le dispositif d'espacement :
- peut comprendre des moyens pour régler une hauteur, le long de la direction d'alignement, de ce dispositif d'espacement, et/ou
- peut être un premier dispositif d'espacement et être interchangeable, et le dispositif selon l'invention peut en outre être accompagné d'au moins un autre dispositif d'espacement de hauteur différente de celle du premier dispositif d'espacement. La lame a de préférence une épaisseur supérieure ou égale à 100 micromètres, de préférence à 130 micromètres.
La lame peut avoir une épaisseur inférieure ou égale à 500 micromètres.
Suivant encore un autre aspect de l'invention, il est proposé un procédé d'utilisation d'un dispositif selon l'invention, caractérisé en ce que :
- on remplit le réservoir avec du liquide à immersion et on insère une extrémité distale d'un objectif de microscope dans le réservoir par l'extrémité ouverte du réservoir, de sorte que l'extrémité distale de l'objectif et la lame soient reliées par le liquide,
- on place le dispositif d'espacement contre une surface d'un échantillon ou autour de l'échantillon de manière à créer un espace intermédiaire entre la lame et l'échantillon,
- on transporte un signal optique à travers l'objectif, ce transport de signal optique comprenant une acquisition du signal en provenance de l'échantillon via l'objectif ou un acheminement du signal optique jusqu'à l'échantillon via l'objectif, de préférence avec une distance (non nulle) entre la lame et l'échantillon.
De préférence, le procédé selon l'invention ne comprend aucune dépressurisation dans l'espace intermédiaire entre la création de l'espace intermédiaire et le transport du signal .
De préférence, le procédé selon l'invention ne comprend aucune déformation de la lame entre la création de l'espace intermédiaire et le transport du signal.
De préférence :
- le procédé selon l'invention peut comprendre un réglage d'une hauteur, le long de la direction d'alignement, du dispositif d'espacement, et/ou
- le dispositif d'espacement peut être un premier dispositif d'espacement, et le procédé selon l'invention peut comprendre un interchangement (ou remplacement) du premier dispositif d'espacement avec un autre dispositif d'espacement de hauteur différente de celle du premier dispositif d'espacement. Cette étape d'interchangement ou de remplacement est typiquement mis en œuvre avant l'étape de transport du signal optique à travers l'objectif.
L'écart de l'indice de réfraction du liquide, par rapport à l'indice de réfraction de la partie de l'échantillon dans lequel se trouve le plan focal de l'objectif au moment du transport du signal, est de préférence inférieur à vingt pour cent.
L'écart de l'indice de réfraction de la lame, par rapport à l'indice de réfraction de la partie de l'échantillon dans lequel se trouve le plan focal de l'objectif au moment du transport du signal, est de préférence inférieur à vingt pour cent.
L'indice de réfraction du liquide est de préférence compris entre 1,3 et 1,7.
La distance entre la lame et l'échantillon est :
- de préférence supérieure ou égale à 10 micromètres, et/ou
- de préférence inférieure ou égale à 1 millimètre.
le procédé selon l'invention peut comprendre une mesure d'une épaisseur de l'échantillon à partir de l'acquisition du signal .
Description des figures et modes de réalisation
D'autres avantages et particularités de l'invention apparaîtront à la lecture de la description détaillée de mises en œuvre et de modes de réalisation nullement limitatifs, et des dessins annexés suivants :
- la figure 1 illustre un objectif 80 et un échantillon 11 selon l'art antérieur,
- la figure 2 illustre une utilisation du montage la figure 1,
- la figure 3 illustre des données Raman acquises selon l'utilisation de l'objectif 80 des figures 1 et 2,
- la figure 4 est une vue de coupe de profil d'un premier mode de réalisation de dispositif 1 selon l'invention en cours d'utilisation sur un échantillon 11, - la figure 5 est une vue de coupe de profil d'une première variante de dispositif selon l'invention de la figure 4,
- la figure 6 est une vue de coupe de profil d'une deuxième variante de dispositif selon l'invention de la figure 4 (cette deuxième variante étant combinable avec la première variante de la figure 5),
- la figure 7 illustre un mouvement de l'objectif 8 de dispositif 1 selon l'invention des figures 4 à 6,
- les figures 8 et 9 illustrent des données Raman obtenues avec le dispositif 1 selon l'invention des figures 4 à 6 pour une mesure d'épaisseur de l'échantillon 11,
- la figure 10 illustre des données Raman obtenues avec le dispositif 1 selon l'invention des figures 4 à 6 pour une détermination de la résolution à la surface supérieure de l'échantillon 11, et
- la figure 11 illustre des données Raman obtenues avec le dispositif 1 selon l'invention des figures 4 à 6 pour une détermination de résolution en profondeur, et
- la figure 12 est un tableau qui donne différentes valeurs d'un facteur de correction F entre le déplacement réel d' du plan de focalisation de l'objectif 8 et le déplacement nominal d du plan de focalisation de l'objectif 8.
Ces modes de réalisation étant nullement limitatifs, on pourra notamment considérer des variantes de l'invention ne comprenant qu'une sélection de caractéristiques décrites ou illustrées par la suite isolées des autres caractéristiques décrites ou illustrées (même si cette sélection est isolée au sein d'une phrase comprenant ces autres caractéristiques), si cette sélection de caractéristiques est suffisante pour conférer un avantage technique ou pour différencier l'invention par rapport à l'état de la technique antérieure. Cette sélection comprend au moins une caractéristique de préférence fonctionnelle sans détails structurels, et/ou avec seulement une partie des détails structurels si cette partie uniquement est suffisante pour conférer un avantage technique ou à différencier l'invention par rapport à l'état de la technique antérieure. La figure 1 représente l'état de l'art.
Les figures 1 et 2 illustrent un objectif 80 et un échantillon 11 (d'indice de réfraction ns) séparés par de l'air d'indice na.
L'échantillon 11 est une couche de polymère de TOPAS 8007® avec une épaisseur de 165 pm mesurée avec un micromètre MITUTOYO (modèle 15610110) .
L'objectif 80 est un objectif d'ouverture numérique égale à 0,9 et de référence MPLFLN 100X d'Olympus.
En référence à la figure 2, lorsque l'on déplace l'objectif de microscope 80 le long de l'axe Z au-dessus de l'échantillon 11 entre deux positions 80a et 80b distants d'une distance d, le plan focal de l'objectif 80 se déplace dans l'échantillon 11 d'une distance d'.
d est différent de d'.
En outre, il n'y a pas de proportionnalité entre d et d'. Autrement dit, d' n'est pas une fonction affine de d, et il n'est pas simple de déterminer d' en fonction de d .
Un tel montage selon l'état de l'art antérieur, au fur et à mesure que le plan de focalisation de l'objectif 80 s'enfonce dans l'échantillon, pose des problèmes de plus en plus importants de résolution, de détermination de la profondeur du plan de focalisation de l'objectif 80, et de réduction de l'intensité Raman .
Par exemple, la figure 3 illustre le profil Raman confocal collecté avec cet objectif 80 sur l'échantillon 11 en déplaçant l'objectif 80 le long de l'axe Z. L'axe des abscisses du graphique de la figure 3 est la position nominale Δ en m de l'objectif 80 le long de l'axe Z. Sur la base de ce profil, on arrive à une mesure erronée d'épaisseur de l'échantillon 11 égale à 89pm.
On va maintenant décrire, en référence aux figures 4 à 12, un premier mode de réalisation de dispositif ou embout ou capuchon 1 selon l'invention et un procédé selon l'invention d'utilisation de ce dispositif ou embout ou capuchon 1.
Le dispositif 1 selon l'invention va à encontre de l'enseignement technique de l'article de Tomba et al . intitulé « Avoiding Coupling Fluid- Sample Interaction in Confocal Raman Depth Profiling with Immersion Objectives », et vainc les préjugés techniques de cet article selon lesquels il faut absolument éliminer tout air entre l'objectif de microscope et l'échantillon et il ne faut intercaler entre l'objectif et l'échantillon rien que des milieux ayant un indice de réfraction très proche de celui de l'échantillon (typiquement une huile de couplage d'indice 1,50 et un film PE d'indice 1,51 pour un échantillon en PP d'indice 1,49).
En référence aux figures 4 à 6, le dispositif 1 selon l'invention pour objectif de microscope, comprend une lame 2.
La lame 2 est plane. La lame 2 est une lame à double faces parallèles. Ainsi, on limite les effets optiques de cette lame.
Le dispositif 1 comprend un réservoir 3 agencé pour contenir du liquide 4, c'est-à-dire pour retenir le liquide 4 sans que le liquide 4 ne se répande à l'extérieur du réservoir 3.
Le réservoir 3 est muni de deux extrémités opposées alignées le long d'une direction d'alignement 5, dont :
o une extrémité ouverte 6, prévue pour l'insertion d'une extrémité distale 7 d'un objectif 8 de microscope, et
o une extrémité fermée 9 par la lame 2.
Le dispositif 1 comprend un dispositif d'espacement 10, situé du côté de la lame 2 opposé par rapport au réservoir 3, et agencé pour, lorsque le dispositif d'espacement 10 est placé contre une surface plane d'un échantillon 11, créer un espace intermédiaire 12 entre la lame 2 et l'échantillon 11.
Le dispositif 1 est dénué de moyens pour créer une dépression dans l'espace intermédiaire 12. Par dépression, on entend de préférence toute pression à l'intérieur de l'espace 12 inférieure à 0,8 atmosphère. Le dispositif 1 est dénué de moyens agencés pour aspirer un gaz en provenance de l'espace intermédiaire 12 ou au moins dénué de moyens agencés pour aspirer un gaz en provenance de l'espace intermédiaire 12 sans le remplacer par un autre gaz.
Le dispositif 1 est dénué de moyens pour déformer la lame 2.
La dispositif d'espacement 10 a une hauteur supérieure ou égale à 10 micromètres, de préférence inférieure ou égale à 1 millimètre. Selon la variante envisagée, le dispositif d'espacement 10 peut être muni :
- de trous pour faire communiquer l'espace intermédiaire 12 avec l'atmosphère gazeuse environnante autour du dispositif 1, ou - peut être fermé pour isoler l'espace intermédiaire 12 par rapport à l'atmosphère gazeuse environnante autour du dispositif 1 ; dans ce cas, le dispositif 1 peut comprendre des moyens pour remplacer le contenu de l'espace intermédiaire 12 (par exemple remplacer un contenu initial d'air par un gaz neutre ou tout autre gaz ou mélange de gaz avec lequel on souhaite mettre en contact l'échantillon 11) .
La lame 2 est rigide. Ainsi, on assure le maintien du volume de l'espace intermédiaire 12.
La lame 2 a un module d'Young supérieur à E= 3 GPa (de préférence supérieur à 6 GPa, de manière préférentielle à 70 GPa), de préférence compris entre 3 GPa et 200 GPa (de préférence entre 6 GPa et 200 GPa, de préférence entre 70 GPa et 200 GPa) . Par exemple, le module d'Young du verre classique Schott® pour lamelles de microscopes (utilisable pour la lame 2) est de 72,9 GPa .
La lame a une épaisseur 16 supérieure ou égale à e= 100 pm ou 130 pm (de préférence inférieure ou égale à 500 micromètres) .
La lame 2 a un Coefficient de contrainte optique supérieur ou égal à C= 3,4.10"12 m2/l\l
La lame 2 a un coefficient de poisson supérieur ou égal à μ = 0,208 La lame 2 a un Module de cisaillement supérieur ou égal à G = 30,l kN/mm2
La lame 2 a une dureté Knoop H K100 supérieur ou égal à 590.
La lame 2 est en verre ou en polymère. Dans une première variante de ce mode de réalisation illustré sur la figure 5, le dispositif d'espacement 10 est interchangeable. Ainsi, sur la figure 4, le dispositif d'espacement 10 est un premier dispositif d'espacement 101 interchangeable. Le dispositif 1 est accompagné (par exemple sous la forme d'un « kit », typiquement sous sa forme commercialisée) d'au moins un autre dispositif d'espacement 102 (de préférence de plusieurs autres dispositifs d'espacement) de hauteur (définie, comme toutes les autres hauteurs de cette description, parallèlement à la direction d'alignement 5 ou à l'axe optique de l'objectif 8 qui est parallèle à cette direction 5) différente de celle du premier dispositif d'espacement 101. Le dispositif d'espacement 101 interchangeable de la figure 4 peut ainsi être remplacé par le dispositif d'espacement 102 (plus haut) tel que représenté sur la figure 5, et inversement. Ceci permet une meilleure adaptabilité à l'échantillon 11 en fonction :
- des hauteurs des reliefs 18 de l'échantillon 11, ou
- de la hauteur de l'échantillon (par exemple dans une variante où sur les figures 4 à 6 la référence 11 serait un support (comme une lame de microscope) et la référence 18 l'échantillon posé sur ce support).
- de la distance focale de l'objectif 8 de microscope
Chaque dispositif d'espacement 10 parmi les différents dispositifs d'espacement interchangeables 101, 102, etc. peut par exemple être un anneau ou une rondelle en polymère et/ou métal anodisé et/ou verre.
Chaque dispositif d'espacement 10 parmi les différents dispositifs d'espacement interchangeables 101, 102, etc. est agencé pour être de préférence maintenu par une force mécanique (coincé, clipsé, ou serré) ou magnétique (aimantation) sur le réservoir 3 ou, de manière moins préférée, simplement posé ou mis en contact du réservoir 3. Dans une deuxième variante de ce mode de réalisation illustré sur la figure 6, le dispositif d'espacement 10 comprend des moyens 13 pour régler (sans interchanger ce dispositif 10) une hauteur 14, le long de la direction d'alignement 5, de ce dispositif d'espacement 10. Ces moyens de réglage 13 sont agencés pour permettre différentes (de préférence au moins 5) valeurs non nulles et stables dans le temps de la hauteur 14 du dispositif d'espacement 10. Ceci permet une meilleure adaptabilité à l'échantillon 11 en fonction :
- des hauteurs des reliefs 18 de l'échantillon 11, ou - de la hauteur de l'échantillon (par exemple dans une variante où sur les figures 4 à 6 la référence 11 serait un support (comme une lame de microscope) et la référence 18 l'échantillon posé sur ce support).
- de la distance focale de l'objectif 8 de microscope.
Le dispositif d'espacement 10 peut par exemple être une paire d'anneaux ou de rondelles 21, 22 munis de moyens pour écarter ces deux anneaux ou rondelles 21, 22 l'un par rapport à l'autre. Ces moyens de réglage 13 ou d'écartement peuvent par exemple comprendre :
- une vis micrométrique 19 qui tourne dans un pas de vis à travers l'anneau ou rondelle supérieur(e) 21 et dont la pointe vient en butée de l'anneau ou rondelle inférieur(e) 22, et
- au moins une (de préférence plusieurs) tige de guidage 20 libre de coulisser à travers l'anneau ou rondelle supérieur(e) 21 et qui est fixée à l'anneau ou rondelle inférieur(e) 22.
En tournant la vis 19, on écarte ou rapproche les anneaux ou rondelles 21, 22 (en fonction du sens de rotation de la vis 19), pendant que le mouvement de translation, parallèlement à la direction 5, de l'anneau ou rondelle supérieur(e) 21 par rapport à l'anneau ou rondelle inférieur(e) 22 est guidé par l'au moins une tige de guidage 20.
Ces deux variantes sont combinables. On peut ainsi avoir plusieurs dispositifs 101, 102, ... interchangeables, chaque dispositif 101, 102, ... étant équipé des moyens de réglage 13 précédemment décrits.
Dans un procédé d'utilisation du dispositif 1 maintenant décrit, on procède aux étapes suivantes dans n'importe quel ordre :
- on remplit le réservoir 3 avec du liquide à immersion 4,
- on insère une extrémité distale 7 (i.e. l'extrémité prévue pour être orientée vers un échantillon 11 pour son observation) de l'objectif 8 de microscope dans le réservoir 3 par l'extrémité ouverte 6 du réservoir 3, de sorte que l'extrémité distale 7 de l'objectif 8 et la lame 2 soient reliées (de préférence uniquement) par le liquide 4, - on place le dispositif d'espacement 10 contre une surface de l'échantillon 11 (ou autour de l'échantillon, par exemple dans une variante où sur les figures 4 à 6 la référence 11 serait un support (comme une lame de microscope) et la référence 18 l'échantillon posé sur ce support) de manière à créer l'espace intermédiaire 12 entre la lame 2 et l'échantillon 11.
L'espace intermédiaire 12 est un espace de gaz, de préférence d'air. Ensuite, on transporte au moins un signal optique à travers l'objectif 8, ce transport d'au moins un signal optique comprenant :
- une acquisition d'un signal optique en provenance de l'échantillon 11 via l'objectif 8 (par exemple un signal de fluorescence de l'échantillon, un signal Raman de l'échantillon, un signal d'observation de l'échantillon en lumière blanche, etc.), et aussi de préférence une mémorisation (typiquement dans une mémoire informatique ou électronique) de données relatives à ce signal et/ou un affichage de ces données (typiquement sur un écran, ou sur un affichage digital ou sur un cadran analogique à aiguille, etc.) ; et/ou
- un acheminement d'un signal optique jusqu'à l'échantillon 11 via l'objectif 8, (par exemple un signal optique d'excitation de l'échantillon).
Lors de ce transport de l'au moins un signal optique à travers l'objectif 8 :
- il n'y a pas de contact entre l'échantillon 11 et la lame 2,
- c'est à dire que la lame 2 ne touche pas l'échantillon 11,
- autrement dit qu'il y a toujours une distance 15 (non nulle) entre la lame 2 et l'échantillon 11.
Lors de ce transport de l'au moins un signal optique à travers l'objectif 8, la partie de l'échantillon 11 sur lequel est projeté ce signal optique ou d'où provient ce signal optique n'est pas en contact de la lame 2 et même n'est pas en contact d'une quelconque partie du dispositif 1.
La lame 2 est transparente, c'est-à-dire qu'elle laisse passer au moins 50% (de préférence au moins 90%) de l'intensité lumineuse du signal optique.
Ce mode de réalisation de procédé selon l'invention ne comprend aucune dépressurisation (en particulier aucune aspiration de gaz ou aucune aspiration de gaz sans le remplacer par un autre gaz) dans l'espace intermédiaire 12 entre l'étape de placement du dispositif d'espacement 10 (c'est-à-dire le moment de la création de l'espace intermédiaire 12) et le transport du signal optique. Par dépressurisation, on entend de préférence toute étape de diminution de la pression à l'intérieur de l'espace 12 à une valeur inférieure à 0,8 atmosphère.
On conserve le volume de l'espace intermédiaire 12 inchangé :
- entre l'étape de placement du dispositif d'espacement 10 (c'est-à- dire le moment de la création de l'espace intermédiaire 12) et le transport du signal optique, et
- pendant le transport du signal optique.
Ainsi, on améliore l'adaptabilité de l'invention à l'échantillon 11, notamment concernant :
- les effets négatifs de la pression de la lame 2 sur l'échantillon 11 si l'espace intermédiaire 12 n'existait pas, notamment pour les échantillons qui peuvent souffrir d'une pression ou les échantillons « mous » dont on veut éviter la déformation,
- les besoins de « respirer » de l'échantillon (par exemple échantillon biologique, de peau ou autre), d'être à l'air libre ou sous une certaine atmosphère.
Ainsi, le dispositif selon l'invention évite une interaction de la partie observée de l'échantillon 11 avec un élément extérieur tel qu'un liquide d'immersion, ou la lame 2, ce qui est important par exemple dans le cas de diffusion de lumière par de la peau . On évite ainsi de créer des interactions « non naturelles » avec l'échantillon 11 et donc de générer des artefacts de mesure, ce qui est important par exemple pour l'étude de l'absorption de médicaments ou de cosmétiques sur un échantillon 11 de peau .
Ce mode de réalisation de procédé selon l'invention ne comprend aucune déformation de la lame 2 entre la création de l'espace intermédiaire 12 et le transport du signal optique.
Selon une première variante, on peut interchanger différents dispositifs d'espacement 101, 102 comme expliqué précédemment. Cette étape d'interchangement ou de remplacement est typiquement mis œuvre avant l'étape de transport du signal optique à travers l'objectif.
Selon une deuxième variante, le procédé selon l'invention comprend un réglage de la hauteur 14, le long de la direction d'alignement 5, du dispositif d'espacement 10, cette étape de réglage étant réalisée via les moyens de réglage 13 comme expliqué précédemment.
L'indice de réfraction est utilisé dans la présente description pour parler de l'indice de réfraction.
Pour la longueur d'onde λ, du signal optique (cas monochromatique) ou au moins une longueur d'onde d'intérêt λ, du signal optique (cas polychromatique), l'écart de l'indice de réfraction nm du liquide 4 (à λ,), par rapport à l'indice de réfraction ns (à λ,) de la partie de l'échantillon 11 dans lequel se trouve le plan focal (position du plan focal à λ,) de l'objectif 8 au moment du transport du signal, est inférieur à vingt pour cent :
Figure imgf000015_0001
L'écart de l'indice de réfraction ng (à λ,) de la lame 2, par rapport à l'indice de réfraction ns (à λ,) de la partie de l'échantillon 11 dans lequel se trouve le plan focal (position du plan focal à λ,) de l'objectif 8 au moment du transport du signal optique, est inférieur à vingt pour cent :
Figure imgf000015_0002
L'indice de réfraction du liquide 4 est compris entre 1,3 et 1,7.
La distance 15 (i.e., sur tout le plan de la lame 2 orienté du côté de l'échantillon, la longueur du plus court segment reliant la lame 2 aux reliefs 18 de l'échantillon 11) entre la lame 2 et l'échantillon 11 est supérieure ou égale à 10 micromètres.
La distance 15 entre la lame 2 et l'échantillon 11 est inférieure ou égale à 1 millimètre.
En référence à la figure 7, lorsque l'on déplace l'objectif de microscope 8 le long de la direction 5 au-dessus de l'échantillon 11 entre deux positions 8a et 8b distants d'une distance d, le plan focal de l'objectif 8 se déplace dans l'échantillon 11 d'une distance d'.
En référence à la figure 7, le déplacement réel d'= PsPs est relié au déplacement nominal d par l'équation (et donc la profondeur réelle Z du plan de focalisation de l'objectif 8 est reliée à la profondeur nominale Δ du plan de focalisation de l'objectif 8) : tg(a.s)
Quand nm = ns, am = as, alors:
d = d'
Δ = Z
Autrement dit, dans le cas où :
- =nm (et de préférence ns=ng) ou par approximation
< 1% (et de préférence < 1% ), et
Figure imgf000016_0001
- l'espace intermédiaire est une lame (de gaz, ou de préférence d'air) à faces parallèles ce qui est vrai si :
o la lame 2 est une lame à face parallèles, ou au moins la lame 2 a une face extérieure orientée vers l'échantillon 11 (c'est-à-dire la face de la lame 2 opposée par rapport au réservoir 3) qui est plane et perpendiculaire à l'axe optique (direction 5) de l'objectif 8, et
o les reliefs 18 sont petits (typiquement quelques micromètres, leurs hauteurs étant volontairement très exagérées sur les figures 4 à 6 pour pouvoir les discerner) par rapport à la distance 15 entre la lame 2 et l'échantillon 11 (typiquement quelques dixièmes de millimètres), alors d = d'.
Ainsi selon l'invention, on évite les problèmes de précision de positionnement du plan focal de l'objectif et de résolution au fur et à mesure que l'on s'enfonce dans l'échantillon.
Dans le cas où : ns≠nm(≠ng) de préférence de préférence
Figure imgf000017_0001
- l'espace intermédiaire est une lame (de gaz, ou préférence d'air) à faces parallèles ce qui est vrai si :
o la lame 2 est une lame à face parallèles, ou au moins la lame 2 a une face extérieure orientée vers l'échantillon 11 (c'est-à-dire la face de la lame 2 opposée par rapport au réservoir 3) qui est plane et perpendiculaire à l'axe optique de l'objectif 8 (et donc à la direction 5), et o les reliefs 18 sont petits (typiquement quelques micromètres, leurs hauteurs étant volontairement très exagérées sur les figures 4 à 6 pour pouvoir les discerner) par rapport à la distance 15 entre la lame 2 et l'échantillon 11 (typiquement quelques dixièmes de millimètres), alors d≠d' mais il existe une proportionnalité entre d et d'. Autrement dit, d' est une fonction affine de d, et il est simple de déterminer d' en fonction de d . Cette proportionnalité peut être prise en compte par un simple facteur de correction entre d et d' (ou entre Δ et Z). La figure 12 donne différentes valeurs de ce facteur de correction F pour ns= l,52 ± 0,01 en fonction de l'ouverture numérique N.A. de l'objectif 8 (première colonne) et en fonction de la valeur de nm (nm = 1,333 pour la première colonne de valeur du facteur de correction ou nm = ns pour la deuxième colonne de valeur du facteur de correction), avec :
d' = F d
Z = F Δ
Ainsi selon l'invention, on limite les problèmes de précision de positionnement du plan focal de l'objectif et de résolution au fur et à mesure que l'on s'enfonce dans l'échantillon. Ce mode de réalisation de procédé selon l'invention comprend de préférence une mesure d'une épaisseur 17 de l'échantillon 11 à partir de l'acquisition du signal optique qui est de préférence un signal Raman.
Par exemple, on a effectué les mesures correspondant aux figures 8 et 9 avec les paramètres suivant.
La lame 2 est en verre Schott®, avec une épaisseur de 130 pm, et un indice de réfraction de 1,51.
Les parois latérales du réservoir 3 sont de forme cylindrique, avec un diamètre intérieur de 25 millimètres.
Les parois latérales du réservoir 3 sont en matière plastique, typiquement en PVC.
Les moyens d'espacement 10 sont un anneau en téflon ou en matière plastique tel que du PVC ou en verre et de hauteur égale à 130 pm
Le liquide d'immersion 4 comprend un mélange de 100 à 0% de 2,2'- thiodiethanol (TDE, ACROS Organics 420861000) avec 0 à 100% de solutions (par exemple de l'eau), de manière à pouvoir adapter l'indice de réfraction du liquide 4 entre 1,33 et 1,6 de préférence le plus proche possible de l'indice de réfraction de l'échantillon. L'indice de réfraction du TDE est de 1,5206±0,0005 mesuré avec un réfractomètre Abbe (Zeiss 144865). L'indice de réfraction de l'eau est 1,33.
L'objectif 8 est un objectif LUMPLFLN60XW à immersion à eau de chez Olympus avec une ouverture numérique de 1,00.
L'échantillon 11 est une couche de polymère TOPAS 8007® (indice de réfraction 1,53) avec une épaisseur de 165 pm mesurée avec un micromètre MITUTOYO (modèle 15610110) avec une précision de ±1 pm, avec un indice de réfraction proche du Stratum Corneum.
L'espace intermédiaire 12 est rempli d'air à la pression atmosphérique.
Les données Raman des figures 8 et 9 sont acquises avec un microspectromètre Labram HR Evolution (Horiba Jobin-Yvon) équipé d'un laser He-Ne d'excitation à 632,8 nm avec un réseau de diffraction à 600 traits par millimètre. Un microscope Olympus (sur lequel est monté l'objectif 8) est relié optiquement au spectromètre, et est équipé d'un trou de filtrage (pour la confocalité du système) ajusté à 500 pm.
L'objectif 8 est monté sur une platine de déplacement à haute précision permettant des pas de 100 nanomètres parallèlement à la direction 5.
Les données Raman des figures 8 et 9 sont obtenues en déplaçant la position du plan de focalisation de l'objectif 8 à travers l'échantillon 11 à différentes hauteurs le long de la direction 5 et en enregistrant un spectre à chaque position de ce plan de focalisation. Chaque spectre est mesuré entre 500 cm"1 et 1500 cm"1, avec un temps d'acquisition de 5 secondes et 10 accumulations. Chaque spectre est lissé en utilisant un lissage de moyenne flottante à cinq points et une correction de la ligne de base par une fonction polynomiale automatique. La largeur à mi-hauteur (FWHM) de la courbe obtenue en suivant la variation de l'intensité intégrée de la bande à 930 cm" 1 du TOPAS 8007® (utilisée car elle ne correspond à aucune bande de vibration du TDE) a été déterminée en fonction de la position nominale Δ du plan focal de l'objectif 8 dans l'échantillon en utilisant un script Matlab. On obtient alors les graphiques des figures 8 et 9. La courbe 23 illustre les données obtenues avec du liquide d'immersion 4 consistant uniquement en de l'eau. La courbe 24 illustre les données obtenues avec du liquide d'immersion 4 consistant uniquement en du TDE.
Sur les figures 8 à 11, le symbole Δ fait référence à la profondeur nominale du plan de focalisation de l'objectif 8 telle que contrôlée par le logiciel Labspec 6.0, et qui peut être différente de la profondeur réelle Z du plan de focalisation de l'objectif 8 dans l'échantillon 11.
Par comparaison des figures 8 et 9 avec la figure 3 (le graphique de la figure 3 ayant été acquis avec les mêmes conditions que les graphiques des figures 8 et 9 mais sans le dispositif selon l'invention comme illustré en figure 1), on remarque que selon l'invention on évite ou limite les problèmes de précision de positionnement du plan focal de l'objectif 8 (l'épaisseur de l'échantillon déterminée à 166 pm dans le cas de la courbe 23 de la figure 9) et de perte d'intensité de mesure (l'évolution de l'intensité du signal Raman 23 ou 24 présente un plateau intermédiaire avec un gain et une perte en signal (à l'entrée et la sortie de l'échantillon 11) quasi symétrique par rapport à un axe central respectivement 25 ou 26).
Dans le cas de la courbe 24 (ns=l,53~nm=l,52) de la figure 8, on a bien Δ=Ζ, c'est-à-dire d=d'. On mesure en effet avec le dispositif 1 une épaisseur de l'échantillon 11 de 166 pm qui est comprise dans l'intervalle d'incertitude de la mesure l'épaisseur de 165±1 pm avec le micromètre MITUTOYO.
Dans le cas de la courbe 23 (ns=l,53≠nm=l,33), on a Δ≠Ζ, c'est-à- dire d≠d'. On mesure en effet avec le dispositif 1 une épaisseur de l'échantillon 11 de 126 pm présentant un écart d'épaisseur de 24 % par rapport à l'épaisseur 165±1 pm mesurée avec le micromètre MITUTOYO, et qui démontre bien la nécessité du facteur de correction décrit précédemment en référence à la figure 7. Dans ce cas on a bien d = 126 pm, F = 1,314 (pour NA= 1,00) et d'=F d =1,314 x 126 ~ 165,5 pm.
Les données des figures 10 et 11 ont été acquises sur le même principe que les données des figures 8 et 9, mais en mesurant l'intensité de la bande à 521 cm"1 typique du Silicium (au lieu de 930 cm"1) pour différentes profondeurs nominales Δ de l'objectif 8. L'échantillon 11 de TOPAS 8007® est déposé sur une tranche de Silicium. Les mesures sont effectuées avec le plan focal de l'objectif 8 :
- directement sur la tranche de Silicium (i.e. le dispositif 1 est disposé sur la tranche de Silicium mais pas sur l'échantillon 11) en visant l'interface entre l'espace intermédiaire 12 et la tranche de silicium ; ceci correspond au graphique 27 de la figure 10 ; et
- derrière l'échantillon 11 (i.e. le dispositif 1 est disposé sur l'échantillon 11) en visant l'interface entre l'échantillon 11 et la tranche de silicium ; ceci correspond au graphique 28 de la figure 11.
A la vue des figures 10 et 11, on remarque que selon l'invention on évite ou limite les problèmes de perte de résolution en profondeur au fur et à mesure que l'on augmente la profondeur dans l'échantillon 11, cette résolution étant de 19 pm sur les deux faces opposées de l'échantillon 11 distantes de 165 pm. L'invention n'est pas limitée aux exemples qui viennent d'être décrits et de nombreux aménagements peuvent être apportés à ces exemples sans sortir du cadre de l'invention .
Les différentes caractéristiques, formes, variantes et modes de réalisation de l'invention peuvent être associées les unes avec les autres selon diverses combinaisons dans la mesure où elles ne sont pas incompatibles ou exclusives les unes des autres. En particulier toutes les variantes et modes de réalisation décrits précédemment sont combinables entre eux.

Claims

REVENDICATIONS
Dispositif (1) pour objectif de microscope, comprenant :
- une lame
(2),
- un réservoir
(3) agencé pour contenir du liquide
(4) et muni de deux extrémités opposées alignées le long d'une direction d'alignement (5), dont :
o une extrémité ouverte (6), prévue pour l'insertion d'une extrémité distale (7) d'un objectif (8) de microscope, et o une extrémité fermée (9) par la lame (2),
- un dispositif d'espacement (10), situé du côté opposé de la lame (2) par rapport au réservoir (3), et agencé pour, lorsque le dispositif d'espacement (10) est placé contre une surface plane d'un échantillon (11), créer un espace intermédiaire (12) entre la lame (2) et l'échantillon (11),
caractérisé en ce qu'il est dénué de moyens pour créer une dépression dans l'espace intermédiaire (12).
Dispositif selon la revendication 1, caractérisé en ce que la lame (2) est rigide, c'est-à-dire avec un module d'Young supérieur à 3 GPa.
Dispositif selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que le dispositif d'espacement (10) comprend des moyens (13) pour régler une hauteur (14), le long de la direction d'alignement (5), de ce dispositif d'espacement (10).
Dispositif selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que le dispositif d'espacement (10) est un premier dispositif d'espacement (101) et est interchangeable, et en ce que le dispositif (1) est en outre accompagné d'au moins un autre dispositif d'espacement (102) de hauteur différente de celle du premier dispositif d'espacement (101).
5. Dispositif selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la lame (2) a une épaisseur (16) supérieure ou égale à 130 micromètres.
6. Dispositif selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la lame (2) a une épaisseur (16) inférieure ou égale à 500 micromètres.
7. Procédé d'utilisation d'un dispositif (1) pour objectif de microscope, ledit dispositif (1) pour objectif de microscope comprenant :
- une lame (2),
- un réservoir (3) agencé pour contenir du liquide (4) et muni de deux extrémités opposées alignées le long d'une direction d'alignement (5), dont :
- une extrémité ouverte (6),
- une extrémité fermée (9) par la lame (2),
- un dispositif d'espacement (10), situé du côté opposé de la lame (2) par rapport au réservoir (3),
ledit procédé étant caractérisé en ce que :
- on remplit le réservoir (3) avec du liquide à immersion (4) et on insère une extrémité distale (7) d'un objectif de microscope (8) dans le réservoir (3) par l'extrémité ouverte (6) du réservoir (3), de sorte que l'extrémité distale (7) de l'objectif et la lame (2) soient reliées par le liquide (4),
- on place le dispositif d'espacement (10) contre une surface d'un échantillon (11) ou autour de l'échantillon (18) de manière à créer un espace intermédiaire (12) entre la lame (2) et l'échantillon (H, 18),
- on transporte un signal optique à travers l'objectif (8), ce transport de signal optique comprenant une acquisition du signal en provenance de l'échantillon (11, 18) via l'objectif (8) ou un acheminement du signal optique jusqu'à l'échantillon (11, 18) via l'objectif (8), de préférence avec une distance (15) entre la lame (2) et l'échantillon (11), et étant caractérisé en ce qu'il ne comprend aucune dépressurisation dans l'espace intermédiaire (12) entre la création de l'espace intermédiaire (12) et le transport du signal.
8. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce qu'il ne comprend aucune déformation de la lame (2) entre la création de l'espace intermédiaire (12) et le transport du signal.
9. Procédé selon la revendication 7 ou 8, caractérisé en ce que :
- il comprend un réglage d'une hauteur (14), le long de la direction d'alignement (5), du dispositif d'espacement (10), et/ou
- le dispositif d'espacement (10) est un premier dispositif d'espacement (101), et en ce que le procédé comprend un interchangement du premier dispositif d'espacement (101) avec un autre dispositif d'espacement (102) de hauteur différente de celle du premier dispositif d'espacement (101).
10. Procédé selon l'une quelconque des revendications 7 à 9, caractérisé en ce que l'écart de l'indice de réfraction du liquide (4), par rapport à l'indice de réfraction de la partie de l'échantillon (11, 18) dans lequel se trouve le plan focal de l'objectif (8) au moment du transport du signal, est inférieur à vingt pour cent.
11. Procédé selon l'une quelconque des revendications 7 à 10, caractérisé en ce que l'écart de l'indice de réfraction de la lame (2), par rapport à l'indice de réfraction de la partie de l'échantillon (11, 18) dans lequel se trouve le plan focal de l'objectif (8) au moment du transport du signal, est inférieur à vingt pour cent.
12. Procédé selon l'une quelconque des revendications 7 à 11, caractérisé en ce que l'indice de réfraction du liquide (4) est compris entre 1,3 et 1,7.
13. Procédé selon l'une quelconque des revendications 7 à 12, caractérisé en ce que la distance ( 15) entre la lame (2) et l'échantillon ( 11, 18) est supérieure ou égale à 10 micromètres.
14. Procédé selon l'une quelconque des revendications 7 à 13, caractérisé en ce que la distance ( 15) entre la lame (2) et l'échantillon ( 11, 18) est inférieure ou égale à 1 millimètre.
15. Procédé selon l'une quelconque des revendications 7 à 14, caractérisé en ce qu'il comprend une mesure d'une épaisseur ( 17) de l'échantillon à partir de l'acquisition du signal .
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Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5870223A (en) * 1996-07-22 1999-02-09 Nikon Corporation Microscope system for liquid immersion observation
US6413252B1 (en) * 1998-02-26 2002-07-02 Lucid, Inc. Confocal microscope for facilitating cryosurgery of tissue
US20140063599A1 (en) * 2012-09-03 2014-03-06 Olympus Corporation Immersion liquid retainer, observed portion fixing apparatus and microscope

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5870223A (en) * 1996-07-22 1999-02-09 Nikon Corporation Microscope system for liquid immersion observation
US6413252B1 (en) * 1998-02-26 2002-07-02 Lucid, Inc. Confocal microscope for facilitating cryosurgery of tissue
US20140063599A1 (en) * 2012-09-03 2014-03-06 Olympus Corporation Immersion liquid retainer, observed portion fixing apparatus and microscope

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2022161816A1 (fr) 2021-01-29 2022-08-04 Damae Medical Dispositifs pour l'analyse microscopique ex vivo d'echantillons et in vivo de la peau
FR3119466A1 (fr) * 2021-01-29 2022-08-05 Damae Medical Dispositifs pour l’analyse microscopique ex vivo d’échantillons et in vivo de la peau
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