FR2883886A1

FR2883886A1 - Methode d'obtention de variants solubles ou mieux exprimes d'une proteine d'interet

Info

Publication number: FR2883886A1
Application number: FR0503366A
Authority: FR
Inventors: Marc Delcourt; Laurent Ducher; Stephane Blesa
Original assignee: Biomethodes SA
Current assignee: Biomethodes SA
Priority date: 2005-04-05
Filing date: 2005-04-05
Publication date: 2006-10-06
Anticipated expiration: 2025-04-05
Also published as: WO2006106193A1; FR2883886B1

Abstract

La présente invention concerne une méthode permettant la sélection de variants solubles ou mieux exprimés d'une protéine ou d'un peptide d'intérêt, à partir d'une banque de mutants de la protéine ou du peptide d'intérêt fusionnés au gène de la résistance à la kanamycine.

Description

La présente invention concerne la biologie moléculaire

et plus particulièrement l'évolution des protéines in vitro. La technologie a pour objet une méthode permettant la sélection, à partir d'une banque de mutants d'une protéine générée dans une première étape, des variants présentant une solubilité améliorée ou un niveau d'expression supérieur.

L'insolubilité des protéines recombinantes constitue un problème majeur dans le domaine des biosciences: lorsque exprimées en bactéries, une grande parties des protéines ne peuvent être exprimées à un niveau important sans s'agréger sous forme de corps d'inclusion. Elles ne pourront alors pas être purifiées, et seront dans la plupart des cas inactives.

Lorsque l'on exprime une protéine eucaryote (notamment une protéine humaine) dans un hôte procaryote, les différentes étapes de maturation (glycosylation, clivage de peptides, etc...) n'ont pas lieu. La protéine a donc une structure générale assez distante de sa structure naturelle, et présente le plus souvent une solubilité réduite.

Dans le cas de protéines recombinantes bactériennes produites en bactéries, ce phénomène d'insolubilité n'est observé que dans une moindre mesure. Cependant, si l'on souhaite exprimer une grande quantité de la protéine, une fraction des protéines s'agrège il existe une concentration limite, fonction de la solubilité de la protéine, que l'on ne peut dépasser sans former de tels corps d'inclusion.

La nature des protéines agrégées est parfois réversible: si l'on traite les corps d'inclusion de façon à les dissoudre, soit en utilisant des dénaturants, soit en modifiant le pH ou la température, puis qu'on replace la solution dans des conditions plus physiologiques, on peut retrouver des protéines dans leur forme native et soluble, c'est-à-dire ayant récupéré leurs fonctionnalités. Néanmoins, le plus souvent, une fraction très minoritaire seulement des protéines peut ainsi être récupérée.

Cette limite à l'expression des protéines représente un obstacle lorsque l'on souhaite exprimer une protéine en grande quantité : c'est le cas notamment des enzymes industrielles, - utilisées dans les industries textiles, agroalimentaires et chimiques notamment -, ou celui des fragments d'anticorps recombinants à une seule chaîne, les ScFv. Cette dernière classe de molécules, qui s'expriment très mal en bactéries pour ces raisons de limite de solubilité, sont utilisables en thérapeutique humaine et doivent alors être produits dans des quantités non négligeables.

Cette limite à l'expression que représente l'insolubilité des protéines recombinantes est également un frein à l'expression des protéines utilisées en petite quantité à des fins de recherche. Par exemples, les cibles thérapeutiques doivent, pour être caractérisées, être produites en quantité suffisante pour permettre la réalisation d'études structurales. Ces études ne peuvent être réalisées sur des protéines insolubles car la formation des cristaux destinés à ces analyses se fait en milieu liquide. L'insolubilité des protéines est donc un phénomène qui limite les progrès dans la caractérisation de nombreuses protéines.

Des efforts importants pour améliorer la production des protéines recombinantes ont été menées ces dernières années.

L'approche générale consiste à rechercher des variants de la protéine ayant acquis une meilleure solubilité, tout en ayant conservé ses autres fonctionnalités (son activité pour une enzyme, sa capacité à lier un antigène pour un anticorps recombinant). Dans une première étape, des mutants sont générés à partir du gène codant pour la protéine de départ. Dans un deuxième temps, ces mutants sont criblés pour identifier ceux qui présentent le meilleur niveau de solubilité ou d'expression. Dans un troisième temps, les mutants présentant un niveau de solubilité ou d'expression amélioré sont testés pour leurs fonctionnalités, afin de vérifier que la ou les mutations introduites ne les ont pas affectées.

Différentes techniques de mutagenèse existent; elles permettent de modifier artificiellement la séquence nucléotidique d'un fragment d'ADN. Elle peuvent être séparées en quatre grands groupes: la mutagenèse aléatoire, la recombinaison de gènes, la mutagenèse dirigée et la mutagenèse massiveTM (Massive Mutagenesis ).

Dans la technique de mutagenèse aléatoire, l'ADN ciblé (contenant le gène à muter) est amplifié dans des conditions particulières altérant les capacités de la polymérase à répliquer fidèlement l'ADN. Celle-ci introduit des mutations au fil des cycles, c'est-à-dire des différences par rapport à la séquence initiale. A la fin de la réaction, un grand nombre de copies de la molécule initiale sont obtenues, chacune de ces molécules comportant des mutations différentes. Ces molécules sont présentes sous forme de banque, c'est-à-dire d'un mélange de molécules de nature différente (différant par la nature et la position de leurs mutations). L'ADN est ensuite inséré dans un vecteur d'expression.

La mutagenèse par recombinaison d'ADN s'inspire du processus de recombinaison à l'oeuvre dans l'évolution Darwinienne. La mutagenèse par mélange d'ADN consiste à recombiner des séquences partiellement homologues, isolées à partir de différents organismes. Par exemple, si l'on travaille sur une enzyme, la première étape d'une approche par mélange d'ADN reviendra à isoler un grand nombre de gènes homologues à cette enzyme, soit à partir de collections de souches, soit à partir de gènes directement isolés à partir d'échantillons naturels (par une approche maintenant décrite sous le terme de metagénome ).

Différentes approches existent alors pour mélanger les domaines de ces gènes homologues et générer une banque de molécules d'ADN chimériques , c'est-à-dire constituées de plusieurs domaines ayant des provenances différentes (Brevet US 6 132 970; Stemmer WP. et al, Nature, vol.370, p. 389-391, 1994; Aguinaldo AM. et a1, Methods Mol Biol., vol.192, p.235-239, 2002; Zhao H. et al, Nat Biotechnol., vol.16, p.258-261, 1998; Shao Z. et al, Nucleic Acids Res., vol.26, p.681-683, 1998; Kawarasaki Y. et al, Nucleic Acids Res., vol.31, 2003; Brevet US 5 965 408; Brevet WO 00 09 679; Brevet WO 02 48 351). Il est attendu que ces molécules contiennent ainsi des caractéristiques nouvelles, et notamment des propriétés cumulées de deux ou plusieurs gènes parentaux. Cette approche par recombinaison d'ADN est basée sur l'idée générale que la combinaison nouvelle de mutations naturelles,- ayant donc été pré- criblées par la nature pour le maintien de l'activité de l'enzyme -, a plus de chance d'être porteuse d'amélioration que l'introduction de mutations générées au hasard. En même temps que l'on restreint la génération de diversité à un espace de séquence raisonnable' car présélectionné', on est cependant limité par les séquences d'origine, qu'il faut posséder physiquement, par la nécessité d'utiliser des gènes ayant un niveau d'homologie suffisant, et par l'impossibilité de générer des séquences autres que des combinaisons des séquences initiales. Ces approches de mélange d'ADN se sont révélées être particulièrement efficaces dans le domaine de l'amélioration de l'activité ou de la stabilité des enzymes.

La mutagenèse dirigée vise à introduire une ou quelques mutations (substitutions, mais aussi délétions ou insertions) de nature et de position connue dans un fragment d'ADN. Un oligonucléotide est utilisé pour introduire cette mutation. Cet oligonucléotide est classiquement constitué d'une trentaine de bases, et est homologue en tout point à la séquence ciblée sur le fragment d'ADN, à l'exception d'une ou quelques positions localisées dans sa partie médiane. Cet oligonucléotide est ensuite utilisé pour amorcer une réaction de réplication en utilisant le fragment d'ADN comme matrice. Dans de nombreux protocoles, un second oligonucléotide, de sens opposé, est utilisé de façon à améliorer le rendement de la réplication. L'ADN synthétisé lors de cette réaction est ensuite sélectionné, notamment selon le critère de son contenu en bases méthylées, de façon à éliminer l'ADN parental non mutant. Différentes techniques de mutagenèse dirigée permettent d'obtenir assez rapidement des mutants, à un rythme qui reste cependant limité : seuls quelques mutants peuvent être générés par jour et par personne. Ce faible débit n'est que très partiellement adapté aux problématiques d'évolution moléculaire: il est en effet rare de pouvoir prédire précisément l'effet des mutations introduites et, lorsqu'on recherche un mutant amélioré sur tel ou tel critère, il est généralement préférable d'en générer un grand nombre dont la plupart n'auront pas l'effet escompté.

Massive Mutagenesis permet de réaliser en un temps très court un grand nombre de mutations dirigées sur un même fragment d'ADN cible. La matrice contenant l'ADN cible est préparée, et mélangée avec les oligonucléotides mutants initialement fabriqués. La matrice est dénaturée par la chaleur de façon à disposer temporairement d'ADN simple brin. Lors du retour à une température plus basse, certains ou tous les oligonucléotides présents dans le mélange se fixent sur la matrice au niveau de leur site d'homologie. Tous les éléments nécessaires à réaliser une réplication de la matrice à partir des oligonucléotides mutants sont ajoutés, et notamment une polymérase, le tampon permettant son activité, des nucléotides triphosphates en quantité suffisante, les éventuels cofacteurs nécessaires. La réaction de réplication a ensuite lieu dans les conditions de température correspondant à l'activité maximale de la polymérase. L'objectif est de disposer de mutants contenant chacun une mutation ou une combinaison de plusieurs mutations différentes. Le nombre moyen de mutations par molécule est modulable à loisir. La diversité possible s'accroît très rapidement avec le nombre de mutations moyen par molécules: l'utilisation de Massive Mutagenesis permet d'obtenir des diversités très larges.

Ces diverses technologies permettent de générer de la diversité. Selon le contexte précis, l'une ou l'autre peut être préférée.

Si l'on recherche des mutants présentant par rapport à la molécule d'origine une amélioration de solubilité ou d'expression, il est nécessaire de disposer d'une technologie permettant de mesurer rapidement cette caractéristique chez chacun des mutants générés. Bien entendu, on pourrait effectuer les mesures une par une en observant chez chacun des mutants le taux de protéines solubles. Cette approche serait cependant très laborieuse, et c'est pourquoi des techniques ont été développées pour permettre de tester ce paramètre de façon parallèle, directement à partir des banques de mutants.

Ces techniques sont pour la plupart basées sur la fusion, en phase, d'une banque de mutants de la protéine d'intérêt d'une part, et d'autre part d'un gène rapporteur. Ces protéines de fusion sont ensuite criblées sur le critère de l'activité du gène rapporteur.

Les protéines de fusion sont utilisées depuis de nombreuses années dans des contextes autres que celui de la recherche de variants solubles: principalement, ces protéines de fusion sont utilisées pour localiser les protéines au niveau cellulaire ou intracellulaire.

Une des premières protéines de fusion à avoir été utilisées est la Rgalactosidase, dont l'activité convertit le X-gal, un sucre non naturel, en un composé bleu. Cette activité peut donc facilement être tracée. (Casadaban MJ. et al, Methods Enzymol., Vol.100, p.293-308, 1983) La CAT (chloramphénicol-acétyl-transférase) a également été utilisée dans ce contexte des protéines de fusion depuis de longues années. Le chloramphénicol est un antibiotique qui se lie aux ribosomes de la bactérie, et bloque ainsi la biosynthèse des protéines, ce qui entraîne rapidement la mort de la cellule. La CAT est une enzyme qui transfère un groupement acétyle d'un co-enzyme A sur le chloramphénicol (qui est alors inactivé). A partir de cette différence d'un groupement acétyle, des tests colorimétriques ont été mis au point: l'activité CAT est alors tracée par un signal jaune (Robben J. et al, Gene, vol.126, p.109-113, 1993).

Ces approches basées sur l'utilisation de protéines rapporteur enzymatiques présentent un obstacle non négligeable: le substrat doit pouvoir accéder au compartiment dans lequel se situe l'enzyme rapporteur. Dans de nombreux cas, le marquage en utilisant ces enzymes n'est donc pas possible. De plus, le produit coloré marqué par l'enzyme est une petite molécule chimique, qui a une tendance naturelle à la diffusion: la localisation intracellulaire des protéines de fusion est donc imprécise.

C'est pour ces raisons qu'ont été développées des protéines de fusion naturellement fluorescentes. Le rapporteur le plus couramment utilisé est aujourd'hui la Green Fluorescent Protein (GFP) (Garamszegi N. et al, Biotechniques, vol.23, 1997). La GFP, isolée en 1962 et clonée en 1992, se compose de 238 acides aminés et est issue de la méduse Aequorea victoria. Elle a pour caractéristique de posséder un chromophore lui permettant d'absorber les rayonnements bleus (400nm) et de re-émettre dans le vert (509nm). Il existe maintenant de nombreux variants de la GFP, qui fluorescent à d'autres longueurs d'ondes et émettent ainsi différentes couleurs (jaune, bleu, violet). Plusieurs protéines de fusion peuvent donc être observées simultanément. Une seconde protéine naturellement fluorescente a été isolée et clonée à partir de l'anémone de mer: le DsRed. Cette protéine émet naturellement un signal rouge. L'utilisation combinée de cette protéine et de la GFP permet là encore de tracer plusieurs protéines en même temps.

Des GFP modifiées ont été réalisées de façon à permettre une expression optimale chez de nombreux organismes tels que les bactéries, les levures, ou les cellules mammifères, afin de permettre les études dans chacun des système couramment employés en biologie.

Lorsqu'on réalise de telles protéines de fusion, la liaison entre le gène d'intérêt et celui codant pour la protéine rapporteur doit se faire sans interrompre la phase de lecture. Il est également nécessaire de prendre soin aux contraintes stériques de l'une et l'autre protéines. En effet, il est possible que la fusion de la protéine d'intérêt et de la protéine rapporteur ne permette pas à l'une et à l'autre d'adopter leur conformation naturelle. Leur structure en serait modifiée, et leur activité annulée. Afin d'éviter ce possible écueil, il peut être nécessaire d'introduire un espaceur entre le gène codant pour la protéine d'intérêt et celui codant pour la protéine rapporteur. Cet espaceur est une séquence d'ADN codant pour un peptide de structure la plus neutre possible, et ne présentant pas en lui-même d'activité particulière. Il est généralement composé de 8 ou 9 acides aminés neutres qui ne doivent pas influer sur la structure des protéines et ne doivent pas être la cible des protéases. Il est également préférable qu'il soit flexible et hydrophile (Sieber V., Methods Mol Biol., vol.230, p.45-55, 2003; Waldo G. S. et al, Brevet US 6,448,087, 1999). Ce fragment d'ADN doit bien entendu être introduit de telle sorte que la phase soit conservée sur l'ensemble constitué par la protéine d'intérêt, l'espaceur, et la protéine rapporteur.

La position relative de la protéine d'intérêt et de la protéine rapporteur n'est pas neutre. Dans certains cas, il est préférable que la protéine de fusion soit positionnée en C-terminal. Dans certains autres, le positionnement en N-terminal est préférable. Fréquemment, l'homme du métier effectue les deux constructions, et retient celle qui présente le meilleur signal à l'issue d'une étape expérimentale préliminaire.

L'utilisation principale des protéines de fusion est donc associée à des travaux de localisation des protéines. Cependant, ces protéines de fusion ont également été utilisées comme système de sélection pour identifier des variants plus solubles d'une protéine: il a en effet été observé que lorsqu'on fusionne une protéine d'intérêt à une protéine rapporteur, la conformation de l'une et de l'autre sont liées. Une conformation incorrecte de la protéine située du côté NH2 est ainsi corrélée à une conformation également incorrecte de la protéine localisée à l'extrémité COOH. L'inverse n'est généralement pas vrai: c'est la conformation de l'extrémité NH2 de la protéine qui influe sur l'ensemble. La conformation de la protéine étant mise en place de façon concomitante à sa synthèse, et celle-ci ayant lieu de l'extrémité NH2 vers l'extrémité COOH, on peut comprendre que la conformation globale de la protéine dépend de la conformation acquise par le premier segment synthétisé. Ces effets de conformation lors de la synthèse sont parfois décrits sous le terme de nucléation .

Cette corrélation entre la conformation de la protéine d'intérêt et celle de la protéine lui étant fusionnée a donc pu être utilisée pour mettre en place des systèmes de sélection de variants plus solubles. C'est naturellement que les protéines de fusion les plus classiques ont été utilisées: la CAT, la R-galactosidase, et la GFP.

L'équipe de Maxwell et al. (Protein science, vol.8, p.1908-1911, 1999), a pu exprimer une protéine de fusion réunissant une protéine insoluble avec la CAT: le domaine catalytique d'une intégrase HIV insoluble a été fusionné au domaine N-terminal de l'enzyme. D'un autre côté, la même construction contenant cette fois-ci un mutant de la protéase plus soluble a été réalisée. Une augmentation significative de la résistance à l'antibiotique chloramphénicol est observée chez la forme mutée. Cette technique permettrait donc de sélectionner une protéine soluble au milieu d'un ensemble de protéines insolubles.

Peu de publications décrivant des travaux basés sur cette approche ont été faites à ce jour.

Dans le brevet EP1479694, il est décrit une méthode pour isoler un fragment scFv soluble. La première étape consiste en la création d'une bibliothèque de mutants du fragment. Puis, il y a construction de deux types de protéines de fusion. Les gènes de ces variants sont, dans la première construction, fusionnés avec une partie du gène nécessaire à l'expression de la R-Galactosidase. La deuxième construction consiste à fusionner le gène codant pour l'antigène correspondant avec la dernière partie du gène de la R-Galactosidase. Ainsi, dans les conditions de sélection permettant l'expression de l'antigène et du ScFv mutant, seules les formes les plus solubles du ScFv présenteront une interaction et permettront le fonctionnement de la R-Galactosidase. La différenciation entre deux clones de solubilité différente repose ici sur le fait que la spécificité du fragment scFv est proportionnelle à sa solubilité. Plus le fragment sera soluble, plus la reconnaissance de l'antigène sera élevée et donc, plus la R-Galactosidase fonctionnera. Cette technique, basée sur la complémentation de deux domaines de la R-Galactosidase, est limitée à l'utilisation dans le cadre d'une liaison anticorps-antigène. La nécessité de cotransformer deux plasmides présente une complication additionnelle par rapport aux systèmes basés sur un seul plasmide. Par ailleurs, ce système sélectionne à la fois les ScFv plus solubles et ceux présentant une meilleure affinité pour l'antigène, ce qui peut introduire également une complexité non souhaitable.

Le système le plus utilisé aujourd'hui pour sélectionner les protéines plus solubles est basé sur l'utilisation de la GFP.

Dans le brevet US6448087 (Waldo G.S. et al), les auteurs décrivent une technique dans laquelle la GFP est fusionnée avec une banque de mutants d'une protéine d'intérêt. Les bactéries exprimant les gènes correspondant à des protéines plus solubles émettent la plus forte fluorescence, et peuvent aisément être sélectionnés en utilisant un trieur de cellules.

Cette approche a permis à plusieurs équipes d'obtenir des résultats positifs, c'est-à-dire d'identifier des mutants présentant une solubilité améliorée. Cependant, cette technique est limitée par le fait qu'il ne s'agit pas ici d'un système basé sur la survie des clones positifs, mais sur une variation d'un signal qui devra être mesurée en utilisant un appareillage complexe.

Dans la demande de brevet 20040170976 (Scott L.A. et al), il est décrit un système dans lequel l'expression de la protéine d'intérêt sous forme insoluble entraîne un changement d'expression du gène rapporteur, en l'absence de protéine de fusion. Pour ce faire, on utilise un promoteur décrit comme spécifiquement activable si des protéines solubles sont présentes dans la bactérie. Le gène rapporteur placé sous le contrôle de ce promoteur particulier peut être par exemple choisi pour permettre d'observer un signal de fluorescence. Si le gène rapporteur code pour une enzyme, il faudra quantifier le produit des modifications enzymatiques d'un composé substrat. Le taux de protéines rapporteur produites sera directement proportionnel au taux de protéines d'intérêt solubles dans le cytoplasme.

Le brevet US 6,727,070(Thomas P.J. et al) décrit un système de complémentation entre deux fragments d'une même protéine rapporteur: une protéine de fusion réunissant la protéine d'intérêt avec le premier fragment d'une protéine rapporteur qui, par lui-même, n'est pas actif, est utilisée. La deuxième partie du marqueur est exprimée au sein de la cellule hôte à partir du chromosome. Il y a manifestation de l'expression de la protéine rapporteur dans le cas où les deux parties peuvent se complémenter. Cette protéine rapporteur peut être une enzyme, un inhibiteur de protéine, un fluorophore ou un chromophore. Une meilleure solubilité ou un niveau d'expression augmenté peuvent être détectés en utilisant les appareillages nécessaires.

Ainsi, donc, l'observation de la fluorescence, de l'expression d'une enzyme catalysant une réaction, ou la simple survie cellulaire, peut permettre de réaliser une ségrégation entre les types de variants solubles et insolubles d'une bibliothèque de mutants.

Les systèmes basés sur la survie ont sur ceux basés sur la fluorescence ou la colorimétrie la supériorité suivante: elles ne nécessitent pas la mesure d'un signal. Elles permettent donc la sélection directe des mutants souhaités.

La seule technique simple de sélection de mutants de solubilité ou d'expression à être basée sur la survie repose, dans l'art antérieur, sur l'utilisation du gène de résistance au chloramphénicol. Cette approche n'est apparue que dans très peu de documents, ce qui suggère une efficacité faible.

Il est donc utile de développer une technique simple permettant de sélectionner de façon sensible et fiable les mutants de solubilité ou d'expression présents dans une banque.

La présente invention est une technique permettant d'obtenir des mutants d'une protéine ou d'un peptide d'intérêt présentant une solubilité améliorée ou associés à un niveau d'expression supérieur. Le procédé selon l'invention est caractérisé par la génération d'une banque de mutants du gène encodant la protéine ou le peptide d'intérêt fusionné en phase avec le gène de résistance à la kanamycine, et par l'utilisation comme crible sélectif d'un milieu solide ou liquide contenant une concentration de kanamycine stringeante. La kanamycine est un antibiotique peu coûteux et couramment utilisé dans les laboratoires de recherche. Il s'agit d'un bactéricide puissant, agissant indépendamment de la densité bactérienne, et ayant un effet à la fois très intense et très rapide in vitro.

Les variants exprimés sous une forme soluble permettent à la bactérie de survivre en présence de kanamycine. De manière surprenante, contrairement au système de fusion avec la CAT, cette sélection directe par survie est remarquable en ce qu'on obtient une discrimination très nette entre les différents variants de la protéine, ce qui permet la sélection directe des clones exprimant les variants solubles ou mieux exprimés de la protéine ou du peptide d'intérêt.

Ainsi, la présente invention concerne un procédé d'obtention de variants solubles ou mieux exprimés d'une protéine ou d'un peptide d'intérêt, caractérisé par la génération d'une banque de mutants du gène codant pour ladite protéine ou ledit peptide d'intérêt fusionnés au gène de résistance à la kanamycine dans un vecteur d'expression, et par la sélection des gènes mutants correspondant à des protéines ou des peptides plus solubles ou mieux exprimées par culture des bactéries transformées par ladite banque de vecteurs d'expression dans un milieu de culture contenant de la kanamycine. De préférence, le gène code pour une protéine d'intérêt. En particulier, le vecteur d'expression est un vecteur d'expression procaryote. Facultativement, celui-ci peut comprendre les éléments permettant également une expression dans un hôte eucaryote.

Dans un mode de réalisation particulier, le procédé 15 comprend: i) Génération de mutants d'un gène codant pour la protéine ou le peptide d'intérêt; ii) Préparation d'une banque de mutants par clonage des mutants obtenus en i) en phase avec le gène de résistance à la kanamycine dans un vecteur d'expression; iii) Transformation de bactéries compétentes par la banque de mutants obtenue en ii) ; et iv) Sélection, en utilisant un milieu de culture contenant de la kanamycine, des bactéries ayant été transformées par un vecteur comprenant un mutant correspondant à une protéine ou un peptide d'intérêt mutant(e) plus soluble ou mieux exprimé(e) que la protéine d'intérêt de départ.

De préférence, les mutants sont générés à l'étape i) par mutagenèse aléatoire. Dans une alternative également préférée, les mutants sont générés à l'étape i) par recombinaison de gènes.

Dans un autre mode de réalisation, le procédé comprend: i) Fabrication d'un vecteur d'expression contenant le gène codant pour la protéine ou le peptide d'intérêt fusionné en phase avec le gène de résistance à la kanamycine; ii) Génération d'une banque de mutants du gène codant pour la protéine ou le peptide d'intérêt sur le vecteur d'expression obtenu en i) ; iii) Transformation de bactéries compétentes par la banque de mutants obtenue en ii).

iv) Sélection, en utilisant un milieu de culture contenant de la kanamycine, des bactéries ayant été transformées par un vecteur comprenant un mutant correspondant à une protéine ou un peptide d'intérêt mutant(e) plus soluble ou mieux exprimé(e) que la protéine d'intérêt de départ.

De préférence, les mutants sont générés à l'étape ii) par mutagenèse massive.

Facultativement, le gène codant pour la protéine ou le peptide d'intérêt et le gène de résistance à la kanamycine sont séparés par un espaceur ne changeant pas la phase de lecture.

De préférence, les bactéries sont transformées par électroporation ou par choc thermique. Le milieu de culture contenant de la kanamycine peut être solide ou liquide. De préférence, le milieu de culture contient une quantité de kanamycine stringeante. De préférence, le vecteur d'expression est un plasmide.

La présente invention concerne en outre l'utilisation d'un vecteur d'expression codant une protéine de fusion entre un mutant d'une protéine ou d'un peptide d'intérêt et le gène de la résistance à la kanamycine pour sélectionner un variant de cette protéine ou de ce peptide présentant unesolubilité améliorée ou une expression augmentée.

Le procédé de l'invention est un procédé d'obtention ou de sélection de mutants d'une protéine ou d'un peptide d'intérêt plus solubles ou mieux exprimés chez les bactéries, caractérisé par le fait qu'il contient les étapes suivantes dans cet ordre ou dans un ordre différent i) On construit un plasmide contenant le gène d'intérêt, fusionné au gène de résistance à la kanamycine. L'ensemble est placé sous la dépendance d'un promoteur bactérien.

ii) On introduit des mutations au niveau du gène d'intérêt.

iii) On transforme des bactéries compétentes avec ces 15 constructions.

iv) On sélectionne, en utilisant une concentration de kanamycine stringeante, les mutants ayant acquis une solubilité ou un niveau d'expression augmentés.

En particulier, les étapes i) et ii) peuvent être inversées.

Dans un mode de réalisation particulier, on peut éventuellement réaliser une étape supplémentaire iii)bis avant l'étape iv) afin de présélectionner les bactéries ayant intégré un plasmide. On utilise alors la résistance à un antibiotique autre que la kanamycine, tel que l'ampicilline. Dans ce mode de réalisation, le vecteur utilisé devra donc contenir, en plus du gène de résistance à la kanamycine fusionné aux gènes d'intérêt mutants, une cassette d'expression contenant le gène de résistance à l'antibiotique retenu (l'ampicilline par exemple), et le promoteur en permettant l'expression.

Lors de l'étape i), le gène de résistance à la kanamycine peut être fusionné à la protéine en N-terminal ou en C-terminal (figure 1) de la protéine d'intérêt. Dans un mode de réalisation préféré, ce gène de résistance est fusionné en C-terminal de la protéine d'intérêt, la conformation générale de la protéine étant principalement gouvernée par son extrémité NH2. La séquence codante pour le gène de résistance à la kanamycine est bien connu de l'homme du métier. Un exemple de cette séquence est donnée en SEQ ID No 1. Il est entendu qu'un variant ou un fragment conservant l'activité biologique du gène de résistance à la kanamycine peut également être utilisé dans le procédé selon la présente invention.

Dans un mode de réalisation particulier, on insère un espaceur peptidique entre la protéine d'intérêt et le produit d'expression du gène de résistance à la kanamycine afin que les deux protéines soient distantes l'une de l'autre et puissent se replier sans interférer.

L'introduction des mutations à l'étape ii) peut être réalisée en utilisant l'une des méthodes de mutagenèse existantes.

Dans un premier mode de réalisation, on utilise la mutagenèse aléatoire. Dans le cas où aucun élément ne permet de définir a priori la nature et la position des changements susceptibles d'apporter une amélioration de la propriété physique étudiée, il est nécessaire de produire un grand nombre de molécules possédant des mutations de position et de nature différentes, afin de maximiser les chances que se trouve parmi elles une molécule correspondant à une solubilité améliorée. Les mutants sont générés sous forme d'un amplifiat PCR, destiné ensuite à être cloné en phase avec le gène de résistance à la kanamycine (figure 1). Comme dans toute étape de ligation double-brin, on ne peut éviter que certains des clones obtenus soient constitués d'un vecteur religué sur lui-même. Ces clones sont ici très gênants, parce qu'ils seront associés à l'expression du gène de résistance à la kanamycine, et apparaîtront lors de l'étape ultérieure de sélection comme des faux positifs. Il est néanmoins possible de limiter ce taux de faux positifs en effectuant une stratégie de clonage telle que les clones religués sur eux-mêmes ne pourront pas s'exprimer, par manque de codon initiateur ou de promoteur, par exemple, ceux-ci étant alors présent dans le fragment à cloner. Ces méthodes sont bien connues de l'homme du métier. Cependant, ces man uvres compliquent la stratégie de clonage.

Dans un deuxième mode de réalisation, on utilise la recombinaison d'ADN pour générer la diversité. Cette approche s'apparente à la mutagenèse aléatoire parce qu'on ne maîtrise pas précisément la diversité que l'on introduit, mais en diffère cependant parce que ladite diversité est sélectionnée pour contenir un taux important de mutations améliorantes. En effet, seules les mutations présélectionnées par la nature pour conserver au moins une partie de l'activité sont retenues. Comme dans le cas de la mutagenèse aléatoire, une étape de ligation double-brin est généralement nécessaire, avec les conséquences en terme de taux de faux positifs décrits précédemment.

Dans un troisième mode de réalisation, on peut utiliser la mutagenèse dirigée pour générer la diversité.

La mutagenèse dirigée permet d'introduire des mutations d'une façon parfaitement précise, mais à un faible débit.

Un avantage supplémentaire de la mutagenèse dirigée dans le contexte est l'absence d'étape de ligation double brin, et le taux de faux positifs est donc limité. Cependant, la génération des mutants un par un n'est pas vraiment adaptée à un système de criblage ultérieur par sélection directe sur le critère de la survie. De plus, la connaissance des sites de mutations pour l'augmentation de la solubilité d'une protéine est une situation peu courante. La mutagenèse dirigée n'est donc pas la technique idéale pour l'amélioration du caractère soluble d'un polypeptide.

Dans un quatrième mode de réalisation, on peut utiliser Massive Mutagenesis (FR2813314). Ce procédé combine les avantages de la mutagenèse dirigée (contrôle de la nature des modifications obtenues en une position donnée), et de la mutagenèse aléatoire (obtention d'un grand nombre de mutations différentes réparties sur de nombreuses positions du fragment d'ADN à muter). Comme la mutagenèse dirigée, cette technique n'intègre pas d'étape de ligation double-brin, ce qui est positif dans le contexte de l'invention pour éviter de produire des clones faux-positifs.

Lors de l'étape iii), la transformation peut être réalisée selon différentes techniques et principalement en utilisant une approche par choc thermique ou par électroporation. C'est notamment la taille de la diversité à obtenir qui orientera sur l'une ou l'autre de ces deux approches: la technique par électroporation permet en effet d'obtenir un nombre de transformants supérieur.

De même, différents types de bactéries peuvent être utilisés tels que E. coli, Streptomyces et Bacillus. Le choix se fera selon les conditions de culture, la protéine à exprimer et la quantité à produire. Dans le mode de réalisation le plus classique, c'est E. Coli qui est le plus souvent utilisé (figure 3).

A l'étape iv), on aura préalablement déterminé la concentration stringeante de kanamycine à ajouter. Cette concentration sera déterminée par des tests utilisant la construction plasmidique contenant le gène d'intérêt non mutant fusionné au gène de résistance à la kanamycine. La concentration stringeante sera suffisamment élevée pour ne plus permettre aux bactéries transformées par cette construction de pousser, ou pour ne leur permettre qu'une croissance ralentie. Dans ces conditions, les bactéries exprimant un variant plus soluble auront un taux de croissance accéléré. Dans un premier mode de réalisation, les cultures de la banque de mutants transformés seront faites en milieu liquide: la sélection des mutants les plus solubles se fera alors selon la vitesse de pousse (figure 4). Dans un deuxième mode de réalisation, elles peuvent aussi se faire en milieu solide: la sélection se fera en fonction du nombre et de la taille des colonies (figure 3).

Dans un premier mode de réalisation, la mutagenèse est réalisée par mutation aléatoire, et le fragment contenant les gènes d'intérêt mutants est introduit en 5' du gène de résistance à la kanamycine: Une molécule d'ADN contenant le gène à muter est amplifiée dans des conditions particulières altérant les capacités de l'enzyme à répliquer fidèlement l'ADN. Celle- ci introduit au fil des cycles des mutations, c'est-à-dire des différences par rapport à la séquence initiale. A la fin de la réaction, un grand nombre de copies de la molécule initiale est obtenu, chacune de ces molécules comportant des mutations différentes. Ces molécules sont présentes sous forme de banque, c'est-à-dire d'un mélange de molécules de nature différente (différant par la nature et la position de leurs mutations). Cette banque de molécules linéaires est introduite en 5' du gène de résistance à la kanamycine, en prenant garde à ce que le taux de molécules de vecteur religué sur lui même, susceptible d'exprimer le gène de résistance à la kanamycine, soit minimal.

Après transformation, les bactéries sont mises en présence d'une concentration sélective de kanamycine permettant de différencier les variants solubles des variants insolubles, préalablement déterminée. Seules les cellules exprimant un variant soluble peuvent survivre.

Dans un second mode de réalisation, la mutagenèse est réalisée en utilisant Massive Mutagenesis . Un plasmide est d'abord construit (figure 2), contenant une origine de réplication, un gène de résistance à l'ampicilline, et le gène d'intérêt fusionné en 5' et en phase avec le gène de résistance à la kanamycine.

- La matrice est préparée en utilisant un kit de préparation d'ADN plasmidique adapté.

- Les oligonucléotides mutants sont synthétisés.

- La matrice est mélangée avec l'ensemble des 20 oligonucléotides mutants.

- La matrice est dénaturée par la chaleur de façon à disposer temporairement d'ADN simple-brin. Lors du retour à une température plus basse, certains ou tous les oligonucléotides présents dans le mélange se fixent sur la matrice au niveau de leur site d'homologie.

- Tous les éléments nécessaires pour réaliser une réplication de la matrice à partir des oligonucléotides mutants sont ajoutés, et notamment une polymérase, le tampon permettant son activité, des nucléotides triphosphates en quantité suffisante, les cofacteurs nécessaires. La réaction de réplication a ensuite lieu dans les conditions de température correspondant à l'activité maximale de la polymérase soit 68 C. L'objectif est de disposer de mutants contenant chacun des combinaisons de plusieurs mutations dirigées différentes.

Des bactéries E. coli utilisées comme cellules hôtes sont transformées. Les clones obtenus sont ensuite mis en culture dans un milieu contenant de l'ampicilline afin de ne sélectionner que les bactéries ayant intégré un plasmide.

Les bactéries ainsi présélectionnées sont ensuite incubées dans un milieu contenant une concentration stringeante de kanamycine, de façon à ce que seules les cellules exprimant un variant présentant une solubilité améliorée ou un niveau d'expression supérieur survivent.

Les protéines ou peptides d'intérêt peuvent être par exemple des enzymes industrielles, - utilisées dans les industries textiles, agroalimentaires et chimiques notamment -, ou des anticorps recombinants, en particuler des anticorps à chaîne unique.

Descripion des Figures: Figure 1: Schéma représentant la préparation d'une banque de mutants de la protéine ou du peptide d'intérêt. Dans un premier temps, une banque de mutants est préparée (mutagenèse) puis cette banque est clonée en phase avec le gène de résistance à la kanamycine dans un vecteur (insertion dans un plasmide).

Figure 2: Schéma représentant la préparation d'une banque de mutants de la protéine ou du peptide d'intérêt. Dans un premier temps, le gène codant la protéine ou le peptide d'intérêt est cloné en phase avec le gène de résistance à la kanamycine dans un vecteur (insertion dans un plasmide), puis une banque de mutants est préparée (mutagenèse).

Figure 3: Schéma représentant la transformation des bactéries compétentes par la banque de mutants de la protéine ou du peptide d'intérêt suivie par la culture en milieu solide sélectif contenant la kanamycine.

Figure 4: Schéma représentant la transformation des bactéries compétentes par la banque de mutants de la protéine ou du peptide d'intérêt suivie par la culture en milieu liquide sélectif contenant la kanamycine.

Figure 5: Schéma représentant le contrôle négatif.

Figure 6: Graphique représentant la résistance à la kanamycine des bactéries transformées avec ContK, Pet23, TA2K ou TB2K6 (résultats de l'exemple 1).

Figure 7: Graphique représentant la résistance au chloramphénicol des bactéries transformées avec ContCam, Pet+Cam, TA2Cam ou TB2Cam (résultats de l'exemple comparatif de l'exemple 1).

Figure 8: Tableau représentant les résultats de

l'exemple 2.

Les exemples qui suivent illustrent la présente demande.

Exemple 1: la protéine Fe65-PTB2 Les gènes codant pour un variant soluble et un variant insoluble de la protéine FE65-PTB2 ont été introduits dans le plasmide petll. La construction a été faite de façon à fusionner ladite protéine à un gène de résistance à la kanamycine, en l'absence d'espaceur peptidique. Le vecteur possède par ailleurs un gène de résistance à l'ampicilline.

On a obtenu différentes constructions: - Pet: plasmide petll qui est à la base des différentes constructions; il ne contient pas de gène de résistance à la kanamycine et sert donc de contrôle négatif (figure 5).

- ContK: plasmide petll sur lequel a été cloné le gène de résistance à la kanamycine (SEQ ID Nos 1 et 2); cette construction sert de contrôle positif.

- TA2K: plasmide petll sur lequel a été cloné une protéine de fusion TA2gène de résistance à la kanamycine (SEQ ID Nos 3 et 4); la protéine TA2 est un variant insoluble de la protéine prise comme modèle.

TB2K: plasmide petll sur lequel a été cloné une protéine fusion TB2-gène de résistance à la kanamycine (SEQ ID Nos 5 et 6); la protéine TB2 est un variant soluble de la protéine prise comme modèle.

Des bactéries E. Coli BL21 DE3 ont ensuite été transformées par choc thermique, puis incubées en milieu liquide contenant de l'ampicilline à 100ul/ml à 37 C pendant 12h.

Après 12h de culture, 10-9 UOD ont été utilisées pour ensemencer des cultures contenant une concentration variable de kanamycine.

On a testé une gamme d'antibiotique kanamycine allant de 100pg/ml à 0, 75pg/ml afin de trouver la concentration stringeante pour cet ensemble de mutants, c'est-à-dire la concentration permettant de différencier les mutants présentant une plus grande solubilité.

On a incubé les cultures et mesuré la DO au 25 spectrophotomètre à 600nm, de façon à mesurer la croissance bactérienne.

On a alors constaté une différence de résistance d'un facteur 2,7 entre le variant soluble (demi-résistance = 90 pg / ml) et le variant insoluble (demi-résistance = 33 pg / ml) (figure 6).

Afin de pouvoir réaliser une comparaison, on a effectué la même expérience avec le gène de résistance au chloramphénicol.

Contcam: plasmide petll sur lequel a été cloné le gène de résistance au chloramphénicol (SEQ ID Nos 7 et 8); cette construction sert de contrôle positif.

- TA2cam: plasmide petll sur lequel a été cloné une protéine de fusion TA2-gène de résistance au chloramphénicol (SEQ ID Nos 9 et 10); la protéine TA2 est un variant insoluble de la protéine prise comme modèle.

TB2cam: plasmide petll sur lequel a été cloné une protéine de fusion TB2gène de résistance au chloramphénicol (SEQ ID Nos 11 et 12); la protéine TB2 est un variant soluble de la protéine prise comme modèle.

L'expérience a été réalisée suivant les mêmes étapes que pour l'antibiotique kanamycine.

Les différentes cultures bactériennes ont été ensemencées à 10-4 UOD / ml (préalablement testé comme représentant l'ensemencement minimum).

Une gamme de chloramphénicol allant de 100pg/ml à 12,3pg/ml a été testée afin de trouver la concentration stringeante pour ce mélange de mutants, c'est-à-dire la concentration permettant de différencier les mutants présentant une plus grande solubilité.

Les cultures ont été incubées et la DO a été mesurée au spectrophotomètre à 600nm, de façon à mesurer la croissance bactérienne.

Dans cette expérience, on a constaté une résistance au chloramphénicol accrue d'un facteur 1,4 du variant soluble de la protéine (demirésistance = 35pg/ml) par rapport au variant insoluble (demi-résistance = 25 pg/ml) (figure 7).

Ces résultats ont démontré que le gène de résistance à la kanamycine est utilisable comme rapporteur de la solubilité d'une protéine lui étant fusionnée. Le gène de résistance à la kanamycine est bien meilleur que le gène de résistance au chloramphénicol, pour lequel on constate que la fenêtre de variation de résistance des deux variants n'est pas très étendue et ne permet donc pas la sélection de mutants au sein d'une banque.

Exemple 2:

Afin d'appliquer la technique au criblage d'une banque de mutants, on a réalisé la même expérience que précédemment mais avec un mélange réunissant les deux variants: soluble et non soluble.

La concentration stringeante de kanamycine déterminée dans l'exemple 1 est utilisée afin de ne sélectionner que les mutants exprimant la protéine soluble.

Les cultures ont été réalisées en milieu solide afin de pouvoir comptabiliser les colonies.

Plusieurs types de cultures ont été réalisées: une culture avec uniquement le variant exprimant la protéine soluble, une culture avec uniquement le variant exprimant la protéine insoluble et plusieurs cultures avec des mélanges des deux variants dans différentes proportions (figure 8).

On a obtenu un nombre de colonies proportionnel au mélange de protéines: pour un ensemencement ne contenant que des clones exprimant la protéine soluble, on a obtenu 17000 colonies; pour un ensemencement ne contenant que des clones exprimant la protéine non soluble, on a obtenu 4 colonies; pour un ensemencement réunissant 10% de clones exprimant la protéine soluble et 90% de clones exprimant la protéine insoluble, on a obtenu 4000 colonies.

Cette technique a permis de mettre en évidence la présence de mutants exprimant une protéine soluble dans un mélange de variants à une proportion pouvant descendre jusqu'à 0,1%.

Exemple 3:

Dans le but de créer des mutants solubles d'une protéine d'intérêt, on réalise une banque de mutants d'un plasmide construit de telle sorte que le gène de résistance à la kanamycine soit fusionné en phase et en Cterminal de celui permettant d'exprimer la protéine d'intérêt.

La mutagenèse est réalisée en utilisant la technologie Massive Mutagenesis - Le plasmide est mélangé avec un ensemble 15 d'oligonucléotides mutants.

- Le mélange est dénaturé par la chaleur.

- Tous les éléments nécessaires à réaliser une réplication de la matrice à partir des oligonucléotides mutants sont ajoutés.

Les bactéries E. coli utilisées comme cellules hôtes sont transformées par électroporation. Les clones obtenus sont ensuite mis en culture en milieu liquide en présence d'ampicilline, de façon à présélectionner les bactéries ayant effectivement intégré un plasmide. La culture est ensuite utilisée pour ensemencer un milieu liquide contenant une concentration stringeante de kanamycine, préalablement déterminée, de façon à sélectionner les cellules exprimant un variant soluble.

Exemple 4:

Dans le but d'identifier des mutants solubles d'une protéine d'intérêt, on génère dans un premier temps de la diversité par mutagenèse aléatoire: une molécule d'ADN contenant le gène à muter est amplifiée par "error- prone PCR". Les molécules obtenues sont clonées dans un plasmide construit de façon à ce que les gènes mutants soient fusionnés en phase et en 5' du gène de résistance à la kanamycine.

La banque de mutants est ensuite criblée comme exposé dans l'exemple précédent, ou en utilisant un milieu solide pour différencier sur le critère du nombre ou de la taille les colonies correspondant à un variant plus soluble de la protéine d'intérêt.

Exemple 5:

Dans le but de créer des mutants solubles d'une protéine d'intérêt, on réalise une banque de mutants d'un plasmide construit de telle sorte que le gène de résistance à la kanamycine soit fusionné en C-terminal de celui permettant d'exprimer la protéine d'intérêt.

On réalise des mutations par recombinaison d'ADN sur le gène d'intérêt: On isole plusieurs gènes homologues entre eux, correspondant à l'activité recherchée.

- On amplifie ces gènes au moyen d'oligonucléotides flanquants, en utilisant des cycles d'amplification très courts (STEP).

- On clone le fragment d'ADN obtenu de telle sorte que les gènes mutants soient fusionnés en phase et en 5' du gène de résistance à la kanamycine présent sur le vecteur.

La banque de mutants est ensuite criblée comme exposé dans l'exemple précédent.

Claims

REVENDICATIONS

1) Procédé d'obtention de variants solubles ou mieux exprimés d'une protéine ou d'un peptide d'intérêt, caractérisé par la génération d'une banque de mutants du gène codant pour ladite protéine ou ledit peptide d'intérêt fusionnés au gène de résistance à la kanamycine dans un vecteur d'expression, et par la sélection des gènes mutants correspondant à des protéines ou des peptides plus solubles ou mieux exprimées par culture des bactéries transformées par ladite banque de vecteurs d'expression dans un milieu de culture contenant de la kanamycine.

2) Procédé selon la revendication 1, caractérisé 15 en ce que le procédé comprend: i) Génération de mutants d'un gène codant pour la protéine ou le peptide d'intérêt; ii) Préparation d'une banque de mutants par clonage des mutants obtenus en i) en phase avec le gène de résistance à la kanamycine dans un vecteur d'expression; iii) Transformation de bactéries compétentes par la banque de mutants obtenue en ii) ; et iv) Sélection, en utilisant un milieu de culture contenant de la kanamycine, des bactéries ayant été transformées par un vecteur comprenant un mutant correspondant à une protéine ou un peptide d'intérêt mutant(e) plus soluble ou mieux exprimé(e) que la protéine d'intérêt de départ.

3) Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que les mutants sont générés à l'étape i) par mutagenèse aléatoire.

4) Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que les mutants sont générés à l'étape i) par recombinaison de gènes.

5) Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce 10 que le procédé comprend: i) Fabrication d'un vecteur d'expression contenant le gène codant pour la protéine ou le peptide d'intérêt fusionné en phase avec le gène de résistance à la kanamycine; ii) Génération d'une banque de mutants du gène codant pour la protéine ou le peptide d'intérêt sur le vecteur d'expression obtenu en i) ; iii) Transformation de bactéries compétentes par la banque de mutants obtenue en ii).

6) Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que les mutants sont générés à l'étape ii) par mutagenèse massive.

7) Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que le vecteur d'expression est constitué, de telle sorte que le gène codant pour la protéine bu le peptide d'intérêt soit situé en 5' du gène de résistance à la kanamycine.

8) Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que le gène codant pour la protéine ou le peptide d'intérêt et le gène de résistance à la kanamycine sont séparés par un espaceur ne changeant pas la phase de lecture.

9) Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que les bactéries sont transformées 15 par électroporation ou par choc thermique.

10) Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisé en ce que le milieu de culture contenant de la kanamycine est solide ou liquide.

11) Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, caractérisé en ce que le milieu de culture contient une quantité de kanamycine stringeante.

12) Utilisation d'un vecteur d'expression codant une protéine de fusion entre un mutant d'une protéine ou d'un peptide d'intérêt et le gène de la résistance à la kanamycine pour sélectionner un variant de cette protéine ou de ce peptide présentant une solubilité améliorée ou une expression augmentée.