FR2822552A1 - Microscope pour objets diffractants - Google Patents

Abstract

L'invention concerne un microscope pour l'observation d'objets diffractants comportant un faisceau laser (2000) réfléchi par une première face des miroirs galvanométriques (2003) et (2007), traversant le condenseur (2011), l'échantillon (2040), l'objectif (2013), réfléchi par une seconde face des miroirs galvanométriques, traversant une lame demi onde percée (2019) et des lames tiers d'onde (2022) (2027) permettant l'application de décalages de phase à la seule partie non diffractée de l'onde, et détecté par plusieurs caméras (2024) (2029) (2032). Applications : microscopie 3D et 2D rapide, en biologie et étude des matériaux.

Description

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Microscope pour objets diffractants Domaine de l'invention :
L'invention concerne un microscope pour l'observation d'objets diffractants.

Technique antérieure.

Des images de résolution élevée, de profondeur de champ très faible ou très élevée, peuvent être obtenues au moyen du microscope décrit dans la publication suivante : [Lauer Il :"Observation of biological objects using an optical diffraction tomographic microscope", par Vincent Lauer, proceedings of SPIE vol. 4164 p. 122-133.

Toutefois l'appareil décrit dans cette publication permet difficilement l'imagerie en temps réel.

Dans un microscope fonctionnant en transmission et dans lequel l'onde d'éclairage n'est pas focalisée en un point particulier de l'échantillon, il est utile de pouvoir modifier indépendamment la partie diffractée de l'onde d'éclairage et la partie non diffractée de cette onde. Le microscope à contraste de phase, par exemple, est basé sur ce principe. Toutefois, dans un microscope à contraste de phase, le décalage de phase appliqué au moyen d'un anneau de phase affecte la partie non diffractée de l'onde, mais également une partie non négligeable de l'onde diffractée. Il s'ensuit des perturbations importantes de l'image, par exemple le phénomène de halo ou le fait que la profondeur de champ est mal définie et supérieure à ce qu'elle est en fond clair, la qualité d'image en général étant très inférieure à celle obtenue au moyen du microscope décrit dans [Lauer 1].

En fond clair, l'image formée par un microscope classique a par ailleurs une résolution effective qui est inférieure de moitié au maximum théorique atteint par exemple dans [Lauer 1].

Description de l'invention :
L'invention a pour objet un microscope dont les performances en termes de résolution et de profondeur de champ sont similaires à celles de celui décrit dans [Lauer 1], mais qui permet l'obtention d'images en temps réel et en couleurs, pour un coût acceptable.

L'invention consiste en un microscope fonctionnant en transmission, dans lequel le faisceau d'éclairage n'est pas focalisé sur un point observé de l'objet, caractérisé par le fait qu'il comporte : - un déflecteur de faisceau A plaçé entre la source d'éclairage et le condenseur, et permettant de modifier la direction de l'onde d'éclairage dans l'échantillon, - un déflecteur de faisceau B plaçé entre l'objectif et le détecteur, et permettant de modifier la direction de l'onde issue de l'échantillon et ayant traversé l'objectif.

Le détecteur peut typiquement être une caméra ou la rétine de l'oeil. Le déflecteur A a pour utilité de faire varier les conditions d'éclairage. Par exemple, la source d'éclairage peut être un faisceau laser. En éclairant l'ensemble de l'échantillon et en faisant varier les conditions d'éclairage au cours du temps, on obtient en moyenne temporelle un éclairage à peu près équivalent à un éclairage incohérent. Le déflecteur B a pour utilité de défléchir le faisceau collecté par l'objectif, de manière à ce que la partie de ce faisceau qui

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n'a pas été diffractée par l'objet observé retrouve des caractéristiques à peu près constantes après passage du déflecteur B. Cette partie non diffractée du faisceau, après passage du déflecteur B, peut être focalisée dans un plan intermédiaire ou elle parviendra donc, moyennant une utilisation appropriée du déflecteur B, en un point à peu près fixe, ou mobile dans une zone réduite. Dans ce plan intermédiaire il est possible de plaçer différents dispositifs permettant par exemple d'augmenter la résolution ou de changer de mode d'observation.

Par exemple, il est possible de placer dans ce plan intermédiaire un dispositif de différenciation pour appliquer une modification moyenne de phase et/ou d'atténuation et/ou de polarisation différente à la partie non diffractée de l'onde d'éclairage et à l'onde diffractée par l'objet observé. Ce dispositif agit donc différemment sur la partie non diffractée de l'onde d'éclairage et sur la partie diffractée de l'onde. Ceci est rendu possible par le fait que la partie non diffractée du faisceau parvient à un point à peu près fixe dans le plan intermédiaire. Si le dispositif de différenciation est, par exemple, une vitre portant une surépaisseur sur une zone réduite comprenant l'ensemble des points atteints par la partie non diffractée de l'onde, alors le décalage de phase produit par cette surépaisseur affecte essentiellement la partie non diffractée de l'onde.

On réalise donc de cette manière un contraste de phase amélioré du fait que le décalage de phase n'affecte que la partie non diffractée de l'onde. La qualité d'image est également améliorée du fait que l'onde d'éclairage peut balayer, au cours du temps, l'ensemble du plan focal du condenseur, alors que dans un microscope à contraste de phase l'onde d'éclairage est nulle dans ce plan en dehors d'un anneau transparent.

Si le dispositif de différentiation modifie l'amplitude et non la phase, on obtient une image en fond clair mais dont le contraste peut être renforcé. Si le dispositif de différentiation absorbe totalement la partie non diffractée de l'onde, on obtient une image en fond noir. Si le dispositif de différentiation modifie la direction de polarisation, cette modification de polarisation peut ultérieurement être transformée, au moyen d'un polariseur ou d'une lame d'onde par exemple, en modification de phase ou d'atténuation. Un tel dispositif permet alors un passage continu du fond clair au fond noir et au contraste de phase.

Dans le plan intermédiaire plaçé après le déflecteur B, il est également possible de plaçer une lame filtrante dont la transmissivité dépend de la distance à l'axe optique. De préférence la transmissivité augmente avec la distance à l'axe optique. Ceci permet d'augmenter la résolution du microscope.

On peut utiliser un éclairage laser, mais il est également possible d'utiliser un éclairage en lumière blanche. Par exemple, on peut utiliser une onde incohérente limitée, dans le plan focal objet du condenseur, à une petite zone en forme de disque, qui se déplace dans le plan focal du fait du déflecteur A. On peut ramener cette onde, au moyen de l'ensemble B, à une zone à peu près fixe du plan intermédiaire, dans laquelle il peut lui être appliqué par exemple un décalage de phase différent de celui appliqué en moyenne à l'onde diffractée. On peut aussi utiliser une onde cohérente ou incohérente limitée dans un plan pupillaire par la traversée de plusieurs trous, l'ensemble de ces trous étant mobiles dans un plan pupillaire. En ramenant, au moyen de l'ensemble B, l'onde directement issue de chacun de ces trous vers autant de points fixes, et en utilisant un dispositif d'atténuation ou de retardement occupant une zone réduite autour de chaque point fixe, on obtient un effet similaire, avec d'avantage de perturbations mais également avec d'avantage de luminosité.

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L'invention ne concerne pas les microscopes à balayage dans lesquels l'onde d'éclairage est focalisée en un point observé de l'objet. En effet, dans le cas ou l'onde d'éclairage est focalisée en un point observé de l'objet, ce point affecte la totalité de l'onde et il est donc difficile de différencier ensuite (au moins en ce point) une onde diffractée d'une onde non diffractée. Par contre, l'onde d'éclairage peut ne pas être plane. Dès lors qu'une partie importante du plan sur lequel l'objectif est focalisé se trouve éclairée, il est possible de différencier ultérieurement l'onde d'éclairage de l'onde diffractée.

Toutefois, selon une version préférée de l'invention, l'onde d'éclairage est une onde plane (cas de l'onde plane cohérente) ou une somme d'ondes planes non corrélées (cas de l'onde incohérente constituant une somme d'ondes planes incohérentes entre elles). Dans ce cas, le plan intermédiaire peut avantageusement se trouver dans un plan conjugué au plan focal image de l'objectif de microscope. Si par exemple l'onde d'éclairage est une onde plane, elle est focalisée en un point précis du plan intermédiaire, ce qui permet de la différencier plus facilement de l'onde diffractée. Si elle est une somme d'ondes planes, elle peut être aisément limitée à une portion réduite du plan focal objet du condenseur et donc à une portion réduite du plan intermédiaire.

Pour que l'efficacité du système soit maximale, il est préférable que lesdits déflecteurs de faisceau A et B soient commandés ou disposés de manière à ce que la direction de l'onde d'éclairage dans l'échantillon soit variable et de manière à ce que la partie non diffractée de l'onde d'éclairage parvienne en un point fixe dudit plan intermédiaire. En effet, si la partie non diffractée de l'onde d'éclairage parvient en un point fixe, le dispositif de différentiation plaçé en ce point peut différencier une surface très réduite autour de ce point, ce qui évite qu'une partie de l'onde diffractée ne soit pas différenciée de l'onde non diffractée.

On peu utiliser divers types de déflecteurs. Par exemple il est possible d'incorporer des déflecteurs accousto-optiques. Toutefois, les déflecteurs qui créent le moins de perturbations parasites sont les miroirs mobiles, par exemple des mirois galvanométriques.

L'obtention d'une position fixe du point auquel parvient la partie non diffractée de l'onde nécessite, si les déflecteurs A et B sont indépendants, une commande très précise de chacun de ces déflecteurs. Ce problème peut être résolu si chaque miroir mobile dudit déflecteur B est confondu avec un miroir mobile correspondant dudit déflecteur A, ou est solidaire d'un miroir mobile correspondant dudit déflecteur A. En effet, dans ce cas, la déflexion par B est proportionnelle à la déflexion par A, et moyennant un système optique approprié elle peut compenser exactement la déflexion par A. Ceci permet d'éviter toute commande complexe des miroirs galvanométriques, la compensation se faisant automatiquement et de manière purement optique.

La partie non diffractée par l'échantillon observé de l'onde, ayant été défléchie successivement par les ensembles A et B, a une diection constante. Cette propriété est utile en ce qu'elle permet l'application d'un décalage de phase et/ou d'une atténuation à cette partie de l'onde seulement. Par contre, en particulier si l'onde d'éclairage est issue d'un faisceau laser intense, l'observation directe de cette onde est dangereuse.

En effet, cette onde est susceptible de se focaliser en un point fixe de la rétine et de causer des lésions.

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De plus, si les miroirs de l'ensemble B ne sont pas placés dans exactement dans des plans images, la déflexion sur ces miroirs s'accompagne d'une translation de l'image qui dépend de l'orientation des miroirs et qui perturbe donc l'image finale obtenue à partir d'une série d'orientations différentes des miroirs.

Pour éviter cette perturbation, les miroirs de l'ensemble B peuvent être plaçés dans des plans images.

Toutefois, cette solution est peu robuste, une translation accidentelle d'un miroir de l'ensemble B pouvant se traduire par une perturbation gênante de l'image.

Selon une version de l'invention, ces deux problèmes sont résolus au moyen d'un déflecteur C permettant de modifier la direction de l'onde provenant de l'échantillon après qu'elle ait été défléchie par ledit déflecteur B. En effet, le déflecteur C permet de faire varier au cours du temps la direction de la partie non diffractée de l'onde après déflexion sur les ensembles A, B et C. Ceci permet une observation directe dans de meilleures conditions de sécurité, le faisceau laser ne pouvant pas être focalisé sur un point fixe. Par ailleurs, une configuration optique appropriée permet de compenser exactement, au moyen du déflecteur C, les translations de l'image qui accompagnent la déflexion sur l'ensemble B.

Si l'ensemble C est indépendant de l'ensemble B, la commande de ce déflecteur doit être parfaitement synchronisée avec la commande du déflecteur B. Cette difficulté est résolue si : - ledit déflecteur C est un miroir mobile ou un couple de miroirs mobiles, - chaque miroir mobile dudit déflecteur C est confondu avec un miroir mobile correspondant dudit déflecteur B, ou est solidaire d'un miroir mobile correspondant dudit déflecteur B.

En effet, dans ce cas, la déflexion par le déflecteur C est proportionnelle à la déflexion par le déflecteur B, et moyennant une configuration appropriée du système optique elle peut compenser exactement la déflexion par le déflecteur B.

De préférence, chaque miroir mobile dudit déflecteur C est réalisé sur la face opposée d'un miroir mobile correspondant dudit déflecteur B. Cette configuration est la plus robuste. En effet, elle évite de superposer sur le même trajet optique deux faisceaux de direction opposée, ce qui serait susceptible de créer des perturbations dûes aux réflexions parasites.

Le système peut être modifié pour générer des images en profondeur de champ étendue. Le mode "profondeur de champ étendue"correspond à la génération d'images dont la profondeur de champ est augmentée à résolution constante. Un fonctionnement en profondeur de champ étendue peut être obtenu, au moyen de la présente invention, en utilisant un masque plaçé dans le plan focal image de l'objectif, ou dans un plan image de ce plan focal qui est plaçé sur la trajectoire du faisceau avant la déflexion par ledit déflecteur B ou après la déflexion par ledit déflecteur C, qui est absorbant partout sauf sur une bande de forme elliptique. Le déflecteur A doit alors être commandé pour obtenir une onde traversant ce plan focal en un point de la bande elliptique qui se déplace sur l'ensemble de la bande. Moyennant un choix approprié des dimensions de cette bande elliptique, une image en profondeur de champ étendue est obtenue. Par exemple, si cette bande est un anneau centré sur l'axe optique, on obtient une projection de l'échantillon suivant l'axe optique. Si cette bande est un anneau légèrement décentré, la direction de projection est légèrement inclinée.

Si cette bande est fortement décentré, son ellipticité soit être calculée de manière appropriée, moyennant

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quoi on obtient une projection de l'échantillon suivant une direction fortement inclinée. Plus cette bande est fine, plus la profondeur de champ est importante.

Toutefois, sur une telle projection, l'onde diffractée tend à être fortement atténuée du fait que la plus grande partie de cette onde est arrêtée par ledit masque, alors que la partie non diffractée de l'onde n'est pas arrêtée par ledit masque. Il est donc nécessaire d'atténuer également la partie non diffractée de l'onde.

Ceci peut être fait au moyen d'un atténuateur plaçé au point fixe atteint par la partie non diffractée de l'onde d'éclairage après redirection par le déflecteur B.

Il est possible d'effectuer l'acquisition, avec une seul caméra, d'une image de type fond clair ou contraste de phase . Toutefois, il est également possible d'utiliser au moins trois caméras, enregistrant chacune une image correspondant à un décalage de phase et/ou un rapport entre atténuations différent entre la partie diffractée et la partie non diffractée de l'onde d'éclairage. En effet, dans ces conditions, il est possible de recalculer à partir de ces images une image complexe caractérisant à la fois les variations d'indice et d'absorptivité de l'objet, et dépendant linéairement de l'onde diffractée sans perturbations du second ordre. Cette image est plus précise et plus directement interprétable que l'image obtenue avec une seule caméra. La solution la plus simple est d'utiliser trois caméras, le décalage de phase entre onde diffractée et partie non diffractée de l'onde d'éclairage étant respectivement et à une constante près de 0,120 et-120 degrés pour l'image formée sur caque caméra.

De plus, une image tridimensionnelle de l'objet observé peut alors être obtenue sans déplacer l'objet observé. Pour cela, on effectue l'acquisition d'une série d'images correspondant chacune à une direction donnée de l'onde d'éclairage. A partir de cette série d'images, et moyennant des calculs appropriés, on peut reconstituer une représentation tridimensionnelle de l'objet.

Les décalages de phase et/ou atténuations de la partie non diffractée de l'onde peuvent être obtenus de diverses manières, toutefois une méthode particulièrement efficace consiste à utiliser comme dispositif de différentiation une lame faisant tourner de 90 degrés la polarisation du faisceau entrant, perçée d'un trou coïncidant avec le point fixe du plan intermédiaire ou est focalisée la partie non diffractée de l'onde d'éclairage, ce trou étant rempli d'un matériau isotrope d'indice proche de celui de la lame. Cet élément biréfringent permet de polariser différemment l'onde diffractée et la partie non diffractée de l'onde d'éclairage. Ces deux ondes peuvent ensuite être décalées en phase l'une par rapport à l'autre au moyen d'une lame retardatrice, et leur intensité relative peut être modifiée au moyen d'un polariseur mobile en rotation. La lame retardatrice peut éventuellement être remplaçée par un ensemble à décalage de phase variable. De préférence, le trou perçé dans l'élément biréfringent doit être rempli d'un matériau d'indice optique proche de l'indice moyen de l'élément biréfringent. En effet, dans le cas contraire, le système présenterait des dysfonctionnements importants en lumière polychromatique, dûs au fait que la partie de l'onde traversant le trou serait décalée en phase de plusieurs longueurs d'onde par rapport à la partie de l'onde ne traversant pas le trou.

Description rapide des figures.

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La Fig. 1 est un schéma d'ensemble d'un premier mode de réalisation. La Fig. 2 est un schéma d'une lame demi onde percée utilisée dans ce mode de réalisation. La Fig. 3 représente la trajectoire du point d'impact de l'onde d'éclairage dans un plan pupillaire, pendant le temps d'intégration des capteurs, pour l'obtention d'une coupe de l'objet à l'aide de ce microscope. La Fig. 4 représente en coupe la représentation fréquentielle bidimensionnelle obtenue par transformation de Fourier de l'image obtenue pour une onde d'éclairage plane donnée, ainsi que la partie de la représentation fréquentielle tridimensionnelle de l'objet dont elle est la projection. La Fig. 5 représente un système d'éclairage pouvant remplacer le laser. La Fig. 6 représente un système de détection à une caméra pouvant remplaçer le système de détection à trois caméras décrit sur la figure 1. La Fig. 7 représente un masque elliptique utilisé pour obtenir une projection de l'objet observé. La Fig. 8 représente un système de détection sans lames d'onde pouvant remplaçer le système de détection décrit sur la figure 1. La Fig. 9 représente un système de détection à une caméra placée dans un plan pupillaire. La Fig. 10 sert de support au calcul des caractéristiques de bandes elliptiques utilisées sur le masque de la Fig. 7. La Fig. 11 représente le masque de la Fig. 7 à l'échelle et pour un cas particulier de réalisation. La Fig. 12 représente une lame filtrante permettant d'atténuer la partie non diffractée de l'onde dans le cas ou le masque de la Fig. 7 est utilisé. La Fig. 13 représente une lame générant un décalage de phase de la partie non diffractée de l'onde d'éclairage. La Fig. 14 représente un système de détection à une caméra dans lequel l'image acquise peut être directement affichée sur un écran. La Fig. 15 représente un dispositif d'observation directe à l'aide d'un oculaire.

La Fig. 16 représente une vue de coté d'un ensemble de trois miroirs également représentés sur la figure 17. La figure 17 représente un mode de réalisation amélioré, plus particulièrement adapté à l'observation directe par des oculaires. La figure 18 représente les électrodes d'un rotateur de polarisation utilisé pour l'observation stéréoscopique. La figure 19 représente la réponse fréquentielle d'un microscope en fond clair.

Premier mode de réalisation.

Dans le texte qui suit le terme lentille pourra désigner indifféremment une lentille simple ou composée, en général étudiée pour minimiser les aberrations.

Les systèmes optiques peuvent être réalisés de diverses manières. Pour faciliter la conception du système et la compréhension des schémas, on utilisera une alternance de plans d'espace, désignés par la lettre (E) sur les schémas, et de plans de fréquence, désignés par la lettre (F) sur les schémas. Un plan d'espace sera défini comme un plan image tel qu'une onde centrée sur un point d'un plan pupillaire soit plane dans le plan d'espace. Un plan de fréquence sera défini comme un plan pupillaire tel qu'une onde centrée sur un point d'un plan image soit plane dans le plan de fréquence. Le terme plan pupillaire signifie un plan tel qu'une onde plane dans l'échantillon observé soit centrée sur un point du plan pupillaire. Un plan image est un plan dans lequel un point de l'échantillon observé, sur lequel l'objectif et le condenseur sont focalisés, a une image ponctuelle.

Les alternances de plans d'espace (E) et de fréquence (F) utilisées dans la description ne constituent pas une limitation de l'invention et un système fonctionnel peut être réalisé qui ne comprenne

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pas de tels plans. L'alternance de plans d'espace et de fréquence est seulement un mode de réalisation particulièrement simple de l'invention.

La Fig. 1 est un schéma d'ensemble du premier mode de réalisation. Sur la figure 1 les plans d'espace et de fréquence sont désignés respectivement par les lettres (E) et (F). Le trajet du faisceau pupillaire est en traits pleins. Le trajet d'un faisceau issu d'un point de l'échantillon est représenté en pointillé sur certaines parties de la figure.

Un faisceau issu du laser 2000 polarisé orthogonalement au plan de la figure est élargi par un élargisseur de faisceau constitué des lentilles 2001 et 2002. Il traverse le diaphragme de champ 2043. Il parvient alors au miroir galvanométrique 2003 qui le réfléchit vers le miroir fixe 2004. Le miroir galvanométrique 2003 est mobile en rotation autour d'un axe passant par son centre et orienté orthogonalement au plan de la figure. Après réflexion sur 2004 le faisceau traverse la lentille 2005 dont le point focal objet est au centre du miroir galvanométrique 2003. Il traverse la lentille 2006 dont le plan focal objet est confondu avec le plan focal image de 2005. Il est réfléchi par le miroir galvanométrique 2007 dont le centre est au point focal image de la lentille 2006. Le miroir galvanométrique 2007 est mobile en rotation autour d'un axe passant par son centre et situé dans le plan de la figure. Le faisceau traverse la lentille 2048 dont le point focal objet est au centre du miroir galvanométrique 2007. Il traverse ensuite la lentille 2049 dont le plan focal objet est confondu avec le plan focal image de la lentille 2048. Il traverse la lentille 2008 dont le plan focal objet est confondu avec le plan focal image de la lentille 2049. Il est réfléchi par le miroir 2043 puis par le miroir 2009 et par le miroir partiellement transparent 2010. Il traverse alors le condenseur 2011. Le plan focal image de la lentille 2008 est dans le plan focal objet du condenseur 2011 de sorte qu'en sortie du condenseur le faisceau est parallèle. Le faisceau traverse alors l'échantillon observé 2040 qui le diffracte. L'ensemble de l'onde, comprenant la partie difractée et la partie non diffractée du faisceau, traverse alors l'objectif 2012. L'onde traverse ensuite la lentille de tube 2044 dont le plan focal objet est confondu avec le plan focal image de l'objectif. Elle traverse ensuite une lentille 2045 dont le plan focal objet est confondu avec le plan focal image de la lentille 2044. Elle traverse ensuite un masque optionnel 2046 plaçé dans le plan focal image de la lentille 2045. Elle est réfléchie par le miroir 2014 et traverse la lentille 2013 dont le plan focal objet est sur le masque optionnel 2046. Elle est est réfléchie par le miroir galvanométrique 2007 dont le centre est confondu avec le point focal objet de la lentille 2013. Elle est ensuite réfléchie par le miroir 2015 puis traverse la lentille 2016 dont le point focal objet est au centre du miroir galvanométrique 2007. Elle traverse la lentille 2017 dont le plan focal objet est confondu avec le plan focal image de la lentille 2016. Elle est réfléchie par le miroir galvanométrique 2003 dont le centre est confondu avec le point focal objet de la lentille 2017. Elle traverse la lentille 2018 dont le point focal objet est au centre du miroir galvanométrique 2003. Elle traverse la lame demi onde percée 2019 située dans le plan focal objet de la lentille 2018. Les axes neutres de cette lame demi onde sont orientés à 45 degrés du plan de la figure de manière à ce que la partie de l'onde qui a traversé la lame demi onde soit polarisée dans le plan de la figure, la partie de l'onde qui a traversé le trou pratiqué dans cette lame étant polarisée dans le sens orthogonal au plan de la figure. L'onde traverse ensuite une lame filtrante optionnelle 2047. L'onde traverse la lentille 2020 dont le plan focal objet est sur la lame demi onde percée 2019. Elle parvient alors

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au séparateur de faisceau 2021 qui réfléchit le tiers de la puissance lumineuse. Elle parvient alors au séparateur de faisceau 2026 qui réfléchit la moitié de la puissance lumineuse.

La partie de l'onde qui a été réfléchie par le séparateur de faisceau 2021 traverse ensuite la lame tiers d'onde 2022 et le polariseur 2023 puis parvient au capteur CCD 2024 lié à la caméra 2025 et situé dans un plan focal image de la lentille 2020. Un axe neutre de la lame tiers d'onde 2022 est dans le plan de la figure, de sorte que cette lame induit un décalage de phase de 120 degrés entre la partie de l'onde qui a traversé la lame demi-onde 2019 et la partie de l'onde qui a traversé le trou pratiqué dans cette lame. Le polariseur est typiquement à 45 degrés du plan de la figure, toutefois des angles différents peuvent être utilisés.

L'ensemble 2027,2028, 2029,2030 est équivalent à l'ensemble 2022,2023, 2024,2025 mais la lame tiers d'onde est tournée de 90 degrés de manière à générer un décalage de phase de-120 degrés.

L'ensemble 2031,2032, 2033 est équivalent à l'ensemble 2022,2023, 2024,2025 mais la lame tiers d'onde est supprimée.

La partie de l'onde d'éclairage qui traverse le miroir partiellement transparent 2010 parvient au capteur CCD 2041 monté sur la caméra 2042 et placé dans un plan pupillaire, sur lequel elle a une image ponctuelle.

Le condenseur et l'objectif sont tous deux achromatiques/aplanétiques. On note Fob, la distance focale de l'objectif et on note Fcond la distance focale du condenseur. On note Fox la distance focale de la lentille numéro X. Afin que les déviations du faisceau d'éclairage et du faisceau ayant traversé l'échantillon, par les miroirs galvanométriques, se compensent exactement, l'égalité suivante doit être

respectée :

La lentille 2016 et la lentille 2006 sont identiques entre elles, et les lentilles 2005 et 2017 sont également

17 T7 identiques entre elles. Le grossissement de l'ensemble vaut g-= 2020 207 2o3o44 F F F F F2018 F2016 F2045 Fob/

Par exemple, on peut utiliser : - un objectif planachromatique Nikon CFI60 d'ouverture numérique 1, 25 formant l'image à l'infini et corrigé indépendamment de la lentille de tube, de distance focale 2 mm - un condenseur Nikon planachromatique, de distance focale 8 mm.

- une lentille 2008 constituée d'un doublet achromatique optimisé Melles Griot, de distance focale 800 mm.

- des lentilles 2044,2045, 2013,2016, 2017,2006, 2005,2018, 2020,2048, 2049,2008 toutes identiques à la lentille de tube utilisée sur les microscopes Nikon, de distance focale 200 mm.

- un laser HeNe rouge 2000 à 633 nm de longueur d'onde.

- des lentilles 2001 et 2002 optimisées pour constituer un élargisseur de faisceau, dimensionnées pour obtenir un faisceau d'environ 10 mm de diamètre.

- un diaphragme 2043 d'environ 8 mm de diamètre.

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- des caméras CCD ayant 512x512 pixels utiles carrés avec un pas de 12 microns.

- des miroirs galvanométriques ayant un diamètre d'environ 10 mm.

La lame demi onde percée 2019 est représentée plus en détail sur la Fig. 2. Elle est constituée d'une lame demi-onde percée en son centre d'un trou 2101 qui peut avoir été réalisé à l'aide d'un laser de puissance ou par des moyens mécaniques. Le trou 2101 doit être sur l'axe optique. Son diamètre est supérieur au diamètre de la tache de diffraction formée par le faisceau sur la lame 2019, tout en étant suffisamment faible. Par exemple, dans l'exemple particulier de dimensionnement donné plus haut, son diamètre peut être d'environ 50 microns. Le trou 2101 peut être vide, toutefois il est préférable qu'il soit rempli d'un matériau d'indice proche de celui de la lame. Par exemple, la lame peut être prétaillée et prépercée, le trou peut être comblé par du verre d'indice approprié, et l'ensemble peut être poli conjointement. On peut également utiliser un ciment optique au lieu du verre. Le remplissage du trou par un matériau d'indice proche de celui de la lame permet d'éviter un décalage de phase important de la partie non diffractée de l'onde. Ceci est particulièrement utile si un laser émettant plusieurs longueurs d'onde simultanément est utilisé : en présence d'un décalage de phase important les images obtenues pour chaque longueur d'onde ne se superposeraient pas de manière constructive.

Le système est conçu de telle manière que l'échantillon observé soit éclairé par une onde plane dont la direction peut être modifiée à l'aide des miroirs galvanométriques 2003 et 2007. Par ailleurs, le système est également conçu pour qu'en l'abscence d'échantillon, l'onde parvenant à la lame demi onde perçée 2019 passe par un point fixe de cette lame, situé sur l'axe optique, et coincidant avec le trou 2101 pratiqué dans cette lame. Pour qu'en l'abscence d'objet l'onde passe bien par un point fixe de la lame 2019 un réglage de l'ensemble doit être effectué. Il s'agit essentiellement d'ajuster la distance focale d'une lentille, par exemple la lentille 2013, de manière à ce que la position du point d'impact de l'onde sur 2019 soit indépendante de la position des miroirs galvanométriques (dans la mesure ou l'onde traverse effectivement le condenseur et l'objectif). A cet effet on peut par exemple utiliser comme lentille 2013 un doublet de lentilles achromatiques adjacentes, la distance entre ces lentilles étant réglable. On modifie alors la distance focale du doublet en ajustant la distance entre ses deux lentilles simples. Pour le réglage on peut remplaçer 2019 par un capteur CCD de manière à pouvoir mesurer les déplacements du point d'impact sur ce capteur lorsque l'orientation des miroirs galvanométriques varie. Pour un réglage approprié de la distance focale de 2013, ce point d'impact est fixe.

Ce réglage ayant été effectué on met en place la lame percée 2019 de manière à ce que le trou 2101 coïncide avec le point d'impact du faisceau en l'abscence d'échantillon. Pour régler la position de la lame percée on peut par exemple placer temporairement derrière cette lame un miroir et une lentille formant l'image de la lame sur un CCD auxilliaire, ainsi qu'un polariseur réglé en rotation de manière à atténuer fortement la partie de l'onde qui est polarisée dans le plan de la figure 1. Lorsque le trou coïncide avec le point d'impact du faisceau, l'intensité parvenant au CCD auxiliaire est maximale. Pour permettre ce réglage la lame 2019 doit être montée sur un positionneur 3 axes.

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Ce réglage ayant été effectué, il est nécessaire de régler la position des cateurs CCD. Pour ce faire, on peut placer dans le plan d'espace situé entre les lemtilles 2044 et 2045 un masque absorbant comportant quelques trous. Sur un écran d'ordinateur on superpose alors les images de ce masque acquises à l'aide des trois CCD et on règle la position des CCD pour amener ces images en coïncidence et pour que ces images soient nettes. Pour permettre ce réglage les capteurs CCD doivent être montés sur des positionneurs 3 axes.

Les trois caméras doivent être synchronisées entre elles et avec les miroirs galvanométriques de manière à ce que leurs temps d'intégration coïncident et correspondent également au temps pendant lequel l'onde d'éclairage balaye le plan focal objet du condenseur.

Une image élémentaire complexe est générée à partir des images réelles détectées sur les trois caméras CCD en effectuant le calcul suivant :

ou/ [/, ] représente l'intensité détectée au point de coordonnées i, j du CCD numéro X.

Une image de référence peut être obtenue en insérant, dans le plan d'espace situé entre les lentilles

2044 et 2045, une lame portant sur une zone réduite une légère surépaisseur, causant un décalage de phase

7r par exemple égal à-. Cette lame peut typiquement être une lame de phase du type utilisé en contraste de 16 phase, mais générant un décalage de phase plus faible. L'image de cette lame se forme sur les capteurs et T* F 1 l'image complexe correspondante 7f, y1 peut être obtenue. On calcule le rapport M = ou 'oJo] ref (il, jl) sont les coordonnées en pixels de l'image d'un point portant une surépaisseur, et (io, jo) sont les coordonnées de l'image d'un point ne portant pas de surépaisseur. Ce rapport permet de normaliser l'image.

On utilisera ensuite l'image élémentaire normalisée C/,/=-=--ou/désigne la racine complexe de '-/A

l'unité. L'image élémentaire normalisée d'un point faiblement diffractant est réelle si ce point est uniquement absorbant et complexe si ce point est non absorbant et a un indice différent de celui du milieu dans lequel il se trouve.

Ces formules sont analogues à celles utilisées dans le brevet WO99/53355. La partie non diffractée de l'onde, qui traverse le trou 2101, est utilisée comme onde de référence et se voit appliquer des décalages de phase par rapport à la partie diffractée de l'onde, au moyen des lames tiers d'onde. Les polariseurs peuvent être orientés à 45 degrés du plan de la figure 1, mais il est possible en modifiant leur orientation de modifier l'intensité relative de l'onde de référence et de l'onde diffractée. Les trois polariseurs doivent cependant être orientés de la même manière, de manière à ce que l'onde de référence ait même amplitude sur les trois capteurs correspondants.

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Ce microscope comporte plusieurs modes d'utilisation : Mode 1) Génération de coupes de l'objet observé. Dans ce mode d'imagerie le masque 2046 et la lame filtrante 2047 ne sont pas utilisés. Pour générer des coupes de l'objet observé, les miroirs galvanométriques sont commandés de manière à ce que le point d'impact de l'onde d'éclairage dans le plan focal objet du condenseur se déplace de telle sorte que la puissance lumineuse reçue en un point du plan focal pendant le temps d'intégration de la caméra soit indépendante de la position de ce point à l'intérieur des limites définies par le diaphragme d'ouverture. Par exemple le point d'impact de l'onde d'éclairage dans le plan focal objet du condenseur peut parcourir une trajectoire du type représenté sur la Fig. 3, la vitesse de déplacement du point étant à peu près constante dans les parties rectilignes de cette trajectoire, et la totalité de la trajectoire étant parcourue pendant le temps d'intégration de la caméra. Sur la Fig. 3 on a représenté le diaphragme d'ouverture 2111 du condenseur et la trajectoire 2112 du point d'impact de l'onde d'éclairage.

Une telle trajectoire peut typiquement être obtenue en utilisant un miroir galvanométrique résonnant et un second miroir galvanométrique plus lent, selon une méthode communément utilisée en microscopie confocale. L'image complexe 0/, J obtenue à partir des images réelles détectées sur les trois capteurs est une coupe de l'objet observé. Toutefois cette coupe est imparfaite et peut être améliorée en prenant plusieurs coupes successives, la position de l'échantillon suivant l'axe optique étant incrémentée d'une valeur

constante entre chaque coupe. On indice ces coupes par un indice k. On obtient ainsi un tableau

tridimensionnel complexe H[i, j, k] dans lequel chaque élément du tableau correspond à un point de l'échantillon, avec n/, A'] = Cjj ou Ck [i, j] est l'image élémentaire normalisée obtenue pour la

position caractérisée par l'indice k. Ce tableau peut être amélioré par une déconvolution permettant de compenser la point spread function ou réponse impulsionnelle du système. Le filtre de déconvolution peut être obtenu par des considérations théoriques ou par mesure à l'aide d'un échantillon ponctuel, par exemple une bille du type utilisé pour calibrer les microscopes confocaux. La trajectoire du point d'impact de l'onde dans le plan focal du condenseur peut être contrôlée à l'aide du capteur CCD 2041. La partie réelle de l'image obtenue correspond, pour des échantillons faiblement diffractants, à l'absorptivité. La partie imaginaire correspond, pour des échantillons faiblement diffractants, à l'indice de réfraction. Le filtre de déconvolution est le même que celui utilisé par exemple dans l'article Reconstructing 3D lightmicroscopic images by digital image processing , par A. Erhardt & al. applied optics vol. 24 no 2,1985.

Mode 2) Utilisation en mode tomographique.

Dans ce mode d'imagerie le masque 2046 et la lame filtrante optionnelle 2047 ne sont pas utilisés.

L'utilisation en mode tomographique consiste à utiliser une méthode du type décrit dans le brevet WO99/53355. Toutefois, il n'y a pas içi de décalage de phase aléatoire à compenser. De plus, les parties de représentation fréquentielle dont la superposition génère la représentation fréquentielle de l'objet sont obtenues d'une manière un peu différente.

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lp+jq On utilise la transformée de Fourier C[p, q] = L C[i, j]e Npix de l'image élémentaire normalisée I. J Cf/, y) obtenue pour une position donnée des miroirs galvanométriques. Np, x. A est la dimension de 7V 7V la zone utile du capteur CCD, et les indices varient de---à-*--1.

2 2 C [p, q] est la projection sur un plan horizontal (suivant l'indice 1 déterminant la direction verticale d'une partie sphérique de la représentation fréquentielle tridimensionnelle de l'objet F ,/]. La Fig. 4 montre en coupe verticale suivant q, l la partie sphérique 2120 de la représentation F [p, ?, ], ainsi que le vecteur d'onde Je de l'onde d'éclairage ramené à l'échelle de cette représentation, et le support bidimensionnel 2121 de C [p, q]. L'image détectée sur le CCD 2041 permet l'obtention du vecteur d'onde Je et donc la détermination de la position de la portion de sphère 2120. Il est alors possible de projeter Cfjp, q] sur cette portion de sphère, suivant la direction verticale 2122, pour obtenir une portion de la représentation fréquentielle de l'objet. La représentation tridimensionnelle F q, q, 11 est alors obtenue, comme dans le

brevet WO99/53355, par superposition d'un ensemble de telles portions de sphères obtenues pour une série d'ondes d'éclairage différant entre elles par leur direction et obtenues par déplacement des miroirs galvanométriques. La représentation spatiale est obtenue par inversion de la transformation de Fourier.

Mode 3) obtention de projections d'un objet.

Des projections d'un objet peuvent être obtenues au moyen d'un masque 2046 opaque du type représenté sur la figure 7, comportant une ouverture 2161 en forme de bande elliptique, et plaçé dans un plan pupillaire.

La Fig. 10 précise les intermédiaires de calcul de cette bande elliptique et détaille le mode d'obtention des caractéristiques d'une ellipse limitant la bande elliptique 2161. Sur cette figure, le

F paramètre R vaut R = nF paramètre R F2044 ou n est l'indice de l'huile optique pour laquelle l'objectif est conçu.

F2O44 -' 2044 Le diamètre DO du cercle 2160 limite la partie utile du plan pupillaire, compte tenu de l'ouverture de F l'objectif. Il vaut DO = 2ouV-J --. L'angle entre la direction de projection et l'axe optique est F2044 0. Les autres paramètres se déduisent de la figure : Le rapport petit axe sur grand axe est - = cos (). La position du centre CI de l'ellipse par rapport au D2

centre optique C0 s'obtient par :

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d'ou finalement :

Par exemple, dans l'exemple particulier de dimensionnement donné plus haut, on a D0=5mm et une ellipse limitant un masque utilisable pour 0 = 8 degrés a par exemple les caractéristiques suivantes, obtenues à partir des équations indiquées précédemment :

<tb>
<tb> paramètre <SEP> valeur
<tb> Da <SEP> 0, <SEP> 30
<tb> D2 <SEP> 4, <SEP> 25
<tb> D3'41
<tb>

La largeur de la bande elliptique doit être supérieure au diamètre de la tache de diffraction formée dans le plan pupillaire. Dans le cas présent elle peut valoir par exemple 20 microns. Ce masque à bande elliptique a été représenté sur la figure 11 pour une largeur de la bande elliptique égale à 20 microns. Plus la largeur de la bande est élevée, plus la profondeur de champ de l'image obtenue est faible, et plus la luminosité est élevée. Il est donc préférable d'utiliser une largeur de bande faible dans la mesure ou cette largeur de bande reste compatible avec la luminosité nécessaire.

Si une projection suivant l'axe optique est recherchée, la bande est annulaire et centrée sur l'axe optique. Si une direction de projection plus inclinée est recherchée, l'ellipticité devient plus marquée et la bande est plus excentrée par rapport à l'axe optique.

Il est également possible de placer le masque à bande elliptique dans un autre plan pupillaire, par exemple un plan pupillaire ou est usuellement placé la lame de phase dans un objectif à contraste de phase.

Les miroirs galvanométriques doivent alors être commandés de manière à ce que le point d'impact du faisceau d'éclairage sur ce masque parcoure la bande elliptique pendant le temps d'intégration des capteurs. L'image Cri, je obtenue est alors une projection suivant la direction verticale. Cette image peut être améliorée par une déconvolution bidimensionnelle dont les caractéristiques peuvent être obtenues soit par mesure de la réponse impulsionnelle soit par des considérations théoriques.

Dans ce mode d'imagerie la plus grande partie de l'onde diffractée est arrêtée par le masque 2046.

Par contre la partie non diffractée de l'onde traverse entièrement le masque. En l'abscence de précautions particulières, l'onde diffractée devient négligeable par rapport à l'onde non diffractée et peut donc difficilement être détectée. Pour remédier à ce défaut, il est nécessaire d'utiliser une lame filtrante 2047.

Cette lame est représentée sur la figure 12. Elle est par exemple constituée d'une vitre transparente comportant en plus un élément absorbant 2201 qui peut être par exemple en verre ou en plastique teinté et

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avoir un diamètre, dans l'exemple particulier de dimensionnement donné plus haut, d'environ 50 microns. Cet élément absorbant 2201 doit être placé juste au-dessus du trou pratiqué dans la lame percée 2019. Il est également possible de supprimer la vitre 2047 et de couler directement un élément absorbant en plastique dans le trou 2101 pratiqué dans la lame percée. L'élément absorbant a pour fonction d'atténuer l'onde non diffractée pour faciliter la détection de l'onde diffractée. La lame filtrante 2047 peut également être utilisée pour effectuer un filtrage plus élaboré de l'image, et peut par exemple avoir une absorptivité décroissant de son centre 2201 vers ses bords.

Au moyen de séparateurs de faisceau et d'interrupteurs rapides, par exemple à base de cristaux liquides ferroélectriques, on peut également séparer deux chemins sur lesquels deux masques différents peuvent être utilisés. En utilisant alternativement ces deux chemins on génère deux projections formant une image stéréoscopique. Le masque peut également être constitué d'un moduateur spatial à cristaux liquides, ce qui permet de modifier à volonté la direction d'observation.

Des modes d'utilisation différents, intermédiaires entre les modes génération de coupes, projection, et tomographique, peuvent être utilisés. En général le mode tomographique est celui qui permet la meilleure qualité d'image, et les deux autres modes sont utilisés pour l'observation en temps réel.

Des variations de ce mode de réalisation peuvent être utilisées. En particulier il est possible d'utiliser plusieurs lasers à des longueurs d'onde différentes, avec un système de commutation entre ces lasers ou un système de superposition des lasers, pour obtenir un effet de couleur.

Il est également possible d'utiliser une source de lumière décrite par la Fig. 5. Sur cette figure de la lumière est produite au foyer 2130 d'une lampe à forte intensité, par exemple une lampe à vapeur de mercure. Cette lumière est collectée par un collecteur 2131 puis focalisée par une lentille 2132 vers un trou 2133. Si ce trou est suffisamment petit, il constitue une source ponctuelle dans un plan pupillaire. La lumière issue de ce trou microscopique traverse une lentille 2134 puis le diaphragme de champ 2135. Le plan focal objet de la lentille 2134 est sur le trou microscopique 2133. Le plan focal image de la lentille 2134 est sur le diaphragme 2135. La lumière issue du diaphragme de champ 2135 peut remplacer la lumière issue du laser et de son élargisseur de faisceau. L'avantage majeur de cette source de lumière est qu'elle est peu coûteuse et polychromatique, ce qui permet au moyen d'un filtre monochromateur de sélectionner diverses longueurs d'onde. Par contre, même en optimisant bien le système, la plus grande partie de la lumière issue de la source est perdue et l'intensité utile est donc assez réduite. Ce problème peut être résolu en élargissant simultanément le trou microscopique 2133 et le trou 2101 pratiqué dans la lame 2019.

Toutefois ceci introduit des approximations qui peuvent diminuer la qualité de l'image. En effet, si la zone illuminée dans le plan focal objet du condenseur est trop importante : - la largeur du trou microscopique 2101 doit être suffisante pour couvrir l'image de cette zone dans le plan de la lame 2019. La partie diffractée de l'onde traversant également cette zone, une partie non négligeable de cette onde diffractée sera modifiée de la même manière que l'onde non diffractée.

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- la largeur de l'ellipse utilisée en mode"obtention de projections d'un objet" (profondeur de champ étendue) doit rester supérieure à la largeur de l'image de la zone illuminée dans le plan du masque 2046. Ceci limite la profondeur de champ pouvant être obtenue.

- de manière similaire, en mode"tomographique", l'extension suivant l'axe vertical de l'image tridimensionnelle pouvant être obtenue est limitée.

Si une telle source est utilisée, une caméra suffisamment sensible doit être utilisée. De plus, les lames demionde et tiers d'onde doivent être achromatiques, ce qui est aussi le cas lorsque plusieurs lasers sont utilisés.

Il n'est pas indispensable d'utiliser des lames d'onde pour générer les décalages de phase. La Fig. 8 représente un dispositif de détection pouvant se substituer à celui de la figure 1. Après traversée de la lentille 2018 l'onde est divisée en trois par les séparateurs de faisceau 2170 et 2175. La partie de l'onde qui est réfléchie par 2170 traverse alors une lame 2171 placée dans un plan pupillaire et portant une surépaisseur au point d'impact de la partie non diffractée de l'onde d'éclairage. La surépaisseur doit être telle qu'elle génère un décalage de phase de 120 degrés entre l'onde la traversant et l'onde qui ne la traverse pas. L'onde traverse ensuite la lentille 2172 dont le plan focal objet est sur la lame 2171 et parvient au CCD 2173 situé dans le plan focal image de 2171 et fixé à la caméra 2174. L'ensemble 2176,2177, 2178,2179 est équivalent à l'ensemble 2171,2172, 2173,2174 mais la surépaisseur génère un décalage de phase de 240 degrés. L'ensemble 2180,2182, 2183 est également équivalent mais ne comporte pas de lame avec surépaisseur (il peut éventuellement comporter une lame sans surépaisseur).

Il est également possible d'utiliser une seule caméra. Dans ce cas, les images correspondant aux trois décalages de phase doivent être prises successivement. Les trois caméras sont par exemple remplaçées par le dispositif de la figure 6. Sur cette figure, le faisceau issu de la lentille 2018 après avoir traversé la partie du dispositif de la Fig. 1 qui se trouve avant cette lentille, parvient à un séparateur de faisceau 2140.

La partie du faisceau qui est réfléchie par 2140 est ensuite réfléchie par le miroir piézoélectrique 2141 et parvient au trou microscopique 2142 qui coïncide avec le point d'impact de l'onde en l'abscence d'échantillon observé. La partie de l'onde qui traverse ce trou microscopique comprend essentiellement la partie non diffractée de l'onde et sera utilisée comme onde de référence. Elle traverse ensuite le séparateur de faisceau 2144.

La partie de l'onde qui traverse le séparateur de faisceau 2140 est réfléchie par le miroir 2143 et par le miroir semi-transparent 2144. Les deux ondes superposées traversent ensuite la lentille 2145 et parviennent au capteur CCD 2146 intégré à la caméra 2147.

L'orientation du miroir 2143 doit être réglée pour obtenir la teinte plate sur la caméra en l'abscence d'objet observé.

Le mode de fonctionnement est similaire au précédent mais l'acquisition simultanée sur les trois caméras est remplacée par l'acquisition successive d'images correspondant à des décalages de phase de 0,120, 240 degrés. Les décalages de phase sont réalisés au moyen du miroir piézoélectrique 2141. Lors des

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trois acquisitions successives nécessaires à l'obtention d'une image complexe, les miroirs galvanométriques doivent être commandés exactement de la même manière.

Il est possible d'ajouter dans le plan pupillaire situé entre 2140 et 2143 une lame portant un point absorbant au point d'impact de la partie non diffractée de l'onde, afin de ne conserver sur ce chemin que l'onde diffractée.

Les caméras ne sont pas nécessairement dans un plan image. La Fig. 9 montre un système de détection à une caméra placée dans un plan pupillaire. L'onde ayant traversé la lentille 2018 traverse les séparateurs de faisceau 2190 et 2191 avant de parvenir au CCD 2192 située dans un plan de fréquence pour cette onde. La partie de l'onde qui est réfléchie par le séparateur de faisceau 2190 traverse le trou microscopique 2194 qui coïncide avec le point d'impact fixe de la partie non diffractée de l'onde. La partie de l'onde qui a traversé 2194 constitue l'onde de référence et le trou microscopique 2194 peut être considéré comme étant dans un plan d'espace pour cette onde. L'onde issue de 2194 est réfléchie sur le miroir piézoélectrique 2195 et sur le miroir 2196. Elle traverse la lentille 2197, est réfléchie par le séparateur de faisceau 2191 et parvient au CCD 2192 fixé à la caméra 2193. Le mode d'utilisation est similaire à celui du dispositif décrit sur la Fig. 6, les décalages de phase étant maintenant réalisés à l'aide du miroir piézoélectrique 2195. Mais la valeur complexe obtenue au pixel de coordonnées il représente maintenant Cl, il au lieu de C [/, j et une transformée de Fourier inverse doit donc être effectuée pour retrouver l'image de l'objet. Des systèmes de détection utilisant trois caméras dans des plans pupillaires et une séparation du front d'onde par polarisation peuvent également être conçus. Il est possible de rajouter un plan pupillaire intermédiaire avant la caméra, dans lequel on place une lame portant un point absorbant situé au point d'impact direct de l'onde non diffractée. Ceci permet d'éviter la saturation de la caméra en ce point.

Il est également possible de supprimer les caméras et d'observer directement l'image à l'aide d'un oculaire, ou de n'utiliser qu'une caméra mais sur laquelle une seule image est acquise et retransmise à l'écran d'un ordinateur sans traitement préalable. Dans ce cas la partie du système de la figure 1 située après la lentille 2018 est remplacée par celle représentée sur la figure 14. L'onde issue de 2018 traverse une lame 2403 située dans le plan focal image de la lentille 2018, puis traverse la lentille 2404 dont le plan focal objet est sur la lame 2403, et parvient au capteur CCD 2405 fixé sur la caméra 2406. Le capteur et la caméra peuvent éventuellement être remplaçés par un oculaire 2407 formant l'image sur la rétine de l'oeil 2408 comme indiqué par la figure 15. La lame 2403 est représentée sur la figure 13 dans le cas ou une

image en contraste de phase est recherchée. Elle est constituée d'une vitre portant en son centre une TC surépaisseur 2411 générant par exemple un décalage de phase de-. La surépaisseur 2411 doit être placée 2 au point d'impact fixe de la partie non diffractée de l'onde d'éclairage. Pour une image en fond clair la lame 2403 n'est pas indispensable, et dans le cas d'une image en mode obtention de projections la lame 2047 doit également être utilisée.

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Les schémas des Fig. 1, 6, 8, 9, 14, 15 peuvent être utilement complétés par des filtres neutres, éventuellement réglables, permettant d'ajuster l'intensité lumineuse dans les différentes parties du dispositif.

Second mode de réalisation (mode préféré)
Ce second mode de réalisation est représenté sur la figure 17. Il diffère du premier mode de réalisation par le fait que l'onde ayant traversé la lame percée est ensuite à nouveau redirigée par les miroirs galvanométriques. Cette solution a pour avantage que : -il n'est pas indispensable de placer les miroirs galvanométriques exactement dans des plans d'espace, - le système est moins sensible aux dérives de position à long terme de ces miroirs - la partie non diffractée du faisceau d'éclairage a une direction variable en sortie du système, ce qui permet une observation directe sans le danger lié à l'utilisation de lumière cohérente.

Le faisceau polarisé linéairement issu du laser 1000 traverse l'élargisseur de faisceau constitué des lentilles 1001 et 1002, puis le diaphragme 1003. Il traverse le séparateur de faisceau polarisant 1004, est réfléchi par le miroir galvanométrique 1005, par le miroir 1006 et par le miroir galvanométrique 1007. Il traverse ensuite le séparateur de faisceau polarisant 1021, puis la lentille 1009. Il est réfléchi par les miroirs 1010 et 1011, puis par le miroir 1012. ici traverse le condenseur 1013, l'objet observé 1014, l'objectif 1015, la lentille de tube 1016, la lentille 1017. Il traverse le polariseur 1050 qui sélectionne uniquement la direction de polarisation principale (direction de polarisation de la partie non diffractée de l'onde) de manière à obtenir un faisceau parfaitement polarisé linéairement. Il traverse le rotateur de polarisation 1019 dont les électrodes sont représentées sur la figure 18 et qui permet de laisser passer au choix l'ensemble du faisceau ou le faisceau traversant le plan de fréquence sur une ou plusieurs bandes elliptiques. Il traverse ensuite le polariseur 1051 orienté orthogonalement au polariseur 1050. Il est réfléchi par le miroir 1018 et traverse la lentille 1020. Il est ensuite réfléchi par le séparateur de faisceau polarisant 1021. Il est alors réfléchi par le miroir galvanométrique 1007, par le miroir 1006, par le miroir galvanométrique 1005, et par le séparateur de faisceau polarisant 1004. Il est réfléchi successivement par les miroirs 143,144, 145,146, 147 constituant l'ensemble 1022 représenté par un bloc sur la figure 17, qui sont montrés sur la figure 16 en vue suivant la direction V indiquée sur la figure I. L'ensemble 1022 sert à inverser l'angle du faisceau par rapport à un plan contenant l'axe optique et situé dans le plan de la figure 1. La direction P indiquée sur la figure 16 montre la direction d'observation suivant laquelle est réalisée la figure 17. Le faisceau traverse la lentille 1025, la lame percée 1026, la lame filtrante 1027. Il est réfléchi par les miroirs 1028 et 1029, traverse la lame retardatrice 1030, le polariseur orientable 1031, la lentille 1032. Il est réfléchi par la seconde face du miroir galvanométrique 1005, par le miroir 1033, par la seconde face du miroir galvanométrique 1007. Il traverse la lentille 1047, est réfléchi par le miroir 1046, traverse la lentille 1045.

Il est ensuite séparé en deux par le miroir semi-transparent 1034. Une partie du faisceau est réfléchie par les miroirs 1039,1040, traverse l'obturateur 1041 composé d'un rotateur de polarisation à cristaux liquides et

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d'un polariseur. Cette partie du faisceau traverse l'oculaire 1042 et parvient à l'oeil 1043. L'autre partie du faisceau est réfléchie par le miroir 1035, traverse l'obturateur 1036, l'oculaire 1037, et parvient à l'oeil 1038.

Le laser 1000 peut être un laser émettant plusieurs longueurs d'onde simultanément, ou une association de plusieurs lasers dont les sorties sont superposées par des miroirs dichroïques, de manière à obtenir une image en couleurs.

Le plan focal objet de la lentille 1009 est sur le miroir 1006. Le plan focal image de la lentille 1009 est confondu avec le plan focal objet du condenseur 1013. Le plan focal objet de la lentille 1016 est confondu avec le plan focal image de l'objectif 1015. Le plan focal image de la lentille 1016 est confondu avec le plan focal objet de la lentille 1017. Le rotateur de polarisation 1019 est dans le plan focal image de la lentille 1017 et dans le plan focal objetde la lentille 1020. Le plan focal image de la lentille 1020 est confondu avec le plan focal objet de la lentille 1009. Le plan focal objet de la lentille 1025 est confondu avec le plan focal image de la lentille 1020. La lame demi onde percée 1026 est dans le plan focal image de la lentille 1025. Le plan focal objet de la lentille 1032 est confondu avec le plan focal image de la lentille 1025. La distance entre 1033 et 1005 soit égale à la distance entre 1006 et 1005. Le plan focal image de la lentille 1032 est sur le miroir 1033. Le plan focal objet de la lentille 1047 est sur le miroir 1033. Le plan focal image de la lentille 1047 est confondu avec le plan focal objet de la lentille 1045. Le plan focal image de la lentille 1045 est le plan image 1048 observé à l'aide des oculaires 1042 et 1037.

Comme précédemment on note F la distance focale de la lentille numéro N, ouv l'ouverture

de l'objectif et du condenseur, Feond la distance focale du condenseur, Fobj la distance focale de l'objectif.

Pour que les déflexions du faisceau sur les diverses parties de sa trajectoire se compensent effectivement les unes les autres, les relations suivantes doivent être vérifiées :

Les électrodes du rotateur de polarisation 1019 sont représentées sur la figure 18. Elles forment deux bandes elliptiques pratiquement annulaires, chacune étant du type représenté sur la figure 11.

L'ensemble de ces deux bandes est composé des électrodes 1111 à 1115. Le reste de la surface du rotateur est composé des électrodes 1116 à 1119 qui sont toutes reliées au même potentiel électrique.

Pour obtenir une image en coupe les miroirs galvanométriques sont commandés de manière à ce que le point d'impact de la partie non diffractée de l'onde d'éclairage balaye la partie du rotateur de ploarisation 1019 qui est accessible compte tenu de l'ouverture de l'objectif, ou de manière équivalente pour que le point d'impact de l'onde d'éclairage balaye l'ensemble du plan focal objet du condenseur 1013.

L'ensemble des électrodes du rotateur sont alors commandées pour que la lumière puisse traverser le polariseur 1051. Les interrupteurs 1041 et 1036 sont ouverts.

Pour obtenir une image stéréoscopique, les électrodes du rotateur de polarisation 1019, les miroirs galvanométriques 1007 et 1005, et les obturateurs 1041 et 1036, doivent être commandés de manière synchrone. La formation d'une image stéréoscopique est composée d'une phase de formation d'image

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gauche, et d'une phase de formation d'image droite. Ces deux phases alternent suffisamment rapidement pour que l'oeil ne puisse pas les distinguer.

Lors de phase de formation d'image gauche : - l'obturateur 1041 est ouvert.

- l'obturateur 1036 est fermé.

- les électrodes 1110,1111, 1112,1113, sont commandées de manière à ce que la lumière qui les traverse ait sa polarisation modifiée et traverse le polariseur 1051.

- les autres électrodes du rotateur de polarisation 1019 sont commandées de manière à ne pas modifier la

polarisation de la lumière les traversant, de sorte que cette lumière soit arrêtée par le polariseur 1051. - Les miroirs galvanométriques 1005,1007 sont commandés pour que le point d'impact de l'onde d'éclairage ait une trajectoire elliptique, se déplaçant sur l'ellipse formée par les électrodes 1110,1111, 1112, 1113.

Lors de la phase de formation d'image droite : - l'obturateur 1041 est fermé.

- l'obturateur 1036 est ouvert.

- les électrodes 1110,1111, 1114,1115, sont commandées de manière à ce que la lumière qui les traverse ait sa polarisation modifiée et traverse le polariseur 1051.

- les autres électrodes du rotateur de polarisation 1019 sont commandées de manière à ne pas modifier la polarisation de la lumière les traversant, de sorte que cette lumière soit arrêtée par le polariseur 1051.

- Les miroirs galvanométriques 1005,1007 sont commandés pour que le point d'impact de l'onde d'éclairage ait une trajectoire elliptique, se déplaçant sur l'ellipse formée par les électrodes 1110,1111, 1114,1115.

Le polariseur 1051 n'est pas absolument indispensable dans la mesure ou le séparateur de faisceau polarisant 1021 suffit à sélectionner une polarisation appropriée.

La lame demi onde percée 1026 est du même type que la lame demi onde percée 2019 du mode de réalisation précédent. La lame filtrante 1027 est du même type que la lame filtrante 2047. La lame retardatrice 1030 peut éventuellement être remplacée par un ensemble à décalage de phase variable du type décrit dans : P. Hariharan,"Achromatic phase shifting for polarization interferometry", Journal of modem optics vol. 43 no 6 pp. 1305-1306,1996.

En faisant tourner le polariseur 1031 et la lame d'onde mobile de l'ensemble à décalage de phase variable remplaçant la lame retardatrice 1030, on peut passer continûment du fond clair classique au fond clair fortement contrasté et au contraste de phase. En échangeant la lame filtrante 1027 on peut modifier le type de filtrage appliqué et obtenir une image en fond noir.

Pour compenser la relative lenteur des miroirs galvanométriques, il est possible de compléter le système avec un déflecteur accouto-optique plaçé par exemple entre le laser 1000 et la lentille 1001. Ce déflecteur peut être utilisé pour défléchir rapidement le faisceau. La modification de la direction du faisceau

dans l'objet est alors dûe en partie aux miroirs galvanométriques et en partie au déflecteur accousto-optique.

La déflexion dûe au déflecteur accousto-optique doit rester très inférieure en amplitude à celle dûe aux miroirs galvanométriques, de sorte que le point d'impact de la partie non diffractée de l'onde sur la lame

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demi-onde perçée se déplace dans une petite zone autour de sa position moyenne. Il suffit alors d'aggrandir légèrement le trou de la lame perçée pour que la partie non diffractée de l'onde le traverse quel que soit l'état du déflecteur accousto-optique. Si le déflecteur accousto-optique ne défléchit le faisceau que dans une direction, il est possible de donner au trou de la lame perçée une forme allongée.

Lorsque les électrodes du rotateur de polarisation 1019 sont toutes passantes et en l'abscence de lame fitrante 1027, la réponse fréquentielle du microscope (transformée de Fourier de la réponse impulsionnelle ou"point spread function"bidimensionnelle, pour un point de l'objet situé dans le plan de focalisation), a l'allure représentée sur la figure 19, ou le module de la fréquence spatiale bidimensionnelle est représenté en abscisses, et ou l'amplitude de la représentation fréquentielle est en ordonnée. Cette réponse fréquentielle est la même que pour un microscope classique en fond clair. L'amplitude diminue pour les fréquences spatiales élevées, ce qui se traduit par une diminution de la résolution telle qu'elle est perçue par l'observateur. Cette résolution peut être améliorée en corrigeant la réponse fréquentielle au moyen d'une lame filtrante 1027 appropriée, la réponse fréquentielle du système corrigé étant alors approximativement constante jusqu'à la fréquence spatiale maximale atteinte.

La représentation fréquentielle de la figure 19, ramenée au plan de Fourier dans lequel se trouve la

F F lame filtrante 1027, est proportionelle à - avec r = OM-. 1017 1025 et ou r est la F1016 F1020

distance à l'axe optique. Pour compenser cette réponse, on peut utiliser une lame filtrante ayant une transmissivité T (r) dépendant de la distance r à l'axe optique et valant :

ou rl, m est une valeur limite comprise entre 0 t r ou est une valeur limite comprise entre 0 et . La résolution effective obtenue vaut alors à peu près, au sens de Rayleigh :

Par exemple on peut utiliser r, m = 0, max et on a alors une limite de résolution de 0, 57 fois la limite de résolution usuellement obtenue avec un microscope en fond clair (limite de Rayleigh). Dans ce cas la valeur minimale atteinte par T (r) est T (0) = 0, 0625.

Si seule une augmentation de résolution en fond clair est recherchée, on peut supprimer la lame percée 1026, la lame d'onde 1030 et le polariseur 1031.

Cette méthode d'augmentation de la résolution peut également être utilisée dans les autres modes de réalisation.

Comme indiqué sur la figure 17, un système peu coûteux peut être obtenu en remplaçant le laser et l'élargisseur de faisceau par le système représenté sur la figure 5 et déjà décrit dans le premier mode de réalisation. L'onde issue de la zone émissive 2130 d'une lampe à arc traverse la lentille collectrice 2130 puis

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est refocalisée par une lentille 2132 sur un trou 2133 situé dans un plan de fréquence. Ce trou est plaçé dans le plan focal objet de la lentille 2134, le diaphragme de champ 1003 étant plaçé dans le plan focal image de cette lentille. Pour que la luminosité soit maximale tout en restant compatible avec la méthode d'augmentation de la résolution décrite içi, le diamètre du trou 2133 de la figure 5 peut être par exemple :

Pour compenser la perte de luminosité qui, comparativement à un miroscope classique, découle de la faible largeur du trou 2133 et de la faible valeur de T (0), il est préférable d'utiliser une source lumineuse 2130 de très forte luminosité, par exemple une lampe à arc.

. Par exemple, on peut utiliser dans ce cas : - un objectif planachromatique Nikon CFI60 d'ouverture numérique 1,25 formant l'image à l'infini et corrigé indépendamment de la lentille de tube, de distance focale 2 mm - un condenseur Nikon planachromatique d'ouverture 1,4 diaphragmé à 1,25, de distance focale 8 mm.

- une lentille 1009 constituée d'un doublet achromatique optimisé Melles Griot, de distance focale 800 mm.

- des lentilles 2134,1016, 1017,1020, 1025,1032, 1047,1045 toutes identiques à la lentille de tube utilisée sur les microscopes Nikon, de distance focale 200 mm.

- une lampe à arc au mercure.

- des miroirs galvanométriques ayant un diamètre d'environ 20 mm.

- un trou 2133 d'environ 0,625 mm de diamètre.

- une lame filtrante définie comme ci-dessus avec r = 2,5 mm et rlim = 1,875 mm
Toutefois ce dimensionnement nécessite des miroirs galvanométriques de grande taille pour ne pas diminuer le champ. Il est avantageux de modifier la distance focale des lentilles de la manière suivante : - Les lentilles 1020,1025, 1032,1047, 2134 ont une distance focale de 50 mm.

- la lentille 1009 a une distance focale de 200 mm. les autres lentilles étant comme précédemment. Cette solution permet d'utiliser des miroirs galvanométriques plus petits (environ 6 mm) et plus rapides, sans diminuer la taille du champ. Toutefois, les lentilles de distance focale 50 mm sont plus difficiles à optimiser en évitant les aberrations.

Dans la configuration indiquée la position de la lentille 1032 et du miroir 1033 doivent être réglés avec suffisamment de précision pour que le plan image soit fixe après réflexion sur les miroirs galvanométriques. Ceci peut être légèrement simplifié en utilisant un miroir galvanométrique unique mobile autour de deux axes, l'autre miroir galvanométrique étant remplaçé par un miroir fixe. Dans ce cas le réglage de position du miroir 1033 devient inutile.

Un changement d'objectif dans le dispositif de la figure 17 nécessite des modifications dans le reste du système optique, qui rendent plus coûteux un système adapté à une série d'objectifs différents, dans lequel diverses lentilles doivent être échangées en même temps que l'objectif. Toutefois l'augmentation de résolution rendue possible par la présente invention est surtout utile avec des objectifs de résolution élevée.

Pour limiter le coût et dans le cas ou l'objectif essentiel du dispositif est une augmentation de résolution en

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fond clair, il est avantageux de combiner la présente méthode, utilisée par exemple avec l'objectif x1O0 à huile ou à sec, avec une méthode de microscopie en fond clair classique utilisée avec les autres objectifs.

Ceci peut être réalisé en dimensionnant le système pour l'objectifx1O0, et en utilisant avec cet objectif la méthode décrite, qui implique une commande appropriée des miroirs galvanométriques permettant le balayage du plan focal objet du condenseur par le faisceau d'éclairage Avec les autres objectifs, on remplace le trou 2133 par un diaphragme d'ouverture suffisamment ouvert, on utilise une position fixe des miroirs galvanométriques, on supprime les lames 1026,1027, 1030 et le polariseur 1031, et on commande le rotateur de polarisation de manière à le rendre entièrement passant, ce qui permet d'obtenir une image en fond clair classique. Il est également possible, mais plus coûteux, d'utiliser un chemin optique partiellement distinct pour le fond clair classique et pour le système avec augmentation de résolution.

Applications industrielles :
Ce microscope peut remplaçer les microscopes en fond clair, contraste de phase, ou DIC. Il offre une qualité d'image très supérieure, ainsi que la possibilité d'obtenir soit des coupes soit des projections de l'objet.

Claims (7)

1. Revendications 1. Microscope fonctionnant en transmission, dans lequel le faisceau d'éclairage n'est pas focalisé sur un point de l'objet observé, caractérisé par le fait qu'il comporte : - un déflecteur de faisceau A plaçé entre la source d'éclairage et le condenseur, et permettant de modifier la direction de l'onde d'éclairage dans l'échantillon, - un déflecteur de faisceau B plaçé entre l'objectif et le détecteur, et permettant de modifier la direction de l'onde issue de l'échantillon et ayant traversé l'objectif,
2. 2. Microscope selon la revendication 1, caractérisé par le fait qu'il comprend un dispositif de différenciation pour appliquer, dans un plan intermédiaire atteint par la lumière après déflexion par ledit déflecteur B, une modification moyenne de phase et/ou d'atténuation et/ou de polarisation différente à la partie non diffractée de l'onde d'éclairage et à l'onde diffractée par l'objet observé.
3. 3. Microscope selon une des revendications 1 ou 2, caractérisé par le fait qu'il comprend une lame filtrante plaçée dans un plan intermédiaire atteint par la lumière après déflexion par ledit déflecteur B, et dont la transmissivité dépend de la distance à l'axe optique.

   
4. 4. Microscope selon une des revendications 2 à 3, caractérisé par le fait que lesdits déflecteurs de faisceau A et B sont commandés ou disposés de manière à ce que la direction de l'onde d'éclairage dans l'échantillon soit variable et de manière à ce que la partie non diffractée de l'onde d'éclairage parvienne en un point fixe dudit plan intermédiaire.
5. 5. Microscope selon une des revendications 1 à 4, caractérisé par le fait que lesdits déflecteurs de faisceau A et B sont des miroirs mobiles ou des couples de miroirs mobiles.
6. 6. Microscope selon une des revendications 1 à 5, caractérisé par le fait que chaque miroir mobile dudit déflecteur B est confondu avec un miroir mobile correspondant dudit déflecteur A, ou est solidaire d'un miroir mobile correspondant dudit déflecteur A.
7. 7. Microscope selon une des revendications 1 à 6, caractérisé par le fait qu'il comprend un déflecteur C permettant de modifier la direction de l'onde provenant de l'échantillon après qu'elle ait été défléchie par ledit déflecteur B.

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   Revendications 8-Microscope selon la revendication 7, caractérisé par le fait que : - ledit déflecteur C est un miroir mobile ou un couple de miroirs mobiles, - chaque miroir mobile dudit déflecteur C est confondu avec un miroir mobile correspondant dudit déflecteur B, ou est solidaire d'un miroir mobile correspondant dudit déflecteur B.

   9-Microscope selon la revendication 8, caractérisé par le fait que chaque miroir mobile dudit déflecteur C est réalisé sur la face opposée d'un miroir mobile correspondant dudit déflecteur B.

   10-Microscope selon une des revendications 1 à 9, caractérisé par le fait qu'il comprend un masque plaçé dans le plan focal image de l'objectif, ou dans un plan image de ce plan focal qui est plaçé sur la trajectoire du faisceau avant la déflexion par ledit déflecteur B ou après la déflexion par ledit déflecteur C, qui est absorbant partout sauf sur une bande de forme elliptique.