FR2754069A1

FR2754069A1 - Microscope enregistrant l'onde diffractee par l'objet observe et l'utilisant pour calculer une representation en trois dimensions de cet objet

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Publication number: FR2754069A1
Application number: FR9611773A
Authority: FR
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1996-09-27
Filing date: 1996-09-27
Publication date: 1998-04-03

Abstract

Microscope enregistrant l'onde diffractée par l'objet observé et l'utilisant pour calculer une représentation en trois dimensions de cet objet. L'invention concerne un microscope qui enregistre sur une surface de capteurs (118) les figures d'interférences produites par une faisceau de référence Fr, par exemple obtenu par réflection sur une bille (116), et un faisceau Fe traversant un échantillon (110). Ce microscope calcule ensuite par des moyens informatiques une représentation tridimensionnelle de l'objet à partir de ces figures d'interférences. Application: microscopie en biologie ou métrologie.

Description

La présente invention concerne un microscope.

Les microscopes existants utilisent tous des lentilles qui forment par un procédé optique une image bidimensionnelle correspondant à une coupe aggrandie de l'objet observé. Cette image peut le cas échéant être enregistrée par une caméra vidéo afin de pouvoir être restituée ultérieurement.

Certains de ces microscopes sont munis de dispositifs permettant de générer des images en trois dimensions. Les images 3D sont alors obtenues par calcul à partir d'une série d'images 2D, qui sont des coupes différant par la profondeur ou l'angle d'observation.

Par ailleurs, il existe des microscopes interférométriques utilisant une onde de référence et une onde diffractée dont la superposition fournit une image. Ces dispositifs produisent des images bidimensionnelles semblables à celles produites par un microscope ordinaire, à ceci près que les variations d'éclairement de l'image ne sont pas caractéristiques de l'absorptivité de l'échantillon mais des variations locales de phase. Ces dispositifs ne permettent pas d'obtenir d'images en trois dimensions.

1l existe également des systèmes de prise de vue holographique enregistrant une image microscopique tridimensionnelle, mais ces systèmes ne permettent pas l'enregistrement de l'information sous forme numérique et l'image reconstituée doit être observée elle-même au microscope. En effet le pas d'analyse pour un enregistrement holographique doit être inférieur à la longueur d'onde, ce qui est hors de portée des systèmes de conversion optique-numérique actuels.

L'invention permet d'obtenir une représentation en trois dimensions de l'objet et une représentation complète de l'onde diffractée par celui-ci, le tout sous forme numérique autorisant ensuite tout mode de représentation et tout type d'analyse. Elle permet d'obtenir ces résultats en un temps très court: au maximum trois enregistrements sur un ensemble de capteurs CCD sont nécessaires pour obtenir une image, alors que la superposition de nombreuses images 2D serait nécessaire avec des méthodes classiques.

Le principe de l'invention est d'enregistrer l'onde diffractée par l'objet et de calculer à partir de cet enregistrement une représentation tridimensionnelle de l'objet. Cependant, l'onde diffractée par l'objet correspond à une valeur complexe qui ne peut pas être enregistrée directement. On ne peut enregistrer directement que des intensités correspondant soit à l'onde diffractée seule soit à la superposition de cette onde diffractée et d'une onde de référence. Il est donc nécessaire de se contenter de ce type d'enregistrements pour calculer la représentation tridimensionnelle.

Bien que la valeur complexe de l'onde diffractée par l'objet ne soit pas accessible directement, il est intéressant de la calculer, ou du moins d'en calculer une approximation, à partir d'enregistrements d'intensité. La représentation tridimensionnelle de l'objet peut alors être obtenue à partir de cette onde par un calcul simple appliquant le principe de retour inverse de la lumière.

Une solution permettant d'accéder à la valeur complexe de l'onde diffractée par l'objet est de la faire interférer avec une onde de référence, suivant le principe de l'holographie. A partir de la figure d'interférences enregistrée, on obtient alors une approximation de l'onde diffractée par l'objet, au sens ou le calcul de la représentation tridimensionnelle de l'objet à partir de cette onde produit une approximation de la représentation qui serait obtenue à partir de l'onde exacte.

Pour éviter ce type d'approximations, il est avantageux de pouvoir obtenir la valeur exacte de l'onde lumineuse issue de l'objet seul. Ceci est facilité par l'enregistrement successif de plusieurs figures d'interférences différant entre elles par la différence de phase entre l'onde de référence et l'onde diffractée par l'objet. En particulier, on peut enregistrer, pour obtenir une représentation tridimensionnelle, trois figures d'interférence successives en faisant varier à chaque fois de 120 degrés la phase de l'onde de référence. L'onde lumineuse issue de l'objet seul peut alors être obtenue par une formule simple, linéaire, à partir des trois enregistrements d'intensité.

La figure d'interférences produite peut être directement enregistrée par des capteurs situés à proximité de l'objet, sans interposition d'éléments optiques qui modifieraient le trajet de la lumière.

L'onde se propageant ainsi à travers un milieu d'indice constant, il est aisé par la suite d'en calculer le trajet inverse.

Une autre solution est de former une image intermédiaire de l'objet à l'aide de lentilles et d'enregistrer l'onde issue de cette image. Cette méthode permet de filtrer spatialement l'image intermédiaire par interposition d'un diaphragme dont l'ouverture détermine la taille de la partie observée de l'objet. En diminuant la taille d'image observée, on diminue la surface de capteurs nécessaire. L'image intermédiaire doit alors être une image en trois dimensions "à l'identique" c'est-àdire que les dimensions de l'image suivant toutes les directions sont les mêmes que celles de l'objet.

Moyennant quoi, elle peut être traitée comme l'objet lui-même: il suffit d'enregistrer l'onde sur des capteurs situés à proximité de l'image intermédiaire, sans interposition d'éléments optiques.

Pour pouvoir enregistrer un hologramme sous forme numérique plutôt que sur une émulsion à grain fin, il faut que les franges d'interférence soient suffisamment larges. Ceci est obtenu, dans le cadre de l'invention, en générant une onde de référence approximativement sphérique et centrée sur un point voisin de l'objet à observer ou d'une image intermédiaire de cet objet. La largeur des franges d'interférences produites par l'objet et cette onde est alors proportionnelle à la distance entre le capteur et l'objet ou son image, et est suffisante pour un enregistrement numérique.

En particulier, on peut utiliser à cet effet une petite bille réfléchissante située à proximité de l'objet à observer. Un faisceau laser est dirigé vers cette bille qui le réfléchit dans toutes les directions.

Ceci produit une onde approximativement sphérique centrée sur la bille, donc près de l'objet.

Dans le cas ou on utilise des lentilles pour déformer l'onde issue de l'objet, par exemple pour former une image intermédiaire, cette onde peut devenir approximativement plane sur une partie de sa trajectoire et un miroir semi-transparent peut être utilisé pour y superposer l'onde de référence. L'onde de référence ainsi superposée a un point d'origine virtuel à proximité de l'objet et peut être refocalisée en un point réel de l'image intermédiaire dans le cas ou on reconstruit optiquement cette image.

Dans les opérations de calcul de la représentation tridimensionnelle de l'objet, il importe de connaître avec précision la phase de l'ondé de référence et la position des capteurs. Ceci peut être réalisé en utilisant un objet de caractéristiques connues, par exemple une source ponctuelle. L'enregistrement de la figure d'interférence obtenue permet alors de déterminer la phase de l'onde de référence. En déplaçant la source ponctuelle dans le champ d'observation, on obtient également les variations de phase qui en résultent sur les capteurs, qui sont liées à la position des capteurs.

L'obtention d'une onde de référence distincte de l'onde d'éclairage implique une certaine complexité du système. Une solution particulièrement simplifiée consiste à utiliser comme onde de référence la partie non diffractée de l'onde d'éclairage, ce qui revient à ne pas avoir d'onde de référence distincte, les interférences étant directement produites par l'onde lumineuse ayant traversé l'objet. Dans ce cas, on doit travailler à partir d'un seul enregistrement, et on utilise donc pour ronde diffractée l'expression approchée obtenue à partir d'une seule figure d'interférence.

Pour effectuer les décalages de phase de l'onde de référence, il est avantageux d'utiliser un dispositif constitué de plusieurs lames transparentes qui peuvent chacune alterner entre deux positions, le mouvement de chaque lame entre ses deux positions étant contrôlé par deux électro-aimants. A chaque combinaison des positions possibles des lames correspond alors un décalage de phase connu.

A partir de l'onde lumineuse issue de l'objet seul ou de son approximation si une seule figure d'interférences a été utilisée, il est possible de reconstituer point par point une représentation en trois dimensions de l'objet en calculant l'onde lumineuse dans cette objet par application du principe de retour inverse de la lumière. Le calcul point par point sur une zone suffisamment importante de l'objet demanderait un temps de calcul beaucoup trop élevé. Afin d'effectuer cette opération pour une portion suffisante de l'objet et avec un temps de calcul raisonnable, on peut d'abord générer la représentation fréquentielle de la partie d'objet considérée puis effectuer une transformée de Fourier rapide inverse pour retrouver une représentation tridimensionnelle classique. Le système de calcul permettant cette opération peut être constitué d'un simple processeur mais il est également possible, pour accélérer le traitement, d'incorporer des moyens dédiés comme des "processeurs de FFT", spécialisés dans la transformée de Fourier rapide, ou des Asics dédiés.

La représentation en trois dimensions obtenue se présente comme une grandeur complexe fonction des trois coordonnées spatiales, correspondant à la vibration lumineuse en tout point de l'objet.

A partir de cette représentation, il est possible de générer tout type d'image en deux dimensions. En particulier, on pourra générer deux images permettant une vision stéréoscopique de l'objet observé.

L'observateur pourra alors faire tourner l'image sous tous les angles souhaités, un changement d'angle d'observation se traduisant simplement par un calcul de projection différent.

Les figures 1 à 6 illustrent un mode de réalisation de l'invention utilisant une onde de référence créée par réfection sur une bille réfléchissante. La Fig. 1 représente une vue d'ensemble du système optique. La Fig.2 représente un exemple de dimensionnement de la partie comprenant la bille et l'échantillon. La Fig.3 représente l'arrangement des capteurs. La Fig. 4 représente un système permettant de générer une figure d'interférence correspondant à un point matériel, utile dans une procédure de calibrage du microscope. La Fig. 5 représente l'organisation globale de la partie électronique et informatique du système. La figure 6 représente le dispositif de contrôle de phase utilisé.

La figure 7 illustre un deuxième mode de réalisation de l'invention, différant du premier par I'abscence d'onde de référence, et la figure 8 illustre un troisième mode de réalisation différant du premier par rexistence d'un système de lentilles créant une image intermédiaire.

Selon le premier mode de réalisation:
Un laser hélium-néon à 543.5 nm et à polarisation aléatoire (101) produit un faisceau. Ce faisceau traverse d'abord un obturateur (102) puis un élargisseur de faisceau (103). I1 est alors séparé en deux faisceaux d'égale intensité par une lame semi-transparente (121). Après cette lame on distingue le faisceau de référence (Fr) et le faisceau d'éclairage (Fe).

Le faisceau d'éclairage est redirigé par des miroirs (126), (104), (105), traverse un filtre (106), une lame demi-onde (107) dont un axe neutre est othogonal au plan de la figure, un dispositif de contrôle de phase (108) et un collimateur (109) diminuant la largeur du faisceau, et est finalement dirigé vers l'échantillon (110) qu'il éclaire par le dessous. A sa sortie de l'échantillon la partie non diffractée du faisceau est redirigée par un miroir (119) vers une cavité absorbante (120).

Le faisceau de référence est redirigé par les miroirs (122) et (123), traverse un filtre (124) et un collimateur (125) diminuant la largeur du faisceau ( typiquement iman de diamètre en sortie). Ce faisceau traverse ensuite une lentille convergente (127) dont le point de focalisation est légèrement derrière la bille (116). Le faisceau produit va frapper la bille (116) qui le réfléchit dans toutes les directions.

Les miroirs (121) et (126) doivent être positionnés entre les miroirs (104) et (122) de manière à ce que les chemins optiques parcourus par les faisceaux d'éclairage et de référence à leur arrivée au voisinnage de l'échantillon soient égaux.

La bille réfléchit le faisceau de référence dans toutes les directions et l'échantillon diffracte le faisceau d'éclairage dans toutes les directions. Le faisceau de référence et le faisceau diffracté vont alors interférer et former une figure d'interférence sur les capteurs CCD (118).

L'échantillon (110) se trouve compns entre une lame (112) et une lamelle (114), elles-mêmes fixées sur un porte-échantillon (111) muni de rebords (113) empêchant la lame et la lamelle de bouger transversalement par rapport au porte-échantillon. La bille est elle-même incluse dans une lamelle (114) fixe par rapport au demi-cube transparent (118) sur les côtés duquel sont fixés les capteurs. Une couche d'huile d'indice proche de celui du demi-cube peut être interposée entre la lamelle couvrant l'échantillon et celle contenant la bille, de manière à minimiser les changements d'indice. L'utilité du demi-cube est de minimiser les changements d'indice intervenant entre l'objet éclairé et les capteurs.

Les indices des différentes lamelles utilisées, de l'huile et du demi-cube, doivent donc être égaux ou proches les uns des autres, et si possible proches de l'indice moyen de l'échantillon lui-même. Le diamètre de la bille, la largeur et le degré de convergence du faisceau de référence arrivant sur cette bille, doivent être réglés de manière à ce que le faisceau soit réfléchi dans tout le demi-plan supérieur mais n'atteigne pas l'échantillon, situé dans le demi-plan inférieur. Les surfaces du porte-échantillon doivent absorber la longueur d'onde du laser afin de limiter les effets parasites.

La Figure 2 détaille la zone de l'échantillon et de la bille. Le faisceau de référence arrivant sur la bille (116) a un point de focalisation (20) sous la bille. Ceci permet de bien contrôler la zone éclairée de la bille, la largeur de la tache de focalisation étant inférieure à celle de la bille. L'axe du faisceau d'éclairage n'est pas parallèle à celui du faisceau de référence. fl est parallèle au rayon le plus externe de ce faisceau. Ceci permet d'éviter que le faisceau d'éclairage "croise" le faisceau de référence, ce qui ne permettrait pas sa redirection par le miroir (119). L'axe optique des éléments (125) (127) et celui de (109) n'ont donc pas exactement la même orientation. Les dimensions sont données à titre d'exemple.

La bille perturbe l'onde diffractée par l'objet et donc doit être aussi petite que possible. Cependant, plus la bille est petite plus la tache de focalisation doit être petite et donc plus le faisceau sortant de (125) doit être large, ce qui impose une zone non utilisable plus grande entre les capteurs, pour laisser passer ce faisceau. De plus il est difficile de focaliser le faisceau sur une bille trop petite. La taille de la bille et la largeur du faisceau sortant de (125) sont un compromis entre ces contraintes.

Des capteurs CCD spécialement dédiés, non packagés, sont utilisés. La figure 3 représente l'arrangement des capteurs. Sur un capteur, la largeur de la bande inutilisée (31) doit être minimisée par rapport à la surface de réception (32). Les points de connection doivent tous ressortir du même côté du capteur (33). La vue de dessus et la vue de côté permettent de bien comprendre l'arrangement des capteurs, qui laisse toutes les surfaces de connection accessibles tout en entourant complètement le demi-cube par des surfaces de réception et en ménageant une ouverture pour le passage des faisceaux laser laser. Le nombre Npix de pixels suivant la plus petite largeur d'un capteur doit vérifier Nps, = 2a À ou r est le rayon d'une sphère contenant à la fois la partie illuminée de l'échantillon et la bille réfléchissante, 2 est la longueur d'onde dans le demi cube (118) du laser utilisé, et a est un nombre supérieur à 1, par exemple 1,4. Ici ce nombre de pixels vaut approximativement 1000.

L'ensemble du dispositif optique, sauf la source laser, est enfermé dans une enceinte non représentée le protégeant de la lumière externe et dont la seule ouverture est constituée par l'obturateur.

Il doit également être isolé des vibrations externes ainsi que des vibrations induites par l'obturateur et le dispositif de contrôle de phase.

Le dispositif de contrôle de phase permet d'effectuer des décalages de phase de 0, 3 4 T, T sur l'onde de référence. I1 est constitué de deux parties symmétriques par rapport à un plan horizontal.

Un support en fer (601) mobile autour d'un axe (605) par l'intermédiaire d'une pièce (604) est percé d'un trou (602) recouvert par une lame (603). Deux électro-aimants (606) (607) permettent de commander la position du support (601). Celui-ci se plaque en position haute contre (606) lorsque (606) est alimenté en courant, et en position basse contre (607) lorsque (607) est alimenté. Les deux électroaimants sont contrôlés directement par l'électronique de commande. Lorsque (601) est en position haute, la lame (603) fait avec l'horizontale un angle O . La position de (606) doit être réglée de telle sorte que l'on ait:

ou y est la longueur d'onde du laser dans le vide, n l'indice de la lame (603) et e son épaisseur.

La partie symmétrique est constituée des pièces (611) à (617).

Le décalage de phase induit par le dispositif dépend de l'alimentation en courant des électroaimants: - (607) et (617) alimentés, (606) et (616) non alimentés: décalage de phase nul.

- (606) et (616) alimentés, (607) et (617) non alimentés: décalage de phase de
3 - autres situations: décalage de phase de
Le dispositif doit être positionné de sorte que le plan défini par la lame (603) pour un décalage de phase nul soit précisément orthogonal à la direction du faisceau.

Ce dispositif induit de part son fonctionnement des vibrations qui doivent être minimisées en recouvrant les extrémités des aimants d'une matière ayant de bonnes propriétés d'absorption des chocs, ainsi qu'en isolant mécaniquement l'ensemble du dispositif de contrôle de phase par rapport aux autres parties du microscope.

Les filtres présents sur le trajet des deux faisceaux permettent de régler le rapport de leurs intensités de la manière la mieux adaptée.

Le jeu de miroirs formant le faisceau d'éclairage agit différemment sur les deux composantes de champ électrique correspondant à l'onde lumineuse, introduisant un déphasage de it entre la composante située dans un plan orthogonal à celui de la figure et la composante située dans le plan de la figure. La lame demi-onde (107) permet de compenser cet effet. Elle peut éventuellement être supprimée si on utilise un laser ayant une polarisation rectiligne selon un vecteur orthogonal ou parallèle au plan de la figure.

Une électronique appropriée (Fig.5), du même type que celle utilisée dans une caméra numérique, génère tous les signaux de contrôle des capteurs CCD et permet à un ordinateur de recevoir par rintermédiaire d'une mémoire vidéo (VRAM) les images prises par les capteurs et échantillonnées par les convertisseurs analogiquenumérique (CAN). Cette électronique contrôle également l'obturateur et les électro-aimants du dispositif de décalage de phase. Elle reçoit un signal d'une horloge (TIMER) à partir duquel elle séquence l'ensemble des opérations.

Une prise d'image se déroule comme suit, le décalage de phase étant initialement à zéro.

TO: Ouverture de l'obturateur et début du premier temps d'intégration des capteurs.

T0+T1: Fermeture de l'obturateur, fin du premier temps d'intégration des capteurs, début du transfert de la première image des capteurs vers la VRAM, réglage du décalage de phase à
T0+T1+T2: Fin du transfert de la première image, ouverture de l'obturateur et début du deuxième temps d'intégration des capteurs.

T0+2T1+T2: Fermeture de l'obturateur, fin du deuxième temps d'intégration des capteurs, début du transfert de la deuxième image des capteurs vers la VRAM, réglage du décalage de phase à
T0+2T1+2T2: Fin du transfert de la deuxième image, ouverture de l'obturateur et début du troisième temps d'intégration des capteurs.

T0+3T1+2T2: Fermeture de l'obturateur, fin du troisième temps d'intégration des capteurs, début du transfert de la troisième image des capteurs vers la VRAM, réglage du décalage de phase à 0.

T0+3T1+3T2: Fin du transfert de la troisième image
T0+T3: début du cycle suivant.

ou T1 est le temps d'intégration des capteurs, T2 est le temps de transfert des données des capteurs vers la VRAM, T3 est l'intervalle de temps entre deux images.

Le traitement, effectué par l'ordinateur, consiste à générer une représentation en trois dimensions à partir des figures d'interférence enregistrées. Ceci est fait en recalculant à partir des trois images décalées en phase l'onde lumineuse associée à l'objet diffractant seul, puis en recalculant la vibration lumineuse dans l'objet par retour inverse de la lumière.

La vibration lumineuse associée à l'objet seul, en un point P de la surface de réception, vaut: s(P) = (P)S(P) s(P)
ou 9, (P) est la phase de l'onde de référence au point P.

On montre, compte tenu de la disposition des capteurs, que la fréquence spatiale maximale du signal S(P) sur la surface d'un capteur est fmax = r ou L est la largeur de la zone active du capteur et r est le rayon d'une sphère contenant la bille et la partie illuminée de l'échantillon. Afin de pouvoir reconstituer ce signal il est nécessaire de l'échantillonner à une fréquence spatiale 2a('max avec a > 1. On pourra par exemple prendre a = 1,4. Ceci implique que le nombre de pixels dans la largeur du capteur soit Npf, 2 2ZfmaXL soit Np" = A -. La première étape du calcul de
S(P) est alors le calcul sur chaque pixel Q du signal Sp (Q) correspondant à la valeur de S(P) au centre du pixel Q, calculée comme si le capteur ne filtrait pas le signal d'intensité reçue. On montre que cette valeur est donnée par:

ou J(Q, o) est l'intensité lumineuse reçue sur le pixel Q pour un décalage en phase 0 entre le faisceau d'éclairage et le faisceau de référence, et 1,ef (Q) est l'intensité de l'onde de référence mesurée sur le pixel Q.

La reconstitution du signal s(P) à partir de Spa (Q) implique de suréchantillonner ce signal, de couper les fréquences spatiales supérieures en valeur absolue à fmax S et d'inverser la fonction de transfert du capteur. Ces opérations classiques de traitement du signal permettent finalement d'obtenir la valeur exacte de S(P) sur un ensemble de points suréchantillonné. Le facteur de suréchantillonnage peut par exemple être de ns = 4. Dans la suite du texte, afin d'éviter toute confusion, on notera toujours Q les points variant sur l'ensemble des pixels, au nombre de N, dans la largeur du capteur, et P les points variant sur l'ensemble suréchantillonné, au nombre de n5 N
La vibration lumineuse qui en résulte par retour inverse de la lumière, en un point M quelconque est alors:

ouMP est la distance entre les points M et P, O est un point fixe suffisamment proche de la bille, À la longueur d'onde dans le cube (118) du laser utilisé, et ou la sommation est étendue à tous les points P de la surface de réception, et avec:

(on rappelle que X désigne le conjugué de X). ou SO (P) est la fonction S(P) obtenue lorsque l'objet observé est une source ponctuelle confondue avec O.

La phase de la contribution du point P de la surface de réception à la vibration lumineuse au pointMde l'objet est alors:

Dans un voisinage de M cette phase varie linéairement suivant les différentes directions, générant les fréquences suivantes:

L'algorithme utilise ces relations pour générer une représentation tridimensionnelle. Il génère d'abord cette représentation dans le domaine fréquentiel, par superposition des fréquences issues des différents points des capteurs, puis effectue une transformée de Fourier rapide pour obtenir l'image dans le domaine spatial.

À NÀ
L'image est calculée au pas de Tn sur une distance , n et N étant des entiers
2n n caractérisant cette discrétisation de l'image. L'image en fréquence discrétisée constitue un tableau H dont les indices varient entre -N et N-l. L'algorithme génère ce tableau en parcourant l'ensemble des points P et en effectuant pour chaque point P l'opération:

ou "+=" désigne l'opération d'ajout à la valeur initiale et E la partie entière, et ou le tableau H est initialisé à zéro.

Le tableau H est ensuite généré à partir de H par transformée de Fourier rapide inverse.

Cette méthode est valide si l'approximation de "fréquence constante" est valide. Si la représentation tridimensionnelle finale est échantillonnée par pas de # ceci implique que la
2n fréquence ne doit pas varier de plus de n sur une longueur N#, ce qui mène à la condition: 2N# 2n

Une valeur typique, pour notre système, est obtenue pour MP=lcm et /2=0,5mi: N < 140. On peut par exemple utiliser les valeurs 7e2 et N=256, ce qui nous fera générer une
n représentation tridimensionnelle de 128 longueurs d'onde de côté.

Pour effectuer les opérations précédentes correctement, il est nécessaire de connaître la position des capteurs avec précision. Il est également nécessaire de déterminer la fonction G. La détermination des paramètres de position et de la fonction G constitue une opération de calibrage dont les résultats doivent être incorporés au logiciel livré avec l'appareil. Pour la détermination de ces valeurs on enlève dans le microscope le collimateur (109) et le porte-échantillon et on les remplace par le dispositif de la
Figure 4 qui doit être lui-même solidaire d'un micropositionneur trois axes. Ce dispositif est un objectif de microscope à grande ouverture (41) focalisant le laser sur un "trou" (43) de faibles dimensions pratiqué dans une lame opaque (42) solidaire de l'objectif. Une couche d'huile d'indice proche de celui du demi-cube doit être interposée entre la plaque opaque (43) et la lame (115). Cet ensemble constitue une source quasi ponctuelle de bonne luminosité déplaçable suivant les trois axes. Le micropositionneur doit pour cette opération être interfacé à l'ordinateur qui va en commander les mouvements.

Le système positionne d'abord le dispositif au centre de la zone d'observation, ce qui détermine le point O. G(P) peut alors immédiatement être calculé en tout point P par la formule:

Pour la détermination des positions des points P on déplace la source ponctuelle générée par le dispositif de la figure 4 autour du point O. Celui-ci constitue donc également le centre du repère dans lequel on va évaluer les positions. On effectue autour du point O des déplacements symmétriques d'amplitude a sur chaque axe. a doit être suffisamment faible pour que la distance entre la bille et la iZN source ponctuelle ne dépasse pas la distance . Cependant, plus a est élevé meilleure est la précision obtenue, donc on a intérêt à maximiser a tout en restant dans la zone autorisée. Les déplacements de la source ponctuelle permettent d'évaluer les grandeurs suivantes:

désigne l'intégrale de d6p , différentielle de la phase au point P considéré, prise sur une ligne entre les points de coordonnées (x1 ,y1 ,z1) et (x2 ,y2 ,z2).

Pour tout point P, on calcule également R(P) = OP, distance entre le point O e avec la meilleure précision possible par des mesures classiques. R(P) est donc connu avec une certaine approximation, mais cette approximation n'entache pas notablement les résultats des calculs.

Par contre il est essentiel d'avoir des rapports x(P) y(P) z(P) connus avec la meilleure précision. C'est ce que permettent les équations suivantes:

Pour déterminer la position du point P suivant les axes l'algorithme intègre la phase sur ces axes et applique les formules ci-dessus.

Par exemple pour déterminer Kx le micropositionneur déplace la "source ponctuelle" du point de coordonnées (-a,O,O) au point de coordonnées (a,O,O) par pas de longueur inférieure au quart de la longueur d'onde. A chaque pas n, et pour chaque point P, l'algorithme calcule Sn (P) et en déduit la phase intégrée au point n: an (P) = Sn-l(P) + Arg(Sn (P)Sn-l(P))
Si le nombre total de pas effectués est Np, l'algorithme calcule finalement: K, (P) ÉÀaON(P)
Le système effectue de même la détermination de Ky (P) et K2; (P), puis, par application des formules indiquées plus haut, l'algorithme calcule les valeurs de x(P),y(P),z(P) en chaque point
P. Le calcul complet peut n'être mené que pour une partie des points P, les points intermédiaires étant alors obtenus par interpolation linéaire.

Cette opération de calibrage fournit les positions de chaque point sous forme d' un tableau
C[d, c,k,l] ou dest l'axe (d=0,1,2=x,y,z), c est le numéro du capteur et k,l sont les indices du point considéré sur le capteur, et fournit la fonction G sous forme d'un tableau G[c,k,l] avec les mêmes conventions.

Préalablement à l'utilisation du microscope il est également nécessaire d'enregistrer l'intensité de l'onde de référence seule sur chaque pixel, ce qui génère un tableau Iref [c, k,l].

L'image calculée sera centrée autour d'un point M, normalement confondu avec 0, mais qui peut s'en éloigner si la précision sur R(P) est suffisante. On utilisera donc également le tableau
WM [d] des coordonnées du point M.

Préalablement à l'utilisation, l'algorithme précalcule un certain nombre de tableaux. Dans ces tableaux, c désigne le numéro du capteur, d une des coordonnées d'espace, k et l désignent l'indice du pixel ( TI, T2) ou du point après suréchantillonnage (autres tableaux).

Les trois figures de diffraction reçues en vue d'obtenir une représentation en trois dimensions forment un tableau '[a, c, k!] ou a est l'indice correspondant à la prise de vue. Les opérations de génération du tableau H se résument alors à 4 étapes:
étape 1: parcourir l'ensemble des pixels en effectuant l'opération suivante, k et l variant de 0 à N,-l sur chaque capteur:
Spix [c, k, l] = Tlc,k,XZl[a,c,k,l] I[l,c,k,l] 1[2,c,k,l])
+jT2[c,k,l](I[l,c,k,l])
étape 2: Suréchantillonner et filtrer ce résultat, sur chaque capteur, de manière à compenser la fonction de transfert du capteur et à travailler sur un nombre de points supérieur au nombre de pixels.

Cette opération fournit le tableau S[c, k, I] ou k et I varient de 0 à n5N - 1,correspondant à la fonction
étape 3: Parcourir l'ensemble des points P (suréchantillonnés) en effectuant: H[U[o,c,k,!],U[I, c, k, l], U[2,c,k,l]]+ = S[c,k,l]V[c,k,l]
étape 4: Effectuer la transformée inverse de H par une méthode de transformée rapide en trois dimensions, obtenant ainsi le tableau H.

Un déplacement du point d'observation M implique en plus un recalcul des tableaux U et V
Le tableau H[ij,k] ainsi obtenu, dont les indices varient de -N à N-l, représente l'onde lumineuse dans l'objet et peut être utilisé pour générer toute forme de représentation de cet objet.

L'algorithme peut en particulier calculer l'intensité lumineuse L[i,j,k]= "[i, j, k] 2 et la projeter suivant des directions choisies. Par exemple une projection sur le plan x,y sera obtenue par:

L'algorithme peut procéder de manière semblable, sommant à chaque fois les intensités suivant une direction choisie, pour obtenir tous types de projections souhaités et en particulier des images stéréoscopiques, qui seront affichées selon des méthodes connues par ailleurs.

Dans certains cas, par example un échantillon comportant des éléments très mobiles, il n'est pas possible d'obtenir les trois enregistrements correspondant à des longueurs d'onde décalées. La représentation tridimensionnelle peut alors être obtenue à partir d'un seul enregistrement en remplaçant la formule donnant Sp " (Q) par:

représente l'intensité enregistrée pour l'unique figure de difliaction utilisée. La représentation tridimensionnelle obtenue est perturbée par des termes parasites
'(Q) en I (Q) ainsi que par la présence d'un objet virtuel approximativement symmétrique de l'objet réel
Iref(Q) par rapport à la bille. L'onde de référence doit être suffisamment forte pour pouvoir négliger les termes
'(Q) parasites en I(Q). La présence de l'objet virtuel est par contre inévitable. L'image obtenue est donc généralement de qualité moyenne. Par contre elle peut être parfaitement "instantanée".

L'éclairage de l'échantillon peut se faire par le haut aussi bien que par le bas. Afin d'améliorer la précision, des capteurs peuvent également être ajoutés sous l'échantillon. Le nombre de capteurs peut également être diminué, ce qui permet de diminuer le côut au prix d'une baisse de précision.

Selon un deuxième mode de réalisation, il n'y a pas d'onde de référence distincte du faisceau d'éclairage. Selon ce deuxième mode de réalisation:
Le faisceau émis par le laser (701) traverse un obturateur (702) puis un élargisseur de faisceau (703), puis un objectif de microscope (704) qui fait converger le faisceau vers un point de focalisation situé sous l'échantillon (705). Le faisceau traverse ensuite l'échantillon et est enregistré par le capteur (706). Le capteur est plaqué sur un demi-cube (707). Le nombre de pixels dans la largeur du capteur est
2r L Npi, = a-- ou r est le rayon du cercle défini par l'intersection du faisceau et du plan définissant la limite supérieure de l'échantillon, A est la longueur d'onde dans le demi cube (707) du laser utilisé, L la largeur du capteur, h la distance entre le capteur et l'échantillon, et a est un nombre supérieur à 1, par exemple 1,4. L'ensemble, source laser exclue, est protégé par une enceinte non représentée dont la seule ouverture est l'obturateur, et qui le protège de la lumière externe. Comme dans le dispositif précédent,
I'échantillon est compris entre une lame (709) et une lamelle (711),1'ensemble étant maintenu par les éléments (708) et (710).

La représentation en trois dimensions de l'objet est obtenue à partir d'une seule figure de diffraction. La fonction I"f (Q) est remplacée par l'intensité enregistrée sur les capteurs en l'abscence de l'échantillon, correspondant au faisceau d'éclairage seul, et pour un temps d'intégration égal à celui utilisé lors de l'enregistrement des figures de diffraction. La fonction Spk (Q) est alors calculée comme suit, 1(Q) représentant l'intensité enregistrée pour la figure de diffraction à partir de laquelle on cherche à calculer la représentation tridimensionnelle:

quand I,f (Q) est supérieur au quart de sa valeur maximale, et S7,b, (Q) =0 pour les autres pixels.

La fonction S(P) est obtenue à partir de Spic (Q) comme dans le premier mode de
r réalisation, avec toutefois fmax = #h
Le point O utilisé dans les formules est remplacé par le point de focalisation du faisceau. La fonction G(P) vaut

ou S(P) est la phase de l'onde d'éclairage seule au point P, S(O) sa phase au point O, OP la distance de O à P, À la longeur d'onde utilisée. G(P) peut être calculé en fonction des caractéristiques des lentilles et des positions des points, par des méthodes connues. Cependant, on utilise ici une onde d'éclairage à symétrie de révolution autour d'un axe passant par O dont la taille du point de focalisation est raisonnablement faible, et dans ces conditions on vérifie G(P) = 1.

ll n'y a pas de procédure de calibrage et la position géométrique des points est directement utilisée. Dans les formules qui suivent, h est la distance entre le point de focalisation et le centre du capteur, L est la largeur de la zone active du capteur, zone qui doit être carrée et centrée sur l'axe optique de l'objectif (704), et n5 est le facteur de suréchantillonnage.

COckl-k-1nN L
C[0,c,k,l] = (k - nsNpix)nsNpix pfr
L
C[l,c,k,l] = (l - nsNpix)nsNpix
C[2,c,k,l] = h
Les formules donnant les tableaux U et V sont remplacées par:

ou wO [d] est le tableau des coordonnées du point O, qui, contrairement au premier mode de réalisation, n'est pas forcément le centre de repère, et WOM [d] est le tableau des coordonnées du vecteur OM. Initialement on a wO [0] = wO [1] = wO [2] = WoM[0] = WOM [1] = 0, et WoM[2] coordonnée du vecteur OM suivant l'axe vertical, est la distance entre le point de focalisation du faisceau et le plan parallèle à la lame supportant l'échantillon et passant par le centre de cet échantillon.

L'image est d'abord calculée avec ces valeurs, puis, lors d'une phase de mise au point, l'opérateur modifie manuellement ( par exemple en entrant des valeurs par l'intermédiaire du clavier) les valeurs de wO [d] Il effectue cette opération en même temps qu'il visualise sur un écran l'image générée par le système, et cherche à obtenir l'image la plus nette possible. Il peut éventuellement modifier ensuite woM[d] s'il souhaite déplacer la zone d'observation.

Pour le reste le mode de calcul est le même que dans le premier mode de réalisation. Dans le mode de génération en quatre étapes de la représentation tridimensionnelle, seule l'étape 1 est modifiée et elle est remplacée par:

quand 1n?f [c,k,1] est supérieur au quart de sa valeur maximale, et S[c, k, 1] = o sinon.

ou I[c, k, 1] est l'intensité de la figure de diffraction au point d'indices (k, I) du capteur numéro c et
Iref[c, k,l] est l'intensité du faisceau d'éclairage seul en ce point.

Le système de variation de phase étant supprimé, l'électronique de commande est simplifiée en conséquence. Il n'y a plus qu'une étape d'enregistrement au lieu de trois dans le cycle de prise d'image et la commande des électroalmants du dispositif de décalage de phase, représentée figure 5, est
supprimée.

La représentation tridimensionnelle obtenue par cette méthode est semblable à celle obtenue par la première méthode dans le cas ou on n'utilise qu'un seul enregistrement pour la générer.

Cependant on ne maltrise pas ici le rapport entre l'intensité diffractée et l'intensité non diffractée, ce qui limite d'avantage les possibilités. L'image est perturbée par la présence d'une image symmétrique de l'objet par rapport au point O et par un terme du second ordre par rapport à l'onde diffractée. En général elle est de bien moins bonne qualité qu'avec les deux autres modes de réalisation. L'avantage de ce mode de réalisation est cependant sa simplicité et sa faible sensibilité aux vibrations.

Un troisième mode de réalisation est illustré par la Fig. 8.

Selon ce mode de réalisation:
Un laser (801) émet un rayon non polarisé qui traverse un élargisseur de faisceau (802) et est séparé en faisceaux d'éclairage et de référence par une lame semi-réfléchissante (803).

Le faisceau d'éclairage traverse ensuite un dispositif de décalage de phase (804) identique à celui utilisé dans le premier mode de réalisation et représenté Fig. 6. Il traverse ensuite un filtre (805) permettant d'en régler l'intensité et est redirigé par le miroir plan (806). Il traverse alors le collimateur (807) qui diminue sa largeur, puis est redirigé par les miroirs (809) et (810). Ces deux derniers miroirs sont à symmétrie cylindrique, l'axe de symmétrie étant confondu avec l'axe optique commun des éléments (807) (812) (814). Ils forment un système connu en microscopie sous le nom d' "éclairage fond noir". 115 redirigent finalement le faisceau sur la zone d'intérêt de l'échantillon (811), sous des angles tels que la partie non diffractée du faisceau ne pénètre pas dans l'objectif (812). Le système de maintien et de positionnement 3 axes de l'échantillon (811) n'est pas représenté sur la figure. Des plaques absorbantes non représentées sont également disposées de manière à arrêter la partie non absorbée du faisceau d'éclairage après traversée de l'échantillon.

L'échantillon (811) est placé au foyer objet d'un objectif de microscope (812) et une plaque (816) percée d'un trou (815) est placée de sorte que le trou soit au foyer image d'un objectif identique disposé symmétriquement (814). Dans ces conditions une image de l'échantillon est formée dans le plan focal image de (814) à l'emplacement de l'ouverture (815). Le système optique doit être calculé pour former en (815) une image stigmatique de la zone d'intérêt de l'échantillon (811). Après avoir reformé l'image de l'échantillon, la partie de l'onde non arrêtée par (816) se dirige vers la surface de capteurs (818) ou elle est enregistrée, un obturateur (817) étant positionné pour pouvoir l'arrêter. La lame semitransparente (813) interposée entre les objectifs (812) et (814) renvoie une partie de l'onde vers une plaque absorbante (823).

Le faisceau de référence traverse d'abord un un filtre (820) qui permet d'en régler l'intensité, puis un cube de verre (821) dont le rôle est d'allonger le chemin optique du faisceau de référence pour rendre égaux les chemins optiques parcourus par les deux faisceaux entre les lames semiréfléchissantes (803) et (813). Il est ensuite redirigé par le miroir (822). Une partie du faisceau traverse alors la lame semi-transparente (813) et est absorbée par la plaque (823). Une autre partie est réfléchie par (813) et va se superposer au faisceau diffracté par l'échantillon pour former sur le plan des capteurs (818) une figure d'interférences.

Le capteur (818) et l'obturateur (817) sont prolongés par des parois (819) de sorte que l'ensemble forme une enceinte fermée ne laissant passer la lumière que par l'obturateur. L'obturateur doit être construit de manière à minimiser les vibrations qu'il induit et doit être correctement isolé mécaniquement par rapport au reste du système.

La taille de l'ouverture (815) détermine la taille d'image que l'on observe. La surface (818) peut
2r L être composée d'un seul capteur dont le nombre de pixels vérifie: Np a ÀW ou r est le rayon de l'ouverture circulaire (64), h est la plus petite distance séparant l'ouverture (63) du capteur (67) et L est la largeur de la zone active du capteur.

Spix (Q) et S(P) sont calculés comme dans le premier mode de réalisation, avec toutefois fmax = r
#h
Il est possible soit d'utiliser la procédure de calibrage déjà décrite pour le premier mode de réalisation, soit de supprimer le calibrage et de le remplacer par une mise au point ainsi qu'elle a été décrite dans le deuxième mode de réalisation.

Dans le cas ou on calibre le système selon la même méthode que celle employée pour le premier mode de réalisation, les éléments (807), (809), (810) et (811) doivent alors être enlevés pendant la procédure de calibrage et remplacés par le dispositif de la figure 4. L'ensemble de la procédure de calibrage est identique à celle utilisée dans le premier mode de réalisation, à ceci près que R(P) représente la distance O'P ou O' est l'image du point O de l'objet par le système de lentilles. O' est donc à peu près au centre de l'ouverture (815). Le calcul des tableaux U et Vest également identique à celui utilisée dans le premier mode de réalisation.

Dans le cas ou on supprime la procédure de calibrage, les formules donnant le tableau
C[d,c,k,l] sont les mêmes que dans le deuxième mode de réalisation, ou h est la distance entre le centre de l'ouverture (815) et le centre du capteur, L est la largeur de la zone active du capteur, zone qui doit être carrée et centrée sur l'axe optique de l'objectif (814), et n5 est le facteur de suréchantillonnage. La fonction G(P) vaut 1 et les formules donnant les tableaux U et V sont également les mêmes que dans le deuxième mode de réalisation, avec toutefois comme valeur initiale WOM [2] = O. La phase de mise au point est effectuée comme dans le deuxième mode de réalisation.

Pour le reste, le mode de fonctionnement du système, à savoir fonctionnement de l'obturateur, du système de décalage de phase et des CCD, et calcul de la représentation tridimensionnelle de l'objet à partir de l'enregistrement sur le capteur, est le même que dans le premier mode de réalisation, que l'on ait employé la procédure de calibrage ou celle de mise au point. Cependant, si l'objectif est un objectif à sec comme sur la figure, la longueur d'onde À utilisée pour les calculs est la longueur d'onde du laser dans le vide. Si un objectif à immersion est utilisé, l'ensemble de la trajectoire de la lumière après sa sortie de l'objectif (814) doit se faire dans un milieu de même indice que le liquide d'immersion, ce qui implique d'insérer des pièces intermédiaires d'indice approprié sur cette partie de la trajectoire. La longueur d'onde à utiliser dans les calculs est alors la longueur d'onde dans ces pièces intermédiaires.

Le cycle de prise d'image étant le même que pour le premier mode de réalisation, l'électronique de commande est également semblable, à ceci près qu'il n'y a qu'un capteur au lieu de 12.

Si on génère la représentation tridimensionnelle à partir d'un seul enregistrement au lieu de trois, un objet virtuel symmétrique de l'objet réel par rapport au point de focalisation de l'onde de référence est généré. Afin que cet objet virtuel ne se superpose pas à l'objet réel, il est nécessaire de décaler le point de focalisation de l'onde de référence pour l'amener sur le coté de l'ouverture (815).

Ceci peut être réalisé en déplaçant légèrement le miroir semi-transparent (813).

L'avantage de ce mode de réalisation par rapport au premier est que l'ouverture (815) permet de sélectionner une petite portion de l'image et que l'onde de référence est centrée au milieu de l'image reconstituée dans l'ouverture (815) et non légèrement excentrée comme dans le premier mode de réalisation. Ceci permet, moyennant une réduction de la zone observée lors d'une prise d'image, d'utiliser beaucoup moins de capteurs. Par contre, la limitation de l'ouverture du faisceau ne permet pas d'obtenir des résultats aussi précis que dans le premier mode de réalisation.

Dans une réalisation plus complète basée sur l'un des trois modes de réalisation, le laser unique peut être remplacé par un ensemble de plusieurs lasers commutant entre eux, par exemple par utilisation de miroirs mobiles. En prenant successivement des images correspondant à des longueurs d'onde différentes, on peut reconstituer un effet de couleur.

Afin d'améliorer la précision, on peut également travailler dans l'ultraviolet. Ceci implique en particulier soit la diminution de la taille de l'objet illuminé soit l'augmentation du nombre de pixels des capteurs.

Ce microscope peut être utilisé au lieu de microscopes à transmission usuels, dans le domaine de la biologie par exemple, apportant d'avantage de confort et de précision. L'enregistrement en trois dimensions est particulièrement utile lorsque l'échantillon est constitué d'éléments mobiles (bactéries, spermatozoïdes, ...). Il permet alors d'examiner une scène sous tout angle jugé utile à postériori, ou de procéder à des comptages ou analyses diverses sur une image tridimensionnelle figée.

Claims

REVENDICATIONS (1/2)

1. Microscope caractérisé par le fait qu'il numérise une ou plusieurs figures d'interférences produites par une onde diffractée par l'objet ou par la superposition d'une onde diffractée par l'objet et d'une onde de référence, et obtient par calcul une représentation en trois dimensions d'une partie de l'objet observé.

2. Microscope selon la revendication 1, caractérisé en ce que la représentation en trois dimensions de l'objet est obtenue à partir d'une seule figure d'interférences produite par la superposition de l'onde diffractée et d'une onde de référence.

3. Microscope selon la revendication 1, caractérisé en ce que la représentation en trois dimensions de l'objet est obtenue à partir de plusieurs figures d'interférences produites par la superposition de l'onde diffractée par l'objet et d'une onde de référence, et différant entre elles par la phase de l'onde de référence.

4. Microscope selon la revendication 3, caractérisé en ce qu'on utilise trois figures d'interférences pour obtenir une représentation en trois dimensions, et que la phase de l'onde de référence est décalée de 120 degrés entre chacune de ces figures.

5. Microscope selon une des revendications I à 4, caractérisé en ce que l'onde diffractée issue de l'objet se dirige à travers un milieu d'indice constant vers des capteurs placés à proximité.

6. Microscope selon une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce qu'une image intermédiaire de l'objet est d'abord formée à l'aide de lentilles et filtrée spatialement.

7. Microscope selon la revendication 6, caractérisé en ce que l'onde issue de l'image intermédiaire se dirige à travers un milieu d'indice constant vers des capteurs placés à proximité.

8. Microscope selon une des revendications 2 à 7, caractérisé en ce que l'onde de référence est approximativement sphérique et centrée sur un point proche de l'objet ou d'une image intermédiaire de celui-ci.

9. Microscope selon la revendication 8, caractérisé en ce que l'onde lumineuse de référence est obtenue par réflexion d'un faisceau laser sur une bille placée à proximité de l'objet à observer.

10. Microscope selon la revendication 8, caractérisé en ce qu'un miroir semi-transparent est utilisé pour superposer l'onde de référence et l'onde diffractée par l'objet.

11. Microscope selon une des revendications 2 à 10, caractérisé en ce que, dans une phase de calibrage, une source ponctuelle est déplacée dans la zone d'observation, et en ce que des paramètres caractéristiques du système sont déduits des valeurs enregistrées sur les capteurs lors de ce déplacement.

12. Microscope selon une des revendication 1 ou 5, caractérisé en ce que les figures d'interférence résultent de la seule onde lumineuse ayant traversé l'objet.

13. Microscope selon l'une des revendications I à 12, caractérisé en ce que les moyens de calcul comportent des premiers moyens pour calculer au niveau des capteurs l'onde lumineuse diffractée par l'objet observé seul, ou une approximation de cette onde, des seconds moyens permettant de calculer la représentation fréquentielle de l'onde lumineuse dans une partie de l'objet observé, et des troisièmes moyens pour effectuer une transformée de Fourier inverse de cette représentation fréquentielle.

REVENDICATIONS (2/2)

14. Système permettant de faire varier la phase d'un faisceau, caractérisé en ce que plusieurs lames transparentes sont utilisées, chacune ayant deux positions possibles dont l'une est parallèle à la section du faisceau et l'autre fait un petit angle avec la première, chaque combinaison des position des lames correspondant à un décalage de phase donné.