FR2816412A1 - Microscope pour objets diffractants - Google Patents

Abstract

L'invention concerne un microscope pour l'observation d'objets diffractants comportant un faisceau laser (2000) réfléchi par une première face des miroirs galvanométriques (2003) et (2007), traversant le condenseur (2011), l'échantillon (2040), l'objectif (2013), réfléchi par une seconde face des miroirs galvanométriques, traversant une lame demi onde percée (2019) et des lames tiers d'onde (2022) (2027) permettant l'application de décalages de phase à la seule partie non diffractée de l'onde, et détecté par plusieurs caméras (2024) (2029) (2032). Applications : microscopie 3D et 2D rapide, en biologie et étude des matériaux.

Description

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Microscope pour objets diffractants Domaine de l'invention :
L'invention concerne un microscope pour l'observation d'objet diffractants.

Technique antérieure.

L'image formée dans un microscope en fond clair ou en contraste de phase résulte de l'interférence entre la partie non diffractée de l'onde d'éclairage, qui parvient directement au plan image, et la partie diffractée de cette onde, qui parvient également au plan image. Certaines méthodes comme le contraste de phase nécessitent l'application d'un décalage de phase à la partie non diffractée de l'onde d'éclairage. En fond clair, il est souhaitable, pour des objets peu diffractants, de pouvoir atténuer la partie non diffractée de l'onde d'éclairage.

En fond clair il est impossible d'atténuer la partie non diffractée de l'onde d'éclairage sans atténuer aussi l'onde diffractée, ce qui a pour seul effet de diminuer la luminosité. En contraste de phase, l'anneau de phase utilisé pour modifier la phase de l'onde d'éclairage perturbe l'onde diffractée, ce qui génère des perturbations comme le halo. Il limite également la répartition d'intensité de l'onde d'éclairage dans un plan pupillaire, ce qui a en particulier pour conséquence une très mauvaise capacité de séparation suivant l'axe vertical.

Description de l'invention :
Afin d'améliorer les performances des méthodes d'imagerie microscopique, il apparaît souhaitable de pouvoir modifier la partie non diffractée de l'onde d'éclairage sans perturber l'onde diffractée et sans limiter la répartition d'intensité de l'onde d'éclairage dans le plan pupillaire.

Selon l'invention, ceci est réalisé au moyen d'un microscope comprenant : - des moyens pour éclairer l'objet observé avec une onde sensiblement plane, - des moyens pour faire varier la direction de cette onde d'éclairage sensiblement plane, - un objectif de microscope recevant l'onde diffractée par l'objet, caractérisé par le fait qu'il comprend des moyens pour rediriger vers un point fixe d'un plan pupillaire la partie non diffractée de l'onde issue de l'objet observé et ayant traversé l'objectif.

L'onde plane d'éclairage a une image ponctuelle dans un plan pupillaire. Lorsqu'elle peut balayer l'ensemble du plan pupillaire, elle est équivalente, en moyenne au cours du temps, à une onde incohérente constituant un éclairage de Köhler. Lorsque le microscope comporte des moyens pour rediriger cette onde vers un point fixe, il devient possible de modifier la phase et/ou cette onde par insertion en ce point fixe d'un élément approprié modifiant l'onde en ce point fixe, ce sans affecter la partie diffractée de l'onde.

Les moyens de redirection peuvent être divers, cependant le moyen le plus efficace consiste à utiliser un ou plusieurs miroirs mobiles. En effet ces miroirs mobiles redirigent l'ensemble de l'onde y compris l'onde diffractée, sans perte d'information. Ces miroirs mobiles peuvent de préférence être placés dans un plan image : en effet, dans ces conditions, le mouvement des miroirs mobiles ne déplace pas

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l'image, ce qui rendrait difficile son moyennage temporel sur un capteur unique. Il est également préférable que ce plan image soit tel que la partie non diffractée de l'onde d'éclairage soit une onde plane dans ce plan image. En effet, dans ce cas, les mouvements du miroir mobile se traduisent uniquement par un déplacement latéral dans le plan pupillaire.

Diverses configuration des miroirs mobiles peuvent être utilisées, cependant il est particulièrement pratique d'utiliser les mêmes miroirs pour faire varier la direction de l'onde d'éclairage et pour rediriger ensuite la partie non diffractée de cette onde. En effet, dans ce cas, si le système optique est convenablement dimensionné et réglé, la redirection de la partie non diffractée de l'onde d'éclairage après traversée de l'objectif peut compenser exactement la variation de direction de l'onde d'éclairage avant traversée du condenseur, ce sans qu'un contrôle informatique précis du mouvement des miroirs soit nécessaire.

Il est préférable que sur chaque miroir mobile utilisé, une première face soit utilisée pour réfléchir l'onde d'éclairage n'ayant pas encore traversé l'objet, et une seconde face soit utilisée pour réfléchir l'onde issue de l'objet. En effet, dans le cas contraire, une partie du trajet optique des deux ondes est commune et

les réflections partielles de l'onde d'éclairage sur les surfaces optiques réfractives peuvent perturber l'onde diffractée.

Il est possible d'acquérir une image pour chaque direction de l'onde d'éclairage et de recalculer ensuite une image de bonne qualité à partir d'une série d'images de ce type. Toutefois, lorsque une méthode en temps réel est recherchée, il est préférable de pouvoir faire varier la direction de l'onde d'éclairage pendant le temps d'intégration des capteurs. En effet, les capteurs accumulent alors une série d'images correspondant chacune à une direction de l'onde d'éclairage et qui sont individuellement de mauvaise qualité, mais dont l'accumulation sur le capteur peut générer une image de bonne qualité.

Si on souhaite obtenir une projection de l'objet en temps réel, il est utile d'utiliser un masque placé dans un plan pupillaire et opaque sauf sur une bande de forme elliptique. En déplaçant le point image de l'onde d'éclairage sur cette bande elliptique, on génère sur les capteurs une image qui est une projection de l'objet. Toutefois, sur une telle projection, l'onde diffractée tend à être fortement atténuée et il est donc nécessaire d'atténuer également la partie non diffractée de l'onde. Ceci peut être fait au moyen d'un atténuateur plaçé au point fixe atteint par la partie non diffractée de l'onde d'éclairage après redirection par les miroirs mobiles.

Il est possible d'effectuer l'acquisition, avec une seul caméra, d'une image de type fond clair ou contraste de phase . Toutefois, il est nettement préférable d'acquérir plusieurs images différant entre elles par le décalage de phase appliqué à la partie non diffractée de l'onde d'éclairage. En effet, dans ces conditions, il est possible de recalculer à partir de ces images une image complexe caractérisant à la fois les variations d'indice et d'absorptivité de l'objet et dépendant linéairement de l'onde diffractée sans perturbations du second ordre.

Les différents décalages de phase peuvent être obtenus de diverses manières, toutefois une méthode particulièrement efficace consiste à utiliser un élément biréfringent placé dans le plan pupillaire ou la partie non diffractée de l'onde d'éclairage éclaire un point fixe. Cet élément biréfringent permet de polariser différemment l'onde diffractée et la partie non diffractée de l'onde d'éclairage. Ces deux ondes peuvent

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ensuite être décalées en phase l'une par rapport à l'autre au moyen de lames de phase placées devant plusieurs capteurs effectuant chacun l'acquisition d'une image avec un décalage de phase donné.

Description rapide des figures.

La Fig. 1 est un schéma d'ensemble d'un mode préféré de réalisation. La Fig. 2 est un schéma d'une lame demi onde percée utilisée dans ce mode de réalisation. La Fig. 3 représente la trajectoire du point d'impact de l'onde d'éclairage dans un plan pupillaire, pendant le temps d'intégration des capteurs, pour l'obtention d'une coupe de l'objet à l'aide de ce microscope. La Fig. 4 représente en coupe la représentation fréquentielle bidimensionnelle obtenue par transformation de Fourier de l'image obtenue pour une onde

d'éclairage plane donnée, ainsi que la partie de la représentation fréquentielle tridimensionnelle de l'objet dont elle est la projection. La Fig. 5 représente un système d'éclairage pouvant remplacer le laser. La Fig. 6 représente un système de détection à une caméra pouvant remplacer le système de détection à trois caméras décrit sur la figure 1. La Fig. 7 représente un masque elliptique utilisé pour obtenir une projection de l'objet observé. La Fig. 8 représente un système de détection sans lames d'onde pouvant remplacer le système de détection décrit sur la figure 1. La Fig. 9 représente un système de détection à une caméra placée dans un plan pupillaire. La Fig. 10 sert de support au calcul des caractéristiques de bandes elliptiques utilisées sur le masque de la Fig. 7. La Fig. 11 représente le masque de la Fig. 7 à l'échelle et pour un cas particulier de réalisation. La Fig. 12 représente une lame filtrante permettant d'atténuer la partie non diffractée de l'onde dans le cas ou le masque de la Fig. 7 est utilisé. La Fig. 13 représente une lame générant un décalage de phase de la partie non diffractée de l'onde d'éclairage. La Fig. 14 représente un système de détection à une caméra dans lequel l'image acquise peut être directement affichée sur un écran. La Fig. 15 représente un dispositif d'observation directe à l'aide d'un oculaire.

Mode de réalisation préféré.

Dans le texte qui suit le terme lentille pourra désigner indifféremment une lentille simple ou composée, en général étudiée pour minimiser les aberrations.

Les systèmes optiques peuvent être réalisés de diverses manières. Pour faciliter la conception du système et la compréhension des schémas, on utilisera une alternance de plans d'espace, désignés par la lettre (E) sur les schémas, et de plans de fréquence, désignés par la lettre (F) sur les schémas. Un plan d'espace sera défini comme un plan image tel qu'une onde centrée sur un point d'un plan pupillaire soit plane dans le plan d'espace. Un plan de fréquence sera défini comme un plan pupillaire tel qu'une onde centrée sur un point d'un plan image soit plane dans le plan de fréquence. Le terme plan pupillaire signifie un plan tel qu'une onde plane dans l'échantillon observé soit centrée sur un point du plan pupillaire. Un plan image est un plan dans lequel un point de l'échantillon observé, sur lequel l'objectif et le condenseur sont focalisés, a une image ponctuelle.

Les alternances de plans d'espace (E) et de fréquence (F) utilisées dans la description ne constituent pas une limitation de l'invention et un système fonctionnel peut être réalisé qui ne comprenne

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pas de tels plans. L'alternance de plans d'espace et de fréquence est seulement un mode de réalisation particulièrement simple de l'invention.

La Fig. 1 est un schéma d'ensemble du mode de réalisation préféré. Sur la figure 1 les plans d'espace et de fréquence sont désignés respectivement par les lettres (E) et (F). Le trajet du faisceau pupillaire est en traits pleins. Le trajet d'un faisceau issu d'un point de l'échantillon est représenté en pointillé sur certaines parties de la figure.

Un faisceau issu du laser (2000) polarisé orthogonalement au plan de la figure est élargi par un

élargisseur de faisceau constitué des lentilles (2001) et (2002). Il traverse le diaphragme de champ (2043). Il parvient alors au miroir galvanométrique (2003) qui le réfléchit vers le miroir fixe (2004). Le miroir galvanométrique (2003) est mobile en rotation autour d'un axe passant par son centre et orienté orthogonalement au plan de la figure. Après réflexion sur (2004) le faisceau traverse la lentille (2005) dont le point focal objet est au centre du miroir galvanométrique (2003). Il traverse la lentille (2006) dont le plan focal objet est confondu avec le plan focal image de (2005). Il est réfléchi par le miroir galvanométrique (2007) dont le centre est au point focal image de la lentille (2006). Le miroir galvanométrique (2007) est mobile en rotation autour d'un axe passant par son centre et situé dans le plan de la figure. Le faisceau traverse la lentille (2048) dont le point focal objet est au centre du miroir galvanométrique (2007). Il traverse ensuite la lentille (2049) dont le plan focal objet est confondu avec le plan focal image de la lentille (2048). Il traverse la lentille (2008) dont le plan focal objet est confondu avec le plan focal image de la lentille (2049). Il est réfléchi par le miroir (2043) puis par le miroir (2009) et par le miroir partiellement transparent (2010). Il traverse alors le condenseur (2011). Le plan focal image de la lentille (2008) est dans le plan focal objet du condenseur (2011) de sorte qu'en sortie du condenseur le faisceau est parallèle. Le faisceau traverse alors l'échantillon observé (2040) qui le diffracte. L'ensemble de l'onde, comprenant la partie difractée et la partie non diffractée du faisceau, traverse alors l'objectif (2012). L'onde traverse ensuite la lentille de tube (2044) dont le plan focal objet est confondu avec le plan focal image de l'objectif.

Elle traverse ensuite une lentille (2045) dont le plan focal objet est confondu avec le plan focal image de la lentille (2044). Elle traverse ensuite un masque optionnel (2046) placé dans le plan focal image de la

lentille (2045). Elle est réfléchie par le miroir (2014) et traverse la lentille (2013) dont le plan focal objet est sur le masque optionnel (2046). Elle est est réfléchie par le miroir galvanométrique (2007) dont le centre est confondu avec le point focal objet de la lentille (2013). Elle est ensuite réfléchie par le miroir (2015) puis traverse la lentille (2016) dont le point focal objet est au centre du miroir galvanométrique (2007). Elle traverse la lentille (2017) dont le plan focal objet est confondu avec le plan focal image de la lentille (2016).

Elle est réfléchie par le miroir galvanométrique (2003) dont le centre est confondu avec le point focal objet de la lentille (2017). Elle traverse la lentille (2018) dont le point focal objet est au centre du miroir galvanométrique (2003). Elle traverse la lame demi onde percée (2019) située dans le plan focal objet de la lentille (2018). Les axes neutres de cette lame demi onde sont orientés à 45 degrés du plan de la figure de manière à ce que la partie de l'onde qui a traversé la lame demi onde soit polarisée dans le plan de la figure, la partie de l'onde qui a traversé le trou pratiqué dans cette lame étant polarisée dans le sens orthogonal au plan de la figure. L'onde traverse ensuite une lame filtrante optionnelle (2047). L'onde traverse la lentille

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(2020) dont le plan focal objet est sur la lame demi onde percée (2019). Elle parvient alors au séparateur de faisceau (2021) qui réfléchit le tiers de la puissance lumineuse. Elle parvient alors au séparateur de faisceau (2026) qui réfléchit la moitié de la puissance lumineuse.

La partie de l'onde qui a été réfléchie par le séparateur de faisceau (2021) traverse ensuite la lame tiers d'onde (2022) et le polariseur (2023) puis parvient au capteur CCD (2024) lié à la caméra (2025) et situé dans un plan focal image de la lentille (2020). Un axe neutre de la lame tiers d'onde (2022) est dans le plan de la figure, de sorte que cette lame induit un décalage de phase de 120 degrés entre la partie de l'onde

qui a traversé la lame demi-onde (2019) et la partie de l'onde qui a traversé le trou pratiqué dans cette lame.

Le polariseur est typiquement à 45 degrés du plan de la figure, toutefois des angles différents peuvent être utilisés.

L'ensemble (2027) (2028) (2029) (2030) est équivalent à l'ensemble (2022) (2023) (2024) (2025) mais la lame tiers d'onde est tournée de 90 degrés de manière à générer un décalage de phase de-120 degrés.

L'ensemble (2031) (2032) (2033) est équivalent à l'ensemble (2022) (2023) (2024) (2025) mais la lame tiers d'onde est supprimée.

La partie de l'onde d'éclairage qui traverse le miroir partiellement transparent 2010 parvient au capteur CCD (2041) monté sur la caméra (2042) et placé dans un plan pupillaire, sur lequel elle a une image ponctuelle.

Le condenseur et l'objectif sont tous deux achromatiques/aplanétiques. On note Fob, la distance focale de l'objectif et on note Fcond la distance focale du condenseur. On note Fox la distance focale de la lentille numéro%. Afin que les déviations du faisceau d'éclairage et du faisceau ayant traversé l'échantillon, par les miroirs galvanométriques, se compensent exactement, l'égalité suivante doit être

respectée :

La lentille (2016) et la lentille (2006) sont identiques entre elles, et les lentilles (2005) et (2017) sont

F F F F également identiques entre elles. Le grossissement de l'ensemble vaut g =2020F2017F2013 F2044.

F2018 8-'20) 2045 oby

Par exemple, on peut utiliser : - un objectif planachromatique Nikon CFI60 d'ouverture numérique 1, 25 formant l'image à l'infini et corrigé indépendamment de la lentille de tube, de distance focale 2 mm - un condenseur Nikon planachromatique, de distance focale 8 mm - une lentille (2008) constituée d'un doublet achromatique optimisé Molles Griot, de distance focale 800 mm.

- des lentilles (2044) (2045) (2013) (2016) (2017) (2006) (2005) (2018) (2020) (2048) (2049) (2008) constituées de doublets achromatiques optimisés de distance focale 200 mm - un laser HeNe rouge (2000) à 633 nm de longueur d'onde.

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- des lentilles (2001) et (2002) optimisées pour constituer un élargisseur de faisceau, dimensionnées pour obtenir un faisceau d'environ 10 mm de diamètre.

- un diaphragme (2043) d'environ 8 mm de diamètre.

- des caméras CCD ayant 512x512 pixels utiles carrés avec un pas de 12 microns.

- des miroirs galvanométriques ayant un diamètre d'environ 10 mm
La lame demi onde percée (2019) est représentée plus en détail sur la Fig. 2. Elle est constituée d'une lame demi-onde percée en son centre d'un trou (2101) qui peut avoir été réalisé à l'aide d'un laser de puissance ou par des moyens mécaniques. Le trou (2101) doit être sur l'axe optique. Son diamètre est supérieur au diamètre de la tache de diffraction formée par le faisceau sur la lame (2019), tout en étant suffisamment faible. Par exemple, dans l'exemple particulier de dimensionnement donné plus haut, son diamètre peut être d'environ 50 microns.

Le système est conçu de telle manière que l'échantillon observé soit éclairé par une onde plane dont la direction peut être modifiée à l'aide des miroirs galvanométriques (2003) et (2007). Par ailleurs, le système est également conçu pour qu'en l'abscence d'échantillon, l'onde parvenant à la lame demi onde

perçée (2019) passe par un point fixe de cette lame, situé sur l'axe optique, et coincidant avec le trou (2101) pratiqué dans cette lame. Pour qu'en l'abscence d'objet l'onde passe bien par un point fixe de la lame (2019) un réglage de l'ensemble doit être effectué. Il s'agit essentiellement d'ajuster la distance focale d'une lentille, par exemple la lentille (2013), de manière à ce que la position du point d'impact de l'onde sur (2019) soit indépendante de la position des miroirs galvanométriques (dans la mesure ou l'onde traverse effectivement le condenseur et l'objectif). A cet effet on peut par exemple utiliser comme lentille (2013) un doublet de lentilles achromatiques adjacentes, la distance entre ces lentilles étant réglable. On modifie alors la distance focale du doublet en ajustant la distance entre ses deux lentilles simples. Pour le réglage on peut remplacer (2019) par un capteur CCD de manière à pouvoir mesurer les déplacements du point d'impact sur ce capteur lorsque l'orientation des miroirs galvanométriques varie. Pour un réglage approprié de la distance focale de (2013), ce point d'impact est fixe.

Ce réglage ayant été effectué on met en place la lame percée (2019) de manière à ce que le trou

(2101) coïncide avec le point d'impact du faisceau en l'abscence d'échantillon. Pour régler la position de la lame percée on peut par exemple placer temporairement derrière cette lame un miroir et une lentille formant l'image de la lame sur un CCD auxiliaire, ainsi qu'un polariseur réglé en rotation de manière à atténuer fortement la partie de l'onde qui est polarisée dans le plan de la figure 1. Lorsque le trou coïncide avec le point d'impact du faisceau, l'intensité parvenant au CCD auxiliaire est maximale. Pour permettre ce réglage la lame (2019) doit être montée sur un positionneur 3 axes.

Ce réglage ayant été effectué, il est nécessaire de régler la position des cateurs CCD. Pour ce faire, on peut placer dans le plan d'espace situé entre les lemtilles (2044) et (2045) un masque absorbant comportant quelques trous. Sur un écran d'ordinateur on superpose alors les images de ce masque acquises à l'aide des trois CCD et on règle la position des CCD pour amener ces images en coïncidence et pour que

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ces images soient nettes. Pour permettre ce réglage les capteurs CCD doivent être montés sur des positionneurs 3 axes.

Les trois caméras doivent être synchronisées entre elles et avec les miroirs galvanométriques de manière à ce que leurs temps d'intégration coïncident et correspondent également au temps pendant lequel l'onde d'éclairage balaye le plan focal objet du condenseur.

Une image élémentaire complexe est générée à partir des images réelles détectées sur les trois caméras CCD en effectuant le calcul suivant :

ou lAi,) ] représente l'intensité détectée au point de coordonnées i, j du CCD numéro.

Une image de référence peut être obtenue en insérant, dans le plan d'espace situé entre les lentilles (2044) et (2045), une lame portant sur une zone réduite une légère surépaisseur, causant un décalage de

7r phase par exemple égal à-. Cette lame peut typiquement être une lame de phase du type utilisé en 16

contraste de phase, mais générant un décalage de phase plus faible. L'image de cette lame se forme sur les capteurs et l'image complexe correspondante ) 7j psut être obtenue. On calcule le rapport @^f [i, j] peut être obtenue. On calcule le rapport

T M =""r-r") ou (, y,) sont les coordonnées en pixels de l'image d'un point portant une ef 10, Jo

surépaisseur, et (io, jo) sont les coordonnées de l'image d'un point ne portant pas de surépaisseur. Ce rapport permet de normaliser l'image. On utilisera ensuite l'image élémentaire normalisée

,. [7]Iiiil-YM ou j designe la racine complexe de l'unité. L'image élémentaire normalisée d'un point 7

faiblement diffractant est réelle si ce point est uniquement absorbant et complexe si ce point est non absorbant et a un indice différent de celui du milieu dans lequel il se trouve.

Ces formules sont analogues à celles utilisées dans le brevet WO99/53355. La partie non diffractée de l'onde, qui traverse le trou (2101), est utilisée comme onde de référence et se voit appliquer des décalages de phase par rapport à la partie diffractée de l'onde, au moyen des lames tiers d'onde. Les polariseurs peuvent être orientés à 45 degrés du plan de la figure 1, mais il est possible en modifiant leur orientation de modifier l'intensité relative de l'onde de référence et de l'onde diffractée. Les trois polariseurs doivent cependant être orientés de la même manière, de manière à ce que l'onde de référence ait même amplitude sur les trois capteurs correspondants.

Ce microscope comporte plusieurs modes d'utilisation :

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Mode 1) Génération de coupes de l'objet observé. Dans ce mode d'imagerie le masque (2046) et la lame filtrante (2047) ne sont pas utilisés. Pour générer des coupes de l'objet observé, les miroirs galvanométriques sont commandés de manière à ce que le point d'impact de l'onde d'éclairage dans le plan focal objet du condenseur se déplace de telle sorte que la puissance lumineuse reçue en un point du plan focal pendant le temps d'intégration de la caméra soit indépendante de la position de ce point à l'intérieur des limites définies par le diaphragme d'ouverture. Par exemple le point d'impact de l'onde d'éclairage dans le plan focal objet du condenseur peut parcourir une trajectoire du type représenté sur la Fig. 3, la vitesse de déplacement du point étant à peu près constante dans les parties rectilignes de cette trajectoire, et la totalité de la trajectoire étant parcourue pendant le temps d'intégration de la caméra. Sur la Fig. 3 on a représenté le diaphragme d'ouverture (2111) du condenseur et la trajectoire (2112) du point d'impact de l'onde d'éclairage. Une telle trajectoire peut typiquement être obtenue en utilisant un miroir galvanométrique résonnant et un second miroir galvanométrique plus lent, selon une méthode

communément utilisée en microscopie confocale. L'image complexe Cl il obtenue à partir des images réelles détectées sur les trois capteurs est une coupe de l'objet observé. Toutefois cette coupe est imparfaite et peut être améliorée en prenant plusieurs coupes successives, la position de l'échantillon suivant l'axe optique étant incrémentée d'une valeur constante entre chaque coupe. On indice ces coupes par un indice k.

On obtient ainsi un tableau tridimensionnel complexe H [i, j, k] dans lequel chaque élément du tableau correspond à un point de l'échantillon, avec H[i,), k] = Ck [i, il ou Ck [./] est l'image élémentaire

normalisée obtenue pour la position caractérisée par l'indice k. Ce tableau peut être amélioré par une déconvolution permettant de compenser la point spread function ou réponse impulsionnelle du système. Le filtre de déconvolution peut être obtenu par des considérations théoriques ou par mesure à l'aide d'un échantillon ponctuel, par exemple une bille du type utilisé pour calibrer les microscopes confocaux. La

trajectoire du point d'impact de l'onde dans le plan focal du condenseur peut être contrôlée à l'aide du i capteur CCD (2041). La partie réelle de l'image obtenue correspond, pour des échantillons faiblement diffractants, à l'absorptivité. La partie imaginaire correspond, pour des échantillons faiblement diffractants, à l'indice de réfraction. Le filtre de déconvolution est le même que celui utilisé par exemple dans l'article Reconstructing 3D light-microscopic images by digital image processing , par A. Erhardt & al. applied optics vol. 24 no 2, 1985.

Mode 2) Utilisation en mode tomographique.

Dans ce mode d'imagerie le masque (2046) et la lame filtrante optionnelle (2047) ne sont pas utilisés.

L'utilisation en mode tomographique consiste à utiliser une méthode du type décrit dans le brevet WO99/53355. Toutefois, il n'y a pas içi de décalage de phase aléatoire à compenser. De plus, les parties de représentation fréquentielle dont la superposition génère la représentation fréquentielle de l'objet sont obtenues d'une manière un peu différente.

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Lp+jq On utilise la transibrmée de Fourier Cf, ] = C*f/, ] e""de l'image élémentaire normalisée 'j C [i, j] obtenue pour une position donnée des miroirs galvanométriques. N x Nplx est la dimension de N N la zone utile du capteur CCD, et les indices varient de---à-"--1.

2 2 C [p, q] est la projection sur un plan horizontal (suivant l'indice 1 déterminant 1a direction verticale) d'une partie sphérique de la représentation fréquentielle tridimensionnelle de l'objet F[p, q, 1], La Fig. 4 montre en coupe verticale suivant q, l la partie sphérique (2120) de la représentation F [p, q, I], ainsi que le vecteur d'onde Je de l'onde d'éclairage ramené à l'échelle de cette représentation, et le support bidimensionnel (2121) de Cf[p, q]. L'image détectée sur le CCD (2041) permet l'obtention du vecteur d'onde Je et donc la détermination de la position de la portion de sphère (2120). Il est alors possible de projeter C[p, q] sur cette portion de sphère, suivant la direction verticale (2122), pour obtenir une portion de la représentation fréquentielle de l'objet. La représentation tridimensionnelle Fi dz q, 1] est alors

obtenue, comme dans le brevet WO99/53355, par superposition d'un ensemble de telles portions de sphères obtenues pour une série d'ondes d'éclairage différant entre elles par leur direction et obtenues par déplacement des miroirs galvanométriques. La représentation spatiale est obtenue par inversion de la transformation de Fourier.

Mode 3) obtention de projections d'un objet.

Des projections d'un objet peuvent être obtenues au moyen d'un masque (2046) opaque du type représenté sur la figure 7, comportant une ouverture (2161) en forme de bande elliptique, et placé dans un plan pupillaire.

La Fig. 10 précise les intermédiaires de calcul de cette bande elliptique et détaille le mode d'obtention des caractéristiques d'une ellipse limitant la bande elliptique (2161). Sur cette figure, le

F paramètre R vaut R = nFobJ ou n est l'indice de l'huile optique pour laquelle l'objectif est conçu.

F, 2044 Le diamètre DO du cercle 2160 limite la partie utile du plan pupillaire, compte tenu de l'ouverture de F l'objectif. Il vaut DO = 2ouv-/.,--. L'angle entre la direction de projection et l'axe optique est obj F2044 -' 2044 0. Les autres paramètres se déduisent de la figure : D3 Le rapport petit axe sur grand axe est-= cos (0). La position du centre CI de l'ellipse par rapport au D2 centre optique C0 s'obtient par :

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d'ou finalement :

Par exemple, dans l'exemple particulier de dimensionnement donné plus haut, on a D0=5mm et une ellipse limitant un masque utilisable pour 0 = 8 degrés a par exemple les caractéristiques suivantes, obtenues à partir des équations indiquées précédemment :

<tb>
<tb> paramètre <SEP> valeur
<tb> Dl30
<tb> D2 <SEP> 4, <SEP> 25
<tb> D3 <SEP> 4, <SEP> 21
<tb> La <SEP> largeur <SEP> de <SEP> la <SEP> bande <SEP> elliptique <SEP> doit <SEP> être <SEP> supérieure <SEP> au <SEP> diamètre <SEP> de <SEP> la <SEP> tache <SEP> de <SEP> diffraction <SEP> formée
<tb>
dans le plan pupillaire. Dans le cas présent elle peut valoir par exemple 20 microns. Ce masque à bande elliptique a été représenté sur la figure 11 pour une largeur de la bande elliptique égale à 20 microns. Plus la largeur de la bande est élevée, plus la profondeur de champ de l'image obtenue est faible, et plus la

luminosité est élevée. Il est donc préférable d'utiliser une largeur de bande faible dans la mesure ou cette largeur de bande reste compatible avec la luminosité nécessaire.

Si une projection suivant l'axe optique est recherchée, la bande est annulaire et centrée sur l'axe optique. Si une direction de projection plus inclinée est recherchée, l'ellipticité devient plus marquée et la bande est plus excentrée par rapport à l'axe optique.

Il est également possible de placer le masque à bande elliptique dans un autre plan pupillaire, par exemple un plan pupillaire ou est usuellement placé la lame de phase dans un objectif à contraste de phase.

Les miroirs galvanométriques doivent alors être commandés de manière à ce que le point d'impact du faisceau d'éclairage sur ce masque parcoure la bande elliptique pendant le temps d'intégration des capteurs. L'image Clil il obtenue est alors une projection suivant la direction verticale. Cette image peut être améliorée par une déconvolution bidimensionnelle dont les caractéristiques peuvent être obtenues soit par mesure de la réponse impulsionnelle soit par des considérations théoriques.

Dans ce mode d'imagerie la plus grande partie de l'onde diffractée est arrêtée par le masque (2046). Par contre la partie non diffractée de l'onde traverse entièrement le masque. En l'abscence de précautions particulières, l'onde diffractée devient négligeable par rapport à l'onde non diffractée et peut donc difficilement être détectée. Pour remédier à ce défaut, il est nécessaire d'utiliser une lame filtrante (2047). Cette lame est représentée sur la figure 12. Elle est par exemple constituée d'une vitre transparente

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comportant en plus un élément absorbant (2201) qui peut être par exemple en verre ou en plastique teinté et avoir un diamètre, dans l'exemple particulier de dimensionnement donné plus haut, d'environ 50 microns.

Cet élément absorbant (2201) doit être placé juste au-dessus du trou pratiqué dans la lame percée (2019). Il est également possible de supprimer la vitre (2047) et de couler directement un élément absorbant en plastique dans le trou (2101) pratiqué dans la lame percée. L'élément absorbant a pour fonction

d'atténuer l'onde non diffractée pour faciliter la détection de l'onde diffractée. La lame filtrante (2047) peut également être utilisée pour effectuer un filtrage plus élaboré de l'image, et peut par exemple avoir une absorptivité décroissant de son centre (2201) vers ses bords.

Au moyen de séparateurs de faisceau et d'interrupteurs rapides, par exemple à base de cristaux liquides ferroélectriques, on peut également séparer deux chemins sur lesquels deux masques différents peuvent être utilisés. En utilisant alternativement ces deux chemins on génère deux projections formant une image stéréoscopique. Le masque peut également être constitué d'un moduateur spatial à cristaux liquides, ce qui permet de modifier à volonté la direction d'observation.

Des modes d'utilisation différents, intermédiaires entre les modes génération de coupes, projection, et tomographique, peuvent être utilisés. En général le mode tomographique est celui qui permet la meilleure qualité d'image, et les deux autres modes sont utilisés pour l'observation en temps réel.

Des variations de ce mode de réalisation peuvent être utilisées. En particulier il est possible d'utiliser plusieurs lasers à des longueurs d'onde différentes, avec un système de commutation entre ces lasers, pour obtenir un effet de couleur. Il est également possible d'utiliser une source de lumière décrite par la Fig. 5. Sur cette figure de la lumière est produite au foyer (2130) d'une lampe à forte intensité, par exemple une lampe à vapeur de mercure. Cette lumière est collectée par un collecteur (2131) puis focalisée par une lentille fortement convergente (2132) vers un trou microscopique (2133). Le trou microscopique constitue une source ponctuelle dans un plan pupillaire. La lumière issue de ce trou microscopique traverse une lentille (2134) puis le diaphragme de champ (2135). Le plan focal objet de la lentille (2134) est sur le trou microscopique (2133). Le plan focal image de la lentille (2134) est sur le diaphragme (2135). La lumière issue du diaphragme de champ (2135) peut remplacer la lumière issue du laser et de son élargisseur de faisceau. L'avantage majeur de cette source de lumière est qu'elle est peu coûteuse et polychromatique, ce qui permet au moyen d'un filtre monochromateur de sélectionner diverses longueurs d'onde. Par contre,

même en optimisant bien le système, la plus grande partie de la lumière issue de la source est perdue et l'intensité utile est donc assez réduite. Ce défaut peut être combattu en élargissant simultanément le trou microscopique (2133) et le trou (2101) pratiqué dans la lame (2019). Toutefois ceci introduit des approximations qui peuvent être préjudiciables à la qualité de l'image. Si une telle source est utilisée, une caméra suffisamment sensible doit être utilisée. De plus, les lames demi-onde et tiers d'onde doivent être achromatiques, ce qui est aussi le cas lorsque plusieurs lasers sont utilisés.

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Il n'est pas indispensable d'utiliser des lames d'onde pour générer les décalages de phase. La Fig. 8 représente un dispositif de détection pouvant se substituer à celui de la figure 1. Après traversée de la lentille (2018) l'onde est divisée en trois par les séparateurs de faisceau (2170) et (2175). La partie de l'onde qui est réfléchie par (2170) traverse alors une lame (2171) placée dans un plan pupillaire et portant une surépaisseur au point d'impact de la partie non diffractée de l'onde d'éclairage. La surépaisseur doit être telle qu'elle génère un décalage de phase de 120 degrés entre l'onde la traversant et l'onde qui ne la traverse pas. L'onde traverse ensuite la lentille (2172) dont le plan focal objet est sur la lame (2171) et parvient au CCD (2173) situé dans le plan focal image de (2171) et fixé à la caméra (2174). L'ensemble (2176) (2177) (2178) (2179) est équivalent à l'ensemble (2171) (2172) (2173) (2174) mais la surépaisseur génère un décalage de phase de 240 degrés. L'ensemble (2180) (2182) (2183) est également équivalent mais ne comporte pas de lame avec surépaisseur (il peut éventuellement comporter une lame sans surépaisseur).

11 est également possible d'utiliser une seule caméra. Dans ce cas, les images correspondant aux trois décalages de phase doivent être prises successivement. Les trois caméras sont par exemple remplaçées par le dispositif de la figure 6. Sur cette figure, le faisceau issu de la lentille (2018) après avoir traversé la partie du dispositif de la Fig. 1 qui se trouve avant cette lentille, parvient à un séparateur de faisceau (2140).

La partie du faisceau qui est réfléchie par (2140) est ensuite réfléchie par le miroir piézoélectrique (2141) et parvient au trou microscopique (2142) qui coïncide avec le point d'impact de l'onde en l'abscence d'échantillon observé. La partie de l'onde qui traverse ce trou microscopique comprend essentiellement la partie non diffractée de l'onde et sera utilisée comme onde de référence. Elle traverse ensuite le séparateur de faisceau (2144).

La partie de l'onde qui traverse le séparateur de faisceau (2140) est réfléchie par le miroir (2143) et par le miroir semi-transparent (2144). Les deux ondes superposées traversent ensuite la lentille (2145) et parviennent au capteur CCD (2146) intégré à la caméra (2147).

L'orientation du miroir (2143) doit être réglée pour obtenir la teinte plate sur la caméra en l'abscence d'objet observé.

Le mode de fonctionnement est similaire au précédent mais l'acquisition simultanée sur les trois caméras est remplacée par l'acquisition successive d'images correspondant à des décalages de phase de 0,120, 240 degrés. Les décalages de phase sont réalisés au moyen du miroir piézoélectrique (2141). Lors des trois acquisitions successives nécessaires à l'obtention d'une image complexe, les miroirs galvanométriques doivent être commandés exactement de la même manière.

11 est possible d'ajouter dans le plan pupillaire situé entre (2140) et (2143) une lame portant un point absorbant au point d'impact de la partie non diffractée de l'onde, afin de ne conserver sur ce chemin que l'onde diffractée.

Les caméras ne sont pas nécessairement dans un plan image. La Fig. 9 montre un système de détection à une caméra placée dans un plan pupillaire. L'onde ayant traversé la lentille (2018) traverse les séparateurs de faisceau (2190) et (2191) avant de parvenir au CCD (2192) située dans un plan de fréquence

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pour cette onde. La partie de l'onde qui est réfléchie par le séparateur de faisceau (2190) traverse le trou microscopique (2194) qui coïncide avec le point d'impact fixe de la partie non diffractée de l'onde. La partie de l'onde qui a traversé (2194) constitue l'onde de référence et le trou microscopique (2194) peut être considéré comme étant dans un plan d'espace pour cette onde. L'onde issue de (2194) est réfléchie sur le miroir piézoélectrique (2195) et sur le miroir (2196). Elle traverse la lentille (2197), est réfléchie par le séparateur de faisceau (2191) et parvient au CCD (2192) fixé à la caméra (2193). Le mode d'utilisation est

similaire à celui du dispositif décrit sur la Fig. 6, les décalages de phase étant maintenant réalisés à l'aide du miroir piézoélectrique (2195). Mais la valeur complexe obtenue au pixel de coordonnées il représente maintenant Cf/, y1 au lieu de Cf/j et une transformée de Fourier inverse doit donc être effectuée pour retrouver l'image de l'objet. Des systèmes de détection utilisant trois caméras dans des plans pupillaires et une séparation du front d'onde par polarisation peuvent également être conçus. Il est possible de rajouter un plan pupillaire intermédiaire avant la caméra, dans lequel on place une lame portant un point absorbant situé au point d'impact direct de l'onde non diffractée. Ceci permet d'éviter la saturation de la caméra en ce point.

Il est également possible de supprimer les caméras et d'observer directement l'image à l'aide d'un oculaire, ou de n'utiliser qu'une caméra mais sur laquelle une seule image est acquise et retransmise à l'écran d'un ordinateur sans traitement préalable. Dans ce cas la partie du système de la figure 1 située après la lentille (2018) est remplacée par celle représentée sur la figure 14. L'onde issue de (2018) traverse une lame (2403) située dans le plan focal image de la lentille (2018), puis traverse la lentille (2404) dont le plan focal objet est sur la lame (2403), et parvient au capteur CCD (2405) fixé sur la caméra (2406). Le capteur et la caméra peuvent éventuellement être remplaçés par un oculaire (2407) formant l'image sur la rétine de l'oeil (2408) comme indiqué par la figure 15. La lame (2403) est représentée sur la figure 13 dans le cas ou une image en contraste de phase est recherchée. Elle est constituée d'une vitre portant en son

Tr centre une surépaisseur (2411) générant par exemple un décalage de phase de-. La surépaisseur (2411) 2

doit être placée au point d'impact fixe de la partie non diffractée de l'onde d'éclairage. Pour une image en fond clair la lame (2403) n'est pas indispensable, et dans le cas d'une image en mode obtention de projections la lame (2047) doit également être utilisée.

Les schémas des Fig. 1, 6, 8, 9,14, 15 peuvent être utilement complétés par des filtres neutres, éventuellement réglables, permettant d'ajuster l'intensité lumineuse dans les différentes parties du dispositif.

Applications industrielles :
Ce microscope peut remplacer les microscopes en fond clair, contraste de phase, ou DIC. Il offre une qualité d'image très supérieure, ainsi que la possibilité d'obtenir soit des coupes soit des projections de l'objet.

Claims (7)

1. 

   Revendications (ILD 1. Microscope comprenant : - des moyens pour éclairer l'objet observé avec une onde sensiblement plane, - des moyens pour faire varier la direction de cette onde d'éclairage sensiblement plane, - un objectif de microscope recevant l'onde diffractée par l'objet, caractérisé par le fait qu'il comprend des moyens pour rediriger vers un point fixe la partie non diffractée de l'onde issue de l'objet observé et ayant traversé l'objectif.
2. 2-Microscope selon la revendication 1, caractérisé par le fait que lesdits moyens rediriger vers un point fixe la partie non diffractée de l'onde sont constitués par un ou plusieurs miroirs mobiles.
3. 3-Microscope selon la revendication 2, caractérisé par le fait que lesdits miroirs mobiles sont dans des plans image.
4. 4-Microscope selon une des revendications 2 et 3, caractérisé par le fait que lesdits moyens pour rediriger

   

   l'onde ayant traversé l'objet les mêmes miroirs mobiles qui sont utilisés pour faire varier la direction de l'onde d'éclairage.
5. 5-Microscope selon la revendication 4, caractérisé par le fait que chacun desdits miroirs mobiles comporte une première face réfléchissant l'onde d'éclairage n'ayant pas encore traversé l'objet et une seconde face réfléchissant l'onde issue de l'objet.
6. 6-Microscope selon une des revendications 1 à 5, caractérisé par le fait qu'il comporte des moyens pour faire varier la direction de l'onde d'éclairage pendant le temps d'intégration des capteurs.
7. 7-Microscope selon une des revendications 1 à 6, caractérisé par le fait qu'il comprend un masque placé dans un plan pupillaire et absorbant l'onde partout sauf sur une bande transparente de forme elliptique.