FR2809819A1 - Methode de detection d'une transformation d'un substrat et ses applications - Google Patents

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Abstract

La présente invention concerne une méthode de détection et/ ou de quantification de la transformation chimique d'un substrat telle que ladite transformation chimique de ce substrat libère un produit détectable. L'invention concerne également des substrats susceptibles d'être utilisés dans cette méthode. L'invention concerne aussi l'utilisation de cette méthode dans un procédé de détection et éventuellement de quantification d'une transformation chimique dans un échantillon. L'invention concerne encore des nouveaux catalyseurs et de nouvelles enzymes identifiés par une méthode de détection et/ ou de quantification d'une transformation chimique d'un substrat selon l'invention.

Description

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METHODE DE DETECTION D'UNE TRANSFORMATION D'UN SUBSTRAT ET SES APPLICATIONS.
La présente invention concerne une méthode de mesure de la transformation chimique d'un substrat telle que ladite transformation chimique de ce substrat libère un produit détectable. L'invention concerne également des substrats susceptibles d'être utilisés dans cette méthode. L'invention concerne encore l'utilisation de cette méthode dans un procédé de détection et éventuellement de quantification d'une transformation chimique dans un échantillon.
De nombreux substrats libèrent après réaction un produit donnant un signal facilement identifiable. On peut citer les exemples bien connus des glycosides, des esters et des phosphates de phénols dont l'hydrolyse libère directement le phénol, qui est détecté en général par sa couleur (substrat chromogène) ou sa fluorescence (substrat fluorogène) (D. C. Demirjian, P. C. Shah, F. Moris-Varas, Top. Curr. Chem. 1999,200, 1 ; M. T. Reetz, K. -E. Jaeger, Top. Curr. Chem. 1999,200, 31) .
On peut citer également le 2-méthoxy-lnaphtalèneméthanol, dont l'oxydation donne le 2-méthoxy-lnaphtaldéhyde fluorescent (B. L. Vallee, brevet US 5,162,203 ; B. List, C. F. Barbas, R. A. Lerner, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1998,95, 15351 for utilisation in aldolases).
Ces types de substrat ont un désavantage majeur : le phénol chromogène ou fluorogène est un groupe fortement activé, ce qui rend ces substrats instables et
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2-méthoxy-1-naphtalèneméthanol, le problème est similaire puisque la position benzylique est sensible à l'oxydation non-spécifique.
Une deuxième classe de substrat conduit à la révélation d'un produit obtenu après réaction secondaire enzymatique et/ou spontanée. Il existe quelques exemples, comme des substrats de pénicillinase (Brevet US 5,583,217), des substrats d'alcool déhydrogenase (ADH) (G. Klein, J.-L.
Reymond, Bioorg. Med. Chem. Lett. 1998, 8, 1113) et des substrats d'aldolase (N. Jourdain, R. Pérez Carlôn, J. -L.
Reymond, Tetrahedron Lett. 1998, 39, 9415).
On peut également noter l'existence d'un substrat pour mesurer le NADH (C. A. Roeschlaub, N. L.
Maidwell, M. R. Rezai, P. G. Sammes, Chem. Commun. 1999, 1637).
Enfin, on peut citer des substrats dont le produit de la réaction secondaire détecté est obtenu par l'action de la beta-galactosidase (K. L. Matta, C.F. Piskorz, J. J. Barlow, Carbohydr.Res. 1981,90, C1-C3) ou par l'ADH (G. Klein, J. -L. Reymond, Helv.Chim.Acta 1999,82, 400) .
Cette deuxième classe de substrat est plus stable. Cependant, cette deuxième classe de substrats est limitée à des utilisations particulières, car le fait d'utiliser une enzyme pour la réaction secondaire représente un inconvénient en terme de coût et de flexibilité.
Les travaux de recherche effectués dans le
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développer une méthode de détection d'une transformation chimique. Ainsi, la présente invention se propose de résoudre les inconvénients rapportés ci-dessus en utilisant une méthode de mesure d'une transformation chimique fiable, sensible et reproductible, mettant en oeuvre un substrat stable dans le milieu dans lequel se produit la réaction chimique, et tel que les transformations successives libèrent un composé détectable.
La détection de cette transformation est obtenue selon le procédé de l'invention grâce à une méthode de détection d'une transformation chimique d'un substrat en un composé détectable, caractérisée en ce qu'elle comprend les deux étapes non simultanées suivantes : a) la transformation chimique d'un substrat de formule (I) dans laquelle la liaison C1-C2 est insensible à une coupure par une réaction d'oxydation chimique :
Figure img00030001

en un composé de formule (II) dans laquelle la liaison C1-C2 est sensible à une coupure par une réaction d'oxydation chimique :
Figure img00030002
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(b) l'oxydation chimique du composé de formule (II) obtenu à l'étape (a) qui coupe la liaison C1-C2 pour obtenir directement ou indirectement un composé détectable, et en ce que dans les composés de formules (I) et (II) : - au moins un des groupes Ri à R6 est un précurseur d'un composé détectable, désigné aussi ci-après Di qui est insensible à l' oxydation chimique de l'étape (b) - les groupes Ri à R6, identiques ou différents, sont choisis parmi : atome d'hydrogène, un groupe alkyle substitué ou non, un groupe fonctionnel substitué ou non et dans le cas d'un groupe fonctionnel de formules -OR12, -SR12 ,-NR11R12, R11 est choisi parmi: un atome d'hydrogène, un groupe alkyle, un groupe aryle, substitués ou non, et R12 n'est pas un atome d'hydrogène, - le ou les groupes Ri à R6 formant après l'étape (a) les groupes de formules-XH et-YH sont insensibles à l'oxydation de l'étape (b), ou peuvent être sensibles à cette oxydation si le composé de formule (I) correspondant ne conduit pas lors d'une oxydation du type de celle de l'étape (b) au composé de formule (II), - X et Y, identiques ou différents, sont choisis parmi un atome d'oxygène, un atome de soufre, une amine de formule -NR11, - R7 à R10, identiques ou différents, sont, soit identiques à quatre au plus des groupes Ri à R6, soit, du fait de la transformation d'un ou plusieurs des groupes Ri à R6,lors de la réaction de l' étape (a), choisis parmi un atome d'hydrogène, un groupe alkyle substitué ou non, ou un groupe fonctionnel substitué ou non, et au moins un des groupes R7 à R10 est un précurseur d'un composé détectable Di, qui est insensible à la réaction d'oxydation de l'étape
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La méthode de l'invention accepte plusieurs significations préférées des groupes RI à R6, parmi lesquelles on envisage plus particulièrement les cas suivants : - Ri à R6 sont choisis de façon à ce que la liaison Cl-C2 fasse partie d'au moins un cycle, - au moins une paire des groupes Ri à R6 forment ensemble un atome d'oxygène, un atome de soufre, ou un groupe de formule -NRn, - au plus une paire de groupes Ri à R6 dont l'un est choisi parmi Ri, R2 et R6 et l' autre choisi parmi R3, R4 et R5 forment une double liaison entre les carbones Ci et C2, - au plus deux paires de groupes Ri à R6 dont l'un est choisi parmi Ri, R2 et R6 et l'autre choisi parmi R3, R4 et R5 forment une triple liaison.
Un exemple de schéma de détection d'une transformation chimique d'un substrat selon l'invention est représenté à la figure 1 en annexe.
La méthode de l'invention accepte également une modification d'un des groupes R7 à Rio en dehors de Di, par l' oxydant chimique de l' étape (b) , à condition que cela ne perturbe pas la coupure de la liaison C1-C2 lors de l'étape (b) ni lors de la révélation ultérieure.
Dans une forme particulière de mise en #uvre du procédé de l'invention où les étapes (a) et (b) sont simultanées, le ou les groupes Ri à R6 sont insensibles à l' oxydation de l' étape (b) .
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La méthode de l'invention peut être mise en oeuvre avec un substrat comprenant plusieurs groupes chimiques susceptibles d'être transformés à l'étape (a) et plusieurs groupes chimiques précurseurs de composés détectables.
Selon la transformation chimique étudiée et/ou la structure du substrat utilisée, la méthode de l'invention pourra être réalisée dans un milieu réactionnel adéquat choisi parmi un milieu aqueux, organique ou biphasique...
Dans le cadre de la présente invention, on entend par : - transformation chimique ou réaction chimique, toute transformation d'un substrat qui peut être spontanée ou non et qui peut nécessiter des conditions expérimentales particulières comme la chaleur, les UV, etc. Dans le cas d'une transformation chimique non spontanée, la réaction peut nécessiter un réactif chimique ou un catalyseur comme une enzyme. Cette transformation chimique de l'étape (a) peut être réalisée au moyen de plusieurs réactions séquentielles, simultanées ou non.
- Composé détectable : un ou plusieurs composés susceptibles de présenter seuls ou en combinaison une variation de leurs propriétés biophysiques, biologiques ou chimiques avant et après l'étape d'oxydation chimique, telles que notamment une variation de type spectral ou une variation de la solubilité.
- Oxydation chimique : Toute réaction chimique réalisée en présence d'un réactif chimique susceptible d'oxyder le produit résultant de l'étape (a) et induisant une coupure de la liaison entre les atomes Ci et C2.
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- Groupe fonctionnel : tout groupe chimique appartenant à une classe de composés organiques caractérisée par des propriétés chimiques. On peut citer à titre d'exemple de groupe fonctionnel : des amides, des acyles, des alcoxy, des nitriles, des aryles, des hétéroaryles, des alkenyles, des carbonyles, des thiocarbonyles, des carboxyles, des thiocarboxyles, des carbamyles, des thiocarbamyles, des thiocarbamides, des alcools, des thiols, des amines substitués ou non.
Les groupes Ri à R10 quelle que soit leur signification peuvent être constitués ou comprendre un isotope comme par exemple le deutérium. En outre, avantageusement, les groupes RI à RIO sont stables dans un milieu réactionnel, notamment aqueux, organique, biphasique, etc.
Avantageusement, le substrat mis en #uvre dans le procédé de l'invention comprend un ou plusieurs centres chiraux. Le substrat mis en #uvre dans le procédé de l'invention peut donc être constitué d'un mélange d'énantiomères, ou de diastéréoisomères, ou d'énantiomères purs.
Des substrats préférés répondant à la formule I sont décrits ci-après.
Une première classe de substrat (I) répond aux formules (V) à (IX) suivantes :
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Figure img00080001

dans lesquelles : - Di représente le groupe précurseur d'un composé détectable, - R1 à R3 et X et Y ont les mêmes significations que précédemment, - Au plus un des groupes Pl et P2 est un atome d'hydrogène. P1 P2 , identiques ou différents sont choisis parmi, un groupe acyle substitué par un groupe aryle ou alkyl ou peptidyle, un groupe phosphate, un groupe ester phosphate, un groupe phosphonate, un groupe carbamyle substitué par un groupe aryle ou acyle ou peptidyle, un groupe glycosyle et un groupe sulfate, - P3 est choisi parmi un groupe carbonyle, un groupe -PO2R11 ou un groupe R11PO-, où R11 présente la même signification que précédemment, un groupe -SO2, un groupe -CHOR13 où R13 représente un groupe aryle, alkyle ou glycosyle, un groupe SiR14R15 où R14 et R14, identiques ou différents, représentent un groupe aryle, alkyle, aryloxy ou alcoxy et un groupe As02H-.
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G est choisi parmi un atome d'oxygène, un atome de soufre, un groupe amine de formule NRn où R11 a la même signification que dans la revendication 1
Le produit du substrat obtenu après la première étape de la méthode de l'invention à partir des substrats de formules (V), (VI), (VII) (VIII) et (IX) répond à la formule (II) ou avantageusement à la formule (X) suivante :
Figure img00090001

(X) dans laquelle, Di, X, Y, R8, Rg, et R10 ont la même signification que précédemment.
La détection de la transformation chimique selon l'invention est mise en #uvre soit par une révélation directe, soit par une révélation indirecte du composé obtenu après l'oxydation chimique du composé de formules (II) ou (X) effectué au moyen d'un agent chimique oxydant selon l'étape (b).
Avantageusement et de façon non limitative, ledit agent chimique oxydant contient un ou plusieurs des réactifs suivants, H15IO6, RuO2, OsO4, (CH3CH2CH2)4N(RuO4), NaC104, NaI04, Na3H2I06, NaMn04, K2OsO4, KIO4, KMn04, KRu04, K2Ru04, LiOCl, l'acétate de plomb, le tétrapropyle ammonium periodate, l'acide chromique ou des sels de celuici,NaBi03,Ph3BiC03, Ca(OCl)2, les réactifs Ce(IV), Cr(VI), les sels de Co (II), IOAc, I(OAc)3, N-iodosuccinimide, VO(acac), Pb(OAc)4, Mn02, ou le mélange des réactifs [H202, Na2W04, H3P04] .
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De manière préférée, l'agent chimique oxydant est l'anion periodate (104-) sous forme de sel.
Le tétrapropyle ammonium periodate, soluble en phase organique, est avantageusement utilisé lorsque la méthode de l'invention est réalisée en milieu organique.
Selon un mode de révélation préférée ci-après nommée révélation directe, selon laquelle le composé répondant à la formule (XI) obtenu après la réaction d'oxydation chimique effectuée sur le dérivé répondant aux formules (II) ou (X) après l'étape (b), est directement détectable, selon le schéma ci-dessous.
Révélation directe
Figure img00100001

HX YH Oxydation- 7 8 9 chimique R9 R7 j chimique chimique R9 Di R7""R8 (X) (XI)
Un mode de réalisation de l'invention avec une révélation directe met en #uvre la détection directe d'une propriété du composé de formule (XI), non présente sur les composés de formules (I) ou (II) ou (X).
A titre d'exemples non limitatifs on peut citer parmi ces propriétés du composé (XI), une propriété physique, telle que la solubilité, une propriété physicochimique, telle qu'une propriété spectrale, ou une propriété biologique, telle que l'activation d'une enzyme, une odeur, ou l'action d'une phéromone.
La molécule répondant à la formule (XI) peut
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cétone béta-aromatique que l'on détecte par une variation spectrale, un aldéhyde comme le benzaldéhyde ou le citronellal que l'on détecte par l'odeur ou à une phéromone que l'on détecte par l'attraction d'insectes. (Suzuki et al., (1980). Agric. Biol.Chem. 44,2519 et Millar et al.
(1996). Bioorg. Med.Chem. 3,331-340).
Dans un deuxième mode de révélation préférée, ci-après nommé de révélation indirecte, le composé (XII), obtenu après l'étape (b) d'oxydation chimique du composé de formules (II) ou (X), subit une réaction de bétaelimination conduisant au groupe détectable ZH, selon le schéma ci-dessous.
Révélation indirecte
Figure img00110001

HX YH Oxydation Y R16Rl7 Di Oxydation R16R17 R7 8 chimique R9 H R18 R8 R9 R9 H R18 (X) (XII) béta-élimination Y Ri7 A.==/ R17 + Z ### ZH R9 if"-R18 16 le groupe Di, répondant à la formule (XIII) suivante:
Figure img00110002
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dans laquelle : - R17, R18 et R19, identiques ou différents, représentent un atome d'hydrogène, un groupe alkyle substitué ou non ou un groupe fonctionnel substitué ou non, et - Z est un groupe transformable en un composé détectable ZH par une réaction de bêta-élimination.
Dans ce mode de réalisation de l'invention avec une révélation indirecte, on réalise la détection d'une propriété du composé ZH obtenu par une réaction de béta- élimination effectuée sur le composé de formule (XII) obtenu après l'étape (b) d'oxydation chimique. Cette réaction de béta-élimination, avantageusement spontanée, est réalisée préférentiellement en présence d'une base appelée B qui peut correspondre à l'albumine de sérum de b#uf (BSA) .
Parmi les propriétés du composé ZH, on peut citer à titre d'exemples non limitatifs une propriété physique telle que la solubilité, une propriété physicochimique telle qu'une propriété spectrale ou une propriété biologique telle que l'induction de croissance de bactéries.
Le composé ZH est choisi parmi un alcool aromatique, un alcool hétéroaromatique, une amine hétéroaromatique, un atome d'halogène, ou un ester phosphorique. A titre d'exemples non limitatifs peuvent être cités, la fluorescéine, la phenolphtaléine, le rouge de phénol, le p-nitrophénol l'o-nitrophénol, le 2,4dinitrophénol, l'acide 6-hydroxynaphtoïque, l'acide 8hydroxy-pyrène 1,3,6-trisulfonique, la tyrosine, la
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luciférine, l'indolyle, le 5-bromo-4-chloro-indolyle, le quinolinium, le nitro-anilinium, ou la pyridoxamine.
Dans un troisième mode de révélation préférée, le composé (XIV), obtenu après l'étape (b) d'oxydation chimique du composé de formules (II) ou (X), répond à la formule XIV suivante :
Figure img00130001

dans laquelle :
Di, R8, R9, X et Y ont les mêmes significations que précédemment et, - les deux groupes détectables Di identiques ou différents, l'un attaché au carbone Ci, le deuxième attaché au carbone Cz interagissent entre eux.
Dans ce cas, la coupure de la liaison C1-C2 sur ce composé (XIV) provoque une variation spectrale détectable.
Un exemple non limitatif d'interaction entre les deux groupes Di est un transfert d'énergie de type FRET.
Un schéma représentant cette révélation mettant en #uvre un transfert d'énergie de type FRET est représenté figure 2 en annexe.
Des exemples de substrats permettant la mise en oeuvre de l'invention avec une révélation directe sont des composés de formule (V) dans lesquelles les groupes X, Y,
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R1, R2, R3 et Di sont choisis parmi ceux décrits dans le tableau suivant.
Pour tous les composés décrits dans les tableaux suivants, illustrant des exemples particuliers de substrats selon l'invention, la stéréochimie est toujours réalisée dans toutes les variantes possibles.
Tableau I
Figure img00140001
<tb>
<tb> N <SEP> X <SEP> Y <SEP> R1 <SEP> R2 <SEP> R3 <SEP> Di
<tb> 6 <SEP> NH <SEP> 0 <SEP> H <SEP> H <SEP> H <SEP> 6'-methoxy-2'-naphtyl
<tb> 7 <SEP> NH <SEP> 0 <SEP> COOH <SEP> H <SEP> H <SEP> 6'-methoxy-2'-naphtyl
<tb> 8 <SEP> NH <SEP> 0 <SEP> CONH- <SEP> H <SEP> H <SEP> 6'-methoxy-2'-naphtyl
<tb> peptide
<tb> 17 <SEP> 0 <SEP> O <SEP> H <SEP> H <SEP> H <SEP> 6'-methoxy-2'-naphtyl
<tb>
Le groupe 6'-methoxy-2'-naphtyl correspond à la formule :
Figure img00140002
Des exemples de substrats permettant la mise en oeuvre de l'invention avec une détection indirecte sont des composés de formule (V) dans lesquelles les groupes X, Y; R11, R12, R13, ainsi que les groupes R1, R2, R3 et ZH sont choisis parmi ceux décrits dans le tableau II suivant.
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Tableau II
Figure img00150001
<tb>
<tb> Di
<tb> N <SEP> X <SEP> Y <SEP> R1 <SEP> R2 <SEP> R3 <SEP> R16 <SEP> R17 <SEP> R18 <SEP> Z
<tb> 1 <SEP> NH <SEP> 0 <SEP> H <SEP> H <SEP> H <SEP> H <SEP> H <SEP> H <SEP> Coum*/NP**
<tb> 2 <SEP> NH <SEP> O <SEP> CH2 <SEP> H <SEP> H <SEP> H <SEP> CH2 <SEP> H <SEP> Coum*/NP**
<tb> 3 <SEP> NH <SEP> 0 <SEP> COOH <SEP> H <SEP> H <SEP> H <SEP> H <SEP> H <SEP> Coum*/NP**
<tb> 4 <SEP> NH <SEP> O <SEP> CONH-peptide <SEP> H <SEP> H <SEP> H <SEP> H <SEP> H <SEP> Coum*/NP**
<tb> 5 <SEP> NH <SEP> 0 <SEP> H <SEP> H <SEP> Me <SEP> H <SEP> H <SEP> H <SEP> Coum*/NP**
<tb> 9 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> H <SEP> H <SEP> H <SEP> H <SEP> H <SEP> H <SEP> Coum*/NP**
<tb> 10 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> Me <SEP> Me <SEP> H <SEP> H <SEP> H <SEP> H <SEP> Coum*/NP**
<tb> il <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> H <SEP> CH2 <SEP> H <SEP> H <SEP> CH2 <SEP> H <SEP> Coum*/NP**
<tb> 12 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> (MeO)CHO <SEP> H <SEP> H <SEP> 0-CH(OMe) <SEP> H <SEP> H <SEP> Coum*/NP**
<tb> 13 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> H <SEP> H <SEP> Me <SEP> H <SEP> H <SEP> H <SEP> Coum*/NP**
<tb> 14 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> Et <SEP> H <SEP> H <SEP> H <SEP> H <SEP> H <SEP> Coum*/NP**
<tb> 15 <SEP> O <SEP> O <SEP> (MeO)CHO <SEP> H <SEP> H <SEP> O-CH(OMe) <SEP> H <SEP> H <SEP> Coum*/NP**
<tb> 16 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> (Ade)CHO <SEP> H <SEP> H <SEP> O-CH(Ade) <SEP> H <SEP> H <SEP> Coum*/NP**
<tb> 18 <SEP> NH <SEP> NH <SEP> H <SEP> H <SEP> H <SEP> H <SEP> H <SEP> H <SEP> Coum*/NP**
<tb>
* Coum = 7-oxycoumarine ** NP = paranitro-phenoxy
Figure img00150002

Les structures correspondantes aux substrats du tableau II sont représentées ci-après:
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- Aminoalcools
Figure img00160001

OP, ! PIHN OP2 ! PIHN OP2 f'oP2 -v. "Y (1) (2) COOH (3) ou NU 1 (4) peptide OP, OP2 OP, OP2 PlHNV P1HN P1HN 1 P HN op2 1 OOH Y '0 COOH NH 1 (5) (6) (7) peptide (8) Diamines NHP2 P1HN (18)
Les diamines peuvent être mono ou disubstituées, les groupes P1 et P2 ne pouvant pas correspondre tous les deux à H.
P1 et/ou P2 peuvent correspondre à:
Figure img00160002
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- Diols:
Figure img00170001
Base = A,C,G,U Les diols peuvent être mono ou disubstitués.
Dans le cas particulier d'une disubstitution, les deux radicaux hydroxyle peuvent être substitués identiquement comme suit:
Figure img00170002
Dans le cas d'une monosubstitution, à titre d'exemple particulier, les radicaux hydroxyle peuvent être monofonctionalisés comme ci-dessus, et en plus comme suit:
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Figure img00180001

0 0 )00 HO """'p""'" 0 HO OH 0""'" """'OR' , , , , OH R"'" = extrémité 5' d'une chaine ADN ou ARN
A titre d'exemple particulier de mise en oeuvre de l'invention, la révélation de l'étape (b) est réalisée de manière séquentielle en utilisant des substrats au moins disubstitués comme le substrat disubstitué de la formule XVII suivante,
Figure img00180002

(XVII) dans laquelle : Di, RI, R2, R6, P1, P2, X et Y ont les mêmes significations que précédemment.
Un mode préféré de réalisation de la méthode de l'invention mettant en #uvre un substrat répondant à la formule (V) ci-dessus, comprend la transformation de dérivés mono ou diesters des diols (1 a/b) par une lipase ou une estérase pour conduire au composé (2) conformément au schéma ci-dessous.
Figure img00180003
Un autre mode préféré de réalisation de la méthode de l'invention mettant en #uvre un substrat appartenant à la deuxième classe ci-dessus, comprend la
Figure img00180004

T v. -, r, (""'0 -F r"\ 'V"Tro # i4--î/-M-t r7 .1 i. v ; TTA (""'t TY\ r"\ Y'\ r"\ - An r1 "'" (""'1 T ......... "'V' (""'0 r"\ (""'1 .ri ....... l (""'1 1
<Desc/Clms Page number 19>
a/b) par une lipase ou une estérase pour conduire au composé (4) conformément au schéma ci-dessous.
Figure img00190001
A titre d'exemple de substrats de formule (VI), on peut citer plus particulièrement ceux correspondant aux formules ci-dessous ;
Figure img00190002
A titre d'exemple de substrats de formule (VII) mis en oeuvre dans la méthode de l'invention avec une révélation directe on peut citer plus particulièrement ceux décrits dans le tableau III suivant :
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Tableau III
Figure img00200001
<tb>
<tb> Di
<tb> N <SEP> Ri <SEP> R2 <SEP> R3 <SEP> Riel <SEP> R17 <SEP> R18 <SEP> Z
<tb> 19 <SEP> H <SEP> H <SEP> H <SEP> H <SEP> H <SEP> H <SEP> coum/NP
<tb> 20 <SEP> H <SEP> H <SEP> Me <SEP> H <SEP> H <SEP> H <SEP> coum/NP
<tb> 21 <SEP> Me <SEP> Me <SEP> H <SEP> H <SEP> H <SEP> H <SEP> coum/NP
<tb> 22 <SEP> Et <SEP> H <SEP> H <SEP> H <SEP> H <SEP> H <SEP> coum/NP
<tb> 23 <SEP> CH2- <SEP> H <SEP> H <SEP> H <SEP> CH2- <SEP> H <SEP> coum/NP
<tb>
Coum et NP ont le mêmes significations que précédemment.
A titre d'exemple de substrats de formule (VII) mis en oeuvre dans la méthode de l'invention avec une révélation indirecte on peut citer plus particulièrement ceux décrits dans le tableau IV suivant :
Tableau IV
Figure img00200002
<tb>
<tb> N <SEP> R1 <SEP> R2 <SEP> R3 <SEP> Di
<tb> 24 <SEP> H <SEP> H <SEP> H <SEP> napht
<tb>
Les structures correspondantes aux substrats des tableaux III et IV sont représentées ci-après
Figure img00200003

Un mode préféré de réalisation de la méthode de
Figure img00200004

"1 1 ..... -- ............1.....! -1 -- - .L..1... - ......1... - ..... -- .. -- -- - .~~,. - . - 1- - - -- - - -- ::.. -- - -.... ~1..... -- .1....:::. 'l
<Desc/Clms Page number 21>
formule (VII) ci-dessus, comprend la transformation de l'époxyde (7) par une époxyde estérase pour conduire au composé (2) conformément au schéma ci-dessous.
Figure img00210001
Un autre mode préféré de réalisation de la méthode de l'invention mettant en #uvre un substrat répondant à la formule (VII) ci-dessus, comprend la transformation de l'époxyde (8) par un époxyde hydrolase pour conduire au composé (4) conformément au schéma cidessous.
Figure img00210002
A titre d'exemple de substrats de formule (VIII) mis en oeuvre dans la méthode de l'invention avec une révélation indirecte on peut citer plus particulièrement ceux décrits dans le tableau V suivant, où les groupes coum et NP ont le mêmes significations que précédemment.
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Tableau V
Figure img00220001
<tb>
<tb> Di
<tb> N <SEP> Ri <SEP> R2 <SEP> R3 <SEP> R16 <SEP> R17 <SEP> R18 <SEP> Z
<tb> 25 <SEP> H <SEP> H <SEP> H <SEP> H <SEP> H <SEP> H <SEP> coum/NP
<tb> 26 <SEP> H <SEP> H <SEP> Me <SEP> H <SEP> H <SEP> H <SEP> coum/NP
<tb> 27 <SEP> Me <SEP> Me <SEP> H <SEP> H <SEP> H <SEP> H <SEP> coum/NP
<tb> 28 <SEP> Et <SEP> H <SEP> H <SEP> H <SEP> H <SEP> H <SEP> coum/NP
<tb> 29 <SEP> CH2- <SEP> H <SEP> H <SEP> H <SEP> CH2- <SEP> H <SEP> coum/NP
<tb>
A titre d'exemple de substrats de formule (VIII) mis en oeuvre dans la méthode de l' invention avec une révélation directe on peut citer plus particulièrement ceux décrits dans le tableau VI suivant:
Tableau VI
Figure img00220002
<tb>
<tb> N <SEP> R1 <SEP> R2 <SEP> R3 <SEP> Di
<tb> 30 <SEP> H <SEP> H <SEP> H <SEP> napht <SEP>
<tb>
Les structures correspondantes aux substrats des tableaux V et VI sont représentées ci-après
Figure img00220003
Un mode préféré de réalisation de l'étape (a) de la méthode de l'invention mettant en #uvre un substrat selon la formule (VIII) ci-dessus, comprend la
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transformation de l'oléfine (9) par une dihydroxylase pour conduire au composé (2) conformément au schéma ci-dessous :
Figure img00230001
Un autre mode préféré de réalisation de l'étape (a) de la méthode de l'invention mettant en #uvre un substrat selon la formule (VIII) ci-dessus, comprend la transformation de l'oléfine (10) par une dihydroxylase pour conduire au composé (4) conformément au schéma ci-dessous.
Figure img00230002
A titre d'exemple de réaction d'oxydation, selon l'étape (b), des produits issus de l'étape (a), on peut citer les deux réactions suivantes:
Avec une méthode de révélation directe
Figure img00230003
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Avec une méthode de révélation indirecte
Figure img00240001
L'invention concerne aussi les substrats répondant aux formules (V), (VI), (VII), (VIII) et (IX).
Ces substrats présentent un intérêt particulier et notamment, il sont susceptibles d'être mis en #uvre dans la méthode décrite précédemment.
Avantageusement ces substrats sont stables dans le milieu réactionnel.
La méthode de l'invention est remarquable en ce qu'elle permet de détecter une transformation chimique éventuellement présente dans un échantillon en choisissant un substrat le plus adapté à la transformation que l'on souhaite analyser.
Avantageusement, ces substrats présentent des degrés de spécificité divers. Ces degrés de spécificité sont apportés par la structure d'un ou des groupes Ri à R6 de la formule (I), ou Ri à R3 ou G ou P1 à P3 des formules (V), (VI), (VII), (VIII) ou(IX).
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A titre d' exemple, dans le cas de la détection d'une transformation chimique effectuée par une lipase, le ou les groupes Ri à R6 sont choisis pour que les substrats répondant à la formule (I) soient proches de la structure du substrat naturel. En particulier ils peuvent correspondre à une chaîne d'acide gras. L'homme du métier saura, en fonction du type de transformation chimique à détecter, adapter le choix de ou des groupes Ri à R6
La méthode de l'invention permet d'identifier une transformation chimique énantio- ou stéreo-sélective dans un échantillon.
Avantageusement, la transformation chimique est effectuée au moyen d'un catalyseur et en particulier d'une enzyme. A titre d'exemple non limitatif, la méthode de l'invention permet la détection de l'activité d'une enzyme choisie parmi : Lipase, Estérase, Protéase, Glycosidase, Glycosyl transférasse, Phosphatase, Kinase, Mono ou Dioxygenase, Haloperoxidase, Lignine peroxydase, Diarylpropane peroxydase, Epoxyde hydrolase, Nitrile hydratase, Nitrilase, Transaminase, Amidase, Acylase, Dihydroxylase, Phytase, Xylanase, Nucléase, Réductase.
Dans le cas d'une transformation chimique spontanée ou non, on peut citer notamment : hydrolyse spontanée ou thermique d'un ester, une dihydroxylation d'oléfine par les réactifs AD-mix, une hydrolyse des époxydes par des complexes de Chrome.
L'invention concerne donc enfin un procédé de détection et/ou de quantification d'une transformation chimique connue, dans un échantillon consistant à mettre en
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décrite précédemment en présence dudit échantillon et d'un substrat adapté à l'activité recherchée.
L'invention permet également de détecter le substrat de formule (I) en présence d'un réactif catalyseur chimique ou biochimique.
Une forme particulière de mise en oeuvre de la méthode de l'invention concerne le cas où le substrat de formule (I) est lui-même le produit d'une première transformation chimique inconnue, dont on souhaite identifier l'activité.
A titre d'exemple de cette forme particulière de mise en #uvre du procédé de l' invention, on peut citer la réaction d'époxydation d' oléfines pour les transformer en époxydes de formules(I) ou (VII), lesdits epoxydes subissent ensuite une réaction enzymatique afin d'obtenir les diols de formules (II) ou (X), lesquels seront soumis à une réaction d'oxydation chimique par le periodate.
La méthode de l'invention est remarquable en ce qu'elle permet également l'identification et l'isolement de nouveaux catalyseurs chimiques ou biochimiques susceptibles de transformer un substrat de formule (I) en un composé de formule (II). En effet la méthode de l'invention permet de révéler la présence d'un catalyseur qui, grâce à l'oxydation chimique, génère un signal directement ou indirectement détectable.
En conséquence, l'invention a également pour objet l'utilisation de la méthode de détection d'une transformation chimique, comme décrite précédemment, pour
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nouvelle d'un catalyseur connu. L'invention se rapporte aussi à un catalyseur susceptible d'être identifié par la méthode de l'invention.
Ces nouveaux catalyseurs sont spécifiques des conditions expérimentales utilisées lors de leur détection.
Plus particulièrement, la méthode de l'invention est remarquable en ce qu'elle permet également l'identification et l'isolement de nouvelles enzymes susceptibles de transformer un substrat de formule (I) en un composé de formule (II). En effet la méthode de l'invention permet de révéler la présence d'une enzyme qui, grâce à l'oxydation chimique, génère un signal directement ou indirectement détectable.
En conséquence, l'invention a également pour objet l'utilisation de la méthode de détection d'une transformation chimique, comme décrite précédemment, pour l'identification de nouvelles enzymes, ou de l'activité nouvelle d'une enzyme connue. L'invention se rapporte aussi à une enzyme susceptible d'être identifié par la méthode de l'invention.
Ces nouvelles enzymes sont spécifiques des conditions expérimentales utilisées lors de leur détection.
D'autres avantages et caractéristiques de l'invention apparaîtront à la lecture des exemples cidessous qui font partie des travaux expérimentaux effectués par la Demanderesse dans le cadre de l'invention.
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Exemple 1: Préparation du 4-(7-coumarinyloxy)- 1-butène.
Figure img00280001
XXX o o 0 4-(7-coumarinyloxy)-1-butène.
Une suspension de 7-hydroxycoumarine (3 g, 19.6 mmol) dans le DMF (20 mL) est traitée avec du NaH (60% suspension dans l'huile, 1. 03 g, 25.9 mmol), puis avec du 4-bromo-1-butène (2. 65 g, 19. 6 mmol. On chauffe à 60 C pendant 24 h, puis on dilue avec de l'acétate d'éthyle (400 mL) et on lave avec de l'eau (3 x 300 mL) puis avec du NaOH 1 M (3 x 200 mL). On chromatographie le résidu (acétate d'ethyle-hexane) pour obtenir le 4-(7-coumarinyloxy)-1butène (2.7 g, 67 %).
Exemple 2 : du (S)-4-(7- coumarinyloxy)-1,2-butanediol.
Figure img00280002
0Jno (S)-4-(7-coumarinyloxy)-1,2-butanediol
On agite une suspension d'AD-mix-alpha (4. 2 g) dans 30 mL de t-BuOH/eau 1 :1 l'obtention d'une seule phase (5 min. ). On refroidit alors à 0 C et on ajoute l'oléfine (0. 648 g, 3 mmol). Après 16 h à 0 C, on quenche avec du Na2S205 (4.5 g) . Après une heure à température ambiante, on extrait avec du CH2C12 et on chromatographie (élution CH2Cl2/acétone 7:3) pour obtenir 0. 6 g (80 %) de diol pur (S).
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m.p. 92-93 C, [a]D 20=-22.4 (c 0.46, CH30H);
1H-NMR (CD30D) 7. 83 (d, 1H, J=9.8 Hz), 7. 47 (d, 1H, J=8.3
Hz), 6.85-6.92 (m, 2H), 6.21 (d, 1H, J=9.3 Hz), 4.16-4.23 (m, 2H) , 3. 81-3. 93 (m, 1H) , 3. 54 (d, 2H, J=6.35 Hz) , 1. 97-
2. 13 (m, 1H), 1. 74-1.91 (m, 1H).
La même procédure avec l'AD-mix béta donne l'énantiomère R.
Exemple 3 : du (S)-4-( 7- coumarinyloxy) - 1,2-epoxybutane.
Figure img00290001
(S)-4-(7-coumarinyloxy)-1,2-epoxybutane (7)
A une solution de (S)-4-(7-coumarinyloxy)-1,2butanediol (0.15 g, 0.6 mmmol) dans le CH2C12, on ajoute du triméthyl orthoacétate (1 mL), puis du pyridinium paratoluène sulfonate (1 mg). Après 40 min., on évapore le tout et on dissout le résidu dans le CH2C12 (1 mL) et on traite avec Me3SiCl (0. 1 mL, 0.78 mmol). Après une heure, on ajoute du méthanol sec (1 mL) et du carbonate de potassium (0,2 g, 1.5 mmol). On laisse 2 h à 20 C, puis on filtre et on chromatographie le filtrat (hexane/acétate d'éthyle 6 :4) obtenir l'époxyde (S) (0. 097 g, rendement 70%). m.p. 61-64 C, [[alpha]]D 20 =-23.0 (c 0.3, CHC13); 1H-NMR (CDC13) : 7. 58 (d, 1H, J=9.3 Hz), 7. 31 (d, 1H, J=8.3
Figure img00290002

TT 1 -1 - -1 1 -, r"r\'1 1 -.nn .. Il nn 1 1
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(m, 2H), 3.05-3.14 (m,lH), 2.78 (t, 1H, J=4.9 Hz), 2.53 (dd, 1H, J=4.9 et 2. 4 Hz), 2.04-2.20 (m, 1H), 1.79-1.97 (m, 1H) .
La même procédure avec le (R)-4-(7coumarinyloxy)-1,2-butanediol donne l'énantiomère R.
Exemple 4: Préparation du (S)-1,2-Diacetoxy-4- (7-coumarinyloxy)-butane.
Figure img00300001
Aco, OAc in AcO \ 1 -""':::::0 (S)-1,2-Diacetoxy-4-(7-coumarinyloxy)-butane
A une solution de (S)-4-(7-coumarinyloxy)-1,2- butanediol (0. 1 g, 0. 4 mmol) dans 4 mL de pyridine anhydre à 0 C, on ajoute 2 mL d'anhydride acétique. Après 18h à 20 C, on évapore avec du toluène, et on chromatographie le résidu pour obtenir le diacétate S (rendement quantitatif). m.p. 74-76 C, [[alpha]]D 20=-9.8 (c 0.5, CHC13); 1HNMR (CDC13): 7. 61 (d, 1H, J=9. 8 Hz), 7. 34 (d, 1H, J=8.8 Hz), 6.74-6.82 (m, 2H), 6.22 (d, 1H, J=9.3 Hz), 5.24-5.35 (m, 1H), 4. 32 (dd, 1H, J=11. 7 et 3. 4 Hz), 3. 97-4.15 (m, 2H), 4.10 (dd, 1H, J=11.7 et 5.9 Hz), 2.05-2.16 (m, 2H), 2. 05 (s, 6H).
La même procédure avec le (R)-4-(7coumarinyloxy)-1,2-butanediol donne l'énantiomère R.
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Exemple 5 : Préparation du (S)-1-Acetoxy-4-(7coumarinyloxy)-2-butanol.
Figure img00310001
Ac \ O Ô \O O (S)-1-Acetoxy-4-(7-coumarinyloxy)-2-butanol
A une solution de (S) -4- (7-coumarinyloxy) -1, 2butanediol (0. 090 g, 0. 36 mmol) et de triéthylamine (0.1 mL, 0. 72 mmol) dans 8 mL de CH2C12 sec, on ajoute du chlorure d'acétyle (0. 36 mmol, 0.024 mL). Après 40 min. à 0 C, on dilue avec du CH2C12, on lave avec une solution aqueuse de NaHC03. La chromatographie du résidu après évaporation donne le monoacétate S (0. 058 g, 0.22 mmol, 60 %) .
[[alpha]]D 20=-9.6 (c 0. 31, CHC13); 1H-NMR (CDC13): 7.61 (d, 1H, J=9.8 Hz), 7.33 (d, 1H, J=7.8 Hz), 6.78-6.83 (m, 2H), 6.21 (d, 1H, J=8.8 Hz), 4.01-4.29 (m, 5H), 2.09 (s, 3H), 1. 91-2.00 (m, 2H).
La même procédure avec le (R)-4-(7coumarinyloxy)-1,2-butanediol donne l'énantiomère R.
Exemple 6 : Préparation du 1-Amino -4-(7coumarinyloxy)-2-butanol.
Figure img00310002
H2N 1 1-H2N 0/ / \ 0 ' 0 \ 0 1-Amino-4-(7-coumarinyloxy)-2-butanol A une solution de 4- (7-coumarinyloxy)-1,2-
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d'éthanol, on ajoute 5 mL d'ammoniaque 30 % aqueux et du Gd(OTf3) (0. 039 g, 0.065 mmol). On chauffe à 65 C pendant 15 h, on évapore le solvant, on dilue le résidu dans l'acétate d'éthyle et on lave avec une solution saturée en NaCl. Le résidu donne l'amine brute (0. 081 g, rendement 50% ) qu'on utilise sans purification pour l'étape suivante.
Exemple 7 : Préparation du 1-Phenylacetamido-4- (7-coumarinyloxy)-2-butanol.
Figure img00320001
A une solution de 1-Amino -4-(7-coumarinyloxy)- 2-butanol (0. 162 g, 0. 65 mmol) dans 3 mL de CH2C12 sec à 0 C, on ajoute de la triéthylamine (1. 3 mmol, 0. 18 mL) puis du chlorure de phénacétyle (0.65 mmol, 0. 085 mL). On agite à 0 C pendant 2 h, puis on dilue avec du CH2C12 et on lave avec une solution aqueuse saturée de NaHC03. On chromatographie le produit brut pour obtenir l'amide (0. 170 g, 0.48 mmol, 74 %).
Exemple 8 : du 6-methoxy-2- naphthaldéhyde et 6-dimethylamino-2-naphthaldéhyde.
Figure img00320002

6-methoxy-2-naphthaldéhyde et 6-dimethylamino-
<Desc/Clms Page number 33>
On prépare le 6-methoxy-2-naphthaldéhyde par traitement successif du 2-bromo-6-methoxynaphthalène en solution dans l'éther sec avec n-butyl lithium puis du diméthyl formamide. (Littérature: J. Med. Chem. 1998,1308- 1312). Le 6-dimethylamino-2-naphthaldehyde est préparé selon la procédure décrite (Barbas et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1998, 95, 15351) comme suit : introduit de la diméthylamine gazeuse dans un mélange de 2. 4 mL de benzène sec et 2. 4 mL d'hexamethylphosphoramide (HMPA) jusqu'à la dissolution de 750 mg (16.7 mmol). A 0 C et sous atmosphère inerte, on ajoute du n-butyl lithium (1. 6 M dans l'hexane, 16. 7 mmol) puis après 15 minutes le 6-methoxynaphthaldehyde (390 mg, 2. 09 mmol). On laisse sous agitation pendant 14 heures à 20 C, puis on verse dans du tampon phosphate aqueux pH 7. 4 et on extrait à l'éther. La purification par chromatographie donne le 6-dimethylamino- 2-naphthaldéhyde (350 mg, 84 %).
6-methoxy-2-naphthaldéhyde : 1H-NMR (CDC13): 10. 09 (s, lH), 8. 26 (s, lH), 7. 78-7.95 (m, 3H), 7. 17-7.26 (m, 2H) , 3.96 (s, 3H) .
Exemple 9 : Préparation du 6-méthoxy et du 6dimethylamino-2-vinylnaphthalene.
Figure img00330001
6-méthoxy et 6-dimethylamino-2vinylnaphthalène.
<Desc/Clms Page number 34>
A une solution d'ylure instantané (Ph3P+Br- + NaNH2, 1.48 g, 2.4 mmol) dans du THF anhydre (5 ml), on ajoute le 6-méthoxy-naphthaldéhyde (432 mg, 2. 35 mmol).
Après une heure sous agitation à température ambiante, on dilue avec de l'éther, on filtre sur célite, et on chromatographie (hexane/AcOEt 5:1) pour obtenir le 6méthoxy-2-vinyl-naphthalène (390 mg, 90 %).
6-méthoxy-2-vinyl-naphthaldéhyde : 1H-NMR (CDC13): 7. 59-7.74 (m, 4H), 7. 11-7.16 (m, 2H), 6. 86 (dd, 1H, J= 17.3 et 10.9 Hz), 5.82 (d, 1H, J=17.6 Hz), 5.28 (d, 1H, J= 10.7 Hz), 3.93 (s, 3H) .
Exemple 10 : Préparation du (R) et du (S) 6- méthoxy-2-(l',2'-dihydroxyéthyl)naphthalène.
Figure img00340001
(R) et (S) 6-méthoxy-2-(1',2'dihydroxyéthyl)naphthalène.
Ces produits, sous forme d'énantiomères R (>99% ee) et S (>99% ee), ont été préparés par dihydroxylation asymétrique de Sharpless de l'oléfine correspondante comme décrit plus haut pour les dérivés de coumarine.
Diol : 1H-NMR (Acétone-d6): 7.71-7.84 (m, 3H),
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(dd, 1H, J= 8.9 et 2.5), 4.87 (dd, 1H, J=7.5 et 4.2 Hz), 3. 94 (s, 3H) , 3.50-3.80 (m, 4H, CH20+2 OH) .
Exemple 11 : Préparation du (R) - et du (S) -2- (6-méthoxy-2-naphthyl)oxyrane.
Figure img00350001
(R) - et (S)-2-(6-méthoxy-2-naphthyl)oxyrane.
Ces produits ont été préparés à partir des diols correspondants selon la méthode décrite plus haut pour les dérivés de coumarine et obtenus optiquement purs (ee >99% selon HPLC chirale)
1H NMR (CDC13): 7. 70-7.75 (m, 3H), 7. 26-7.32 (m, 1H), 7. 13-7.19 (m, 2H), 4. 00 (dd, 1H, J= 4. 1 et 2.4 Hz), 3.92 (s, 3H), 3.22 (dd, 1H, J= 5.4 et 4.0 Hz), 2.91 (dd, 1H, J= 5.4et 2.4Hz).
II - Oxydation par le periodate.
L'oxydation de 1,2 diols et d'amino-alcools par le periodate dans un milieux aqueux est une réaction bien connue de l'homme du métier. Cette réaction apporte une alternative purement chimique pour la conversion d'alcools en groupes carbonyles en milieu aqueux avec une chimioselectivitée élevée en présence d'autres groupes fonctionnels. La Demanderesse a trouvé maintenant que, avantageusement, des enzymes hydrolytiques qui libèrent des
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à l'oxydation par le periodate sont détectables par fluorescence en présence de periodate et d'albumine de sérum bovine (BSA).
Les diesters (R) - (S) - ainsi que les monoesters (R)- et (S)- représentés par la formule (I) (composés 1 a/b, 3 a/b) constituent d'excellents substrats pour les lipases et les estérases étant donné leur similarité structurelle avez les glycérides. Les amides représentées par la formule I (composé 5) réagissent avec les amidases et les peptidases. Les époxydes (R)- et (S)- représentés par la formule (II) (composés 7 et 8) réagissent avec les enzymes époxy-hydrolases. Ainsi, la demanderesse a trouvé que la transformation subie par ces substrats fluorogéniques transformés par le periodate de sodium, en présence des enzymes hydrolytiques fournit une nouvelle méthode de détection desdites enzymes.
III - Stabilité des substrats.
Les substrats acétates 1, l'amide 5 et l'époxyde 6 sont stables en présence de periodate et de BSA sans les milieux aqueux. Dans les mêmes conditions, le diol 2 et l'amino-alcool 6 n'a pas été décrit dans le brevet libèrent l'umbélliférone. Dans des conditions de réaction optimisées utilisant lOOum de substrat, 1mM de periodate de sodium, 2 mg/ml de BSA dans un tampon borate à pH 8, 8, le diol 2 est transformé en umbelliferone avec un rendement de 72% sans réactions secondaires observables. Le rendement de l'oxydation est indépendant de la présence de BSA, ce qui indique que ces réactifs n'interfèrent de manière notoire entre eux. L'oxydation de l'amino-alcool 6 se produit avec un rendement de 85% dans les mêmes conditions.
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IV - Développement de l'essai.
Les acétates 1, l'amide 5 et les époxydes (R)-7 et (S)-7 ont été testés en présence des enzymes hydrolytiques correspondantes. Les acétates ont été testés vis-à-vis de 25 estérases et lipases différentes. Les époxydes ont été testés vis-à-vis de l'époxy-hydrolase extraite d'Aspergillus Niger (X-J. Chen, A. Archelas, R. Furstoss, J. Org.Chem. 1993,58 , 5528) et de Rhodotorula glutinis (C.A.G.M. Weijers, A.L. Botes, M.S. van Dyk, J. A.M. de Bont, Tetrahedron Asymm. 1998,9,467).
La phenylacétamide 5 a été testée vis-à-vis de la pénicilline G acylase, de la chimitripsine et de la papaïne. Une augmentation de la fluorescence clairement dépendante du temps est observée lorsque l'activité enzymatique est présente. Les analyses effectuées par chromatographie liquide de haute pression (HPLC) confirment que l'augmentation de la fluorescence est provoquée par la libération de l'umbélliférone des substrats.
Dans tous les cas les résultats obtenus sont similaires tant à pH 7,2 qu'à pH 8,8.
Toutes les enzymes qui ont montré une activité à l'encontre d'un quelconque substrat conservent leur activité que ce soit en effectuant une preincubation de l'enzyme avec le substrat, avant l'addition du periodate et de la BSA ou lors de la réaction, en présente de tous les composants. Ceci prouve clairement que l'addition du periodate et de la BSA en tant qu'agents secondaires n'affectent pas l'activité enzymatique des enzymes qui doivent être analysées. Les analyses par HPLC de la réaction avec les enzymes actives en absence de periodate et de BSA montrent que le diol 2 et l'amino-alcool 6 sont
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réellement libérées par les enzymes ayant été considérées comme actives dans le test de fluorescence.

Claims (41)

REVENDICATIONS
1) Méthode de détection d'une transformation chimique d'un substrat en un composé détectable, caractérisée en ce qu'elle comprend les deux étapes suivantes : a) la transformation chimique d'un substrat de formule (I) dans laquelle la liaison C1-C2 est insensible à une coupure par une réaction d'oxydation chimique :
Figure img00390001
en un composé de formule (II) dans laquelle la liaison C1-C2 est sensible à une coupure par une réaction d'oxydation chimique :
Figure img00390002
et, (b) l'oxydation chimique du composé de formule (II) obtenu à l'étape (a) qui coupe la liaison C1-C2 pour obtenir directement ou indirectement un composé détectable, et en ce que dans les composés de formules (I) et (II) : - au moins un des groupes Ri à R6 est un précurseur d'un composé détectable, qui est insensible à l'oxydation chimique de l'étape (b) - les groupes Ri à R6, identiques ou différents, sont choisis parmi : atome d'hydrogène, un
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substitué ou non et dans le cas d'un groupe fonctionnel de formules -OR12, -SR12 , -NR11R12, R11 est choisi parmi: un atome d'hydrogène, un groupe alkyle, un groupe aryle, substitués ou non, et R12 n'est pas un atome d'hydrogène, - le ou les groupes Ri à R6 formant après l'étape (a) les groupes de formules-XH et-YH sont insensibles à l'oxydation de l'étape (b), ou peuvent être sensibles à cette oxydation si le composé de formule (I) correspondant ne conduit pas lors d'une oxydation du type de celle de l'étape (b) au composé de formule (II), - X et Y, identiques ou différents, sont choisis parmi un atome d'oxygène, un atome de soufre, une amine de formule -NR11, - R7 à R10, identiques ou différents, sont, soit identiques à quatre au plus des groupes Ri à R6, soit, du fait de la transformation d'un ou plusieurs des groupes Ri à R6,lors de la réaction de l' étape (a), choisis parmi un atome d'hydrogène, un groupe alkyle substitué ou non, ou un groupe fonctionnel substitué ou non, et au moins un des groupes R7 à R10 est un précurseur d'un composé détectable, qui est insensible à la réaction d'oxydation de l'étape (b) .
2) Méthode selon la revendication 1, caractérisée en ce que Ri à R6 sont choisis de façon à ce que la liaison C1-C2 fasse partie d'au moins un cycle.
3) Méthode selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisée en ce qu'au moins une paire des groupes Ri à R6 forment ensemble un atome d'oxygène, un atome de soufre, ou un groupe de formule -NR11.
4) Méthode selon l' une des revendications 1 à
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R6 dont l'un est choisi parmi Ri, R2 et R6 et l' autre choisi parmi R3, R4 et R5 forment une double liaison entre les carbones Ci et C2.
5) Méthode selon la revendication 1, caractérisée en ce que au plus deux paires de groupes Ri à R6 dont l'un est choisi parmi R1, R2 et R6 et l' autre choisi parmi R3, R4 et R5 forment une triple liaison.
6) Méthode selon les revendications 1 à 5, caractérisée en ce que les groupes Ri à R6 sont sensibles ou insensibles à l'oxydation de l'étape (b) et en ce que les étapes (a) et (b) sont non simultanées.
7) Méthode selon l'une des revendications 1 à 5 caractérisée en ce que le ou les groupes Ri à R6 sont insensibles à l' oxydation de l' étape (b) et en ce que les étapes (a) et (b) sont simultanées.
8) Méthode selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisée en ce que la transformation chimique réalisée dans l'étape (a) est une réaction catalytique.
9) Méthode selon l' une des revendications 1 à 8, caractérisée en ce que la transformation chimique réalisée dans l'étape (a) est une réaction enzymatique.
10) Méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que les groupes Ri à R10 sont stables dans un milieu réactionnel, choisi parmi un milieu aqueux, un milieu organique ou un milieu biphasique.
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11) Méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que l'une ou l'autre ou les deux étapes (a) et (b) de la méthode de l'invention sont réalisées dans un milieu réactionnel choisi parmi un milieu aqueux, un milieu organique, ou un milieu biphasique.
12) Méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisée en ce que le substrat mis en #uvre dans le procédé de l'invention comprend un ou plusieurs centres chiraux.
13) Méthode selon les revendications 1 à 12, caractérisée en ce que le substrat répond à la formule (V) suivante :
Figure img00420001
dans laquelle : - Di, R1, R2, R3, X et Y ont la même signification que dans la revendication 1 et - Au plus un des groupes P1 et P2 est un atome d'hydrogène ou P1, P2 , identiques ou différents, sont choisis parmi, un groupe acyle substitué par un groupe aryle ou alkyl ou peptidyle, un groupe phosphate, un groupe ester phosphate, un groupe phosphonate, un groupe carbamyle substitué par un groupe aryle ou acyle ou peptidyle, un groupe glycosyle et un groupe sulfate,
14) Méthode selon l'une des revendications 1 à 12. caractérisée en ce aue le substrat répond à la formule
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dans laquelle : - Di R1, R2, R3, X et Y ont la même signification que dans le revendication 1, et - P3 est choisi parmi un groupe carbonyle, un groupe -PO2R11 ou un groupe -ORnP, où R11 présente la même signification que dans la revendication 1, un groupe -SO2, un groupe -CHOR13 où R13 représente un groupe aryle, alkyle ou glycosyle, un groupe SiR14R15 où R14 et R15, identiques ou différents, représentent un groupe aryle, alkyle, aryloxy ou alcoxy et un groupe AsO2H-.
Figure img00430001
15) Méthode selon l'une des revendications 1 à 12, caractérisée en ce que le substrat répond à la formule (VII) suivante :
Figure img00430002
dans laquelle : - Di, R1, R2 et R3 ont la même signification que dans le revendication 1 et, - G représente un atome d'oxygène, un atome de soufre ou un groupe amine de formule NR11 où R11 a la même signification que dans la revendication 1.
16) Méthode selon l'une des revendications 1 à 12, caractérisée en ce que le substrat répond à la formule (VIII) suivante :
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dans laquelle : - Di, Ri, R2 et R3, ont les mêmes significations que dans la revendication 1
Figure img00440001
17) Méthode selon l'une des revendications 1 à 12, caractérisée en ce que le substrat répond à la formule (IX) suivante :
Figure img00440002
dans laquelle, Di, R1, R3, X et Y ont la même signification que dans la revendication 1.
18) Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 17, caractérisée en ce que le produit issu de la transformation de l'étape (a) du substrat répond à la formule (X) suivante :
Figure img00440003
dans laquelle, Di, R8, Rg, RIO, X et Y ont la même signification que dans la revendication 1.
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19) Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 18, caractérisée en ce que l'oxydation chimique effectuée à l'étape (b) est une réaction d'oxydation effectuée au moyen d'un agent chimique oxydant.
20) Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 19 caractérisée en ce que l'agent chimique oxydant est choisi parmi, H5IO6, RuO2, OsO4, (CH3CH2CH2)4N(Ru04) , NaC104, NaI04, Na3H2I06, NaMn04, K20s04, KI04, KMn04, KRu04, K2Ru04, LiOCl, l' acétate de plomb, le tétrapropyle ammonium periodate, l'acide chromique ou des sels de celui-ci, NaBi03, Ph3BiC03, Ca(OCl)2, les réactifs Ce (IV), Cr (VI), les sels de Co (II), IOAc, I(OAc)3, Niodosuccinimide, VO(acac), Pb(OAc)4, Mn02, ou le mélange des réactifs [H202, Na2W04, H3P04] .
21) Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 20 caractérisée en ce que l'agent chimique oxydant est un sel periodate.
22) Méthode selon la revendication 21 caractérisée en ce la réaction de l'étape (b) est réalisée en milieu organique.
23) Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 22 caractérisée en ce que l'oxydation chimique du composé de formule (II) conduit au composé de formule (XI) suivante :
Figure img00450001
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dans laquelle Di, R9 et Y ont les mêmes significations que précédemment, est directement détectable.
24) Méthode selon la revendication précédente caractérisée en ce que le composé de formule (XI) est choisi parmi une cétone aromatique, un aldéhyde ou une phéromone.
25) Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 22, caractérisée en ce que l' oxydation chimique du composé de formule (II), est suivie d'une réaction de béta-élimination et conduit au composé détectable de formule ZH directement détectable.
26) Méthode selon la revendication 25, caractérisée en ce que le groupe détectable Di de la formule (II) ou de la formule (X) répond à la formule (XIII) suivante:
Figure img00460001
dans laquelle : - R16, R17 et Ris, identiques ou différents, représentent soit un atome d'hydrogène , un groupe alkyle substitué ou non, un groupe fonctionnel substitué ou non.
- Z est un composé transformé en un composé détectable ZH par une réaction de béta-élimination.
27) Méthode selon la revendication 26,
Figure img00460002
'-'",",\Y"""'"'\,-..-I-AY"";(,",!f...1""o 1""0'\>""\ l''''fr"'\ /'Vl l /#\ 1 - - - - - - - A 7 LI - -4- - l-, - ' , ' Y"\",,",Y""m"; 11 V*
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dérivé d'un alcool aromatique, un alcool hétéroaromatique, une amine hétéroaromatique, un atome d'halogène, ou un ester phosphorique.
28) Méthode selon la revendication 27, caractérisée en ce que ZH est choisi parmi la fluorescéine, la phenolphtaléine, le rouge de phénol, le p-nitrophénol l'o-nitrophénol, le 2,4-dinitrophénol, l'acide 6hydroxynaphtoïque, l'acide 8-hydroxy-pyrène 1,3,6trisulfonique, la tyrosine, la luciférine, le 5-bromo-4chloro-indolyle, l'indolyle, le quinolinium, le nitroanilinium, ou la pyridoxamine.
29) Méthode selon l'une des revendications 1 à 28, caractérisée en ce que : - le composé issu de la transformation du substrat après l'étape (a) répond à la formule (XIV) suivante :
Figure img00470001
dans laquelle Di, R8, R9, X et Y ont la même signification que précédemment , - il comprend une paire de groupes détectables identiques ou différents, l'un attaché au carbone Ci, le deuxième attaché au carbone C2, et - les deux groupes détectables interagissent entre eux.
30) Méthode de détection d'une transformation chimique dans un échantillon, selon l'une quelconque des revendications 1 à 29 caractérisée en ce que le dégré de
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spécificité du substrat est apporté par la structure de ou des groupes Ri à R6 de la formule (I)
31) Un substrat susceptible d'être mis en oeuvre dans une méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 13 et 18 à 30 répondant à la formule (V) suivante :
Figure img00480001
dans laquelle : - Di, R1, R2, R3, X et Y ont la même signification que dans le revendication et - Au plus un des groupes P1 et P2 est un atome d'hydrogène ou P1, P2 , identiques ou différents, sont choisis parmi, un groupe acyle substitué par un groupe aryle ou alkyl ou peptidyle, un groupe phosphate, un groupe ester phosphate, un groupe phosphonate, un groupe carbamyle substitué par un groupe aryle ou alkyl ou peptidyle, un groupe glycosyle et un groupe sulfate,
32) Un substrat susceptible d'être mis en oeuvre dans une méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 12, 14 et 18 à 30 répondant à la formule (VI) suivante :
Figure img00480002
dans laquelle :
Di P1, R2, R3, X et Y ont la même
<Desc/Clms Page number 49>
- P3 est choisi parmi un groupe carbonyle, un groupe -PO2R11 où un groupe R11PO-, ou R11 présente la même signification que dans la revendication 1, un groupe -SO2, un groupe -CHOR13 où R13 représente un groupe aryle, alkyle ou glycosyle, un groupe SiRi4Ri5 où R14 et R15,identiques ou différents, représentent un groupe aryle, alkyle, aryloxy ou alcoxy et un groupe AS02H-.
33) Un substrat susceptible d'être mis en oeuvre dans une méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 12,15 et 18 à 30 répondant à la formule (VII) suivante :
Figure img00490001
dans laquelle : - Di, R1, R2 et R3 ont la même signification que dans la revendication 1 et, - G représente un atome d'oxygène, un atome de soufre ou un groupe amine de formule NRn où R11 a la même signification que dans la revendication 1
34) Un substrat susceptible d'être mis en oeuvre dans une méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 12,16 et 18 à 30 répondant à la formule (VIII) suivante :
Figure img00490002
dans laquelle : - Di, Ri, R2 et R3, ont la même signification
<Desc/Clms Page number 50>
35) Un substrat susceptible d'être mis en oeuvre dans une méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 12,17 à 30 répondant à la formule (IX) suivante :
Figure img00500001
dans laquelle, - Di, Ri, R3, X et Y ont la même signification que dans la revendication 1.
36) Un substrat selon l'une quelconque des revendications 31 à 35 caractérisé en ce que les groupes Ri à R3 sont stables dans un milieu réactionnel, notamment aqueux, organique, biphasique, etc.
37) Utilisation d'une méthode de détection et/ou de quantification d'une transformation chimique connue dans un échantillon, selon l'une quelconque des revendications 1 à 30 pour l'identification de nouveaux catalyseurs, ou de l'activité nouvelle de catalyseurs connus.
38) Utilisation d'une méthode de détection d'une transformation chimique selon l'une quelconque des revendications 1 à 30 pour la détection d'un substrat de formule (I) lequel substrat est produit par une première transformation chimique inconnue, dont on souhaite identifier l'activité.
<Desc/Clms Page number 51>
39) Utilisation d'une méthode de détection d'une transformation chimique selon l'une quelconque des revendications 1 à 30 pour l'identification de nouveaux catalyseurs ou de l'activité nouvelle de catalyseurs connus.
40) Un catalyseur susceptible d'être identifié par une méthode de détection d'une transformation chimique selon les revendications 1,37 ou 38.
41) Une enzyme susceptible d'être identifiée par une méthode de détection d'une transformation chimique selon les revendications 1,37 ou 38.
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