FR2798469A1 - Procede de recherche in vitro d'une anomalie du fibrinogene - Google Patents

Abstract

Cette invention concerne un procédé pour rechercher in vitro une anomalie du fibrinogène normalement coagulable chez des sujets humains chez qui le risque d'anomalie biologique de l'hémostase favorisant la survenue d'une thrombose doit être recherché. Le fibrinogène est normalement coagulable en ce que sa mesure par une méthode coagulométrique est normale, tout comme le temps de coagulation en présence de quantités faibles de thrombine communément dénommé temps de thrombine. Ce procédé comprend la recherche d'une perturbation des caractéristiques de migration électrophorétique de la molécule ou de l'une de ses chaînes peptidiques, par rapport au fibrinogène obtenu de sujets contrôles témoins et contrôles patients.

Description

La présente invention concerne en premier lieu le domaine de la thrombose chez l'homme, et plus particulièrement un procédé de recherche et de mise en évidence vitro d'anomalie électrophorétique du fibrinogène associé à la survenue de thrombose et au risque de thrombose. Par extension, ce procédé peut être appliqué en cas manifestations cliniques pouvant faire suspecter une anomalie du fibrinogène en général.

Une thrombose est la survenue anormale d'un caillot sanguin dans l'arbre vasculaire défini comme l'ensemble des artères, des veines, et des cavités cardiaques. conséquences sont l'apparition d'une obstruction partielle ou totale avec réduction arrêt du flux sanguin dans le territoire tissulaire correspondant. Les conséquences cliniques vont dépendre de la nature et de la topographie du vaisseau atteint, l'importance de son occlusion (partielle ou totale), de l'existence possible de vaisseau de suppléance. Au niveau des veines, ceci va pouvoir se traduire par un tableau clinique de phlébite, d'embolie pulmonaire, ou des deux. Au niveau artériel, le tableau pourra être celui d'un infarctus du myocarde, d'un accident vasculaire cérébral, d'une obstruction artérielle des membres inférieurs. Au niveau des cavités cardiaque, le tableau pourra être celui d'une insuffisance cardiaque, d'une embolie artérielle, ou d'un arrêt cardiaque. Dans toutes les localisations, secondairement à la diminution de l'oxygénation des tissus, ou à son arrêt, et à l'augmentation mécanique de la pression sanguine, un risque de maladie invalidante résiduelle et un risque mortel existent. La survenue d'une thrombose est la conséquence d'un dérèglement de l'hémostase. L'hémostase est un système biologique complexe qui maintient le sang à l'état fluide lorsqu'il circule normalement dans l'arbre vasculaire, mais aussi génère un caillot dès qu'une brèche apparaît dans ce même arbre vasculaire. Les cellules sanguines et de nombreuses protéines plasmatiques sont impliquées dans les trois étapes de sa mise en jeu que sont l'hémostase primaire, la coagulation, et la fibrinolyse. Chacune de ces étapes peut être perturbée et constituer alors un risque de thrombose. Ainsi, une thrombocytose, une polyglobulie, une activité antiprothrombinase, des élévations des taux de facteur VII, d'activateur tissulaire du plasminogène (t-PA), d'inhibiteur 1 des activateurs du plasminogène (PAI-1), de facteur von Willebrand, de fibrinogène sont associés à un risque de thrombose artérielle, tout comme certaines anomalies sévères du fibrinogène. De même, la survenue de thrombose veineuse peut être en rapport avec une thrombocytose, une polyglobulie, une activité an tiprothrombinase, un déficit en antithrombine, en protéine C, en protéine S, une résistance anormale à la proteine C activée (comme décrit par WO 93/10261), une mutation du facteur V en position 506, une anomalie constitutionnelle du fibrinogène, une hyperhomocystéïnémie (Middeltrop S et al. In<B>:</B> Cardiovascular Thrombosis : Thrombocardiology and Thromboneurology. Second edition. Edts : Verstraete M, Fuster V, Topol <B>EL</B> Lippincott-Raven publishers, Philadelphia1998; 59-75). L'intérêt de repérer ce genre d'anomalie est de proposer une prévention adaptée pour éviter une nouvelle thrombose chez les sujets présentant l'anomalie, de proposer à ces mêmes sujets un traitement prenant en compte l'anomalie de façon spécifique, de rechercher des sujets apparentés présentant cette anomalie alors qu'ils n'ont pas encore manifesté de thrombose pour leur proposer une attitude préventive. Pour les raisons qui précèdent, il est admis qu'une étiologie biologique doit être recherchée en cas de maladie thrombotique ou thromboembolique, maladie qui peut être définie comme la survenue d'une thrombose chez un sujet jeune, ou de façon récidivante, ou à un caractère familial. Les anomalies constitutionnelles du fibrinogène plasmatiques ou dysfibrinogènémies font parties des anomalies recherchées dans ces situations, une ou plusieurs des fonctions du fibrinogène étant perturbées et induisant l'apparition ou la persistance anormale de caillot. Le fibrinogène est une molécule glycoprotéique allongée formée de 6 chaînes deux à deux identiques liées par des ponts disulfures en position N-terminale : 2 chaînes Aa, 2 chaînes Bp et 2 chaînes y. Il est soluble dans le plasma et joue un rôle central a tous les niveaux de l'hémostase : 1/ il se fixe sur la glycoprotéine de membrane plaquettaire GPa2B/p3, et participe par ce biais à l'agrégation des plaquettes en formant des ponts moléculaires entre elles; 2/ l'activation de l'ensemble des protéines coagulantes conduit à la transformation du fibrinogène en fibrine; les monomères de fibrine qui sont générés s'organisent en fibres de fibrine, insolubles; elles constituent filet tridimensionnel fixé ' la paroi vasculaire, le substratum du caillot, qui emprisonne les cellules sanguines; cette étape est en partie seulement évaluée par la capacité du fibrinogène à coaguler; 3/ les fibres de fibrine sont coupées de façon retardée la plasmine, enzyme généree à la surface de la fibrine, ce qui conduit à la dégradation du caillot. D'autre part, le fibrinogène est le siège d'interactions moléculaires très variees qui n'interviennent pas dans l'hémostase (thrombospondine, fibuline, intégrines autres, albumine, apolipoprotéine, élastase, inhibiteur de la fraction 1 du complément...). Ainsi, outre son rôle déterminant dans le maintien de l'intégrité vasculaire, il participe donc aussi à la plasticité sanguine par l'intermédiaire de la viscosité plasmatique et de ses interactions érythrocytaires (agrégation, précipitation, rouloformation), aux phénomènes de diapedèse (adhésion leucocytaire), à la nidation, à la réparation tissulaire autre. De ces données, il peut être déduit que l'évaluation de la capacité du fibrinogène à coaguler n'est reflet que d'une partie de ses fonctions. Une dysfibrinogènémie correspond à la présence plasmatique de molécules de fibrinogène anormales. Elles sont synthétisées suite à un dysfonctionnement acquis, ou sont traduction d'une anomalie génique. C'est dans ces derniers cas qu'elles peuvent être associées à une maladie thrombotique. Le diagnostic dysfibrinogénémie constitutionnelle en cas de maladie thrombotique est évoqué actuellement sur l'existence d'un retard de coagulation du plasma en présence de thrombine, traduisant une diminution d'une capacité du fibrinogène à coaguler. II peut s'agir de la baisse du taux plasmatique de fibrinogène mesuré par une technique coagulométrique (technique de Clauss, avec des concentrations finales de thrombine élevées), ou d'un allongement du temps de thrombine (concentrations finales de thrombine faibles : inférieures à 5 unites NIH/mL généralement). D'autres anomalies de la coagulation du fibrinogène peuvent être associées, voire inciter à la recherche de cette anomalie : allongement du temps de céphaline, du temps de Quick, du temps de thrombine, du temps de Reptilase . Ces différents paramètres coagulométriques (fibrinogène, temps de céphaline, du temps de Quick, du temps de thrombine, du temps de Reptïlase ) peuvent être mesurés par des systèmes à détection mécanique ou optique ou autre. D'autres fonctions du fibrinogène peuvent être atteintes, cependant il s'agit d'anomalies mises en évidence secondairement, les dysfibrinogènes présentés étant toujours caractérisés par un retard de coagulation en présence de thrombine (Ebert R F. "Index of variant human fibrinogen". CRC Press 1994, Boca Raton, Ann Arbor). Souvent non informative, l'électrophorèse en milieu dénaturant sous conditions réductrices et non 'ductrices après purification du fibrinogène plasmatique est une technique qui n'est pas systématiquement mise en oeuvre. Lorsqu'elle est réalisée, elle est utilisée actuellement seconde intention, pour situer l'anomalie sur le fibrinogène, une fois le diagnostic établi ou suspecté sur le retard de coagulation en présence de thrombine. Le diagnostic est porté lorsqu'il existe une discordance entre le taux coagulométrique abaissé et un taux normal déterminé par une technique immunologique, lorsqu'une autre anomalie du fibrinogène est trouvée au niveau de ses séquences peptidique ou génique. En l'absence de données peptidiques ou géniques, la persistance de l'anomalie et sa mise en évidence chez des sujets apparentés est nécessaire pour porter le diagnostic d'anomalie constitutionnelle. D'autres cas de dysfibrinogénémies ont été décrits au cours de pathologies beaucoup moins fréquentes. Les critères diagnostiques des dysfibrinogénémies associées à des manifestations hémorragiques sont superposables à ceux décrits ci-dessus. La situation moléculaire de l'anomalie définit une modification de la fonction hémostatique, avec insuffisance d'hémostase. Les amyloses rénales familiales sont des affections encore plus rares, pour lesquelles une anomalie constitutionnelle fibrinogène est parfois trouvée. Le fibrinogène plasmatique est souvent non étudié lorsque c'est le cas, son taux est normal, tout comme ses capacités de coagulation évaluées par le temps de thrombine. Les cas décrits ont été diagnostiqués par l'accumulation anormale de molécules apparentées au fibrinogène sur des biopsies tissulaires associée à une anomalie du gène du fibrinogène. En l'absence de biopsie tissulaire, l'électrophorèse fibrinogène plasmatique n'est pas réalisée. Les caractéristiques électrophorétiques propres du fibrinogène plasmatique ne sont pas utilisées pour porter le diagnostic, ni meme pour l'évoquer. La multiplicité des fonctions du fibrinogène, de ses interactions cellulaires, et de ses interactions moléculaires permet d'envisager l'implication d'anomalies non détectables par les tests coagulométriques mentionnés (fibrinogène coagulant, temps de thrombine entre autre) dans d'autres pathologies. Le schéma diagnostique actuel des dysfibrinogènes en cas de maladie thrombotique pose problème<B>:</B> la prévalence des dysfibrinogènémies constitutionnelles dans la maladie thrombotique est faible (inférieur ou égal à 1%, exceptionnel pour certains auteurs) au regard des autres anomalies connues de l'hémostase, comprise entre 2 et 20 % chacune environ, entre 20 et 50 % au total environ (Middeltrop S et al. In : Cardiovascular Thrombosis : Thrombocardiology and Thromboneurology. Second edition. Edts Verstraete M, Fuster V, Topol EJ. Lippincott-Raven publishers, Philadelphial998; 75),( Haverkate F, Samama M. Thromb Haemost 1995, 73; l51-61). Une soixantaine de cas ont été rapportés associés à la survenue de thrombose, bien qu'un lien ne puisse pas être établi systématiquement (Haverkate F, Samama M.. Thromb Haemost 1995 73; 151-61). Une vingtaine d'anomalies moléculaires seulement ont été identifiées, certaines étant relativement fréquentes, d'autres n'ayant été mises en évidence que chez un patient. Pourtant, au regard des autres composants plasmatiques de l'hémostase nécessaire à la génération d'un thrombus, le fibrinogène est la molécule la plus importante en quantité, et centrale. C'est aussi une molécule très ancienne, qui a donc pu subir beaucoup plus de mutations que celles connues à ce jour. Il est possible que faible nombre d'anomalies dénombrées soit en rapport avec la méthode de recherche actuelle de ces dysfibrinogènémies : seule une des fonctions du fibrinogène est explorée, sa capacité à coaguler, et ceci dans des conditions prédéfinies restrictives. L'hypothèse qui a prévalue au développement de l'invention ici rapportée est basée sur un abord diagnostique différent, recherchant une anomalie de la molécule indépendamment sa capacité à coaguler. Le présent inventeur a réalisé qu'il existait des anomalies constitutionnelles du fibrinogène non reconnues jusqu'à maintenant chez des patients présentant une maladie thrombotique ou pouvant présenter un risque de maladie thrombotique, et dont le diagnostic pouvait être réalisé en mesurant les caractéristiques électrophorétiques du fibrinogène de prime abord, la fonction coagulante telle qu'elle est explorée par les techniques de l'art actuel étant normale. Le fibrinogène est normalement coagulable en ce que sa mesure par une méthode coagulométrique est normale (technique dite de Clauss), tout comme le temps de coagulation en présence de quantités faibles de thrombine communément dénommé temps de thrombine, quelque soit le système de détection utilisé ( optique, mécanique, ou autre). La présente invention a plus particulièrement pour objet de rechercher une anomalie des propriétés électrophorétiques du fibrinogène humain, alors que les techniques coagulométriques actuelles ne permettent pas d'établir ni de suspecter le diagnostic d'anomalie moléculaire à partir du même plasma (à savoir une baisse du taux de fibrinogène capable de coaguler et/ou un retard de la coagulation du plasma en présence de thrombine), ceci bien que l'expression clinique ou le risque clinique ou la suspicion de risque inciterait à la rechercher (maladie thromboembolique veineuse, maladie thrombotique artérielle). Par extension, ce procédé peut être appliqué en cas de manifestations cliniques pouvant faire suspecter une anomalie du fibrinogène général (maladie hémorragique sans cause connue, symptomatologie évocatrice d'une amylose rénale de préférence avant biopsie tissulaire, par exemple). La mesure des propriétés électrophorétiques du fibrinogène peut être réalisée par électrophorèse en gel de polyacrylamide, en conditions dénaturantes ou (par exemple présence ou non de dodécylsulfate de sodium, ou SDS), en conditions réductrices ou non, après ou non hydrolyse enzymatique ménagée controlée, par focalisation isoélectrique, par électrophorèse bidimensionnelle. profil électrophorétique obtenu peut être comparé à celui d'un ou de plusieurs fibrinogènes de référence ou contrôles traités dans les mêmes conditions et en même temps que celles utilisées pour le patient. La recherche est effectuée sur le fibrinogène obtenu après purification plasma sanguin, mais, dans certaines conditions, peut être réalisée directement sur le plasma. Pour ce faire, dans les deux cas, une faible quantité de sang veineux (4,5 mL par exemple) est prélevée sur un anticoagulant (comme le citrate liquide 0,11 M à raison d'un volume de solution citratée pour 9 volumes de sang). Des additifs bloquant les capacités enzymatiques sanguines peuvent être adjoints. Le plasma est isolé par centrifugation à forte accélération (2500 g d'accélération pendant 20 minutes par exemple). Il est utilisé de suite, ou conservé congelé. Le fibrinogène est préparé à partir de plasma. Ceci facilite son repérage dans le gel, donc la mesure de ses propriétés électrophorétiques, procure un gain de temps par possibilité de détection simultanée des formes non réduites et réduites de la molécule après migration, et est indépendante de la fixation d'anticorps de révélation. technique la plus couramment utilisée élimine le plasminogène et la fibronectine par chromatographie d'adsorption sur lysine immobilisée (par exemple lysine Sépharose ) et sur gélatine immobilisée (par exemple gélatine Sépharose ), le surnageant étant précipité puis lavé par le sulfate d'ammonium avec une concentration pondérale comprise de préférence entre 10 et 30 % final. D'autres agents précipitants peuvent être employées, comme la bêta alanine sous une concentration comprise de préférence entre 1 M/L et 3 MIL final ou l'éthanol ou la glycine sous une concentration comprise préférence entre 0,7 M/L et 2,0 M/L final ou le polyéthylène glycol. L'adsorption d'autres contaminants éventuels peut être proposée, comme l'adsorption d'immunoglobuline sur Protéine G Sépharose . Le fibrinogène peut également être purifié directement par chromatographie d'adsorption sur un ou des anticorps ou fragments complémentaires immobilisés. L'inventeur a réalisé que ces étapes de chromatographie, de précipitation et de lavage pouvaient etre réalisées par manipulation, incubation et stockage dans des microtubes à centrifugation (par exemple à fond conique et supportant de fortes accélérations) ou dans des microplaques (de 96 puits par exemple), autorisant l'utilisation de quantités plasmatiques faibles, et la réalisation de séries de purification de plusieurs plasmas patient par traitement simultané des échantillons. Dix plasmas peuvent être purifiés simultanément par la technique en microtube (type Eppendorf ), 72 au minimum la technique microplaque. Une quantité de 0,1 mL de plasma additionné à 0,1 mL produit précipitant par exemple peut être suffisante et permet une exploration in vitro à partir d'une prise de sang de faible volume. Une quantité de 0,8 mL de plasma exemple permet une purification par précipitation par le sulfate d'ammonium en microtube avec chromatographie d'adsorption initiales sur Lysine Sépharose , et sur Gélatine Sépharose .

La présente invention a également pour objet une trousse réunissant les réactifs et le matériel essentiel à la préparation du fibrinogène à évaluer à partir d'un échantillon plasmatique de faible volume, compris entre 0,1 mL et 1 mL, ainsi que des échantillons de référence ou contrôles normaux et/ou pathologiques permettant juger de son comportement électrophorétique.

Lorsque la recherche est effectuée sur le fibrinogène purifié à partir du plasma, le fibrinogène est repéré de manière non spécifique après sa migration dans les conditions précisées ci-dessus, par une coloration des protéines présentes dans le et qui ont été soumises à l'action du courant électrique, comme, par exemple, une coloration à l'aide du bleu de Coomassie, ou une coloration à l'aide de sels d'argent.

Dans le cas où les mesures électrophorétiques sont effectuées directement sur le plasma, la migration du fibrinogène est repérée à l'aide d'un anticorps le reconnaissant spécifiquement. Pour ce faire, le gel peut être soumis à un électrotransfert sur membrane intermédiaire, où les protéines plasmatiques (dont le fibrinogène) seront transférées. Ensuite, cette membrane sera mise en présence d'anticorps spécifique reconnaissant le fibrinogène ou une de ses chaînes, et la fixation de cet anticorps sera révélé secondairement par un marquage de celui-ci (technique dite d'immunoblot). Il est également possible d'incorporer l'anticorps dans un second gel, de révéler la molécule de fibrinogène par une seconde migration dans ce deuxième gel (technique d'immunoélectrophorèse croisée). EXEMPLES ÉTUDE DE LA COAGULATION Elles ont été effectuées sur l'automate Hémolab Biomérieux (Marcy 'Etoile, France), système à détection optique et sur le STA (Diagnostica Stago, Asnières, France), système à détection mécanique. Le temps de thrombine a été réalisé à l'aide du réactif Réactif Thrombine-Test Behring (Marburg, Allemagne), le taux de fibrinogène déterminé par technique coagulométrique a été réalisé à l'aide du réactif Fibrinomat Biomérieux (Marcy l'Etoile, France) sur Hémolab, puis sur STA à l'aide du réactif Fibriprest 2 Diagnostica Stago. MÉTHODE DE PURIFICATION UTILISÉE Le plasma est obtenu à partir de sang total prélevé sur anticoagulant (citrate 0,11 M; un volume pour 10 volumes final) par centrifugation 30 minutes à 2500 g, puis conservé congelé en aliquotes de 1,1 mL. 0,2 g de lysine Sépharose Pharmacia (Pharmacia Biotech, Upsala, Suède) réhydratée en tampon phosphate (NaH2P04 5 mM; NaCI 0,1 M; pH 7,5) est mélangé à 1 mL de plasma 5 mn à + 4 C. Le surnageant est récupéré par centrifugation puis retraité de la sorte deux fois. Une quantité de 0.70 g de Gelatin Ultrogel est mélangé à 0.8 mL de surnageant, pendant 30 mn à + 4 C. Le surnageant est récupéré par centrifugation puis retraité une fois. Le surnageant est alors précipité à température ambiante, par l'ajout d'un volume de sulfate d'ammonium (solution à 25 %) pour un volume de surnageant. Le précipité formé extemporanément est recueilli par une centrifugation en tube conique. Le précipité est lavé 3 fois avec même volume de sulfate d'ammonium, puis dissout dans un volume de tampon de dissolution (tris 0,05 M; NaCI 0,1 M; pH 7,4) identique au demi-volume de plasma traité. La solution obtenue ainsi est riche en fibrinogène. Sa concentration en protéines déterminée par la technique de Bradford. MÉTHODE D'HYDROLYSE MÉNAGÉE L'endoprotéinase Glu-C (protéase V8) Boehringer Mannheim est reprise par 1 mL d'eau distillée pour 2 mg, à + 4`C, puis 1 mL de tampon (tris 0,05 NaCI 0,1 M; pH 7,4; SDS 4 %; glycérol 20 %) est ajouté. Le fibrinogène à étudier est ramené à une concentration de 0,5 g/L et incubé 2 h à température ambiante en présence d'endoprotéinase Glu-C diluée dans le tampon de dissolution du fibrinogène à une concentration finale de 1/4000, et 1/8000. De la sorte, une hydrolyse en position en Glu ou [Glu et Asp] est réalisé, coupant de façon reproductible essentiellement la chaîne Acx dans ces conditions. MÉTHODE D'ÉLECTROPHORÈSE UTILISÉE Elle suit les recommandations du constructeur, utilisant les gels de polyacrylamide 4% ou 8% Novex (Novex, San Diego, CA, USA), le P mercaptoéthanol comme agent réducteur, les tampons échantillon et de migration mentionnés, la solution de coloration "Colloidal Coomassie Stain" Novex (Novex, San Diego, CA, USA). Le dépôt est de 1 #Lg de protéine par bande attendue pour une coloration par bleu de Coomassie. Un marqueur de poids moléculaire est également déposé. Les anomalies de migration d'une bande du fibrinogène sont repérées à l'oeil nu, et peuvent être quantifiées à l'aide d'un système de numérisation de l'image et de quantification informatique (scanner logiciel d'intégration Quantiscan, Biosoft, Cambridge, UK) SÉQUENÇAGE PEPTIDIQUE N-TERMINAL : Les échantillons après hydrolyse ménagé ont été transférés sur une membrane PVDF Problott (Applied Biosystems, Foster, California, USA) à partir du gel de polyacrylamide 8 %, selon les indications constructeur. Le transfert a été coloré par bleu de Coomasie. Les bandes ont été découpées et soumises à une dégradation d'Edman automatisée sur un système Applied Biosystems Procise 492. La séquence obtenue a été comparée à celle disponible (Ebert R F. CRC Press 1994 Bocca Raton, Ann Arbor). CAS N'1 : Monsieur X. est porteur d'un diabète insulinodépendant traité et équilibré. A l'âge de 33 ans, il présente une thrombose veineuse du membre inférieur gauche avec embolie pulmonaire à l'occasion d'un voyage en voiture, puis une récidive à 47 ans. Le bilan biologique étiologique de cette maladie thromboembolique permet d'éliminer toutes les causes biologiques connues et accessibles. En particulier, il n'existe pas d'allongement des temps de céphaline, de Quick, de thrombine (20 secondes pour un témoin à 20 secondes), de Reptilase. Le taux de fibrinogène coagulant (2,2-2,1 g/L est bien retrouvé normal à plusieurs reprises, sans discordance avec la mesure immunologique. Le fibrinogène est purifié à partir du plasma, puis des électrophorèses en milieu non réducteur et réducteur sont réalisées, en présence de SDS. La migration du fibrinogène dans ces conditions permet de retrouver 4 bandes en milieu réducteur comme attendu, de même masse moléculaire apparente que les sujets contrôles, correspondant aux chaînes Aa et<B>Au</B> raccourcie, Bp et y. En milieu non réducteur, l'aspect global des deux bandes est retrouvé comme chez les sujets contrôles témoins (n = 80), chez les patients autres ayant développé une maladie thrombotique veineuse (à un âge inférieur à 45 ans, ou récidivante, ou à caractère familial, en l'absence de maladie générale, n = 173), et chez les patients autres ayant développé une maladie thrombotique artérielle (à un âge inférieur à 45 ans, ou récidivante, ou à caractère familial, en l'absence de maladie générale, n = 24) correspondant aux édifices "HMWF" (abréviation consacrée pour "High Molecular Weight Fibrinogen", ou fibrinogène de haut poids moléculaire) et "LMWF" (abréviation consacree pour "Low Molecular Weight Fibrinogen", ou fibrinogène de bas poids moléculaire). Par contre, il existe un étalement de la bande "HMWF" en zone cathodique avec une augmentation de la masse moléculaire apparente. Après hydrolyse ménagée, le profil électrophorétique du fibrinogène évolue de façon identique au fibrinogène d'un sujet contôle, avec persistance de l'étalement cathodique qui se déplace parallèlement à la molécule hydrolysée. La figure 1 montre une électrophorèse dénaturante en gel de polyacrylamide; les bandes 1, 2, et 3 correspondent au sujet atteint, les bandes 4, 5, et 6 au sujet contrôle. Les bandes (2, 5) et (1, 4) ont été traitées par l'endoprotéinase Glu- C aux deux concentrations différentes. L'anomalie du fibrinogène retenue est persistante à distance de la mise en évidence initiale. Elle est retrouvée également chez un fils et chez une soeur, non porteurs de diabète, et est absente chez son autre fils. Ses fils étaient au jour des investigations indemnes de pathologie thrombotique. Par contre, sa soeur rapporte une thrombose veineuse postpartum. Une notion phlébites et embolies pulmonaires multiples est connue chez la grand-mère maternelle. La particularité intéressante de ce dysfibrinogène constitutionnel sa migration anormale (décalage en position cathodique) dans des conditions dénaturantes non réductrices. Ceci a déjà été rapporté dans les dysfibrinogènes avec maladie thrombotique Dusard et Milano VII, avec apparition d'un résidu cystéine par mutation et d'une liaison albumine -fibrinogène (Koopman J et al. J Clin Invest 1993, 91; 1637 1643, et Steinmann C et al. Blood 1994, 84; 1874-1880). Cependant, dans ces cas, le diagnostic avait été orienté par des allongements du temps de thrombine et de Reptilase , et une baisse du taux de fibrinogène. CAS N 2 : A l'âge de 38 ans, monsieur Y. développe une thrombose veineuse du membre inférieur gauche avec embolie pulmonaire sans élément déclenchant notable, ni facteur de risque connu. Le bilan biologique étiologique de cette maladie thrombotique permet d'éliminer toutes les causes biologiques connues et accessibles. En particulier, il n'existe pas chez lui non plus d'allongement des temps de céphaline, de Quick, de thrombine (19 secondes pour un témoin à 20 secondes), de Reptilase . Le taux de fibrinogène coagulant est retrouvé normal à plusieurs reprises (2,7 5 g/L), sans discordance avec le taux immunologique. Le fibrinogène est purifié à partir du plasma, puis des électrophorèses en milieu non réducteur et réducteur sont réalisées, présence de SDS. La migration du fibrinogène dans ces conditions permet de retrouver 5 bandes en milieu réducteur, au lieu des 4 attendues chez les sujets contrôles témoins (n = 80), chez les patients autres ayant développé une maladie thrombotique veineuse (à un âge inférieur à 45 ans, ou récidivante, ou à caractère familial, en l'absence de maladie générale, n = 173), et chez les patients autres ayant développé une pathologie thrombotique artérielle (à un âge inférieur à 45 ans, ou récidivante, ou à caractère familial, en l'absence de maladie générale, n = 24). Quatre sont de même masse moléculaire apparente que celles retrouvées chez les sujets contrôles, correspondant aux chaînes Au, Aa raccourcie, Bp et y. La bande atypique est de masse moléculaire apparente légèrement supérieure à Au. La figure 2 montre une électrophorèse dénaturante en gel de polyacrylamide, et en conditions réductrices; bande 1 et 4 : témoin bande 2 : marqueurs de poids moléculaire ; bande 3 : patient). En milieu non réducteur, la masse moléculaire apparente du fibrinogène du patient est identique aux sujets contrôles témoins et patients, avec conservation de l'aspect de deux bandes, correspondant aux édifices "HMWF" et "LMWF". Après hydrolyse ménagée, le profil électrophorétique du fibrinogène évolue de façon identique aux fibrinogènes contrôles, avec persistance d'une bande atypique, mais qui est hydrolysée de la même façon que la chaîne<B>Au</B> . Le séquençage peptidique en zone N-terminale d'un fragment hydrolysé permet de confirmer l'appartenance des premiers aminoacides à la séquence peptidique de la chaîne Au. L'anomalie du fibrinogène retenue est persistante à distance de la mise en évidence initiale. Elle est retrouvée également chez son fils et chez sa mere, mais pas chez son père. Son fils agé de 4 ans était au jour des investigations indemne de pathologie thrombotique. Sa mère rapporte la notion de traitement antivitamine K instauré après une grossesse extra-utérine. La particularité intéressante de ce dysfibrinogène constitutionnel est le dedoublement de la chaîne Au (décalage en position cathodique) dans des conditions dénaturantes réductrices. Les anomalies de la chaîne Aa du fibrinogène décrites à ce jour dans le cadre des maladies thrombotiques sont associées à des troubles de la fibrinoformation (baisse du taux de fibrinogène coagulant, allongement des temps de thrombine et de Reptilase(P).

Dans les deux cas, l'anomalie persiste au cours du temps, sur une période de 6 mois au moins, et retrouvée chez deux autres membres de la famille. Il s'agit donc de deux anomalies constitutionnelles différentes, présentes sur le produit issu de la purification du fibrinogène à partir du plasma. La nature exacte des changements protéiques et géniques reste à déterminer, mais le comportement lors de l'hydrolyse ménagée par l'endoproteinase Glu-C, et dans le deuxième cas le séquençage peptidique, sont en faveur de la présence de dysfibrinogène. Ces anomalies ont été retrouvés chez des patients présentant une maladie thromboembolique veineuse, mais l'effectif des patients présentant des thrombose artérielles est plus faible, et l'existence de telles anomalies dans ce cadre ne peut être exclu.

De ces deux exemples, il ressort qu'il est possible de rechercher des anomalies constitutionnelles du fibrinogène plasmatique humain ou dysfibrinogènémies par une technique n'a jamais été utilisée à ce jour dans ce but. Ces dysfibrinogenes apparaissent chez les membres de la famille qui ont présentés des thromboses ou chez des personnes qui sont encore jeunes et n'ont peut-être pas encore développé ce genre de manifestation. Il semblerait que la fréquence de survenue d'une telle anomalie soit au moins egale ou supérieure à celle connue jusqu'à présent dans le domaine la thrombose veineuse : en effet, ces deux cas ont été trouvés chez 175 patients apparentés présentant une maladie thromboembolique veineuse, soit 1,1 %, alors que le chiffre actuel se situe aux alentours de 0,1-1 %, parfois annoncé exceptionnel par certains auteurs, et correspondent à des anomalies différentes. Ces deux fréquences doivent donc être additionnées. La recherche de dysfibrinogène par ce procédé peut se révéler utile et peut être proposé chez les patients ayant développé une thrombose, ou chez qui un risque de développer une thrombose est recherché. Par extension, un schéma similaire peut être proposé pour rechercher des dysfibrinogènémies en cas de suspicion clinique autre d'anomalies du fibrinogène, bien que ces situations soient beaucoup moins fréquentes.

Les techniques d'électrophorèse sont maintenant bien standardisées et accessibles aux laboratoires d'analyses. Par contre, le développement à cette fin d'une technique permettant de purifier le fibrinogène en série ` partir de plusieurs plasmas de patient traités simultanément, l'utilisation d'un matériel prêt à l'emploi permettant de purifier rapidement le fibrinogène à étudier in vitro a partir de faibles quantités de sang, et l'utilisation de matériel(s) de référence normal et/ou pathologique permettant de comparer les caractéristiques électrophorétiques du fibrinogène à étudier peuvent être source d'application industrielle.

Claims (5)

REVENDICATIONS

1. Procédé de recherche in vitro d'un risque de thrombose chez un patient dont le fibrinogène est présent à une concentration normale dans le plasma lorsque mesure par son activité coagulante, et pour lequel il n'existe pas de retard du plasma à coaguler en présence de thrombine à faibles concentrations, communément appelé temps de thrombine, caractérisé en ce qu'il consiste à rechercher une anomalie de la migration électrophorétique du fibrinogène plasmatique, en l'absence de réduction et/ou après réduction.

2. Procédé de recherche in vitro d'une anomalie du fibrinogène plasmatique circulant chez un patient chez lequel un tel dysfonctionnement peut être suspecté des arguments cliniques alors que ce fibrinogène est présent à une concentration normale dans le plasma lorsque mesuré par son activité coagulante, et qu'il n'existe pas retard du plasma à coaguler en présence de thrombine à faibles concentrations, communément appelé temps de thrombine, quelque soit le système de mesure utilisé, caractérisé en ce qu'il consiste à rechercher une anomalie de la migration électrophorétique du fibrinogène plasmatique en l'absence de réduction et/ou après réduction.

3. Procédé selon les revendications 1 ou 2 caractérisé en ce que la position des bandes de migration électrophorétique du fibrinogène ou plus généralement les caractéristiques de migration électrophorétique sont comparées à celles d'échantillons contrôles.

4. Procédé selon l'une des revendications 1, 2 ou 3 caractérisé en ce que le repérage du fibrinogène se fait après coloration des protéines présentes dans le gel, ou après marquage à l'aide d'un anticorps reconnaissant spécifiquement le fibrinogène.

5. Procédé selon la revendication 4 caractérisé en ce que le fibrinogène qui est examiné a été préalablement purifié à partir de volumes faibles de plasma, compris entre 0,1 mL et 1 mL, par une technique réalisée en microtube ou en microplaque, permettant la réalisation simultanée de plusieurs purifications. Procédé selon la revendication 5 caractérisé en ce que le fibrinogène qui est examiné été préalablement purifié à partir du plasma par précipitation notamment par du sulfate d'ammonium, ou de la glycine, ou de la bêta alanine, par chromatographie d'adsorption sur des fragments de fibrine ou des anticorps antifibrinogéneimmobilisés. 7. Procédé selon la revendication 6 caractérisé en ce que des protéines susceptibles de contaminer la préparation de fibrinogène ont été éliminées du plasma par chromatographie d'adsorption notamment sur de la lysine immobilisée, de la gélatine immobilisée, ou de la protéine G immobilisée. 8. Kits ou trousses de purification du fibrinogène destinés à la detection d'une anomalie de migration électrophorétique du fibrinogène selon les revendications 6 ou 7 caractérisés en ce qu'ils comprennent, sous une forme prête à l'usage, 1/ un milieu de précipitation du fibrinogène, un milieu de lavage du précipité, et un tampon de dissolution du précipité obtenu, pour une précipitation à partir d'un échantillon plasmatique de faible volume, 2/ ou bien un milieu d'adsorption du fibrinogène, un tampon de lavage, et un tampon d'élution, pour une chromatographie d'adsorption à partir d'un échantillon plasmatique de faible volume. 9. Kits ou trousses de purification du fibrinogène destinés à la detection d'une anomalie migration électrophorétique du fibrinogène selon la revendication 8 caractérisés en qu'ils comprennent, sous une forme prête à l'usage, de la lysine immobilisée, ou de la gélatine immobilisée, ou de la protéine G immobilisée, pour l'élimination de protéines susceptibles de contaminer la préparation de fibrinogène. 10. Kits ou trousses de purification du fibrinogène destinés à la détection d'une anomalie de migration électrophorétique du fibrinogène selon les revendications 8 ou 9 caractérisés en ce que les réactifs nécessaires à la préparation du fibrinogène sont mis à disposition dans un récipient, comme des microtubes à centrifugation ou une microplaque, permettant à la fois 1/ l'adsorption des protéines susceptibles de contaminer la préparation, puis la récupération par centrifugation de la solution surnageante contenant le fibrinogène à étudier, 2/ et/ou la précipitation du fibrinogène, puis la collecte de ce précipité par centrifugation, puis le lavage de ce précipité par la solution de précipitation, puis la dissolution de ce précipité par le tampon de dissolution, 3/ et/ou l'adsorption du fibrinogène à étudier, puis sa récuperation par des centrifugations dans le même contenant en présence des différentes solutions de lavage et d'élution. 11. Kits ou trousses de purification du fibrinogène destinés à la detection d'une anomalie de migration électrophorétique du fibrinogène selon les revendications 8, 9 ou 10 caractérisés en ce qu'ils contiennent également des aliquotes de fibrinogène contrôle dont les caractéristiques de migration électrophorétique ont été établies, et dont les caractéristiques de migration électrophorétique peuvent être considérées comme pathologiques pour certains ou normales pour d'autres, et qui seront comparés au fibrinogène étudié à l'aide de ces kits.