FR2763954A1 - Peptides utiles pour la detection et le dosage des immunoglobulines e anti-curares et leurs utilisations - Google Patents

Abstract

La présente Invention se rapporte à des peptides utiles pour la détection et le dosage des Immunoglobulines E (IgE) anti-curares et à leurs utilisations dans un procédé de détection et/ ou de dosage in vitro des IgE susceptibles d'être présentes dans un échantillon biologique, et dans la préparation d'un réactif et d'une trousse propres à permettre la mise en oeuvre de ce procédé.Ces peptides répondent à la formule générale (I) ci-après : (CF DESSIN DANS BOPI) dans laquelle : Orn* représente une ornithine delta-perméthylée, X et Y, identiques ou différents, représentent une méthionine, une méthionine sulfoxyde, une O-méthylsérine ou une cystéine.L'Invention trouve notamment application au diagnostic étiologique des réactions allergiques peropératoires et à la détection d'une allergie potentielle aux curares.

Description

PEPTIDES UTILES POUR LA DETECTION ET LE DOSAGE DES
IMMUNOGLOBULINES E ANTI-CURARES ET LEURS UTILISATIONS
La présente Invention se rapporte à des peptides utiles pour la détection et le dosage des
Immunoglobulines E (IgE) anti-curares et à leurs utilisations dans un procédé de détection et/ou de dosage in vitro des IgE susceptibles d'être présentes dans un échantillon biologique, et dans la préparation d'un réactif et d'une trousse propres à permettre la mise en oeuvre de ce procédé.

Les curares (suxaméthonium, vécuronium, gallamine, alcuronium, pancuronium, atracurium, ...) sont des agents pharmacologiques qui se caractérisent par leur pouvoir d'inhibition de la transmission de l'influx nerveux au niveau de la plaque motrice.

Cette propriété myorelaxante est à l'origine de leur utilisation comme adjuvants de l'anesthésie générale lors d'interventions chirurgicales, notamment pour faciliter l'intubation endo-trachéale et la réalisation d'actes opératoires nécessitant un relâchement musculaire important comme, par exemple, en chirurgie abdominale.

Ils présentent, toutefois, l'inconvénient d'induire chez certains sujets des réactions allergiques brutales, de gravité variable, allant de la simple manifestation cutanée (rash cutané, urticaire, ...) jusqu'au choc anaphylactique dont l'évolution est parfois mortelle par asphyxie, arrêt cardiaque ou passage de l'état de choc à un stade d'irréversibilité.

Ainsi, une enquête pratiquée dans huit centres français d'allergoanesthésie et portant sur 821 accidents anaphylactiques peropératoires (LAXENAIRE et al., Ann.

Fr. Anesth. Réanim., vol. 9, nO 6, 501-506, 1990) a montré que les curares sont responsables de 80% de ces accidents, le suxaméthonium apparaissant à lui seul être à l'origine de plus de la moitié des anaphylaxies aux curares.

Sur le plan chimique, les curares ont en commun de présenter au moins une et le plus souvent deux fonctions ammonium quaternaire, leur structure étant par ailleurs extrêmement variée puisqu'elle va de la simple chaîne aliphatique (suxaméthonium) à des formes complexes stéroidiques (vécuronium, pancuronium), benzoisoquino léiniques (atracurium) ou encore alcaloïdiques (alcuronium). I1 a été prouvé que ces fonctions ammonium quaternaire jouent un rôle prépondérant, non seulement dans leurs effets myorelaxants, mais également dans leur caractère allergénique.

Compte-tenu de la gravité potentielle des réactions anaphylactiques peropératoires et de la prédominance de la responsabilité des curares dans la survenue de ces réactions, on comprendra qu'il est indispensable de disposer de tests permettant
- d'une part, de vérifier chez un patient ayant reçu un ou plusieurs curares lors d'une intervention chirurgicale et ayant développé une réaction allergique, surtout s'il s'agit d'un choc anaphylactique, leur éventuelle responsabilité dans cette réaction et ce, ne serait-ce que pour pouvoir les éliminer, le cas échéant, des agents susceptibles d'être utilisés chez ce patient lors d'anesthésies ultérieures ; et
- d'autre part, de détecter, chez un patient devant subir une intervention chirurgicale sous anesthésie générale, dans le cadre de laquelle l'utilisation d'un ou plusieurs curares est envisagée, une anaphylaxie potentielle à ces agents myorelaxants.

Parmi les tests qui ont été proposés à ce jour, on distingue
- des tests cutanés qui visent à détecter la présence d'IgE anti-curares à la surface des mastocytes de la peau. I1 s'agit, d'une part, des Prick-tests dans lesquels une dose infinitésimale du curare suspecté d'allergénicité est introduite très superficiellement dans l'épiderme, généralement sans dilution préalable, et, d'autre part, des intradermoréactions qui consistent à injecter le curare, toujours dilué, dans le derme de manière à réactiver une éventuelle sensibilisation antérieure. Dans les deux cas, l'apparition dune verrucosité, voire d'un oedème, dans les 15 à 20 minutes qui suivent, confirme la sensibilisation du sujet au curare testé.

Ces tests cutanés sont à la fois très sensibles et très reproductibles. Toutefois, de par le fait qu'ils sont pratiqués in vivo, qu'ils nécessitent du temps et l'intervention d'un allergologue, leur utilisation à titre prédictif ne peut être envisagée que chez des patients suspectés de présenter des facteurs de risque d'une réaction anaphylactique aux curares, lesquels sont encore très mal définis, et ne peut en aucun cas s'inscrire dans un bilan pré-anesthésique visant à dépister systématiquement une allergie potentielle aux curares.

- des tests cytologiques qui visent à détecter la présence d'IgE anti-curares à la surface des basophiles. I1 s'agit, d'une part, des tests de dégranulation des basophiles humains et, d'autre part, des tests d'histaminolibération leucocytaire. L'intérêt des premiers est très limité en raison de leur manque de sensibilité. Quant aux seconds, outre qu'ils nécessitent la présence du patient à proximité du laboratoire car l'incubation du curare à tester doit être pratiquée sitôt le prélèvement de sang, c'est leur manque de spécificité qui est mis en cause puisque celle-ci varie, selon les auteurs, entre 65 et 88%.

- des tests radioimmunologiques qui visent à détecter la présence d'IgE anti-curares dans le sérum et, plus généralement, la présence d'IgE anti-ammonium quaternaire. I1 existe ainsi des tests dits RAST (Radio Allergo Sorbent)-alcuronium
et RAST-choline, dans lesquels le sérum à tester est
mis à incuber en présence de disques de papier sur
lesquels sont fixés de l'alcuronium ou de la choline,
et les complexes antigène-anticorps retenus sur les
disques sont révélés par un anticorps anti-IgE humaines
marqué par de l'iode125 . des tests dans lesquels la phase solide est constituée
par des particules de SEPHAROSEe couplées à des composés
porteurs d'une fonction ammonium quaternaire comme la
triméthylamine ou la triéthylamine, ou couplées à de la
morphine ; et . des tests dérivés de ces derniers et dits tests SAQ-RIA
(SEPHAROSE Ammonium Quaternaire RadioImmunoAssay), dans
lesquels la phase solide est constituée, soit par des
particules de SEPHAROSE# sur lesquelles est fixée de la
choline ou de la p-aminophosphorylcholine, soit par des
particules d'Epoxy-SEPHAROSE# porteuses de propa
méthylène-triméthylammonium-amine (GUEANT et al.,
Allergy, vol. 46, 452-458, 1991).

Outre que la sensibilité de ces tests radioimmunologiques est extrêmement variable, puisqu'une étude réalisée sur des sérums provenant de 31 patients ayant développé une réaction anaphylactique au décours d'une anesthésie générale et dont les tests cutanés se sont révélés positifs au curare utilisé au cours de cette anesthésie, a montré que leur sensibilité varie de 36% pour le test le moins sensible (RAST-alcuronium) à 97k pour le test le plus sensible (test SAQ-RIA/p-aminophosphorylcholine), leur utilisation ne peut pas être envisagée dans le cadre d'un dépistage systématique des allergies aux curares car elle expose au risque de détecter des sujets présentant des IgE anti-ammonium quaternaire non spécifiques d'une sensibilisation aux curares. Au surplus, aucun de ces tests radioimmunologiques, à l'exception du test RAST-alcuronium, n'a fait l'objet d'une commercialisation.

Le problème se pose, par conséquent, de fournir un test in vitro permettant de diagnostiquer une allergie potentielle ou avérée aux curares, qui soit à la fois sensible et spécifique pour éviter qu'il ne conduise à des résultats faussement positifs ou, au contraire, faussement négatifs, et qui soit facilement et rapidement réalisable à partir d'un simple prélèvement biologique et par tout laboratoire de biologie médicale, de manière à autoriser le dépistage systématique d'une telle allergie dans un bilan pré-anesthésique.

Or, dans le cadre de leurs recherches, les
Inventeurs ont découvert que, de manière surprenante, des oligopeptides présentant deux fonctions ammonium quaternaire sont capables d'être reconnus par les IgE dirigées contre des curares et de former avec ces dernières des complexes antigène-anticorps, et sont, de ce fait, aptes à être utilisés pour détecter la présence de telles Immunoglobulines dans un échantillon biologique tel qu'un échantillon sanguin, ainsi que pour doser ces
Immunoglobulines.

La présente Invention a, donc, pour objet des peptides, caractérisés en ce qu'ils comprennent une séquence en acides aminés qui répond à la formule générale (I) ci-après
Orn* -X-Y-Orn* (I) dans laquelle
Orn* représente une ornithine 6-perméthylée,
X et Y, identiques ou différents, représentent une méthionine, une méthionine sulfoxyde, une O-méthylsérine ou une cystéine.

Au sens de la présente Invention, on entend par ornithine 8-perméthylée, une ornithine dans laquelle les 3 atomes d'hydrogène de la fonction amine située en position 8 du groupement carboxyle ont été remplacés par 3 groupes méthyle.

Au sens de la présente Invention, on entend, par ailleurs, par méthionine sulfoxyde, une méthionine dans laquelle le groupe thiol a été remplacé par un groupe sulfoxyde et, par O-méthylserine, une sérine dans laquelle l'atome d'hydrogène du groupe hydroxyle a été remplacé par un groupe méthyle.

Parmi les peptides conformes à l'Invention, on préfère notamment
- le peptide dont la séquence en acides aminés répond à la formule (I) dans laquelle X et Y sont tous deux une méthionine, et qui sera désigné dans ce qui suit peptide de séquence (la)
- le peptide dont la séquence en acides aminés répond à la formule (I) dans laquelle X et Y sont tous deux une méthionine sulfoxyde, et qui sera désigné dans ce qui suit peptide de séquence (lob)
- le peptide dont la séquence en acides aminés répond à la formule (I) dans laquelle X et Y sont tous deux une O-méthylsérine, et qui sera désigné dans ce qui suit peptide de séquence (Ic) ; et
- le peptide dont la séquence en acides aminés répond à la formule (I) dans laquelle X et Y sont tous deux une cystéine et sont liés par un pont disulfure. Ce peptide sera désigné dans ce qui suit peptide de séquence (Id).

Selon un mode de réalisation préféré des peptides conformes à l'Invention, ceux-ci sont sous la forme carboxyamide C-terminal qui leur assure une protection contre une éventuelle dégradation par des carboxypeptidases.

Les peptides conformes à l'Invention présentent de préférence une structure linéaire. Il est, toutefois, possible de leur conférer une structure cyclique par la formation d'une liaison peptidique, soit directement entre les deux ornithines 6-perméthylées terminales, soit entre un ou plusieurs acides aminés liés à l'une et/ou à l'autre de ces ornithines tels qu'un ou plusieurs résidus glycine.

Les peptides conformes à l'Invention peuvent être préparés par toutes les techniques classiques de synthèse peptidique et, notamment, par la technique de synthèse en phase solide de MERRIFIELD (The Chemistry of
Solid Phase Peptide Synthesis, STEWART et YOUNG ED., 1984).

L'ornithine 6-perméthylée peut, quant à elle, être préparée par exemple en soumettant une ornithine dont la fonction amine est protégée par un groupement protecteur telle que l'a-t-butoxycarbonyl ornithine, à une réaction de perméthylation par l'iodure de méthyle dans du méthanol anhydre en milieu alcalin (pH 9) conformément à la méthode de perméthylation décrite par
GREENSTEIN et WINITZ (In Chemistry of the amino-acids,
WILEY & SONS ED., vol. 3, 1961).

La présente Invention a, également, pour objet un procédé pour détecter et/ou doser in vitro les IgE anti-curares susceptibles d'être présentes dans un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'il comprend
- la mise en contact de l'échantillon avec au moins un des peptides conformes à l'Invention, éventuellement sous forme conjuguée à une molécule porteuse, dans des conditions qui permettent la formation de complexes antigène-anticorps entre ledit ou lesdits peptides et lesdites IgE anti-curares, et
- la détection de la présence éventuelle de complexes antigène-anticorps dans ledit échantillon.

Ce procédé de détection et/ou de dosage peut être mis en oeuvre selon toutes les techniques classiquement utilisées pour détecter ou doser des anticorps présents dans un échantillon biologique et utilisant une réaction antigène-anticorps telles que notamment les techniques radio-immunologiques, immunoenzymatiques, d'immuno-fluorescence, d' immunoprécipi- tation, etc.

A titre d'exemple, le procédé de détection et/ou de dosage des IgE anti-curares conforme à l'Invention peut être mis en oeuvre sous la forme d'un test radioimmunologique visant à détecter les IgE anticurares sériques et comprenant les étapes suivantes
- le dépôt d'un volume déterminé des sérums à tester dans des tubes comprenant une quantité connue d'au moins un peptide conforme à l'Invention fixé sur une phase solide (qui peut par exemple être constituée par des billes ou par des particules),
- une première incubation d'une durée suffisante pour permettre la fixation des IgE anticurares éventuellement présentes dans les tubes sur le ou lesdits peptides
- l'élimination de la phase liquide et le lavage de la phase solide par une solution tampon appropriée,
- le dépôt dans les tubes d'une quantité déterminée d'anticorps anti-IgE humaines marqué par un radioisotope tel que l'iode125,
- une deuxième incubation d'une durée suffisante pour permettre la fixation des anticorps anti
IgE humaines sur les IgE anti-curares éventuellement liées à la phase solide,
- l'élimination de la phase liquide et le lavage de la phase solide par une solution tampon appropriée, puis
- la mesure de la radioactivité liée à la phase solide.

Conformément à l'Invention, les peptides peuvent être utilisés sous la forme de conjugués dans lesquels ils sont couplés à une molécule porteuse, par exemple par l'intermédiaire de leur fonction amine Nterminale. A titre d'exemples de molécules porteuses susceptibles d'être couplées aux peptides conformes à l'Invention, on peut mentionner l'ovalbumine, les sérum albumines, les hémocyanines ou encore les acides gras.

La présente Invention a, aussi, pour objet un réactif utile pour détecter et/ou doser in vitro les IgE anti-curares susceptibles d'être présentes dans un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'il comprend une quantité appropriée d'au moins un peptide conforme à l'Invention, éventuellement sous forme conjuguée à une molécule porteuse et/ou fixé sur une phase solide.

La présente Invention a, encore, pour objet une trousse utile pour détecter et/ou doser in vitro les
IgE anti-curares susceptibles d'être présentes dans un échantillon biologique, caractérisée en ce qu'elle comprend
- une quantité appropriée d'au moins un peptide conforme à l'Invention, éventuellement sous forme conjuguée à une molécule porteuse et/ou fixé sur une phase solide
- une quantité appropriée d'au moins un anticorps anti-IgE humaines couplé à un marqueur ; et
- éventuellement, des quantités appropriées d'un diluant et/ou d'une solution de lavage et/ou d'un sérum de contrôle et/ou d'une substance de révélation de l'activité du marqueur, tous convenablement choisis.

La présente Invention a, en outre, pour objet, l'application du procédé de détection et/ou de dosage in vitro, ainsi que du réactif et de la trousse tels que précédemment définis, au diagnostic et au dépistage des allergies aux curares.

La présente Invention sera mieux comprise à laide du complément de description qui suit et qui se réfère à des exemples de réalisation de peptides conformes à l'Invention et de mise en évidence de leurs propriétés biologiques.

Il va de soi, toutefois, que ces exemples sont donnés uniquement à titre d'illustrations de l'objet de l'Invention et n'en constituent en aucune manière une limitation.

EXEMPLE 1 : PREPARATION DES PEPTIDES CONFORMES A
L'INVENTION
Le peptide présentant la séquence d'acides aminés (Ia) définie ci-avant a été préparé sous la forme carboxyamide C-terminal par une synthèse en phase solide selon la technique de MERRIFIELD, au moyen d'un synthétiseur semi-automatique SACHEM , modèle SP 4000, et en utilisant le t-butyloxycarbonyle (t-Boc) comme groupement protecteur des fonctions a-amine de l'ornithine 6-perméthylée et de la méthionine.

Il a donc été procédé préalablement à la synthèse d'a-t-Boc-6-N-perméthyl-ornithine.

a) Préparation de 1'a-t-Boc-8-N-perméthyl- ornithine
5 g d'a-t-Boc-ornithine (Société BACHEM) ont été introduits dans un ballon 3 cols, d'une contenance de 500 ml et muni d'un réfrigérant ainsi que d'une ampoule à brome, et ont été dissous dans 250 ml de méthanol anhydre. La solution ainsi obtenue, tout en étant maintenue sous agitation, a été chauffée à 600C dans un bain d'huile et son pH porté à 9 par l'addition de méthylate de sodium ne contenant aucune trace d'hydroxyde de sodium.

100 ml d'iodure de méthyle ont alors été ajoutés goutte à goutte à la solution et le mélange réactionnel résultant a été maintenu, toujours sous agitation, à 600C et à un pH de 9 pendant 8 heures.

Après refroidissement du mélange et élimination par filtration d'une partie de l'iodure de sodium s'étant formé, le méthanol a été totalement éliminé par une distillation sous vide à 300C. Le résidu ainsi obtenu a été dissous dans 50 ml d'eau et la solution résultante a été ramenée, sous agitation, à pH 5 par de la résine BIOREX# 70 (Société BIO-RAD) sous forme H (environ 20 g) . Après filtration et lavage de cette résine par de l'eau (4 x 50 ml), puis concentration de la solution jusqu'à l'obtention d'un volume de 30 ml, cette dernière a été traitée pendant une nuit par 6 g de di-tbutyldicarbonate [(Boc)2-O, Société NOVABIOCHEM], en milieu alcalin obtenu par de l'hydroxyde de sodium, pour réintroduire sur l'ornithine perméthylée une partie du groupe t-Boc qui a été éliminé pendant la réaction de perméthylation. Puis, l'hydroxyde de sodium a été éliminé en ramenant la solution à pH 3 par de la résine BIOREXs 70 dans des conditions identiques à celles précédemment exposées. Après filtration et plusieurs lavages, la solution a été concentrée à sec.

Le résidu ainsi obtenu a été repris dans un mélange méthanol/chloroforme, v/v : 30/70, à raison de 5 ml de mélange par gramme de résidu, et soumis à une chromatographie sur une colonne (diamètre : 4 cm, hauteur : 40 cm) de gel de silice (CHROMOSORB - Société MERCK), à raison de 8 g de gel pour 1 g de mélange. Trois phases mobiles, représentant chacune 5 fois le volume en gel de silice contenu dans la colonne, ont été utilisées dans l'ordre suivant - méthanol/chloroforme, v/v : 30/70 , pour éliminer
l'iodure de sodium, - méthanol/chloroforme, v/v : 50/50, pour équilibrer la
colonne avant utilisation de la phase mobile suivante, - méthanol/eau, v/v : 30/70, pour l'élution de l'a-t-Boc
6-N-perméthyl-ornithine.

Cette dernière, obtenue sous forme d'huile, après évaporation à sec du solvant, est homogène en chromatographie sur couche mince (Kieselgur F254, MERCK, solvant : méthanol/eau, v/v 7/3, Rf = 0,38) . Sa masse, déterminée par spectrométrie de masse, est de 275 Daltons et correspond à sa masse théorique, tandis que son spectre RMN à 600 MHZ met en évidence les fonctions carboxylique et a-amine ainsi que les 3 groupements méthyle et a-t-Boc.

b) Synthèse du peptide de séquence (Ia)
La synthèse du peptide de séquence (Ia) a été réalisée en utilisant - une résine de polystyrène réticulé à 1% de
divinylbenzène, portant une fonction méthylbenzyl
hydrylamine à 0,63 mM par gramme de résine (Société
NOVABIOCHEM), comme phase solide, - le benzotriazolyl-N-oxy-trisdiméthylaminophosphonium
hexafluorophosphate (BOP ou réactif de CASTRO - Société
NOVABIOCHEM) et le l-hydroxybenzotriazole (HOBT
Société NOVABIOCHEM), en tant qu'agents de couplage, et - la di-isopropyléthylamine (DIEA - Société SDS), en tant
qu'agent de neutralisation, en mélange avec du chlorure
de méthylène (v/v : 10/90).

La résine de polystyrène réticulé à 1 de divinylbenzène portant une fonction méthylbenzhydrylamine à 0,63 mM par gramme de résine, les acides aminés protégés (a-t-Boc-6-N-perméthyl-ornithine et a-t-Bocméthionine) et les agents de couplage (BOP et HOBT) ont été utilisés en excès d'un facteur 4 par rapport à cette fonction, tandis que l'agent de neutralisation (DIEA) a été utilisé en excès d'un facteur 6, soit une utilisation, pour 1 gramme de résine, de - 693 mg de a-t-Boc-S-N-perméthyl-ornithine, - 628 mg de a-t-Boc-méthionine, - 1,13 g de BOP, - 385,5 mg de HOBT, et - 1,03 ml de DIEA.

Le contrôle du couplage des acides aminés a été effectué selon la méthode de KAISER et al. (Ann.

Biochem., 595, 1970).

A l'issue du couplage de l'ornithine 6-perméthylée C-terminale, le peptide a été clivé de sa matrice solide par de l'acide fluorhydrique liquide (1 heure à OOC, à raison de 10 ml d'acide fluorhydrique liquide par gramme de résine), en présence de paracrésol (500 mg) et de 1,2 éthane-dithiol (1 ml) pour prévenir toute oxydation des résidus méthionine. Après élimination de l'acide fluorhydrique par distillation sous vide et lavage de la résine par de l'éther éthylique (3 x 20 ml), le peptide a été repris dans de l'acide acétique 0,1 M par filtration et les filtrats obtenus ont été réunis et soumis à une lyophilisation.

Le peptide présent dans ce lyophilisat a été purifié en soumettant ce dernier, après dissolution dans une solution d'acétate d'ammonium 0,1 M (500 pl), à deux chromatographies successives de perméation de gel réalisées chacune sur une colonne (diamètre : 2 cm, hauteur : 60 cm) de gel TSK HW40S (Société TOUZART ET
MATIGNON) avec, pour la première, une élution par l'acétate d'ammonium 0,1 M et, pour la seconde, une élution par l'acide acétique 0,1 M.

Dans les deux cas, les fractions renfermant le peptide ont été révélées par une spectrophotométrie à 280 nm. A cet égard, il convient de préciser que le peptide de séquence (Ia) ne comportant aucune fonction susceptible d'absorber à 280 nm, il a également été synthétisé sous une forme dans laquelle l'ornithine 6perméthylée N-terminale était marquée au carbone4 sur ses 3 groupes méthyle pour permettre sa détection, par mesure de la radioactivité, dans les fractions d'élution de chromatographies. Il a été ainsi possible de standardiser les colonnes de chromatographie et de constater que le pic de radioactivité se superposait à celui mesuré à 280 nm en raison d'un phénomène de turbidescence se produisant dès l'apparition du peptide dans la microcellule de mesure (20 pl).

Les fractions d'élution de la seconde chromatographie contenant le peptide ont été réunies et lyophilisées.

En suivant un mode opératoire similaire, il a été également possible de synthétiser les peptides présentant les séquences d'acides aminés (lob), (Ic) et (Id)
EXEMPLE 2 : MISE EN EVIDENCE DES PROPRIETES BIOLOGIQUES
DES PEPTIDES CONFORMES A L'INVENTION
Les propriétés biologiques des peptides conformes à l'Invention ont été appréciées en testant
- d'une part, l'aptitude de quatre peptides différents, à savoir les peptides de séquences (la), (Ib), (Ic) et (Id), à être reconnus par des IgE dirigées contre un seul et même curare, en l'espèce des IgE antisuxaméthonium ; et
- d'autre part, l'aptitude d'un seul et même peptide, à savoir le peptide de séquence (la), à être reconnu par des IgE dirigées contre différents curares.

Dans les deux cas, les tests ont été réalisés en utilisant une méthode dérivée de celle décrite par
GUEANT et al. (Ibidem) et GUILLOUX et al.

(J. Allerg. Clin. Imm., vol. 90, 153-159, 1992) pour détecter la présence d'IgE anti-curares dans un échantillon de sérum, et les résultats ont été comparés à ceux obtenus dans les mêmes conditions avec le suxaméthonium.

a) Principe et mode opératoire de la méthode
Elle consiste à déterminer la capacité que présente un peptide à inhiber la fixation d'IgE anti curares présentes dans un échantillon sérique sur un gel de propaméthylène-triméthylammonium-amine-Epoxy-SEPHAROSE (PTMAES), l'inhibition par le peptide de cette fixation étant d'autant plus importante que sa reconnaissance par les IgE anti-curares est grande.

Pour ce faire, on introduit dans un tube 50 l d'un sérum provenant d'un patient présentant une sensibilisation à un ou plusieurs curares selon le cas et 50 pl d'une solution du peptide à tester de concentration connue. On laisse incuber pendant 1 heure, sous agitation lente et à température ambiante.

On ajoute 50 p1 d'une suspension de gel PTMAES préalablement préparé selon la technique décrite par
MONERET-VAUTRIN et al. (J. Aller. Clin. Immunol ., vol.

82, 745-752, 1988) et on laisse incuber pendant 3 heures, toujours sous agitation lente et à température ambiante.

Au terme de cette incubation, le gel PTMAES est lavé trois fois avec 2 ml d'une solution d'un tampon
PO4Na2H,PO4NaH2 0,05 M, pH 7,4, NaCl 0,5 M, BSA 0,02%.

On introduit alors dans le tube contenant le culot de gel PTMAES ainsi lavé, 50 pl d'une solution d'anticorps anti-IgE marqués par de l'iode125 (activité spécifique = 0,5 pCi/ml) et on laisse incuber pendant 18 heures, à température ambiante et sous agitation lente.

Au terme de cette incubation, on soumet de nouveau le gel PTMAES à une série de trois lavages par 2 ml de la même solution tampon que précédemment.

On mesure la radioactivité liée au gel PTMAES en l'absence de peptide (radioactivité A - tube Témoin), et en présence de peptide (radioactivité B) par un comptage d'une minute sur compteur gamma et on calcule le pourcentage d'inhibition (I) selon la formule
radioactivité A - radioactivité B
I ~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~ x 100
radioactivité A
L'inhibition est considérée comme positive lorsque le pourcentage d'inhibition (I) ainsi obtenu est supérieur à 20%. De plus, la reconnaissance du peptide testé par les IgE anti-curares est d'autant plus importante que ce pourcentage d'inhibition (I) est élevé.

b) Reconnaissance des peptides de séquences (Ia), (Ib), (Ic) et (Id) par des IgE anti-suxaméthonium
Ce test a été conduit sur un sérum provenant d'un patient connu pour ne présenter qu'une sensibilisation au suxaméthonium. La reconnaissance de chacun des peptides de séquences (Ia), (Ib), (Ic) et (Id) par les IgE anti-suxaméthonium présentes dans ce sérum a été testée avec des solutions présentant une concentration en peptide de 5 pM/ml et comparée à celle obtenue avec une solution de suxaméthonium de même concentration. Les résultats, exprimés en pourcentages d'inhibition (I), sont présentés dans le Tableau 1 ciaprès.

TABLEAU 1

<tb> <SEP> Inhibiteur <SEP>
<tb> Peptide <SEP> de <SEP> séquence <SEP> (Ia) <SEP> 78%
<tb> Peptide <SEP> de <SEP> séquence <SEP> (Ib) <SEP> 67% <SEP>
<tb> Peptide <SEP> de <SEP> séquence <SEP> (Ic) <SEP> 80%
<tb> Peptide <SEP> de <SEP> séquence <SEP> (Id) <SEP> 68% <SEP>
<tb> <SEP> Suxaméthonium <SEP> 72W <SEP>
<tb>
Ces résultats montrent que les peptides conformes à l'Invention sont reconnus par les IgE dirigées contre le suxaméthonium au moins aussi bien, voire mieux pour ce qui concerne les peptides de séquences (Ia) et (Ic), que le suxaméthonium lui-même.

c) Reconnaissance du peptide de séquence (Ia) par des IgE dirigées contre différents curares
Ce test a été conduit sur les sérums - ciaprès sérums 1, 2 et 3 - de trois patients connus pour présenter une sensibilisation, respectivement à
l'atracurium et la gallamine pour le premier,
l'atracurium, la gallamine et le vécuronium pour le
second, et
l'atracurium et le vécuronium pour le troisième.

La reconnaissance du peptide de séquence (Ia) par les IgE anti-curares présentes dans ces sérums a été testée avec des solutions comprenant soit 3pM/ml, soit 5 pM/ml de peptide et comparée avec celle obtenue avec une solution de suxaméthonium présentant une concentration de 5 FM/ml. Les résultats, exprimés en pourcentages d'inhibition (I), sont prés

Ainsi que cela ressort de ce qui précède, l'Invention ne se limite nullement à ceux de ses modes de mise en oeuvre, de réalisation et d'application qui viennent d'être décrits de façon plus explicite ; elle en embrasse au contraire toutes les variantes qui peuvent venir à l'esprit du technicien en la matière, sans s'écarter du cadre, ni de la portée de la présente
Invention.

Claims (11)

REVENDICATIONS

1. Peptide, caractérisé en ce qu'il comprend une séquence en acides aminés qui répond à la formule générale (I) ci-après

Orn*-X-Y-Orn* (I) dans laquelle

Orin* représente une ornithine 6-perméthylée,

X et Y, identiques ou différents, représentent une méthionine, une méthionine sulfoxyde, une O-méthylsérine ou une cystéine.

2. Peptide selon la revendication 1, caractérisé en ce que sa séquence répond à la formule générale (I) dans laquelle X et Y sont une méthionine.

3. Peptide selon la revendication 1, caractérisé en ce que sa séquence répond à la formule générale (I) dans laquelle X et Y sont une méthionine sulfoxyde.

4. Peptide selon la revendication 1, caractérisé en ce que sa séquence répond à la formule générale (I) dans laquelle X et Y sont une

O-méthylsérine.

5. Peptide selon la revendication 1, caractérisé en ce que sa séquence répond à la formule générale (I) dans laquelle X et Y sont une cystéine et sont liés par un pont disulfure.

6. Peptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce qu'il est sous la forme carboxyamide C-terminal.

7. Procédé pour détecter et/ou doser in vitro les IgE anti-curares susceptibles d'être présentes dans un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'il comprend

- la mise en contact de l'échantillon avec au moins un peptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, éventuellement sous forme conjuguée à une molécule porteuse, dans des conditions qui permettent la formation de complexes antigène-anticorps entre ledit ou lesdits peptides et lesdites IgE anticurares, et

- la détection de la présence éventuelle de complexes antigène-anticorps dans ledit échantillon.

8. Réactif utile pour détecter et/ou doser in vitro les IgE anti-curares susceptibles d'être présentes dans un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'il comprend une quantité appropriée d'au moins un peptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, éventuellement sous forme conjuguée à une molécule porteuse et/ou fixé sur une phase solide.

9. Trousse utile pour détecter et/ou doser in vitro les IgE anti-curares susceptibles d'être présentes dans un échantillon biologique, caractérisée en ce qu'elle comprend

- une quantité appropriée d'au moins un peptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, éventuellement sous forme conjuguée à une molécule porteuse et/ou fixé sur une phase solide

- une quantité appropriée d'au moins un anticorps anti-IgE humaines couplé à un marqueur ; et

- éventuellement, des quantités appropriées d'un diluant et/ou d'une solution de lavage et/ou d'un sérum de contrôle et/ou d'une substance de révélation de l'activité du marqueur, tous convenablement choisis.

10. Application du procédé de détection et/ou de dosage in vitro selon la revendication 7 au diagnostic et au dépistage des allergies aux curares.

11. Application du réactif selon la revendication 8 ou de la trousse selon la revendication 9 au diagnostic et au dépistage des allergies aux curares.