JP2001502792A - 診断法「ａ」 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 活性化食細胞および（または）炎症が関与するアテローム性動脈硬化およびそれに類する疾病に対する診断法およびスクリーニング試験法が提供される。本法は、ｐ−ヒドロキシフェニルアセトアルデヒド−リシンが体液または組織試料中に、通常の患者における濃度と比べて高濃度で存在することを測定するものである。

Description

【発明の詳細な説明】 診断法「Ａ」発明の背景 本発明は新規診断法に関する。更に詳しく言えば、本発明は、活性化食細胞お よび（または）炎症が関与するアテローム性動脈硬化および同様な疾病、例えば 関節炎、炎症性腸疾患、虚血性リパーフュージョン(reperfusion)損傷ならびに 同様な炎症および血管疾患、の診断法およびスクリーニング試験法に関する。 合衆国における死亡の主因は心臓病である。合衆国においては年間約百万人が 心臓病で死亡する。実際には、心臓病は多種多様な病気であり、その多くの主な 原因は動脈硬化である。 アテローム性動脈硬化は、プラークと呼ばれる脂肪沈着物が内膜（動脈内壁） に蓄積する動脈硬化の一般的な形式である。心臓へ血液を供給する動脈に対して 生じた狭窄の結果として、心臓の酸素供給（血液により運ばれる）が減少する。 血液供給が目立って減少すると、個人は狭心症の苦痛を感じるかも知れない。こ のような苦痛は、例えば興奮が高まる、あるいは運動している間、心臓が異常に 大量の血液を必要とする場合に悪化することが多い。このようにして心臓がその 酸素供給を阻んだとき、心臓組織は死ぬ。即ち、冠動脈閉塞あるいは心筋梗塞が 起こり、もし広い区域の組織が影響を受けるなら、致命的となりうる。 従って、個人が狭心症の痛みの症状を経験したときには、急いで医学的救助を 求めるのがよい。もし既に痛みが起こっていたならば、心筋梗塞を防止するため 、あるいは医療を受けるために、早い医学的対応が必要かも知れない。 心臓疾患と闘うために使われる多くの治療剤はあるけれども、それらの使用は 、既に過度の組織損傷が起こっている場合に限られる。血管形成術あるいはバイ パス外科手術といった外科的介入も必要かも知れない。 上記事項からみて、アテローム性動脈硬化に対する診断法およびスクリーニン グ試験は、医学分野で重要な実際の使用価値をもつ筈であることは明白である。 このような診断法は、食餌、運動などといった個人のコントロールの中で予防手 段を設けるために、あるいは心筋梗塞の開始前に治療の介入を行なうために有用 であろう。 従って、本発明の主要な目的は、活性化食細胞および（または）炎症が関与す るアテローム性動脈硬化および類似の疾病、例えば関節炎、炎症性腸疾患、虚血 性リパーフュージョン損傷およびそれに類する炎症および血管の病気、に対する 診断法あるいは予防的スクリーニング試験法を提供することである。 もう一つの目的は、例えば心臓カテーテル法のような侵害的手順とは違って、 患者に対し本質的に非侵害的なアテローム性動脈硬化診断法を提供することにあ る。 （注：以下の背景となる情報ならびに当業者にとって公知の通常の試験法および 実験室的手順、および本明細書中で用いられている他のこのような最新式の技術 に関する参考文献をカッコ内に示し、本明細書の末尾に付けた）。高コレステロール血症と高血糖症とは、アテローム性動脈硬化性血管疾患に対す る二つの重要な危険因子である（１，２）。 反応性アルデヒドによるタンパク質 の共有結合性修飾が、これら障害の両方においてアテローム誘発に関係している （３−５）。以前の報告は、血液コレステロールの主要な運び手である低密度リ ポタンパク質（ＬＤＬ）が、動脈硬化の病理学的発生を開始するためには酸化的 に修飾されねばならないことを示している（４，６，７）。 酸化されたＬＤＬ脂質から誘導されたアルデヒドは、これら病変の多くを媒介 する上で重要な役割を演じることがある（３−７）。糖尿病性血管疾患も同様に 血管壁および血漿タンパク質のグルコース（その開鎖形において反応性アルデヒ ド部分を有する）による共有結合性修飾から起こりうる（８−１０）。 病気および老化の病因論において、反応性アルデヒドの潜在的重要性に広汎な 関心があるにも拘らず（３−１２）、生体内でアルデヒドとタンパク質との間に 生成される共有結合性付加体の性質に関しては殆ど知られていない。アルデヒド で修飾されたタンパク質を検出するための大抵の研究は、免疫組織化学的方法に 頼っており、同起源エピトープ（複数のことがある）の正しい構造（複数かもし れない）は一般に不明である。事実、生体内でのアルデヒドとタンパク質との反 応の生成物で、十分にその特性が明らかにされた唯一のものはグルコースリシン （１７）、フルクトースリシン（Amadori生成物；文献１７）、ペントシジン（ １８）、およびＮ^ε−（カルボキシメチル）リシン（１９）であり、これらは容 器内で還元糖とタンパク質との反応により生成される。 血管損傷に対して、本明細書中に提出し考察した一つの潜在的経路は、食細胞 により分泌されるヘムタンパク質であるミエロペルオキシダーゼを含んでいる（ ７，２０−２２）。ミエロペルオキシダーゼは、食細胞によりつくり出されたＨ₂ Ｏ₂を利用して拡散性細胞毒性オキシダントを生成させる（２３−２８）。免疫 組織化学的および生物化学的研究は、活性ミエロペルオキシダーゼがヒトの動脈 硬化性病変の成分であることを実証した（２２）。アテローム性動脈硬化性病変 部位（１５）における酵素（２２）およびタンパク質の結合した脂質酸化生成物 に対する免疫学的染色のパターンは著しく類似している。 ミエロペルオキシダーゼの最もよく特性が明らかにされた生成物は次亜塩素酸 （ＨＯＣｌ）で、このものは塩化物イオン（Ｃｌ^-）から２電子酸化反応（反応 式１：文献２１，２３）で発生する。 Ｃｌ^-＋ Ｈ₂Ｏ₂ ＋ Ｈ⁺ → ＨＯＣｌ ＋ Ｈ₂Ｏ （反応式１） ＨＯＣｌはヘムタンパク質を漂白し（３０）、アミンをクロラミンに変え（３１ −３３）、スルフヒドリル基を不活性化し（３４，３５）、不飽和脂質を塩素化 する（３６−３８）。 ミエロペルオキシダーゼによる酸化のもう一つの基質はＬ−チロシンである。 このものは一電子酸化反応を受けてチロシルラジカルを生成する（２５，２６） 。チロシルラジカルはタンパク質と結合したチロシル残基をＯ，Ｏ’−ジチロシ ンに変え、脂質の過酸化を開始させる。この過酸化がＬＤＬにアテローム誘発性 を付与するのかも知れない（２５，２６，３９，４０）。 活性化食細胞はまたミエロペルオキシダーゼ−Ｈ₂Ｏ₂−Ｃｌ系を用いてＬ−チ ロシンを両親媒性アルデヒド、ｐ−ヒドロキシフェニルアセトアルデヒド（ｐＨ Ａ）に変換することが最近実証された（２７）。Ｌ−チロシンおよびＣｌ^-の生 理学的濃度において、ｐＨＡは食細胞活性化の主要生成物である（２７）。 発明の簡単な説明 本発明は、活性化食細胞および（または）炎症が関与するアテローム性動脈硬 化およびそれに類する疾病に対する診断法およびスクリーニング試験法を提供す るものである。 本法は、体液または組織中で、ミエロペルオキシダーゼーが媒介する酸化的損 傷に対する高度に選択的かつ敏感なマーカーとして、ｐ−ヒドロキシフェニルア セトアルデヒド−リシン（ｐＨＡ−リシン）の存在を測定することからなる。 患者の体液または組織から、通常の患者における濃度に比して実質的に高い濃 度でｐＨＡ−リシンが検出されることは、活性化食細胞および（または）炎症が 関与するアテローム性動脈硬化および多種多様な病気のスクリーニングに役立つ 。 本診断法はまた活性化食細胞および（または）炎症が関与するアテローム性動 脈硬化および類似の疾患に対する治療の介入の有効性をモニターするための、ま た生体内での酸化的緊張に対する検定法として有用である。 本診断法に使用する体液または組織は、例えば活性化食細胞の代謝生成物を含 む血清または血漿、尿または体組織あるいは細胞でよい。 本発明によると、食細胞によるＬ−チロシン酸化の主要生成物であるｐＨＡは 、タンパク質のリシン残基の遊離アミノ基と反応してSchiff塩基を生成すること が分かった（下記のスキームＩ参照）。還元されたタンパク質付加体の構造は、 質量分析および高分解能ＮＭＲ分光法により、疑う余地なくｐＨＡ−リシンとし て確定された。更にまた、ヒトの炎症組織からｐＨＡ−リシンが検出され、ｐＨ Ａが生体内でタンパク質を修飾することが実証された。 ｐＨＡ−リシンはまた合成的に調製されたｐＨＡ、ミエロペルオキシダーゼー Ｈ₂Ｏ₂−Ｃｌ^-系により酸化されたＬ−チロシン、および活性化ヒト食細胞によ り酸化されたＬ−チロシンに暴露されたモデルタンパク質でも発生した。これら の結果は、反応経路における重要な段階として、ミエロペルオキシダーゼによる 遊離ｐＨＡ発生を示している。これらの発見事項と一致して、Ｈ₂Ｏ₂スカベンジ ャーであるカタラーゼの添加、およびペルオキシダーゼ阻害剤のアジ化物および シアン化物の添加は、精製酵素系および活性化ヒト好中球の両方によりｐＨＡ− リシン発生を抑制した。 完全な好中球および赤血球の細胞内タンパク質および膜関連タンパク質上での リシン残基の共有結合による修飾が、ミエロペルオキシダーゼによるｐＨＡ合成 後に観察された。従って、炎症部位でのｐＨＡ産生は細胞外、膜性および細胞内 の標的タンパク質の共有結合による修飾を起こす。 ｐＨＡ−リシンは、ｐＨＡに暴露され、ＮａＣＮＢＨ₃で還元され、そして酸 加水分解を受けたモデルタンパク質のアミノ酸加水分解物中に検出される主要な 付加体である。従って、ヒト組織中のｐＨＡ−リシンの検出は、アテローム性動 脈硬化症の場合のように、ミエロペルオキシダーゼ媒介酸化的損傷に対する高度 に選択的かつ敏感なマーカーとして役立つ。ここに開発された安定同位体希釈Ｇ Ｃ−ＭＳ分析は、フェムトモル(femtomole)濃度でｐＨＡ−リシンを検出でき、 種々な炎症性疾患状態において、食細胞発生アルデヒドによるタンパク質修飾の 度合を評価するための有用性に確証を与える。 発明の詳細な説明 本明細書は、本発明を構成すると考えられる主題事項を個々に指摘し、別々に 請求する請求項で結んでいるが、本発明は図面と共に取り上げた特に適当な具体 例についての下記の詳細な説明から一層よく理解されるであろう。該図は簡単に 言えば： 図面の簡単な説明 図１は、ｐＨＡとＮ^α−アセチル−リシンとの間の反応で生成した還元シッフ塩 基付加体の逆相ＨＰＬＣ検出を示す。ｐＨＡ（２mM）およびＮ^α−アセチル−リ シン（４mM）の両方を、あるいはいずれかの成分単独を含む反応物を、２０mMリ ン酸ナトリウム、１００μｍ ＤＴＰＡ（pH７．４）中３７℃で４時間インキュ ベートした。次にＮａＣＮＢＨ₃（１０mM）を加え、反応混合物を３７℃で一晩 インキュベートした。生成物を、後の「方法」のところで説明されているＣ１８ カラム上のＨＰＬＣ分析にかけた。ｐＨＡおよびＮ^α−アセチル−リシン両方の 存在下で生じた単一の主要酸安定性化合物（保持時間１４．０分）を集め、これ を図２−４で述べた試験によりＮ^α−アセチル−Ｎ^ε−ｐＨＡ−リシンとして同 定した。 図２は、二つの部分、図２Ａと２Ｂにおいて、ｐＨＡとＮ^α−アセチル−リシン との間で生じた還元シッフ塩基の負イオン化学イオン化−ガスクロマトグラフィ ー−質量スペクトルを示す。Ｎ^α−アセチル−リシンとｐＨＡとの間の反応の主 生成物（図１、保持時間１４．０分）を逆相ＨＰＬＣにより単離し、そのｎ−プ ロピルエステル、per−ＰＦＰ誘導体を「方法」のところで述べるＧＣ−ＭＳ分 析にかけた。 （図２Ａ）誘導体化ＨＰＬＣ−精製生成物の全イオンクロマトグラム。 （図２Ｂ）誘導体化ＨＰＬＣ精製生成物の負イオン化学イオン化質量スペクト ル。質量スペクトルは、提出した構造（挿入図、図２Ｂ）および Ｎ^α−アセチル−Ｎ^ε−ｐＨＡ−リシンのｎ−プロピルエステル、 per−ＰＦＰ誘導体のフラグメンテーションパターン（挿入図、図 ２Ａ）と一致する。 ガスクロマトグラフィーによる分離は、次の温度勾配：６０℃／分で６０℃から １５０℃、次に１０℃／分で１５０℃から２５０℃、で操作した１５ｍ ＤＢ− ５ キャピラリーカラム（J & W Scientific；内径０．３５mm、膜厚１．０μｍ ）上で行なった。インジェクター、トランスファーライン、およびソース温度は それぞれ２５０℃、２５０℃および１５０℃にセットした。 図３は、ｐＨＡとＮ^α−アセチル−リシンとの間で生じた還元シッフ塩基の¹Ｈ ＮＭＲスペクトルを示す。Ｎ^α−アセチル−リシンとｐＨＡとの主生成物（図 １、保持時間１４．０分）を、「方法」のところで述べるように、逆相ＨＰＬＣ により単離し、¹Ｈ ＮＭＲにより分析した。ＴＯＣＳＹにより確定したピーク 帰属（図４）を描き（挿入図）、相対的積分面積を示した。α−プロトンおよび アミド（Ｎ^α−Ｎ^ε）プロトンの積分面積が＜１であるのは、それぞれ交換水（ 信号励起前に照射）から生ずる部分的な抑制と飽和移動によるものである。 「α」と帰属されたプロトンは縮退せず、一つはメチレン（ｆ）信号に非常に 接近して共鳴する。中性pHにおいて、アミドに隣接するプロトンは近くのメチレ ン基とのカップリングを示すが、溶媒と迅速に交換するアミドプロトンとはカッ プリングしない。ＤＣｌを添加すると、アミド交換は遅くなり（アミドプロトン の検出が可能）、アミドに隣接する共鳴のブロード化を起こす。溶媒との迅速な 交換のために観察されなかったプロトンは（Ｌ）と表示してある。 図４は、Ｎ^α−アセチル−Ｎ^ε−ｐＨＡ−リシンの二次元全相関スペクトルを示 す。このスペクトルに用いた試料は図３に用いたものと同一である。交差ピーク は還元シッフ塩基の共鳴（図３）の帰属を可能にする。Ｆ１とＦ２中の４．７pp m近くの人工物は強い水信号から生じたものである。 図５は、放射能標識したｐＨＡと反応させたＢＳＡの逆相ＨＰＬＣ分析を示す。 ＢＳＡ（１mg／ml）を、緩衝液Ｂ（２０mMリン酸ナトリウム、１００μＭ ＤＴ ＰＡ、pH７．０）中で精製[¹⁴Ｃ]ｐＨＡ（１．０mM）と３７℃で２時間インキュ ベートした。反応生成物を１０mM ＮａＣＮＢＨ₃の添加により還元し、３７℃ で１時間インキュベーションし、そして次に修飾されたＢＳＡを０℃で１０％ト リクロロ酢酸により沈殿させた。 ペレットを氷冷１０％トリクロロ酢酸で二回洗浄し、「方法」のところで説明 するようにＨＢｒで加水分解した。このアミノ酸加水分解物を、１ml／分で２５ 分間にわたり、０．１％ＴＦＡ（pH２．５）中０〜１００％メタノールの直線勾 配を用いる逆相ＨＰＬＣにかけた。フラクションを乾燥し、シンチレーション分 光測定により分析した。主要な放射能化合物の実体がｐＨＡ−リシンであること はＧＣ−ＭＳ分析により確かめられた。ＢＳＡから誘導されたＬ−チロシンがこ れらＨＰＬＣ条件下でｐＨＡ−リシンと共に溶離し、Ａ₂₇₆nmにおける吸光度に 寄与することに注意されたい。 図６は、二つの部分図６Ａと図６Ｂとして、ミエロペルオキシダーゼ−Ｈ₂Ｏ₂− Ｃｌ^-−チロシン系に暴露された赤血球の細胞質タンパク質および膜関連タンパ ク質中のｐＨＡ−リシンの定量を示す。全血から得た赤血球（１×１０⁶個／ml ）を、ミエロペルオキシダーゼ（４０nM）、Ｈ₂Ｏ₂(１００μＭ)、１００mMＣｌ^- 、およびＬ−チロシン(１００μＭ)と共に、媒質Ｂ中３７℃で１時間インキュ ベートした。ＮａＣＮＢＨ₃で還元後、赤血球シトゾルタンパク質および膜関連 タンパク質を、「方法」のところで述べるように、超遠心により単離した。 （図６Ａ）：赤血球細胞質タンパク質および膜関連タンパク質中のｐＨＡ−リ シンの含量を、安定同位体希釈ＧＣ−ＭＳにより定量した。値は 三回の独立した定量操作に対する平均＋／−ＳＥＭを表わす。 （図６Ｂ）：ミエロペルオキシダーゼにより発生したｐＨＡに暴露された赤血 球細胞質タンパク質および膜関連タンパク質から得たｐＨＡ−リ シンの基準ピーク（ｍ／ｚ７２６；Ｍ^・-−ＨＦ）および他の主要 フラグメントイオン（ｍ／ｚ７０６；Ｍ^・-−２ＨＦ）の選ばれた イオンモニタリング。 ガスクロマトグラフィー分離は、次の温度勾配：６０℃／分で７０℃から２０ ０℃；次に１０℃／分で２００℃から２７０℃、で操作した１２ｍ ＨＰ−１キ ャピラリーカラム(Hewlett Packard；内径０．２０mm、膜厚０．３３μｍ)上で 行なった。インジェクター、トランスファーライン、およびソース温度はそれぞ れ２５０℃、２５０℃および１８０℃にセットした。^*［¹³Ｃ₆］−標準ｐＨＡ− リシン内部標準から生じたイオン。 図７は、活性化ヒト好中球に暴露されたＢＳＡにおけるｐＨＡ−リシン生成を示 す。新しく採取したヒト好中球（１×１０⁵個／ml）を、ＢＳＡ（１mg／ml）お よびＬ−チロシン(１００μＭ)で補充した媒質Ａ中でインキュベーションした。 細胞をホルボールミリステートアセテート（２００nM）で刺激し、３７℃で２時 間インキュベートし、３７℃において２時間ＮａＣＮＢＨ₃（最終１０mM）で還 元した。好中球を遠心により除いた。 上澄中のタンパク質を１０％トリクロロ酢酸で０℃において沈殿させ、酸加水 分解し、アミノ酸加水分解物をＧＣ−ＭＳにかけた。負イオン化学イオン化質量 スペクトルおよびｐＨＡ−リシンのｎ−プロピルエステル、per ＰＦＰ誘導体の 提出したフラグメンションパターンを例示する。^*［¹³Ｃ₆］−標識ｐＨＡ−リシ ン内部標準から生ずるイオン。 図８は、活性化ヒト好中球の内因性タンパク質におけるｐＨＡ−リシンの生成を 示す。完全な系（コンプリート）は、新しく採取したヒト好中球（１×１０⁶個 ／ml）を、２００μＭのＬ−チロシンおよび２００nMのホルボールミリステート アセテート（ＰＭＡ）で補充した媒質Ａ中でインキュベートしたものである。３ ７℃で６０分のインキュベーション後に、細胞をペレット化した。好中球タンパ ク質を３７℃で２時間１０mM ＮａＣＮＢＨ₃により還元し、酸加水分解にかけ た。アミノ酸加水分解物中のｐＨＡ−リシンの含有量を、安定同位体希釈ＧＣ− ＭＳにより定量した。指示した場合には、超酸化物ジスムターゼ（ＳＯＤ；１０ μｇ／ml）、イオノマイシン抗生物質(ＩＯＮＯ；１μＭ)、ＮａＮ₃（１mM）、 ＮａＣＮ（１mM）またはカタラーゼ（２０μｇ／ml）を完全系と共に含めた。 図９は、ヒト炎症組織中のｐＨＡ−リシンの質量分析による検出を示す。腹腔内 膿瘍から得た液体を集め、カタラーゼおよびアジ化ナトリウムを補なった氷冷緩 衝液Ｂと１：１（ｖ：ｖ）で混合し、次に、直ちに氷冷した水に浸けた。試料を １００mＭ酢酸アンモニウムの存在下、１０mM ＮａＣＮＢＨ₃により還元し、脱 脂質し、¹³Ｃ−標準ｐＨＡ−リシン内部標準を加えた。 タンパク質を酸加水分解し、Ｃ１８逆相カラムを用いて単離し、「方法」のと ころで説明するように、選択イオンモニターイングＧＣ−ＭＳ分析のために誘導 体化した。ｐＨＡ−リシンのｎ−プロピル−per ＰＦＰ誘導体から生ずるイオン をｍ／ｚ７４６（Ｍ^・-），７２６（Ｍ^・-−ＨＦ），７０６（Ｍ^・-−２ＨＦ），６ ８２（Ｍ^・-−ＨＦ−ＣＯ₂），５９８（Ｍ^・-−ＣＦ₃ＣＦ₂ＣＨＯ）および４７９ （Ｍ^・-−ＣＦ₃ＣＦ₂ＣＯＯ−Ｃ₆Ｈ₄−ＣＨ₂ＣＨ₂）でモニターした。 これらイオンの保持時間は、［¹³Ｃ₆］−標識ｐＨＡ−リシン内部標準から誘 導された対応するイオンと同一であった。ガスクロマトグラフィーによる分離は 、次の温度勾配：１７５℃で３分間、次に４０℃／分で１７５℃から２７０℃、 で操作した３０ｍ ＤＢ−１７ キャピラリーカラム(J & W Scientific；内径 ０．２５mm、膜厚０．２５μｍ)上で行なった。インジェクター、トランスファ ーライン、およびソース温度は、それぞれ２５０℃、２５０℃および１２０℃に セットした。 本発明を更に詳細に説明するために、下記の例を実施するが、本発明がこれら 特定の例に、あるいは例中に述べられた詳細事項に限定されないことは明らかで あろう。例 材料 Ｄ₂Ｏ、Ｌ−［¹³Ｃ₆］リシンおよびＬ−［¹³Ｃ₆］チロシンは、Cambridge Iso tope，Inc．から購入した。Ｌ−[¹⁴Ｃ]チロシンはDupont-New England Nuclear から購入した。ＨＰＬＣ溶媒はBaxterから購入した。Chelex−１００樹脂、脂肪 酸不含ＢＳＡおよび結晶カタラーゼ（ウシ肝臓から得た；チモールを含 まず）はBoehringer-Mannheimから購入した。リン酸ナトリウム、酢酸エチル、 Ｈ₂Ｏ₂およびＮａＯＣｌはFisher Chemical Companyから購入した。他の材料は すべて、特に指示した場合を除き、Sigma Chemical Companyから購入した。方 法 一般手順 以前に記述されている通り（２５，４１）、ミエロペルオキシダーゼ（ドナー :過酸化水素、オキシドレダクターゼ、ＥＣ１．１１．１．７）を単離し（Ａ₄₃₀ nm／Ａ₂₈₀nm比０．６）、貯蔵した。 酵素濃度を分光測光法で測定した（ε₄₃₀＝１７０mM^-1cm^-1；文献４２）。ヒ ト好中球を浮遊密度遠心（２７）により単離した。細胞実験は、１００μＭジエ チレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）で補なった媒質Ａ（ハンクス液、マグネシ ウム、カルシウム、フェノールおよび重炭酸塩を含まず；pH７．２；Gibco−Ｂ ＲＬ）で行なった。 好中球実験については、イオノマイシンおよびホルボールミリステートアセテ ートをそれぞれエタノールまたはジメチルスルホキシド中の濃縮原液から加え、 各ビヒクルの最終含量を≦０．２％（ｖ／ｖ）とした。 ＨＯＣｌ濃度は、分光測光により決定した。 （ε₂₉₂＝３５０Ｍ^-1cm^-1；文献４３） 緩衝液はレドックス活性金属を除くために、１００μＭ ＤＴＰＡで処理し、 かつこれで補ったChelex−１００である。 ＊ デシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動 （ＳＤＳ−Ｐ ＡＧＥ）はLaemmli（４４）により記述された方法で行なった。 ＊ タンパク質含量は、標準としてウシ血清アルブミンを用いるLowry等（４ ５）の方法により測定した。 ＊ アミノ酸分析は、Washington University School of Medicine Protein Chemistry Core Laboratoryで行なった。アミノ酸加水分解物の６−アミ ノキノイル−Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミジルカルバメートによるプレ カラム誘導体化は、紫外検知による高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰ ＬＣ）に従った（４６，４７）。ｐＨＡの合成 ＮａＯＣｌ（１：１、モル：モル）を、Ｌ−チロシン（２０mM リン酸ナトリウム、pH７．４中２mM）へ０℃で絶えずかきまぜながら滴加した。 次に溶液を３７℃に６０分加温し、直ちに実験に用いた。調製物は使用に先立ち 逆相ＨＰＬＣにより分析した。普通は≧９５％純粋であった。 高性能液体クロマトグラフィー ｐＨＡのＨＰＬＣ分析は、溶媒Ａ（５％メタ ノール、０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、pH２．５）で平衡化したＣ１８ カラム（Beckman μporacil、５μｍ樹脂、４．６mm×２６０mm）を用いて行な った。 生成物は、吸光度（Ａ₂₇₆nm）によりモニターし、下記のように、溶媒Ｂ（９ ０％メタノール、０．１％ＴＦＡ、pH２．５）で発生させた非直線勾配により、 流速１ml／分で溶離した： １０分間にわたり溶媒Ｂ０％から３５％； ２０分間溶媒Ｂ３５％でアイソクラチック溶出 １０分間にわたりＢ１２％から１００％。 [¹⁴Ｃ]ｐＨＡ−リシンは、下記の勾配： ５分間にわたり溶媒Ｂ０％から１０％； ２０分間１０％Ｂでアイソクラチック(isocratic)溶出； １０分間にわたり溶媒Ｂ１０％から１００％ を用いる逆相ＨＰＬＣ（表Ｉ、後述）で単離後、シンチレーション分光測定によ り定量した。これら条件下で、ｐＨＡ−リシンはチロシンから基線分解(base-li ne resolved)された。ｐＨＡ−リシン付加体の生成 前記図の簡単な説明の中で示した反応条件下、３ ７℃で４時間反応を行なった。次にシッフ塩基付加体を１０mM ＮａＣＮＢＨ₃ の添加と一晩の（あるいは指示された時間）３７℃インキュベーションにより還 元した。示されている場合には、還元中遊離ｐＨＡを除去するために１００ｍＭ 酢酸アンモニウムを含めた。 完全な細胞の膜関連タンパク質および細胞質タンパク質上でのｐＨＡ−リシン 生成 媒質Ｂ（１０mMリン酸塩緩衝食塩水、pH７．０(Sigma Chemical Company) 、１００μＭ ＤＴＰＡで補充）で最終濃度１×１０⁶個赤血球／mlに希釈した全 血 を、ミエロペルオキシダーゼ（４０nM）、Ｈ₂Ｏ₂(１００μＭ）およびＬ−チロ シン(１００μＭ)と３７℃で１時間インキュベーションした。 シッフ塩基付加体を、１００mM酢酸アンモニウムの存在下、３７℃で２時間１ ０mM ＮａＣＮＢＨ₃とインキュベートすることにより還元した。細胞を４℃で １５分遠心（５０００×ｇ）することによりペレット化し、媒質Ｂで二回洗浄し 、次に固く適合したPotter-Elvejheimホモジナイザーを用いて氷上で均質化した 。 細胞溶解物を超遠心（１００，０００×ｇ，４℃で１時間）により可溶性画分 と膜関連画分とに分別し、水洗したジエチルエーテル（１：１；ｖ：ｖ）で二回 連続抽出することにより脱脂質し、Ｌ−［¹³Ｃ₆］チロシン（３００ナノモル； タンパク質分のマーカー）およびＮ^α−アセチル−Ｎ^ε−［¹³Ｃ₆］ｐＨＡ−リ シン（２０ピコモル）を内部標準として加えた。ＨＢｒ加水分解およびＣ１８Su pelcoカラム上での固相抽出の後、ｐＨＡ−リシン含量を後述のように安定同位 体希釈ＧＣ−ＭＳにより定量した。 Ｎ^α−アセチル−Ｎ^ε−［¹³Ｃ₆］ｐＨＡ−リシン内部標準の調製 先ず、２ ０mMリン酸ナトリウム（pH７．０）中Ｌ−［¹³Ｃ₆］チロシン（２mM）を、前記 のようにＮａＯＣｌの添加によって［¹³Ｃ₆］ｐＨＡ（逆相ＨＰＬＣにより評価 したところ純度≧９８％）に変えた。次にＮ^α−アセチル−リシン（４mM）を加 え、混合物を３７℃で４時間インキュベートし、シッフ塩基を１０mM ＮａＣＮ ＢＨ₃と一晩インキュベートすることにより還元した。Ｎ^α−アセチル−Ｎ^ε− ［¹³Ｃ₆］ｐＨＡ−リシンを逆相ＨＰＬＣにより単離した（図１）。 タンパク質加水分解 ｐＨＡにより共有結合で修飾されたタンパク質の溶液を 真空乾燥した。次に既知量のＬ−［¹³Ｃ₆］リジンまたはＬ−［¹³Ｃ₆］チロシン のいずれか、およびＮ^α−アセチル−Ｎ^ε−［¹³Ｃ₆］ｐＨＡ−リシンを内部標 準として加えた。フェノール（１％）を添加したＨＢｒ（６Ｎ，０．５ml）を、 Mininert気密弁を具えた２mlガラス反応容器中で試料（タンパク質２５０μｇ） へ加え、試料を排気およびアルゴンガスによる掃気を交互に５回行なった。アル ゴンで覆われた溶液を１２０℃で２４時間加水分解した。このタンパク質加水分 解物を０．１％ＴＦＡで２．０mlに希釈し、０．１％ＴＦＡで平衡化したＣ１８ カラム(Supleclean，3ml，Supelco Co.)に適用した。０．１％ＴＦＡ2mlで洗浄 後、ｐＨＡ−リシンを０．１％ＴＦＡ中２０％メタノール２mlで回収した。 誘導体化に先立ち、試料を無水Ｎ₂または真空いずれかの下で蒸発乾固した。 ｎ−プロパノール（Cambridge Isotope Laboratories）中３．５Ｍ ＨＢｒ２０ ０μｌを添加し、次いで６５℃で３０分加熱することによりｎ−プロピルエステ ルを調製した。プロピル化生成物をＮ₂下で乾燥し、次に酢酸エチル中過剰のペ ンタフルオロプロピオン酸無水物(Pierce Chemical Co.)（１：３；ｖ：ｖ）を 加えて６５℃で１時間加熱することによりペンタフルオロプロピオニル（ＰＦＰ ）誘導体を生成させた。エステル化反応生成物のヘプタフルオロブチリル（ＨＦ Ｂ）誘導体は、酢酸エチル／ヘプタフルオロ酪酸無水物（４：１，ｖ／ｖ）５０ μｌを加え、６５℃で３０分加熱することにより調製した。 組織の収集 試料を氷の中に浸し、収集３０分以内処理した。シッフ塩基を、 ５０mMリン酸ナトリウム（pH７．４）中１００mM酢酸アンモニウム（遊離アルデ ヒドを除去するため）、１mM ＮａＮ₃（ミエロペルオキシダーゼ阻害剤）およ び３００nMカタラーゼ（Ｈ₂Ｏ₂スカベンジャー）の存在下、１０mM ＮａＣＮＢ Ｈ₃で３７℃において１時間還元することにより、酸に対して安定化させた。予 備的実験によると、試料にミエロペルオキシダーゼ（２０nM）およびＨ₂Ｏ₂(１ ００μＭ)を追加したとき、これら条件下で更にｐＨＡ−リシンが生成すること はないことが確かめられた。 その後試料を脱脂質し、タンパク質ペレットを排煙フード下で１０％トリクロ ロ酢酸により０℃で二回洗浄し、次に酸加水分解に付し、Ｃ１８ミニカラム上で 固相抽出し、ＧＣ−ＭＳ分析に供するため誘導体化した。 質量分析 負イオン化学イオン化モードで安定同位体希釈ＧＣ−ＭＳを用いる ことによりアミノ酸を定量した。拡張された質量範囲をもつHewlett Packard ５ ９８８Ａ質量分析計とインターフェースで連結したHewlett Packard ５８９０ガ スクロマトグラフを用いて試料を分析した。ガスクロマトグラフィー分離は、典 型的には、キャリヤーガスとしてＨｅを用い、スプリットレスモードで１２ｍＨ Ｐ−１キャピラリーカラム(Hewlett Packard；内径０．２mm、膜厚０．３３μｍ )を用いることにより行なった。特に断らない限り、次の温度勾配：６０℃／分 で７０℃から２００℃、次いで１０℃／分で２００℃から２５０℃、でカラム を操作した。インジェクター、トランスファーラインおよびソース温度は、それ ぞれ２５０℃、２５０℃、および１５０℃にセットした。ＶＧ−ＺＡＢ ＳＥ二 重集束質量分析計を用いて高分解質量分析を行ない、主要イオンの元素組成を決 定することによりそれらのここに提出した構造帰属を確証した。分解能は、標準 としてペルフルオロケロシンを用いて１０，０００にセットした。 アミノ酸は選ばれたイオンのモニターイングを用いてそれらのｎ−プロピル、 per−ＰＦＰ誘導体として定量した。ｐＨＡ−リシンはｍ／ｚ７２６（Ｍ^・-−Ｈ Ｆ）の基準ピーク、他の主要フラグメントイオンｍ／ｚ７０６（Ｍ^・-−２ＨＦ） 、およびそれらの対応する同位体標識した内部標準イオンｍ／ｚ７３２およびｍ ／ｚ７１２を用いてモニターした。Ｌ−チロシンはｍ／ｚ３６７（Ｍ^・-−ＰＦＰ ）の基準ピーク、ｍ／ｚ４９５（Ｍ^・-−ＨＦ）の他の主要フラグメントイオン、 およびｍ／ｚ３７３とｍ／ｚ５０１におけるそれらの対応した同位体標識内部標 準イオンを用いてモニターした。Ｌ−リシンはｍ／ｚ４６０（Ｍ^・-−ＨＦ）の基 準ピーク、他の主要フラグメントイオンｍ／ｚ４４０（Ｍ^・-−２ＨＦ）、および それらの対応する同位体標識した内部標準イオンｍ／ｚ４６６およびｍ／ｚ４４ ６を用いてモニターした。 定量化は、各真正化合物およびその同位体標識した内部標準を用いて構成され た校正曲線に基づいた。被検物質と同時に溶出する妨害イオンが無いことを確か めるために、各化合物およびその内部標準の二つの特徴的なイオンのイオン流の 比を通常の仕方でモニターした。すべてのアミノ酸は基線分離され、¹³Ｃ標識さ れた内部標準と共に溶出した。検出限界（信号／ノイズ＞１０）は全化合物に対 し＜１ピコモルであった。 ＮＭＲ研究 Nalorac間接検知プローブを具えたVarian Unity-Plus ５００分光計（¹Ｈに対 し４９９，８４３MHz)を用い、ＨＰＬＣ精製Ｎ^α−アセチル−Ｎ^ε−ｐＨＡ−リ シンについて２５℃においてＤ₂Ｏ：Ｈ₂Ｏ（１：９；ｖ：ｖ）中で分析を行なっ た。¹Ｈ化学シフトは外部Ｄ₂Ｏ中３−（トリメチルシリル）−プロピオン酸ナト リウム−２，２，３，３−ｄ₄を標準とした。 ＮＭＲ分析に先立ち、Ｎ^α−アセチル−Ｎ^ε−ｐＨＡ−リシンの試料をアミド プロトン交換の抑制が観察されるまでＤＣｌ(Cambridge Isotopes Inc.)で酸性 にした。プロトンおよび全相関分光法（ＴＯＣＳＹ）実験に対し、トランスミッ ター前照射により強い水の信号を減弱化した。Ｎ^α−アセチル−Ｎ^ε−リシンの プロトンＮＭＲスペクトルを２５℃で６４トランジェントから、下記条件：プリ −アクイジション ディレー＝２秒、アクイジション タイプ＝１．８９秒（３ ７，７６０コンプレックス データポイント）、パルス幅＝７μｓ（フリップ角 ８０°）およびスペクトル幅＝１０，０００Hzで記録した。自由誘導減衰は１． ０Hzの線幅ブロード化アポディゼーションで処理した。ＴＯＣＳＹについては、 ２００ｔ₁ドメインインクリーメントの各々に対し８トランジェントを集めた。 １０ミリ秒の混合時間を用い、最も強いスカラ一カップリング（ジェミナールお よびビシナール）だけについて交差ピークを得た。アクイジションタイムはｔ₂ で０．２５６秒（２０４８コンプレックス データポイント）およびｔ₁で０． ０５０秒（２００データポイント）であった。ＴＯＣＳＹデータはｔ₁およびｔ₂ ジメンション両方で、ガウスの秤量を用いるハイパーコンプレックス法(hyperco mplex method)により処理した。強い水の共鳴から生ずる人工現象を抑えるため デジタル信号処理を用いた。結果 ｐＨＡは、Ｎ^α−アセチル−リシンの遊離アミノ基とシッフ塩基付加体を生成す る。 最初、生成物の単離と同定を容易にするため、タンパク質上の遊離アミノ 基に対するモデル化合物であるＮ^α−アセチル−リシンとｐＨＡとの反応につい て研究した。反応は、リン酸塩緩衝生理食塩溶液中pH７．４、37℃で行なった。 ＮａＣＮＢＨ₃による還元後、完全反応混合物の逆相ＨＰＬＣ分析は、単一の 主要な酸安定生成物（図１；保持時間１４．０分）を示した。この化合物の生成 は、ｐＨＡとＮ^α−アセチル−リシン両方の存在を必要とした（図１）。このも のはＨＰＬＣ分析に用いた酸性条件下で還元なしでは検出できなかった。 ＮＭＲおよびＧＣ−ＭＳによる安定な還元生成物の特徴づけ（下記参照）はそ れがＮ^α−アセチル−Ｎ^ε−ｐＨＡ−リシンであることを実証した（スキーム Ｉ）。酸存在下でこの化合物を検出できないことは、アルデヒドとＮ^α−アセチ ル−リシンの遊離アミノ基との最初の反応がシッフ塩基の生成を起こしたことを 示唆した。次に、シッフ塩基を還元すると酸に安定なアルデヒド−リシン付加体 が生成するであろう（スキームＩ）。 化合物の構造を決定するために、反応混合物をＮａＣＮＢＨ₃で還元し、ＨＰ ＬＣ精製物質を誘導体化し、ＧＣ−ＭＳ分析にかけた。全イオンクロマトグラム に物質の単一の主要ピークが現われた（図２Ａ）。化合物のｎ−プロピルエステ ル、per−ＰＦＰ誘導体の負イオン化学イオン化質量スペクトル（図２Ｂ）は、 ｐＨＡ−リシンの提出した構造と一致した（図２Ａ、挿入図）。 この化合物は、選ばれたイオンモニターイングで、化合物の質量スペクトルに 見られる主要イオンと一緒に溶出するｍ／ｚ７４６（分子イオン（Ｍ^・-）の予期 したｍ／ｚ）の低存在量イオンを実証した。化合物のｎ−プロピルエステル、pe r−ＨＦＢ誘導体のＧＣ−ＭＳ分析も、提出した構造と一致する質量スペクトル を示した；イオンはｍ／ｚ８９６（Ｍ^・-）、８７６（Ｍ^・-−ＨＦ）、８５６（Ｍ^・- −２ＨＦ）、８３２（Ｍ^・-−ＨＦ−ＣＯ₂）、６９８（Ｍ^・-−ＣＦ₃ＣＦ₂ＣＦ₂ ＣＨＯ）および５７９（Ｍ^・-−ＣＦ₃ＣＦ₂ＣＯＯ−Ｃ₆Ｈ₄−ＣＨ₂ＣＨ₂）に観察 された。 ＮＭＲ分光法を実施し、疑う余地なく化合物の構造を確立した（図３）。¹Ｈ ＮＭＲスペクトルの化学シフトおよび積分されたピーク面積は、両方ともｐＨ Ａ−リシンの構造と一致した（図３、挿入図）。プロトンの帰属を確かめるため 、ＴＯＣＳＹを用いて共鳴間のスカラーカップリングを確認した（図４）。ＴＯ ＣＳＹ実験で観察された２，３−結合 Ｈ−Ｈカップリングの連続順序は、化合 物の構造がＮ^α−アセチル−Ｎ^ε−ｐＨＡ−リシンであることを確定した。要約 すると、これらの研究は、ｐＨＡがＮ^α−アセチル−リシンの遊離アミノ基とシ ッフ塩基を形成すること、および安定な還元生成物の構造がＮ^α−アセチル−Ｎ^ε −ｐＨＡ−リシンであることを示している。ミエロペルオキシダーゼ−Ｈ₂Ｏ₂−Ｃｌ^-系により発生したｐＨＡがＢＳＡのリ シン残基を共有結合で修飾する。 Ｌ−［¹⁴Ｃ］チロシンを用いた予備実験は、 ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびその後のオートラジオグラフィーにより評価される通り 、 完全なミエロペルオキシダーゼ−Ｈ₂Ｏ₂−Ｃｌ^-系の存在下で、ウシ血清アルブ ミン（ＢＳＡ）がＬ−チロシン誘導生成物により共有結合で修飾されることを実 証した。 ｐＨＡとリシンのε−アミノ基との間のシッフ塩基付加体が、一部は、この反 応の原因となるかどうかを決定するため、生理学的濃度（４８）の¹⁴Ｃ標識され たＬ−チロシン(１００μＭ)と塩化物（１００mM）を追加したミエロペルオキシ ダーゼ−Ｈ₂Ｏ₂系にＢＳＡを暴露した。 インキュベーション後、タンパク質をＮａＣＮＢＨ₃で還元し、［¹⁴Ｃ］ｐＨ Ａ−リシン含量を、「方法」のところで述べたように逆相ＨＰＬＣおよびシンチ レーションカウンティングにより測定した。完全ミエロペルオキシダーゼ−Ｈ₂ Ｏ₂−Ｃｌ^-系の存在下で、ＢＳＡのリシン残基はｐＨＡ−リシンへ変換された（ 表Ｉ）。付加体の合成は、ミエロペルオキシダーゼ、Ｈ₂Ｏ₂、Ｌ−チロシンおよ びＣｌ^-の存在を要求しており、Ｈ₂Ｏ₂スカベンジャーカタラーゼにより妨害さ れた（表Ｉ）。アジ化物またはシアン化物、二種のヘムタンパク質阻害剤、いず れかを添加するとｐＨＡ−リシン合成の阻害が起こり、この反応がペルオキシダ ーゼに依存していることと一致する。 この酵素反応のＣ¹依存性は、ＨＯＣｌ（あるいは、恐らくは酵素と結合した 次亜塩素酸塩；文献４９，５０）がｐＨＡ生成における中間体であることを示唆 している（２７）。この提案と一致して、ＢＳＡに対するＨＯＣｌおよびＬ−ト リプシンの添加はＮ^ε−リシン残基の共有結合による修飾を起こした（表Ｉ）。 更にまた、基質として塩化物を利用しないラクトペルオキシダーゼおよびセイヨ ウワサビペルオキシダーゼは、両方ともｐＨＡ（２７）またはリシン付加体を発 生させなかった（表Ｉ）。ｐＨＡによるＢＳＡの共有結合修飾は、遊離金属イオ ンに無関係であった。それはすべての反応が、金属で触媒される反応の強力な阻 害剤であるＤＴＰＡの存在下で行なわれたからである。ｐＨＡとＢＳＡとの間で生じた主要な共有結合付加体はｐＨＡ−リシンである。 他の潜在的タンパク質付加体と比較して、ｐＨＡ−リシンの定量的重要性を決定 するために、ＨＰＬＣ精製した¹⁴Ｃ−標識ｐＨＡとＢＳＡをインキュベートした 。次に修飾タンパク質をＮａＣＮＢＨ₃、とインキュベートし、ＨＢｒで加水分 解し、 アミノ酸加水分解物を逆相ＨＰＬＣおよびシンチレーション分光測定により分析 した。アミノ酸加水分解物中に回収された放射能の80％以上が真正ｐＨＡ−リシ ンと共にクロマトグラフィー挙動を示した（図５）。放射能標識された化合物が ｐＨＡ−リシンと同一であることはＧＣ−ＭＳ分析により確証が与えられた。 アミノ酸分析によれば、リシンがｐＨＡによる共有結合修飾に対する主な標的 であることが確証された。ＮａＣＮＢＨ₃存在下にＢＳＡを精製ｐＨＡとインキ ュベーションにすると、タンパク質中の全Ｌ−リシン残基のうちの３４％が消費 された。また少量ではあるが、一貫したＬ−アルギニンの減損（〜６％）も観察 され、これは図５に見られる終り頃の溶出生成物を説明できる。また、少量では あるが一貫したＬ−アスパラギン酸の減損（〜３％）があり、このことは反応が ＢＳＡのＮ−末端アスパラギン酸の遊離アミノ基を含むことを示唆する。 シッフ塩基は、それらの母体アルデヒドおよびアミノ部分との平衡状態にある 。ＮａＣＮＢＨ₃の存在下で、ｐＨＡ−リシン生成は存在するシッフ塩基の還元 により促進される。還元剤欠如下で修飾されるタンパク質リシン残基の数を見積 るため、ＢＳＡをｐＨＡとインキュベーションし、次にこのシッフ塩基付加体を 、高濃度の酢酸アンモニウム（未反応ｐＨＡを除去するため）の存在下でＮａＣ ＮＢＨ₃還元により安定化した。アミノ酸加水分解は、これら条件下でｐＨＡに よる共有結合修飾に対する主要標的がリシンであることを証明した（表II）。Ｌ −リシン残基の減損は、アミノ酸分析に際してＬ−グリシンと共に溶出する新し い生成物の出現と、これがｐＨＡ−リシンを代表すると考えられることにより説 明された。ｐＨＡ、両親媒性Ｌ−チロシン酸化生成物、は完全な細胞の肝要な膜および細胞 質のタンパク質を共有結合で修飾する。 以前の研究によれば、活性化好中球に より生じたｐＨＡの〜９０％が、アルデヒドの両親媒性のため、膜部分に配分さ れることが示された（２７）。それ故に、ミエロペルオキシダーゼで発生したｐ ＨＡが、完全細胞の膜関連タンパク質と細胞質タンパク質を共有結合によって修 飾しうるかどうかを本発明により決定したのである。赤血球をミエロペルオキシ ダーゼ、Ｈ₂Ｏ₂および生理学的濃度のＬ−チロシンおよびＣｌ^-と共にインキュ ベートし、ｐＨＡ−リシン生成の程度を測定した。 ｐＨＡとＮ^α−リシン残基との間のシッフ塩基付加体の相当な量が、膜タンパ ク質および細胞質タンパク質両方に生成することがＧＣ−ＭＳにより検出された （図６Ａ）。選ばれたイオンをモニターするＧＣ−ＭＳ分析は、ｐＨＡ−リシン に対して予期された主要イオンが、合成的につくられた［¹³Ｃ₆］ｐＨＡ−リシ ンのそれと共に溶出することを実証した（図６Ｂ）。 ｐＨＡ−リシンの生成は、ミエロペルオキシダーゼ、Ｈ₂Ｏ₂、Ｌ−チロシン、 および赤血球を必要とする。これらの結果は、ｐＨＡが血漿膜を通って容易に拡 散して細胞内タンパク質と反応することを示す。膜関連タンパク質中にｐＨＡ− リシンが相対的に豊富に存在するのは、遊離ｐＨＡが最初にミエロペルオキシダ ーゼにより発生する細胞内環境と細胞外空間との境界面におけるｐＨＡの高い局 所濃度あるいはその所在のいずれかによるのかも知れない。ヒト好中球により発生するｐＨＡが、モデルタンパク質上でｐＨＡ−リシン付加 体を生成する。 ＢＳＡおよび血漿濃度のＬ−チロシンを追加した平衡塩類溶液 中でインキュベートしたホルボールエステル活性化ヒト好中球がｐＨＡ−リシン を発生させることは、安定同位体希釈ＧＣ−ＭＳにより測定された通りである( 図７および表III)。選ばれたイオンをモニターするＧＣ−ＭＳは、ｐＨＡ−リシ ンの存在に確証を与え、合成的につくられた［¹³Ｃ₆］ｐＨＡ−リシンに見られ るｍ／ｚおよび予期した保持時間をもつイオンを明らかにした。更にまた、好中 球生成物の負イオン化学イオン化質量スペクトルは、真正ｐＨＡ−リシンのそれ と同一であった（図７および図２Ｂ参照）。 好中球により発生したｐＨＡによるＢＳＡ中のリシン残基の共有結合修飾は、 細胞、Ｌ−チロシン、および活性化させる剌激を必要とする(表III)。反応混合 物へ超酸化物ジスムターゼ（中性pHにおいて、超酸化物陰イオンからＨ₂Ｏ₂への 変換を５００倍促進する（５１））を添加すると付加体の収量を２倍増加させた (表III)。ｐＨＡ合成を高める（２７）カルシウムイオノホア、イオノマイシン の添加もまた更にｐＨＡ−リシン生成を起こし、これはＨ₂Ｏ₂合成の増進および （または）ミエロペルオキシダーゼ脱顆粒と一致する。 活性化ヒト好中球による共有結合付加体の生成は、カタラーゼによる阻害に敏 感であり、このことはＨ₂Ｏ₂がｐＨＡ−リシン合成に必要であることを示す。 ヘム毒であるアジ化物およびシアン化物は、ｐＨＡ−リシン生成を阻害するが、 このことは細胞によるアルデヒド発生におけるミエロペルオキシダーゼの役割と 一致する（２７）。総括すると、本発明によるこれらの結果は、活性化されたヒ ト好中球がミエロペルオキシダーゼ−Ｈ₂Ｏ₂−Ｃｌ^-系を用いることによりｐＨ Ａを発生させ、次にこのｐＨＡがタンパク質の遊離アミノ基と反応してｐＨＡ− リシンを生ずることを示している。活性化好中球は内因性タンパク質上でｐＨＡ−リシン付加体を形成する。 生理 学的濃度のＬ−チロシンを含む媒質中で、ホルボールエステルによるヒト好中球 の活性化は好中球タンパク質の共有結合による修飾を起こした（図８）。ＢＳＡ の場合と同様に、細胞媒介反応は、超酸化物ジスムターゼにより刺激され、ペル オキシダーゼ阻害剤（ＮａＮ₃およびＮａＣＮ）またはＨ₂Ｏ₂スカベンジャー（ カタラーゼ）のいずれかにより抑制される（図８）。ｐＨＡ−リシンはヒトの炎症組織中に存在する。 生体内でのタンパク質修飾に おけるｐＨＡの役割を調べるため、種々な急性炎症組織をリシン付加体の存在に ついて検査した。過剰の酢酸アンモニウム（遊離アルデヒドを排除するため）、 ＮａＮ₃（ミエロペルオキシダーゼ阻害剤）およびカタラーゼ（Ｈ₂Ｏ₂スカベン ジャー）の存在下で標品をＮａＣＮＢＨ₃で還元した。その後、試料を脱脂質し 、酸加水分解にかけ、ＧＣ−ＭＳにより分析した。ｐＨＡ−リシンは、選ばれた イオンをモニターすることにより、腹腔内膿瘍から単離された液体中に容易に検 出された（図９）。痛風膝および感染毛巣のう胞から集めた標品についても同様 な結果が得られた。 スキームＩ 完全系は、緩衝液Ｂ（２０mMリン酸ナトリウム、pH７．０、１００μＭ ＤＴＰ Ａ）に、ＢＳＡ（１mg／ml）、ミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ；４０nM）、Ｈ₂ Ｏ₂(１００μＭ)、Ｌ−[¹⁴Ｃ]チロシン(１００μＭ)およびＮａＣｌ（１００mM ）を補充したものである。示した場合には、ラクトペルオキシダーゼ（１００μ ｇ／ml）およびセイヨウワサビペルオキシダーゼ（１０μｇ/ml）をミエロペル オキシダーゼの代りに使用し、あるいは試薬ＨＯＣｌ(１００μＭ)をミエ ロペルオキシダーゼおよびＨ₂Ｏ₂の代りに用いた。３７℃で１時間のインキュベ ーション後、反応生成物をＮａＣＮＢＨ₃で還元し、ＢＳＡを沈殿させ、ペレッ トを１０％トリクロロ酢酸で洗浄し（×３）、次いで酸加水分解した。次にアミ ノ酸加水分解物のｐＨＡ−リシン含量を、「方法」のところで述べたように、逆 相ＨＰＬＣおよびシンチレーションカウンティングにより測定した。生成物が何 であるかをＧＣ−ＭＳ分析により確認した。完全系におけるＨ₂Ｏ₂の２．５％^* および試薬ＨＯＣｌの５．５％^**をｐＨＡ−リシンの生成に使用した。 ＢＳＡ（１mg／ml）に媒質Ｂ中でｐＨＡ（１mM）と３７℃で一晩インキュベート した。反応を１０mM ＮａＣＮＢＨ₃および１００mM酢酸アンモニウム（それぞ れ、シッフ塩基を還元するため、および遊離ｐＨＡを除去するため）の添加によ り停止させた。３７℃で２時間のインキュベーション後、修飾されたタンパク質 を、Ｈ₂Ｏで平衡化したＤＧ−１０カラム(Bio−Rad)を用いてサイズ排除クロマ トグラフィーにより単離した。次にタンパク質を真空下で乾燥し、酸加水分解し 、「方法」のところで述べたように、アミノ酸分析にかけた。システイン、メチ オニンおよびトリプトファンは酸に不安定であり、定量しなかった。 ^* グリシンと推定ｐＨＡ−リシン付加体の合算収量を表わす。 ヒト好中球（１×１０⁶個／ml）を、ＤＴＰＡ（１００μＭ）およびＢＳＡ（１m g／ml）で補充したHank's平衡塩類溶液中３７℃で２時間インキュベートした。 好中球をホルボールエステル（ＰＭＡ；２００nM）で活性化し、間欠的反転によ り浮遊状態に保った（完全系）。好中球を遠心により除去し、上澄中のシッフ塩 基を、ＮａＣＮＢＨ₃（１０mM）および酢酸アンモニウム（１００mM）の添加に より還元した。３７℃で２時間のインキュベーション後、上澄中のタンパク質を 氷冷１０％トリクロロ酢酸で沈殿させ、タンパク質ペレットを酸加水分解にかけ た。アミノ酸加水分解物のｐＨＡ−リシン含量を安定同位体希釈ＧＣ−ＭＳによ り定量した。ＳＯＤ、超酸化物ジスムターゼ。 本発明の開示を読めば、本発明の主旨と範囲から離れることなく、種々な他の 例が当業者にとって明白になるであろう。このような他のあらゆる例も請求の範 囲内に含めるものとする。従って、体液または組織試料中のｐＨＡ−リシンの存 在と濃度も、ｐＨＡ−リシンに対する多クローン抗体または単クローン抗体を用 いる免疫検定法において、免疫沈殿手順により測定できる。一部位および二部位 放射線免疫検定法および酵素免疫検定法、例えばEngvall and Perlmann，J.Immu nol. １０９ ，１２９−１３５（１９７２）により記述された酵素結合免疫吸着検 定法（ＥＬＩＳＡ）、の手順を本発明診断法に使用できる。このような手順に使 用する単クローン抗体は、Kohler and Milstein,Nature ２５６，４９５−４９７ （１９７５），およびEur ．J．Immunol．６，５１１−５１９（１９７６）；お よびGoding，Monoclonal Antibodies ：Principles and Practice，Academic Pre ss Inc.，New York，１９８３）に記述された通常のハイブリドーマ方法論によ り調製できる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，Ｓ Ｄ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ， ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，Ｆ Ｉ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ， ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，Ｍ Ｘ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ， ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 1. 活性化食細胞および（または）炎症が関与するアテローム性動脈硬化およ び同様な疾病の診断法およびスクリーニング試験法において、体液または組織試 料中に、ｐ−ヒドロキシフェニルアルデヒド−リシンが正常被験者における濃度 と比べて高濃度で存在することを測定することからなる上記方法。 2. 試料はヒトの炎症組織である、請求項１記載の方法。 3. 試料はヒトの血清または血漿部分である、請求項１記載の方法。 4. ｐ−ヒドロキシフェニルアルデヒド−リシンの存在および濃度を、質量分 析および高分解能ＮＭＲ分光法により測定する、請求項１記載の方法。 5. ｐ−ヒドロキシフェニルアルデヒド−リシンの存在および濃度を、前記ｐ −ヒドロキシアルデヒド−リシンに対する抗体を用いる免疫検定法により測定す る、請求項１記載の方法。