FR2762009A1 - Enzymes recombinantes purifiees a activite prolylpeptidasique, leur procede de preparation et leurs applications - Google Patents
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Abstract
Enzymes recombinantes purifiées à activité prolylpeptidasique, leur procédé de préparation et leurs applications, notamment comme réactif en analyse biochimique et en cartographie peptidique.Lesdites enzymes présentent la séquence d'une cyclophiline modifiée par substitution d'au moins un résidu d'aminoacide du site actif peptidyl-prolyl cis- trans-isomérase, inclus dans une sphère de 10 Â centrée sur le carbonyle de la liaison (CF DESSIN DANS BOPI) d'aminoacide et ont à la fois une activité de prolylendopeptidase ou de prolylendoprotéinase et une activité de prolylexopeptidase aussi bien en position N- terminale, qu'en position C-terminale, vis-à-vis des substrats peptidiques et protéiques.
Description
La présente invention est relative à des enzymes recombinantes punfiées à activité prolylpeptidasique, à leur procédé de préparation et à leurs applications, notamment comme réactif en analyse biochimique et en cartographie peptidique.
La protéolyse représente un moyen performant d'analyse topologique et structurale des protéines. La caractérisation des peptides et protéines passe très souvent par une étape d'hydrolyse enzymatique, préalablement au séquençage ou à la spectrométrie de masse; des exemple peuvent être trouvés dans les ouvrages généraux suivants: Proteolytic enzymes: a practical approach (Beynon R.J. & Bond J.S.
Editors.J IRL Press, Oxford (1989); Protein sequencing: a practical approach (Findlay J.B.C. & Geisow M.J. Editors) IRL Press, Oxford (1989).
Malheureusement, et en dépit du grand nombre de substances déjà isolées, présentant une activité protéolytique, il n'est toujours pas possible de couper facilement et spécifiquement aussi bien les peptides que les protéines, au niveau de n'importe lequel de leurs aminoacides constitutifs. Parmi ceux-ci, il faut citer la proline qui présente un intérêt particulier, en raison de sa faible abondance (env. 5 %) et de sa présence majoritaire dans les structures en boucle ou coude qui joignent les éléments de structures secondaire ou tertiaire [14] et pour laquelle les méthodes chimiques de coupure [15,16] sont peu utilisées, en raison des nombreuses dégradations non spécifiques qu'elles génèrent.
Des hydrolases coupant spécifiquement au niveau des liaisons amides des prolines ont été déjà été décrites (Yaron A et al., Critical Reviens in Biochemistry and Molecular Biology, 1993, 28, 1, 31-81): EC# 3.4.11.5 (proline iminopeptidase), 3.4.11.9 (aminopeptidase P), 3.4.13.8 (prolinase), 3.4.13.9 (prolidase), 3.4.16.2, 3.4.17.16, 3.4.21.26 [prolylendopeptidase, Demande internationale PCT WO 96/00293] et 3.4.21.72 [17]. Les six premières correspondent à des exopeptidases et seules les deux dernières sont relatives à des endoprotéinases, dont l'une restreinte à la coupure dans les régions charnières des IgA (3.4.21.72).
Majoritairement, elles sont d'origine bactérienne et clivent des liaisons de type Pro-Xaa (coupure au niveau du carboxyle de la proline : liaison amide en a de la proline), les coupures Xaa-Pro n'existant que pour l'aminopeptidase P (3.4.11.9) et la carboxypeptidase C (3.4.16.2) qui, elles, ne clivent pas les substrats polypeptidiques de grande taille ou les protéines.
En conséquence, la Demanderesse s'est donné pour but de pourvoir à une enzyme recombinante purifiée à activité prolylpeptidasique, apte à présenter à la fois une activité de prolylendopeptidase ou de prolylendoprotéinase et une activité de prolylexopeptidase aussi bien en position N-terminale, qu'en position C-terminale, tant vis-à-vis des substrats peptidiques que des protéines, qui réponde ainsi mieux aux besoins de la pratique que les prolylpeptidases de l'art antérieur.
La présente invention a pour objet une enzyme recombinante purifiée à activité prolylpeptidasique, caractérisée en ce qu'elle présente la séquence d'une cyclophiline modifiée par substitution d'au moins un résidu d'aminoacide du site actif peptidyl-prolyl cis-trans-isomérase, inclus dans une sphère de 10 Â centrée sur le carbonyle de la liaison amide
et non-impliqué dans l'activité isomérase, par un autre résidu d'aminoacide et en ce qu'elle présente à la fois une activité de prolylendopeptidase ou de prolylendoprotéinase et une activité de prolylexopeptidase aussi bien en position N-terminale, qu'en position C-terminale, vis-à-vis des substrats peptidiques et protéiques.
et non-impliqué dans l'activité isomérase, par un autre résidu d'aminoacide et en ce qu'elle présente à la fois une activité de prolylendopeptidase ou de prolylendoprotéinase et une activité de prolylexopeptidase aussi bien en position N-terminale, qu'en position C-terminale, vis-à-vis des substrats peptidiques et protéiques.
Selon un mode de réalisation de ladite cyclophiline recombinante purifiée à activité prolylpeptidasique, elle présente une activité spécifique supérieure à 102 U/mg de furyl-acryloyl-alanyl-proline (fa-AP) et un Km compris entre 0,1 et 10 mM, une température optimale d'activité de 35-40"C et un pH optimal d'activité compris entre 6 et 8 ; elle présente, de préférence, un poids moléculaire de 18 kDa (cyclophiline cytosolique).
De telles cyclophilines modifiées sont aptes à hydrolyser les liaisons amides de la proline, de type:
dans laquelle
X représente un atome d'hydrogène : activité d'aminopeptidase, ou un résidu d'aminoacide: activité d'endoprotéinase ou d'endopeptidase
Z représente: un résidu d'aminoacide: activité d'endoprotéinase ou d'endopeptidase ou un groupe hydroxyle : action de carboxypeptidase et
R représente un élément constitutif d'un aminoacide quelconque.
dans laquelle
X représente un atome d'hydrogène : activité d'aminopeptidase, ou un résidu d'aminoacide: activité d'endoprotéinase ou d'endopeptidase
Z représente: un résidu d'aminoacide: activité d'endoprotéinase ou d'endopeptidase ou un groupe hydroxyle : action de carboxypeptidase et
R représente un élément constitutif d'un aminoacide quelconque.
On entend par résidu d'aminoacide, au sens de la présente invention, n'importe quel résidu d'aminoacide, et notamment : Ala, Cys, Asp, Glu, Phe, Gly, His,
Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr et leurs dérivés naturels ou chimiques, tels que hydroxyproline, hydroxylysine, carboxyméthylcystéine, etc.
Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr et leurs dérivés naturels ou chimiques, tels que hydroxyproline, hydroxylysine, carboxyméthylcystéine, etc.
De nombreuses cyclophilines ont été décrites [1]: on peut citer des cyclophilines de faible poids moléculaire (env. 16 kDa) isolées chez Bacillus subtilis et
Synechoccus sp., des cyclophilines cytosoliques de poids moléculaire compris entre 17 et 18 kDa, (cyclophiline A) isolées chez la plupart des autres organismes vivants (animaux et végétaux) et des cyclophilines de poids moléculaire plus élevé (19-160 kDa), isolées à partir de fractions membranaires (cyclophiline B ou CyP-B: cyclophiline du réticulum endoplasmique; cyclophiline C ou CyP-C: cyclophiline mito chondriale ; cyclophiline D ou CyP-D, par exemple).
Synechoccus sp., des cyclophilines cytosoliques de poids moléculaire compris entre 17 et 18 kDa, (cyclophiline A) isolées chez la plupart des autres organismes vivants (animaux et végétaux) et des cyclophilines de poids moléculaire plus élevé (19-160 kDa), isolées à partir de fractions membranaires (cyclophiline B ou CyP-B: cyclophiline du réticulum endoplasmique; cyclophiline C ou CyP-C: cyclophiline mito chondriale ; cyclophiline D ou CyP-D, par exemple).
Les cyclophilines présentent essentiellement trois fonctions une fonction enzymatique peptidyl-prolyl cis-trans-isomérase (E.C. 5.2. 1.8) [1] associée au repliement des protéines [2], une fonction de récepteur cellulaire de la cyclosporine A [2] et une fonction d'inhibition de la calcineurine [13].
Selon leur origine et leur localisation, elles présentent une ou plusieurs des fonctions précitées.
Aussi bien la structure que les fonctions précitées de ces différentes cyclophilines ont été étudiées ces dernières années; on peut citer notamment les études portant sur la cyclophiline C [3], la cyclophiline périplasmique d'Escherichia coli (ECypP) dont la séquence du gène fut d'abord décrite sous le nom d'ORF190 [4] puis, deux années plus tard, sous le nom de Cyp a et la cyclophiline cytoplasmique d'Escherichia coli ou Cyp b (ECypC) [5].
Des vecteurs permettant l'expression de cyclophilines recombinantes en grande quantité [6,7], ouvrant la voie à un important travail structural sur ces enzymes, ont également été décrits.
A ce jour, plus de 25 fichiers de coordonnées atomiques de cyclophilines, seules ou en complexe avec des peptides ou la cyclosporine, sont déposés à la
Brookhaven Protein Data Bank. La structure de la protéine ECypP fût résolue par résonance magnétique nucléaire en 1994 [8]. Le mécanisme catalytique de l'enzyme est principalement déduit de l'analyse de la structure cristalline de la cyclophiline A humaine (hCypA) [9,10].
Brookhaven Protein Data Bank. La structure de la protéine ECypP fût résolue par résonance magnétique nucléaire en 1994 [8]. Le mécanisme catalytique de l'enzyme est principalement déduit de l'analyse de la structure cristalline de la cyclophiline A humaine (hCypA) [9,10].
Récemment a été décrite la recherche, parmi les structures déposées à la Brookhaven Protein Data Bank, des protéines contenant une triade catalytique de type Ser-His-Asp [11], il a notamment été trouvé que la protéine hCypA s'avère contenir ces trois résidus, en positions S99, H92 et D123, avec une géométrie rappelant celle formée au sein des protéases à sérine. Toutefois, aucune activité protéolytique n'a été décrite à ce jour pour cette protéine et l'examen de sa structure atomique montre que ces résidus ne sont pas situés dans le site actif de l'enzyme. De plus, ils ne sont pas conservés dans des séquences homologues comme ECypP ou ECypC (cf.
Figure 1).
De nombreux mutants au niveau du site actif de la cyclophiline ont pu être préparés et étudiés pour l'altération de leurs propriétés enzymatiques et/ou de liaison de la cyclosporine.
Ainsi, il a pu être démontré par mutagenèse en alanine des cystéines 52, 62, 115 et 161 de hCypA que celles-ci ne participent ni à l'activité isomérase, ni à la liaison de la cyclosporine A [6].
Le rôle de W121 de la protéine humaine dans la liaison de la drogue a été clarifié par comparaison des propriétés des mutants W121F et W121A de hCypA et F112W de ECypP [12]. Ces études ont été complétées par l'examen de l'effet des mutations de hCypA suivantes: H54Q, QlllA, F113A, H126Q, F60A, R55A sur l'interaction avec la calcineurine ou la cyclosporine A et sur l'activité peptidylprolylisomérase [13].
Toutefois aucun des mutants décrits dans l'art antérieur ne modifient radicalement les propriétés de la peptidyl-prolyl cis-trans-isomérase étudiée; en parti culier, aucune de ces nombreuses études, n'a abouti à l'obtention d'une peptidyl-prolyl cis-trans-isomérase modifiée, présentant les propriétés de prolylpeptidase, telles que précisées ci-dessus.
Selon un mode de réalisation avantageux de l'invention, lesdites cyclophilines sont de préférence des cyclophilines cytosoliques, d'origine bactérienne ou d'origine animale, et dans ce dernier cas, de préférence issues de mammifères, et notamment des cyclophilines cyto soliques humaines.
Selon une disposition avantageuse de ce mode de réalisation, ladite cyclophiline est de préférence d'origine bactérienne et issue d'E. coli, par exemple (ECypC) ou d'origine humaine (hCypA).
Selon un autre mode de réalisation avantageux de l'invention, ladite enzyme recombinante purifiée à activité prolylpeptidasique est constituée par une cyclophiline modifiée au niveau d'un seul résidu d'aminoacide, situé dans la partie du site actif peptidyl-prolyl cis-trans-isomérase non-impliqué dans l'activité isomérase, qui est remplacé par un aminoacide nucléophile, tel que la sérine ou la cystéine.
Selon un autre mode de réalisation avantageux de l'invention, ladite enzyme recombinante purifiée à activité prolylpeptidasique est constituée par une cyclophiline modifiée au niveau de trois résidus d'aminoacides situés dans la partie du site actif peptidyl-prolyl cis-trans-isomérase non-impliqué dans l'activité isomérase, qui sont remplacés par une triade catalytique de type aminoacide basique, aminoacide acide et aminoacide nucléophile, telle que la triade sérine-histidine-acide aspartique.
Selon une disposition avantageuse de ce mode de réalisation, ladite enzyme recombinante purifiée à activité propylpeptidasique est constituée par une cyclophiline périplasmique issue d'E. colt, modifiée au niveau d'au moins l'un des résidus en position 91, en position 104, en position 106 ou en position 122.
Conformément à cette disposition avantageuse, ladite cyclophiline périplasmique d'Escherichia coli modifiée comprend la substitution au niveau du résidu en position 91 d'une alanine (Ala ou A) par une sérine (Ser ou S), la substitution au niveau du résidu en position 104, d'une phénylalanine (Phe ou F) par une histidine (His ou H), la substitution au niveau du résidu en position 106, d'une asparagine (Asn ou D) par un acide aspartique (Asp ou D); on obtient alors une cyclophiline mutée, dénommée cypIII (A91S-F104H-N106D) (SEQ ID N04).
Conformément à l'invention, ladite cyclophiline modifiée comprend en outre, en position 122, la substitution d'une tyrosine (Tyr ou Y) par une histidine (His ou H); on obtient alors une cyclophiline modifiée, dénommée cypIV (A91S
F104H-N106D-Y122H) (SEQ ID N"6).
F104H-N106D-Y122H) (SEQ ID N"6).
De manière surprenante, ces cyclophilines modifiées présentent une propriété nouvelle de prolypeptidase de type X-Pro, qui n'existe pas pour les endoprotéinases naturelles.
Bien qu'un très grand nombre d'hydrolases de spécificité variable partagent un motif catalytique commun, dénommé triade catalytique , constitué de trois résidus d'acides aminés (Serine, Histidine et Aspartate) qui adoptent une géométrie spatiale précise et que la structure tertiaire qui les porte puisse varier largement [18], il n'était pas évident que des cyclophilines ayant une activité peptidyl-prolyl cistrans-isomérase puissent être modifiées de telles sorte que cette triade se substitue à certains de ses aminoacides et que dans ce contexte, elles puissent effectivement acquérir une fonction de prolylpeptidase à fonction polyvalente. Cette triade confère aux dites cyclophilines modifiées, une réactivité chimique élevée, mobilisant le groupe hydroxyle de la sérine dont le caractère nucléophile est exacerbé par l'environnement hydrophobe du site actif et la présence des deux résidus His et Asp en relais.
La présente invention a également pour objet les séquences nucléiques codant pour une enzyme recombinante purifiée à activité prolylpeptidasique, telle que définie ci-dessus.
De manière avantageuse, ladite séquence nucléique est susceptible d'être obtenue par une méthode comprenant:
(a) la mutagenèse dirigée d'une séquence d'ADN codant pour une cyclophiline naturelle issue d'un procaryote ou d'un eucaryote,
(b) la production d'une banque de séquences d'ADN mutées obtenues en (a) et
(c) le criblage de ladite banque et la sélection des séquences codant pour une cyclophiline modifiée présentant à la fois une activité de prolylendopeptidase et de prolylexopeptidase.
(a) la mutagenèse dirigée d'une séquence d'ADN codant pour une cyclophiline naturelle issue d'un procaryote ou d'un eucaryote,
(b) la production d'une banque de séquences d'ADN mutées obtenues en (a) et
(c) le criblage de ladite banque et la sélection des séquences codant pour une cyclophiline modifiée présentant à la fois une activité de prolylendopeptidase et de prolylexopeptidase.
Conformément à cette méthode, la séquence selon l'étape (a) est une séquence d'ADN codant pour une cyclophiline naturelle, de préférence la séquence codant pour la cyclophiline périplasmique d'E. coli (SEQ ID N"1).
Également conformément à cette méthode, l'étape (a) de mutagenèse dirigée est mise en oeuvre en présence des nucléotides de séquences SEQ ID NO 7-12.
On obtient notamment les séquences nucléiques SEQ ID NO 3 et SEQ ID N"5.
La présente invention a également pour objet un vecteur d'expression, caractérisé en ce qu'il comprend une séquence d'acide nucléique codant pour une enzyme recombinante purifiée à activité prolylpeptidasique constituée par une cyclophiline modifiée selon l'invention.
Selon un mode de réalisation avantageux dudit vecteur, il inclut un système d'expression comprenant en particulier une origine de réplication dans un microorganisme hôte approprié, notamment une bactérie ou une cellule eucaryote, éventuellement un gène dont l'expression permet la sélection soit des bactéries, soit des cellules eucaryotes, transformées par ledit vecteur, une séquence régulatrice appropriée, notamment un promoteur convenable, un site de fixation aux ribosomes, optionnellement une séquence signal et une séquence nucléique telle que définie ci-dessus, lequel système est inséré dans une structure génétique appropriée, notamment choisie dans le groupe qui comprend des plasmides, des phages, des cosmides ou des chromosomes appropnes.
Conformément à l'invention, ladite structure génétique est de préférence un plasmide.
Lorsque la séquence nucléique comporte une séquence signal, elle est adaptée à la cellule hôte et est notamment choisie dans le groupe constitué par la séquence signal CypP [7] ou la séquence signal Omp A (Swiss-Prot P02934, aminoacides 1-21).
Lorsque la cellule hôte est une bactérie, telle qu'E. coli, la protéine est exprimée dans le cytoplasme, en l'absence de séquence signal ou est exportée dans le périplasme, en présence d'une des séquences signal précitées.
La présente invention a également pour objet une cellule hôte, transformée par un plasmide selon l'invention, notamment une bactérie telle qu'E. coli.
La présente invention a également pour objet un procédé de préparation desdites enzymes recombinantes dans une cellule hôte, caractérisé en ce qu'il comprend:
(a) la transformation d'une cellule hôte appropriée par un vecteur d'expression, tel que défini ci-dessus,
(b) I'expression d'une enzyme recombinante purifiée à activité prolylpeptidasique constituée par une cyclophiline modifiée selon l'invention et
(c) la purification de l'enzyme recombinante obtenue.
(a) la transformation d'une cellule hôte appropriée par un vecteur d'expression, tel que défini ci-dessus,
(b) I'expression d'une enzyme recombinante purifiée à activité prolylpeptidasique constituée par une cyclophiline modifiée selon l'invention et
(c) la purification de l'enzyme recombinante obtenue.
La présente invention a également pour objet un réactif biologique, caractérisé en ce qu'il est constitué d'une prolylpeptidase selon l'invention.
La présente invention a également pour objet une méthode de caractérisation d'une protéine, caractérisée en ce qu'elle comprend la dégradation de la protéine à analyser à l'aide d'une prolylpeptidase selon l'invention, seule ou en combinaison avec d'autres réactifs de coupure des protéines et l'analyse des produits de dégradation par des techniques d'analyse telles que l'électrophorèse ou la chromatographie.
La présente invention a, en outre, pour objet l'application d'une cellule hôte transformée, telle que définie ci-dessus, à la bioconversion de produits agro-alimentaires.
Certains peptides utiles dans le domaine agro-alimentaire sont amers et leurs propriétés organoleptiques peuvent avantageusement être modifiées par action d'une prolylpeptidase selon l'invention.
Outre les dispositions qui précèdent, I'invention comprend encore d'autres dispositions, qui ressortiront de la description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de mise en oeuvre du procédé objet de la présente invention ainsi qu'aux dessins annexés, dans lesquels
- la figure 1 représente l'alignement structural des séquences de cyclophilines de structures tridimensionnelles connues;
- la figure 2 illustre la localisation des mutations dans le gène de structure de la cyclophiline pénplasmique d'Escherichia coli. A cette figure la séquence nucléotidique dans la région de la phase codante pour la cyclophiline est décrite ainsi que sa traduction (en majuscules). Il désigne le site de coupure post traductionnel déduit du séquençage N-terminal de la protéine mature. Les modifications introduites par la mutagenèse sont indiquées en gras ainsi que les acides aminés correspondants,
- la figure 3 illustre la détermination de l'efficacité catalytique de
CypIII pour fa-AP. Cette figure montre la conversion de fa-AP en fa-A+P suivie par spectrophotométrie de différence sur une solution 1 mM fa-AP avec ou sans enzyme.
- la figure 1 représente l'alignement structural des séquences de cyclophilines de structures tridimensionnelles connues;
- la figure 2 illustre la localisation des mutations dans le gène de structure de la cyclophiline pénplasmique d'Escherichia coli. A cette figure la séquence nucléotidique dans la région de la phase codante pour la cyclophiline est décrite ainsi que sa traduction (en majuscules). Il désigne le site de coupure post traductionnel déduit du séquençage N-terminal de la protéine mature. Les modifications introduites par la mutagenèse sont indiquées en gras ainsi que les acides aminés correspondants,
- la figure 3 illustre la détermination de l'efficacité catalytique de
CypIII pour fa-AP. Cette figure montre la conversion de fa-AP en fa-A+P suivie par spectrophotométrie de différence sur une solution 1 mM fa-AP avec ou sans enzyme.
Les spectres obtenus à 0, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 45, 60, 75, 90 et 120 minutes de réaction sont présentés. La concentration initiale en fa-AP (So) est déterminée à 300 nm (e=13500 Mt.cm-t). La concentration en enzyme (Et) est 13,6 ng/ml, soit 76.10-1l M.
La pente de InS=f(t) est de 0,49.106 s
- la figure 4 illustre l'efficacité catalytique de CyplII sur la neurotoxine a du venin de serpent Naja nigricollis.
- la figure 4 illustre l'efficacité catalytique de CyplII sur la neurotoxine a du venin de serpent Naja nigricollis.
Il doit être bien entendu, toutefois, que ces exemples sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'invention, dont ils ne constituent en aucune manière une limitation.
Exemple 1 : Préparation de séquences nucléiques codant pour des cyclophilines modifiées et expression des protéines modifiées.
La figure 1 présente l'alignement structural de trois séquences homologues : cyclophiline périplasmique (ECypP) et cytoplasmique (ECypC) d'E. coli et cyclophiline A humaine (hCypA). Les résidus du site actif de la hCypA et de l'ECypC sont définis comme étant ceux inclus dans une sphère de 10 Â centrée sur le carbonyle de la liaison amide X-Pro. Les aminoacides alignés avec ceux-ci dans ECypP sont considérés comme faisant partie du site actif.
Les éléments de structure secondaire conservés sont encadrés et les résidus homologues ombrés. En gras, sont indiqués les aminoacides situés dans le site actif et en négatif, les acides aminés soumis aux mutations.
- Production de séquences codant pour une cyclophiline d'E. coli périplasmique modifiée
Le plasmide pJLEC-2B [7] contenant le gène de structure codant pour ECypP a été utilisé pour une expérience de mutagenèse par cycles thermiques (18 cycles : 940C, 30 secondes ; 45"C, 1 minute; 68"C, 10 minutes) en présence de Pfu
DNA polymérase (méthode QuickChange#, Stratagene. USA). Les oligonucléotides utilisés sont les suivants
A) SEQ ID N 7: 5'P-AGC GGT ACG TGA CAT TGC GAT GGT GCC-3'0H
B) SEQ ID N 8: 5'P-GGC ACC ATC GCA ATG TCA CGT ACC GCT-3'0H
C) SEQ ID N09: 5'P-GTT ATC GGC AAC GTC GAT GTG GAA CTG GCT GGT 3'OH
D) SEQ ID N 10: 5'P-ACC AGC CAG TTC CAC ATC GAC GTT GCC GAT AAC 3'OH
E) SEQ ID N 11: 5'P-ACC AAA TAC CGC GTG ACC GAA ATC ACG CTG-3'0H et
F) SEQ ID N"12 : 5'P-CAG CGT GAT TTC GGT CAC GCG GTA TTT GGT-3'0H.
Le plasmide pJLEC-2B [7] contenant le gène de structure codant pour ECypP a été utilisé pour une expérience de mutagenèse par cycles thermiques (18 cycles : 940C, 30 secondes ; 45"C, 1 minute; 68"C, 10 minutes) en présence de Pfu
DNA polymérase (méthode QuickChange#, Stratagene. USA). Les oligonucléotides utilisés sont les suivants
A) SEQ ID N 7: 5'P-AGC GGT ACG TGA CAT TGC GAT GGT GCC-3'0H
B) SEQ ID N 8: 5'P-GGC ACC ATC GCA ATG TCA CGT ACC GCT-3'0H
C) SEQ ID N09: 5'P-GTT ATC GGC AAC GTC GAT GTG GAA CTG GCT GGT 3'OH
D) SEQ ID N 10: 5'P-ACC AGC CAG TTC CAC ATC GAC GTT GCC GAT AAC 3'OH
E) SEQ ID N 11: 5'P-ACC AAA TAC CGC GTG ACC GAA ATC ACG CTG-3'0H et
F) SEQ ID N"12 : 5'P-CAG CGT GAT TTC GGT CAC GCG GTA TTT GGT-3'0H.
Après mutagenèse in vitro et transformation par choc thermique (30 minutes à 4 C, 45 secondes à 42 C et 30 minutes à 37"C) (Sambrook et al., Molecular
Cloning, a laboratory manuel, 2nd Ed., CSH, 1989, pages 1.82-1.84) dans E. coli
XL1-Blue, plusieurs clones résistants à l'ampicilline ont été isolés et les 573 pb du gène séquencées. Deux clones, cIII et cIV, contenant respectivement les plasmides pECE (contenant la séquence ID N"3) et pECIV (contenant la séquence ID N05) ont été retenus sur la base de l'hydrolyse du fa-AP dans le milieu de culture et de la présence des mutations définies plus haut dans leur séquence. Les changements introduits dans leurs séquences protéiques par les mutations nucléotidiques sont décrites dans la figure 2. Elles se résument de la façon suivante:
cypIII: A9lS-F104H-N106D (SEQ ID N"4)
cypIV: A9lS-F104H-N106D-Y122H (SEQ ID N"6)
- Construction des vecteurs exprimant Cyplil et CypIV
Le vecteur de production de CypIII et de CypIV dérive directement de pJLEC-2B [Liu et al., 1990] en raison de la stratégie de mutagenèse utilisée qui ne requiert pas de changement de vecteur. Notamment, I'absence de séquence signal à l'extrémité N-terminale de ECypP se traduit par une accumulation cytoplasmique de la protéine recombinante. Le protocole de purification est décrit pour une culture d'un litre.
Cloning, a laboratory manuel, 2nd Ed., CSH, 1989, pages 1.82-1.84) dans E. coli
XL1-Blue, plusieurs clones résistants à l'ampicilline ont été isolés et les 573 pb du gène séquencées. Deux clones, cIII et cIV, contenant respectivement les plasmides pECE (contenant la séquence ID N"3) et pECIV (contenant la séquence ID N05) ont été retenus sur la base de l'hydrolyse du fa-AP dans le milieu de culture et de la présence des mutations définies plus haut dans leur séquence. Les changements introduits dans leurs séquences protéiques par les mutations nucléotidiques sont décrites dans la figure 2. Elles se résument de la façon suivante:
cypIII: A9lS-F104H-N106D (SEQ ID N"4)
cypIV: A9lS-F104H-N106D-Y122H (SEQ ID N"6)
- Construction des vecteurs exprimant Cyplil et CypIV
Le vecteur de production de CypIII et de CypIV dérive directement de pJLEC-2B [Liu et al., 1990] en raison de la stratégie de mutagenèse utilisée qui ne requiert pas de changement de vecteur. Notamment, I'absence de séquence signal à l'extrémité N-terminale de ECypP se traduit par une accumulation cytoplasmique de la protéine recombinante. Le protocole de purification est décrit pour une culture d'un litre.
La culture de cellules d'Escherichia coli MC1061, transformées par l'un ou l'autre des plasmides précédemment décrits (pECiH, pECIV), est conduite dans le milieu LB à 37"C, 220 rpm en présence d'ampicilline à 100 mg/l jusqu'à une densité optique de 0,8. A ce stade, I'IPTG inducteur est ajouté à une concentration finale de 0,1 mM et la culture poursuivie pendant 6 à 8 heures. Les cellules sont alors collectées par centrifugation à 6000 g, 15 min., 4"C. Le culot est récupéré avec 20 ml d'un tampon Tris-HCl 20 mM, pH 7,80 (tampon A). Les cellules sont ensuite lysées par 4 cycles de congélation-décongélation, dans l'azote liquide et au bain-marie à 37"C alternativement.
Si nécessaire, une étape à la presse d'Eaton peut être combinée tout en sachant que celle-ci utilisée seule ne donne pas lieu à une récupération quantitative de l'enzyme, comme illustré au Tableau I ci-après.
L'essentiel des débris cellulaires est éliminé par une première précipitation au sulfate d'ammonium à 30 % de saturation. Après centrifugation à 12 000 g pendant 30 min., le surnageant est récupéré puis l'enzyme est précipitée par addition de sulfate d'ammonium jusqu'à 60 % de saturation. Une nouvelle centrifugation à 12 000 g pendant 30 min. permet d'obtenir un culot enrichi en enzyme.
Celui-ci est repris dans 2 ml de tampon A et dialysé contre 3 X 1 litre du même tampon. La solution d'enzyme est ensuite déposée sur une colonne DEAE
Sepharose CL-6B (Pharmacia) équilibrée dans le tampon A. La protéine d'intérêt est contenue dans la fraction non retenue qui est collectée tandis que les contaminants majeurs restent sur la résine. La solution d'enzyme est pure à environ 95% à cette étape, mais diluée (généralement 0.5-2 mg/ml). La concentration peut s'effectuer par lyophilisation ou centrifugation sur Centricon 10. Une purification ultime peut être effectuée par une étape chromatographique additionnelle de filtration sur un gel de type
Sephadex G-50 ou Superose 12 (Pharmacia) ou par échange de cations sur gel -CM à pH 7,50.
Sepharose CL-6B (Pharmacia) équilibrée dans le tampon A. La protéine d'intérêt est contenue dans la fraction non retenue qui est collectée tandis que les contaminants majeurs restent sur la résine. La solution d'enzyme est pure à environ 95% à cette étape, mais diluée (généralement 0.5-2 mg/ml). La concentration peut s'effectuer par lyophilisation ou centrifugation sur Centricon 10. Une purification ultime peut être effectuée par une étape chromatographique additionnelle de filtration sur un gel de type
Sephadex G-50 ou Superose 12 (Pharmacia) ou par échange de cations sur gel -CM à pH 7,50.
Exemple 2: Propriétés enzymatiques de cypffi et cypIV
- Hydrolyse du dipeptide modifié chimiquement: furyl-actyloyl
Ala-Pro oufa-AP
Le Tableau I illustre l'enrichissement réalisé à chaque étape du fractionnement et de la purification de CypIII et de Cyp IV, tels que mis en oeuvre à l'exemple 1 (la méthode de mesure de l'activité est explicitée ci-après).
- Hydrolyse du dipeptide modifié chimiquement: furyl-actyloyl
Ala-Pro oufa-AP
Le Tableau I illustre l'enrichissement réalisé à chaque étape du fractionnement et de la purification de CypIII et de Cyp IV, tels que mis en oeuvre à l'exemple 1 (la méthode de mesure de l'activité est explicitée ci-après).
TABLEAU I
<tb> <SEP> C <SEP> III <SEP> C <SEP> IV
<tb> Etape <SEP> de <SEP> purification <SEP> Activité <SEP> totale <SEP> Activité <SEP> spécifique <SEP> Activité <SEP> totale <SEP> Activité <SEP> spécifique
<tb> <SEP> (pour <SEP> un <SEP> litre <SEP> de <SEP> (U) <SEP> (U/mg) <SEP> (U) <SEP> (U/mg)
<tb> <SEP> culture <SEP> bactérienne)
<tb> extrait <SEP> cetoplasmique <SEP> 2262 <SEP> 0,75 <SEP> 1520 <SEP> 0,4
<tb> (cngl./décgl.) <SEP>
<tb> extrait <SEP> cytoplasmique <SEP> 3741 <SEP> 1,2 <SEP> 3478 <SEP> 0,9
<tb> (cngl./décgl.+E <SEP> press)
<tb> Précipitation <SEP> sulfate <SEP> 1914 <SEP> 18 <SEP> 2068 <SEP> 23
<tb> d'ammonium <SEP> 40-60%
<tb> DEAE-Sephacel <SEP> 1827 <SEP> 61.103 <SEP> 1786 <SEP> 69.103 <SEP>
<tb> (volume <SEP> mort)
<tb> Lyophilisation <SEP> 1690 <SEP> - <SEP> <SEP> 1320
<tb> Superose <SEP> 12 <SEP> 1131 <SEP> 87.103 <SEP> 983 <SEP> 94.10j <SEP>
<tb>
La réaction d'hydrolyse du substrat est suivie en continu au spectrophotomètre grâce au spectre différentiel entre fa-AP et le produit formé, le furylacryloyl-alanine. Une unité d'activité enzymatique (1 U) est définie comme le nombre de Rmoles hydrolysées en l minute. En pratique, l'échantillon à tester est incubé pendant une heure à 370C dans le mélange réactionnel suivant: 20 mM Hepes. 1 mM
EDTA, 1 mM fa-AP, pH 7,80. A l'issue de cette incubation, l'échantillon est dilué 20 fois et dosé au spectrophotomètre double faisceau contre une solution 50 pLM fa-AP.
<tb> Etape <SEP> de <SEP> purification <SEP> Activité <SEP> totale <SEP> Activité <SEP> spécifique <SEP> Activité <SEP> totale <SEP> Activité <SEP> spécifique
<tb> <SEP> (pour <SEP> un <SEP> litre <SEP> de <SEP> (U) <SEP> (U/mg) <SEP> (U) <SEP> (U/mg)
<tb> <SEP> culture <SEP> bactérienne)
<tb> extrait <SEP> cetoplasmique <SEP> 2262 <SEP> 0,75 <SEP> 1520 <SEP> 0,4
<tb> (cngl./décgl.) <SEP>
<tb> extrait <SEP> cytoplasmique <SEP> 3741 <SEP> 1,2 <SEP> 3478 <SEP> 0,9
<tb> (cngl./décgl.+E <SEP> press)
<tb> Précipitation <SEP> sulfate <SEP> 1914 <SEP> 18 <SEP> 2068 <SEP> 23
<tb> d'ammonium <SEP> 40-60%
<tb> DEAE-Sephacel <SEP> 1827 <SEP> 61.103 <SEP> 1786 <SEP> 69.103 <SEP>
<tb> (volume <SEP> mort)
<tb> Lyophilisation <SEP> 1690 <SEP> - <SEP> <SEP> 1320
<tb> Superose <SEP> 12 <SEP> 1131 <SEP> 87.103 <SEP> 983 <SEP> 94.10j <SEP>
<tb>
La réaction d'hydrolyse du substrat est suivie en continu au spectrophotomètre grâce au spectre différentiel entre fa-AP et le produit formé, le furylacryloyl-alanine. Une unité d'activité enzymatique (1 U) est définie comme le nombre de Rmoles hydrolysées en l minute. En pratique, l'échantillon à tester est incubé pendant une heure à 370C dans le mélange réactionnel suivant: 20 mM Hepes. 1 mM
EDTA, 1 mM fa-AP, pH 7,80. A l'issue de cette incubation, l'échantillon est dilué 20 fois et dosé au spectrophotomètre double faisceau contre une solution 50 pLM fa-AP.
La quantité de produit formé est estimée en utilisant une valeur de A324 de -2110 Nf1.cm1 [21]. Une unité d'enzyme produit une différence d'absorbance de -0,127 en une heure.
Il est apparu que la proline formée en cours de réaction se comporte comme un inhibiteur de la réaction. De plus, le Km pour le substrat fa-AP apparaît élevé (de l'ordre de 1 à 5 mM suivant les milieux utilisées). Ces limitations n'autorisent pas la mesure individuelle des paramètres cinétiques Vm et Km. Un traitement mathématique particulier des données doit être effectué pour accéder à l'efficacité enzymatique kcat/Km. Les mesures d'activité sont réalisées dans des conditions où la concentration en substrat est très inférieure au Km, ce qui permet d'effectuer un traitement du premier ordre. Dans ces conditions (S Km), I'équation de Michaelis et Menten peut se réduire à v=(Vm.S)/Km. Par intégration de v=-dS/dt =k.t, on obtient InS=-kobs.t +
InSo, et on peut donc tracer la droite InS=f(t) dont la pente est égale à koh. On accède ensuite à kcat/Km puisque kobs=Vm/Km=(kcat.Et)/Km. La figure 3 présente les données brutes de conversion de fa-AP en fonction du temps ainsi que le graphe InS=frt). Les valeurs obtenues dans ces conditions pour CypIII et CypIV sont, respectivement. de 0,49 et 0,52. 106 s-1.M-1.
InSo, et on peut donc tracer la droite InS=f(t) dont la pente est égale à koh. On accède ensuite à kcat/Km puisque kobs=Vm/Km=(kcat.Et)/Km. La figure 3 présente les données brutes de conversion de fa-AP en fonction du temps ainsi que le graphe InS=frt). Les valeurs obtenues dans ces conditions pour CypIII et CypIV sont, respectivement. de 0,49 et 0,52. 106 s-1.M-1.
Exemple 3: Protéolyse et cartographie peptidique
Afin d'illustrer le champ d'applications possibles de cette protéase de spécificité nouvelle, une digestion enzymatique par CypIII d'une protéine de 61 résidus et de structure connue, la neurotoxine a du venin du serpent Naja nigricollis, a été réalisée. Sa séquence est la suivante
LECHNQQ S SQPPTTKTCPGETNCYKKvwRDHRGTIIERGCGCPTVKPGIKLNC
CTTDKCNN (SEQ ID N 13)
Elle contient 5 prolines (en gras) et quatre ponts disulfure (3-24. 1741, 43-54, 55-60).
Afin d'illustrer le champ d'applications possibles de cette protéase de spécificité nouvelle, une digestion enzymatique par CypIII d'une protéine de 61 résidus et de structure connue, la neurotoxine a du venin du serpent Naja nigricollis, a été réalisée. Sa séquence est la suivante
LECHNQQ S SQPPTTKTCPGETNCYKKvwRDHRGTIIERGCGCPTVKPGIKLNC
CTTDKCNN (SEQ ID N 13)
Elle contient 5 prolines (en gras) et quatre ponts disulfure (3-24. 1741, 43-54, 55-60).
Les conditions opératoires sont les suivantes : 1 mg de toxine préalablement réduite et alkylée au N éthylmaléimide est incubée dans 5 ml de tampon
Hepes 20 mM, pH 7,80, en pré
Hepes 20 mM, pH 7,80, en pré
TABLEAU Il
<tb> pic <SEP> n <SEP> TR** <SEP> HPLC <SEP> (min.) <SEP> masse <SEP> Séq. <SEP> N-terminale <SEP> fragment
<tb> <SEP> 1 <SEP> 22 <SEP> 1298 <SEP> LECHNQQSSQ <SEP> 1 <SEP> 1-10* <SEP>
<tb> <SEP> 2 <SEP> 24 <SEP> 1 <SEP> 2001 <SEP> PGIKLNXXTD. <SEP> 47-61*
<tb> <SEP> 3 <SEP> 27 <SEP> 3254 <SEP> j <SEP> PGETNXKKVX.. <SEP> 18-42*
<tb> <SEP> 4 <SEP> 29 <SEP> 5661 <SEP> PGETNXKKVX.. <SEP> 18-61*
<tb> <SEP> 5 <SEP> 33 <SEP> 3679 <SEP> PGETNXKK.. <SEP> 1847* <SEP>
<tb> * positions dans la séquence ** TR = temps de rétention.
<tb> <SEP> 1 <SEP> 22 <SEP> 1298 <SEP> LECHNQQSSQ <SEP> 1 <SEP> 1-10* <SEP>
<tb> <SEP> 2 <SEP> 24 <SEP> 1 <SEP> 2001 <SEP> PGIKLNXXTD. <SEP> 47-61*
<tb> <SEP> 3 <SEP> 27 <SEP> 3254 <SEP> j <SEP> PGETNXKKVX.. <SEP> 18-42*
<tb> <SEP> 4 <SEP> 29 <SEP> 5661 <SEP> PGETNXKKVX.. <SEP> 18-61*
<tb> <SEP> 5 <SEP> 33 <SEP> 3679 <SEP> PGETNXKK.. <SEP> 1847* <SEP>
<tb> * positions dans la séquence ** TR = temps de rétention.
Le séquençage N-terminal par la méthode d'Edman ainsi que les mesures de masse de ces peptides confirment la spécificité de coupure X-Pro. Le site majeur de coupure au niveau de P18 est remarquable (3 produits sur 5). Ce résidu est situé dans le coude T2, à proximité des quatre ponts disulflire, et est relativement accessible au solvant dans la protéine native [22].
Néanmoins, il n'est pas attaqué par CypIII ou CypIV dans cette
conformation native et la réduction est requise pour l'obtention d'une coupure à ce
niveau. Il convient également de noter que dans le cas de l'enchaînement Pli-P 12, la
coupure par CypIII se produit en amont de P11 (fragment 1-10). De nombreux autres
fragments de faible abondance doivent également résulter de la protéolyse, comme en
témoignent les nombreux pics mineurs visibles sur le chromatogramme.
conformation native et la réduction est requise pour l'obtention d'une coupure à ce
niveau. Il convient également de noter que dans le cas de l'enchaînement Pli-P 12, la
coupure par CypIII se produit en amont de P11 (fragment 1-10). De nombreux autres
fragments de faible abondance doivent également résulter de la protéolyse, comme en
témoignent les nombreux pics mineurs visibles sur le chromatogramme.
Il n'a toutefois pas été possible de procéder à leur caractérisation.
La possibilité d'effectuer, à l'aide des mutants de cyclophiline à acti
vité protéinase, des digestions spécifiques en vue d'analyses biochimiques sur des
protéines (cartographie de modifications post-traductionnelles, analyse topologique)
est ainsi démontrée.
vité protéinase, des digestions spécifiques en vue d'analyses biochimiques sur des
protéines (cartographie de modifications post-traductionnelles, analyse topologique)
est ainsi démontrée.
Références
[1] Galat A. et Metcalfe S., Prog. Biophys. Mol. Biol., 1995, 63, 69-119.
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171, 4525-4529.
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Acad. Sci. USA, 1990, 87, 2304-2308.
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[10] Zhao Y. et Ke H., Biochemistry, 1996, 35, 7362-7368.
[11] Wallace A.C., Laskowski R.A. et Thornton J.M., Prot. Sci., 1996, 5, 1001-1013.
[12] Liu J., Chen C.-M. et Walsh C.T., Biochemistry, 1991, 30, 2306-2310.
[13] Zydowsky L.D.. Etzkom F.A., Chang H.Y., Ferguson S.B., Stolz L.A.. Ho S.I. et
Walsh C.T., Prot. Sci., 1992, 1, 1092- 1099.
Walsh C.T., Prot. Sci., 1992, 1, 1092- 1099.
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Remington S.J., Silman I., Schrag J., Sussman J.L., Verschueren K.H.G et Goldman A., Prot. Eng., 1992, 5, 197-211.
Remington S.J., Silman I., Schrag J., Sussman J.L., Verschueren K.H.G et Goldman A., Prot. Eng., 1992, 5, 197-211.
[19] Ke H., Mayrose D. et Cao W., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1993, 90, 3324-3328.
[20] Konno M.. Ito M., Hayano T. et Takahashi N., J. Mol. Biol., 1996, 256, 897-908.
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[22] Zinn-Justin S., Roumestand C., Gilquin B., Bontems F., Menez A. et Toma F.,
Biochemistry, 1992,31,11335-11347.
Biochemistry, 1992,31,11335-11347.
Ainsi que cela ressort de ce qui précède, I'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes de mise en oeuvre, de réalisation et d'application qui viennent d'être décrits de façon plus explicite; elle en embrasse au contraire toutes les variantes qui peuvent venir à l'esprit du technicien en la matière, sans s'écarter du cadre, ni de la portée, de la présente invention.
LISTE DZ SEQUENCES
(1) INFORMATIONS GENERALES:
(i) DEPOSANT:
(A) NOM: COMMISSARIAT A L'ENERGIE ATOMIQUE
(B) RUE: 31-33 RUE DE LA FEDERATION
(C) VILLE: PARIS
(E) PAYS: FRANCE
(F) CODE POSTAL: 75015
(ii) TITRE DE L'INVENTION: CYCLOPHILINES MODIFIEES, LEUR PROCEDE DE
PREPARATION ET LEURS APPLICATIONS.
(1) INFORMATIONS GENERALES:
(i) DEPOSANT:
(A) NOM: COMMISSARIAT A L'ENERGIE ATOMIQUE
(B) RUE: 31-33 RUE DE LA FEDERATION
(C) VILLE: PARIS
(E) PAYS: FRANCE
(F) CODE POSTAL: 75015
(ii) TITRE DE L'INVENTION: CYCLOPHILINES MODIFIEES, LEUR PROCEDE DE
PREPARATION ET LEURS APPLICATIONS.
(iii) NOMBRE DE SEQUENCES: 12
(iv) FORME DECHIFFRABLE PAR ORDINATEUR:
(A) TYPE DE SUPPORT: Floppy disk
(B) ORDINATEUR: IBM PC compatible
(C) SYSTEME D'EXPLOITATION: PC-DOS/MS-DOS
(D) LOGICIEL: PatentIn Release #1.0, Version #1.30 (OEB)
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 1: Séquence codant pour l'ECypP
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 657 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique)
(ix) CARACTERISTIQUE:
(A) NOM/CLE: CDS
(B) EMPLACEMENT:157..656
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 1:
CGCAAACCGC CTCTCCCCGC GCGTTGGCCG ATTCATTAAT GCAGATTCTG AAATGAGCTG 60
TTGACAATTA ATCATCGGCT CGTATAATGT GTGGAATTGT GAGCGGATAA CAATTTCACA 120
CAGGAAACAG AATTCTAGGA GGAATACTTA ATGGCA GCG AAA GGG GAC CCG CAC 174
Ala Lys Gly Asp Pro His
1 5
GTA TTG TTG ACA ACC TCA GCT GGT AAC ATC GAA CTG GAG CTG GAT AAA 222
Val Leu Leu Thr Thr Ser Ala Gly Asn Ile Glu Leu Glu Leu Asp Lys
10 15 20
CAA AAA GCG CCA GTG TCT GTG CAA AAC TTT GTC GAT TAT GTG AAC AGC 270 Gln Lys Ala Pro Val Ser Val Gln Asn Phe Val Asp Tyr Val Asn Ser
25 30 35
GGT TTT TAT AAC AAC ACT ACC TTT CAC CGC GTC ATT CCT GGC TTT ATG 318
Gly Phe Tyr Asn Asn Thr Thr Phe His Arg Val Ile Pro Gly Phe Met
40 45 50
ATT CAG GGC GGC GGT TTC ACC GAG CAG ATG CAG CAG AAA AAA CCA AAC 366
Ile Gln Gly Gly Gly Phe Thr Glu Gln Met Gln Gln Lys Lys Pro Asn
55 60 65 70
CCG CCA ATC AAA AAT GAA GCC GAT AAC GGC CTG CGC AAC ACG CGT GGC 414
Pro Pro Ile Lys Asn Glu Ala Asp Asn Gly Leu Arg Asn Thr Arg Gly
75 80 85
ACC ATC GCG ATG GCA CGT ACC GCT GAC AAA GAC AGC GCC ACC AGC CAG 462
Thr Ile Ala Met Ala Arg Thr Ala Asp Lys Asp Ser Ala Thr Ser Gln
90 95 100
TTC TTT ATC AAC GTT GCC GAT AAC GCC TTC CTT GAC CAT GGT CAG CGT 510
Phe Phe Ile Asn Val Ala Asp Asn Ala Phe Leu Asp His Gly Gln Arg
105 110 115
GAT TTC GGT TAC GCG GTA TTT GGT AAA GTG GTG AAA GGC ATG GAC GTT 558
Asp Phe Gly Tyr Ala Val Phe Gly Lys Val Val Lys Gly Met Asp Val
120 125 130
GCC GAT AAG ATT TCC CAG GTG CCG ACT CAT GAC GTT GGT CCG TAC CAG 606
Ala Asp Lys Ile Ser Gln Val Pro Thr His Asp Val Gly Pro Tyr Gln 135 140 145 150
AAT GTG CCG TCA AAA CCG GTA GTT ATC CTT TCC GCT AAA GTC CTG CCG TAA 657
Asn Val Pro Ser Lys Pro Val Val Ile Leu Ser Ala Lys Val Leu Pro
155 160 165
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 2: ECypP
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 166 acides aminés
(B) TYPE: acide aminé
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: protéine
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 2:
Ala Lys Gly Asp Pro His Val Leu Leu Thr Thr Ser Ala Gly Asn Ile
1 5 10 15
Glu Leu Glu Leu Asp Lys Gln Lys Ala Pro Val Ser Val Gln Asn Phe
20 25 30
Val Asp Tyr Val Asn Ser Gly Phe Tyr Asn Asn Thr Thr Phe His Arg
35 40 45
Val Ile Pro Gly Phe Met Ile Gln Gly Gly Gly Phe Thr Glu Gln Met
50 55 60 Gln Gln Lys Lys Pro Asn Pro Pro Ile Lys Asn Glu Ala Asp Asn Gly
65 70 75 80
Leu Arg Asn Thr Arg Gly Thr Ile Ala Met Ala Arg Thr Ala Asp Lys
85 90 95
Asp Ser Ala Thr Ser Gln Phe Phe Ile Asn Val Ala Asp Asn Ala Phe
100 105 110
Leu Asp His Gly Gln Arg Asp Phe Gly Tyr Ala Val Phe Gly Lys Val
115 120 125
Val Lys Gly Met Asp Val Ala Asp Lys Ile Ser Gln Val Pro Thr His
130 135 140
Asp Val Gly Pro Tyr Gln Asn Val Pro Ser Lys Pro Val Val Ile Leu 145 150 155 160
Ser Ala Lys Val Leu Pro
165
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 3: Séquence codant pour cypIII
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 657 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique)
(ix) CARACTERISTIQUE:
(A) NOM/CLE: CDS
(B) EMPLACEMENT: 157. .656
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 3: CGCAAACCGC CTCTCCCCGC GCGTTGGCCG ATTCATTAAT GCAGATTCTG AAATGAGCTG 60
TTGACAATTA ATCATCGGCT CGTATAATGT GTGGAATTGT GAGCGGATAA CAATTTCACA 120
CAGGAAACAG AATTCTAGGA GGAATACTTA ATGGCA GCG AAA GGG GAC CCG CAC 174
Ala Lys Gly Asp Pro His
1 5
GTA TTG TTG ACA ACC TCA GCT GGT AAC ATC GAA CTG GAG CTG GAT AAA 222
Val Leu Leu Thr Thr Ser Ala Gly Asn Ile Glu Leu Glu Leu Asp Lys
10 15 20
CAA AAA GCG CCA GTG TCT GTG CAA AAC TTT GTC GAT TAT GTG AAC AGC 270 Gln Lys Ala Pro Val Ser Val Gln Asn Phe Val Asp Tyr Val Asn Ser
25 30 35
GGT TTT TAT AAC AAC ACT ACC TTT CAC CGC GTC ATT CCT GGC TTT ATG 318
Gly Phe Tyr Asn Asn Thr Thr Phe His Arg Val Ile Pro Gly Phe Met
40 45 50
ATT CAG GGC GGC GGT TTC ACC GAG CAG ATG CAG CAG AAA AAA CCA AAC 366
Ile Gln Gly Gly Gly Phe Thr Glu Gln Met Gln Gln Lys Lys Pro Asn 55 60 65 70
CCG CCA ATC AAA AAT GAA GCC GAT AAC GGC CTG CGC AAC ACG CGT GGC 414
Pro Pro Ile Lys Asn Glu Ala Asp Asn Gly Leu Arg Asn Thr Arg Gly
75 80 85
ACC ATC GCA ATG TCA CGT ACC GCT GAC AAA GAC AGC GCC ACC AGC CAG 462
Thr Ile Ala Met Ser Arg Thr Ala Asp Lys Asp Ser Ala Thr Ser Gln
90 95 100
TTC CAC ATC GAC GTT GCC GAT AAC GCC TTC CTT GAC CAT GGT CAG CGT 510
Phe His Ile Asp Val Ala Asp Asn Ala Phe Leu Asp His Gly Gln Arg
105 110 115
GAT TTC GGT TAC GCG GTA TTT GGT AAA GTG GTG AAA GGC ATG GAC GTT 558
Asp Phe Gly Tyr Ala Val Phe Gly Lys Val Val Lys Gly Met Asp Val
120 125 130
GCC GAT AAG ATT TCC CAG GTG CCG ACT CAT GAC GTT GGT CCG TAC CAG 606
Ala Asp Lys Ile Ser Gln Val Pro Thr His Asp Val Gly Pro Tyr Gln 135 140 145 150
AAT GTG CCG TCA AAA CCG GTA GTT ATC CTT TCC GCT AAA GTC CTG CCG TAA 657
Asn Val Pro Ser Lys Pro Val Val Ile Leu Ser Ala Lys Val Leu Pro
155 160 165
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 4: cypIII
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 166 acides aminé
(B) TYPE: acide aminé
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: protéine
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 4:
Ala Lys Gly Asp Pro His Val Leu Leu Thr Thr Ser Ala Gly Asn Ile
1 5 10 15
Glu Leu Glu Leu Asp Lys Gln Lys Ala Pro Val Ser Val Gln Asn Phe
20 25 30
Val Asp Tyr Val Asn Ser Gly Phe Tyr Asn Asn Thr Thr Phe His Arg
35 40 45
Val Ile Pro Gly Phe Met Ile Gln Gly Gly Gly Phe Thr Glu Gln Met
50 55 60 Gln Gln Lys Lys Pro Asn Pro Pro Ile Lys Asn Glu Ala Asp Asn Gly
65 70 75 80
Leu Arg Asn Thr Arg Gly Thr Ile Ala Met Ser Arg Thr Ala Asp Lys
85 90 95
Asp Ser Ala Thr Ser Gln Phe His Ile Asp Val Ala Asp Asn Ala Phe
100 105 110
Leu Asp His Gly Gln Arg Asp Phe Gly Tyr Ala Val Phe Gly Lys Val
115 120 125
Val Lys Gly Met Asp Val Ala Asp Lys Ile Ser Gln Val Pro Thr His
130 135 140
Asp Val Gly Pro Tyr Gln Asn Val Pro Ser Lys Pro Val Val Ile Leu 145 150 155 160
Ser Ala Lys Val Leu Pro
165
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 5: séquence codant pour cypIV
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 657 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique)
(ix) CARACTERISTIQUE:
(A) NOM/CLE: CDS
(B) EMPLACEMENT:157..656
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 5: CGCAAACCGC CTCTCCCCGC GCGTTGGCCG ATTCATTAAT GCAGATTCTG ARATGAGCTG 60
TTGACAATTA ATCATCGGCT CGTATAATGT GTGGAATTGT GAGCGGATAA CAATTTCACA 120
CAGGAAACAG AATTCTAGGA GGAATACTTA ATGGCA GCG AAA GGG GAC CCG CAC 174
Ala Lys Gly Asp Pro His
1 5
GTA TTG TTG ACA ACC TCA GCT GGT AAC ATC GAA CTG GAG CTG GAT AAA 222
Val Leu Leu Thr Thr Ser Ala Gly Asn Ile Glu Leu Glu Leu Asp Lys
10 15 20
CAA AAA GCG CCA GTG TCT GTG CAA AAC TTT GTC GAT TAT GTG AAC AGC 270 Gln Lys Ala Pro Val Ser Val Gln Asn Phe Val Asp Tyr Val Asn Ser
25 30 35
GGT TTT TAT AAC AAC ACT ACC TTT CAC CGC GTC ATT CCT GGC TTT ATG 318
Gly Phe Tyr Asn Asn Thr Thr Phe His Arg Val Ile Pro Gly Phe Met
40 45 50
ATT CAG GGC GGC GGT TTC ACC GAG CAG ATG CAG CAG AAA AAA CCA AAC 366
Ile Gln Gly Gly Gly Phe Thr Glu Gln Met Gln Gln Lys Lys Pro Asn 55 60 65 70
CCG CCA ATC AAA AAT GAA GCC GAT AAC GGC CTG CGC AAC ACG CGT GGC 414
Pro Pro Ile Lys Asn Glu Ala Asp Asn Gly Leu Arg Asn Thr Arg Gly
75 80 85
ACC ATC GCA ATG TCA CGT ACC GCT GAC AAA GAC AGC GCC ACC AGC CAG 462
Thr Ile Ala Met Ser Arg Thr Ala Asp Lys Asp Ser Ala Thr Ser Gln
90 95 100
TTC CAC ATC GAC GTT GCC GAT AAC GCC TTC CTT GAC CAT GGT CAG CGT 510
Phe His Ile Asp Val Ala Asp Asn Ala Phe Leu Asp His Gly Gln Arg
105 110 115
GAT TTC GGT CAC GCG GTA TTT GGT AAA GTG GTG AAA GGC ATG GAC GTT 558
Asp Phe Gly His Ala Val Phe Gly Lys Val Val Lys Gly Met Asp Val
120 125 130
GCC GAT AAG ATT TCC CAG GTG CCG ACT CAT GAC GTT GGT CCG TAC CAG 606
Ala Asp Lys Ile Ser Gln Val Pro Thr His Asp Val Gly Pro Tyr Gln 135 140 145 150
AAT GTG CCG TCA AAA CCG GTA GTT ATC CTT TCC GCT ARA GTC CTG CCG TAA 657
Asn Val Pro Ser Lys Pro Val Val île Leu Ser Ala Lys Val Leu Pro
155 160 165
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 6: cypIV
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 166 acides aminés
(B) TYPE: acide aminé
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: protéine
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 6:
Ala Lys Gly Asp Pro His Val Leu Leu Thr Thr Ser Ala Gly Asn Ile
1 5 10 15
Glu Leu Glu Leu Asp Lys Gln Lys Ala Pro Val Ser Val Gln Asn Phe
20 25 30
Val Asp Tyr Val Asn Ser Gly Phe Tyr Asn Asn Thr Thr Phe His Arg
35 40 45
Val Ile Pro Gly Phe Met Ile Gln Gly Gly Gly Phe Thr Glu Gln Met
50 55 60 Gln Gln Lys Lys Pro Asn Pro Pro Ile Lys Asn Glu Ala Asp Asn Gly
65 70 75 80
Leu Arg Asn Thr Arg Gly Thr Ile Ala Met Ser Arg Thr Ala Asp Lys
85 90 95
Asp Ser Ala Thr Ser Gln Phe His Ile Asp Val Ala Asp Asn Ala Phe
100 105 110
Leu Asp His Gly Gln Arg Asp Phe Gly Hie Ala Val Phe Gly Lys Val
115 120 125
Val Lys Gly Met Asp Val Ala Asp Lys Ile Ser Gln Val Pro Thr His
130 135 140
Asp Val Gly Pro Tyr Gln Asn Val Pro Ser Lys Pro Val Val Ile Leu 145 150 155 160
Ser Ala Lys Val Leu Pro
165
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 7:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 27 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: Autre acide nucléique
(A) DESCRIPTION: /desc = "AMORCE"
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 7:
AGCGGTACGT GACATTGCGA TGGTGCC 27
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 8:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 27 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: Autre acide nucléique
(A) DESCRIPTION: /desc = "AMORCE"
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 8:
GGCACCATCG CAATGTCACG TACCGCT 27
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 9:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 33 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: Autre acide nucléique
(A) DESCRIPTION: /desc = "AMORCE"
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 9:
GTTATCGGCA ACGTCGATGT GGAACTGGCT GGT 33
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 10:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 33 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: Autre acide nucléique
(A) DESCRIPTION: /desc = "AMORCE"
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 10:
ACCAGCCAGT TCCACATCGA CGTTGCCGAT AAC 33
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 11:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 30 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: Autre acide nucléique
(A) DESCRIPTION: /desc = "AMORCE"
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 11: ACCARATACC GCGTGACCGA AATCACGCTG 30
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 12:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 30 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: Autre acide nucléique
(A) DESCRIPTION: /desc = "AMORCE"
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 12:
CAGCGTGATT TCGGTCACGC GGTATTTGGT 30
(iv) FORME DECHIFFRABLE PAR ORDINATEUR:
(A) TYPE DE SUPPORT: Floppy disk
(B) ORDINATEUR: IBM PC compatible
(C) SYSTEME D'EXPLOITATION: PC-DOS/MS-DOS
(D) LOGICIEL: PatentIn Release #1.0, Version #1.30 (OEB)
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 1: Séquence codant pour l'ECypP
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 657 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique)
(ix) CARACTERISTIQUE:
(A) NOM/CLE: CDS
(B) EMPLACEMENT:157..656
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 1:
CGCAAACCGC CTCTCCCCGC GCGTTGGCCG ATTCATTAAT GCAGATTCTG AAATGAGCTG 60
TTGACAATTA ATCATCGGCT CGTATAATGT GTGGAATTGT GAGCGGATAA CAATTTCACA 120
CAGGAAACAG AATTCTAGGA GGAATACTTA ATGGCA GCG AAA GGG GAC CCG CAC 174
Ala Lys Gly Asp Pro His
1 5
GTA TTG TTG ACA ACC TCA GCT GGT AAC ATC GAA CTG GAG CTG GAT AAA 222
Val Leu Leu Thr Thr Ser Ala Gly Asn Ile Glu Leu Glu Leu Asp Lys
10 15 20
CAA AAA GCG CCA GTG TCT GTG CAA AAC TTT GTC GAT TAT GTG AAC AGC 270 Gln Lys Ala Pro Val Ser Val Gln Asn Phe Val Asp Tyr Val Asn Ser
25 30 35
GGT TTT TAT AAC AAC ACT ACC TTT CAC CGC GTC ATT CCT GGC TTT ATG 318
Gly Phe Tyr Asn Asn Thr Thr Phe His Arg Val Ile Pro Gly Phe Met
40 45 50
ATT CAG GGC GGC GGT TTC ACC GAG CAG ATG CAG CAG AAA AAA CCA AAC 366
Ile Gln Gly Gly Gly Phe Thr Glu Gln Met Gln Gln Lys Lys Pro Asn
55 60 65 70
CCG CCA ATC AAA AAT GAA GCC GAT AAC GGC CTG CGC AAC ACG CGT GGC 414
Pro Pro Ile Lys Asn Glu Ala Asp Asn Gly Leu Arg Asn Thr Arg Gly
75 80 85
ACC ATC GCG ATG GCA CGT ACC GCT GAC AAA GAC AGC GCC ACC AGC CAG 462
Thr Ile Ala Met Ala Arg Thr Ala Asp Lys Asp Ser Ala Thr Ser Gln
90 95 100
TTC TTT ATC AAC GTT GCC GAT AAC GCC TTC CTT GAC CAT GGT CAG CGT 510
Phe Phe Ile Asn Val Ala Asp Asn Ala Phe Leu Asp His Gly Gln Arg
105 110 115
GAT TTC GGT TAC GCG GTA TTT GGT AAA GTG GTG AAA GGC ATG GAC GTT 558
Asp Phe Gly Tyr Ala Val Phe Gly Lys Val Val Lys Gly Met Asp Val
120 125 130
GCC GAT AAG ATT TCC CAG GTG CCG ACT CAT GAC GTT GGT CCG TAC CAG 606
Ala Asp Lys Ile Ser Gln Val Pro Thr His Asp Val Gly Pro Tyr Gln 135 140 145 150
AAT GTG CCG TCA AAA CCG GTA GTT ATC CTT TCC GCT AAA GTC CTG CCG TAA 657
Asn Val Pro Ser Lys Pro Val Val Ile Leu Ser Ala Lys Val Leu Pro
155 160 165
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 2: ECypP
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 166 acides aminés
(B) TYPE: acide aminé
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: protéine
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 2:
Ala Lys Gly Asp Pro His Val Leu Leu Thr Thr Ser Ala Gly Asn Ile
1 5 10 15
Glu Leu Glu Leu Asp Lys Gln Lys Ala Pro Val Ser Val Gln Asn Phe
20 25 30
Val Asp Tyr Val Asn Ser Gly Phe Tyr Asn Asn Thr Thr Phe His Arg
35 40 45
Val Ile Pro Gly Phe Met Ile Gln Gly Gly Gly Phe Thr Glu Gln Met
50 55 60 Gln Gln Lys Lys Pro Asn Pro Pro Ile Lys Asn Glu Ala Asp Asn Gly
65 70 75 80
Leu Arg Asn Thr Arg Gly Thr Ile Ala Met Ala Arg Thr Ala Asp Lys
85 90 95
Asp Ser Ala Thr Ser Gln Phe Phe Ile Asn Val Ala Asp Asn Ala Phe
100 105 110
Leu Asp His Gly Gln Arg Asp Phe Gly Tyr Ala Val Phe Gly Lys Val
115 120 125
Val Lys Gly Met Asp Val Ala Asp Lys Ile Ser Gln Val Pro Thr His
130 135 140
Asp Val Gly Pro Tyr Gln Asn Val Pro Ser Lys Pro Val Val Ile Leu 145 150 155 160
Ser Ala Lys Val Leu Pro
165
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 3: Séquence codant pour cypIII
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 657 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique)
(ix) CARACTERISTIQUE:
(A) NOM/CLE: CDS
(B) EMPLACEMENT: 157. .656
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 3: CGCAAACCGC CTCTCCCCGC GCGTTGGCCG ATTCATTAAT GCAGATTCTG AAATGAGCTG 60
TTGACAATTA ATCATCGGCT CGTATAATGT GTGGAATTGT GAGCGGATAA CAATTTCACA 120
CAGGAAACAG AATTCTAGGA GGAATACTTA ATGGCA GCG AAA GGG GAC CCG CAC 174
Ala Lys Gly Asp Pro His
1 5
GTA TTG TTG ACA ACC TCA GCT GGT AAC ATC GAA CTG GAG CTG GAT AAA 222
Val Leu Leu Thr Thr Ser Ala Gly Asn Ile Glu Leu Glu Leu Asp Lys
10 15 20
CAA AAA GCG CCA GTG TCT GTG CAA AAC TTT GTC GAT TAT GTG AAC AGC 270 Gln Lys Ala Pro Val Ser Val Gln Asn Phe Val Asp Tyr Val Asn Ser
25 30 35
GGT TTT TAT AAC AAC ACT ACC TTT CAC CGC GTC ATT CCT GGC TTT ATG 318
Gly Phe Tyr Asn Asn Thr Thr Phe His Arg Val Ile Pro Gly Phe Met
40 45 50
ATT CAG GGC GGC GGT TTC ACC GAG CAG ATG CAG CAG AAA AAA CCA AAC 366
Ile Gln Gly Gly Gly Phe Thr Glu Gln Met Gln Gln Lys Lys Pro Asn 55 60 65 70
CCG CCA ATC AAA AAT GAA GCC GAT AAC GGC CTG CGC AAC ACG CGT GGC 414
Pro Pro Ile Lys Asn Glu Ala Asp Asn Gly Leu Arg Asn Thr Arg Gly
75 80 85
ACC ATC GCA ATG TCA CGT ACC GCT GAC AAA GAC AGC GCC ACC AGC CAG 462
Thr Ile Ala Met Ser Arg Thr Ala Asp Lys Asp Ser Ala Thr Ser Gln
90 95 100
TTC CAC ATC GAC GTT GCC GAT AAC GCC TTC CTT GAC CAT GGT CAG CGT 510
Phe His Ile Asp Val Ala Asp Asn Ala Phe Leu Asp His Gly Gln Arg
105 110 115
GAT TTC GGT TAC GCG GTA TTT GGT AAA GTG GTG AAA GGC ATG GAC GTT 558
Asp Phe Gly Tyr Ala Val Phe Gly Lys Val Val Lys Gly Met Asp Val
120 125 130
GCC GAT AAG ATT TCC CAG GTG CCG ACT CAT GAC GTT GGT CCG TAC CAG 606
Ala Asp Lys Ile Ser Gln Val Pro Thr His Asp Val Gly Pro Tyr Gln 135 140 145 150
AAT GTG CCG TCA AAA CCG GTA GTT ATC CTT TCC GCT AAA GTC CTG CCG TAA 657
Asn Val Pro Ser Lys Pro Val Val Ile Leu Ser Ala Lys Val Leu Pro
155 160 165
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 4: cypIII
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 166 acides aminé
(B) TYPE: acide aminé
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: protéine
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 4:
Ala Lys Gly Asp Pro His Val Leu Leu Thr Thr Ser Ala Gly Asn Ile
1 5 10 15
Glu Leu Glu Leu Asp Lys Gln Lys Ala Pro Val Ser Val Gln Asn Phe
20 25 30
Val Asp Tyr Val Asn Ser Gly Phe Tyr Asn Asn Thr Thr Phe His Arg
35 40 45
Val Ile Pro Gly Phe Met Ile Gln Gly Gly Gly Phe Thr Glu Gln Met
50 55 60 Gln Gln Lys Lys Pro Asn Pro Pro Ile Lys Asn Glu Ala Asp Asn Gly
65 70 75 80
Leu Arg Asn Thr Arg Gly Thr Ile Ala Met Ser Arg Thr Ala Asp Lys
85 90 95
Asp Ser Ala Thr Ser Gln Phe His Ile Asp Val Ala Asp Asn Ala Phe
100 105 110
Leu Asp His Gly Gln Arg Asp Phe Gly Tyr Ala Val Phe Gly Lys Val
115 120 125
Val Lys Gly Met Asp Val Ala Asp Lys Ile Ser Gln Val Pro Thr His
130 135 140
Asp Val Gly Pro Tyr Gln Asn Val Pro Ser Lys Pro Val Val Ile Leu 145 150 155 160
Ser Ala Lys Val Leu Pro
165
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 5: séquence codant pour cypIV
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 657 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique)
(ix) CARACTERISTIQUE:
(A) NOM/CLE: CDS
(B) EMPLACEMENT:157..656
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 5: CGCAAACCGC CTCTCCCCGC GCGTTGGCCG ATTCATTAAT GCAGATTCTG ARATGAGCTG 60
TTGACAATTA ATCATCGGCT CGTATAATGT GTGGAATTGT GAGCGGATAA CAATTTCACA 120
CAGGAAACAG AATTCTAGGA GGAATACTTA ATGGCA GCG AAA GGG GAC CCG CAC 174
Ala Lys Gly Asp Pro His
1 5
GTA TTG TTG ACA ACC TCA GCT GGT AAC ATC GAA CTG GAG CTG GAT AAA 222
Val Leu Leu Thr Thr Ser Ala Gly Asn Ile Glu Leu Glu Leu Asp Lys
10 15 20
CAA AAA GCG CCA GTG TCT GTG CAA AAC TTT GTC GAT TAT GTG AAC AGC 270 Gln Lys Ala Pro Val Ser Val Gln Asn Phe Val Asp Tyr Val Asn Ser
25 30 35
GGT TTT TAT AAC AAC ACT ACC TTT CAC CGC GTC ATT CCT GGC TTT ATG 318
Gly Phe Tyr Asn Asn Thr Thr Phe His Arg Val Ile Pro Gly Phe Met
40 45 50
ATT CAG GGC GGC GGT TTC ACC GAG CAG ATG CAG CAG AAA AAA CCA AAC 366
Ile Gln Gly Gly Gly Phe Thr Glu Gln Met Gln Gln Lys Lys Pro Asn 55 60 65 70
CCG CCA ATC AAA AAT GAA GCC GAT AAC GGC CTG CGC AAC ACG CGT GGC 414
Pro Pro Ile Lys Asn Glu Ala Asp Asn Gly Leu Arg Asn Thr Arg Gly
75 80 85
ACC ATC GCA ATG TCA CGT ACC GCT GAC AAA GAC AGC GCC ACC AGC CAG 462
Thr Ile Ala Met Ser Arg Thr Ala Asp Lys Asp Ser Ala Thr Ser Gln
90 95 100
TTC CAC ATC GAC GTT GCC GAT AAC GCC TTC CTT GAC CAT GGT CAG CGT 510
Phe His Ile Asp Val Ala Asp Asn Ala Phe Leu Asp His Gly Gln Arg
105 110 115
GAT TTC GGT CAC GCG GTA TTT GGT AAA GTG GTG AAA GGC ATG GAC GTT 558
Asp Phe Gly His Ala Val Phe Gly Lys Val Val Lys Gly Met Asp Val
120 125 130
GCC GAT AAG ATT TCC CAG GTG CCG ACT CAT GAC GTT GGT CCG TAC CAG 606
Ala Asp Lys Ile Ser Gln Val Pro Thr His Asp Val Gly Pro Tyr Gln 135 140 145 150
AAT GTG CCG TCA AAA CCG GTA GTT ATC CTT TCC GCT ARA GTC CTG CCG TAA 657
Asn Val Pro Ser Lys Pro Val Val île Leu Ser Ala Lys Val Leu Pro
155 160 165
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 6: cypIV
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 166 acides aminés
(B) TYPE: acide aminé
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: protéine
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 6:
Ala Lys Gly Asp Pro His Val Leu Leu Thr Thr Ser Ala Gly Asn Ile
1 5 10 15
Glu Leu Glu Leu Asp Lys Gln Lys Ala Pro Val Ser Val Gln Asn Phe
20 25 30
Val Asp Tyr Val Asn Ser Gly Phe Tyr Asn Asn Thr Thr Phe His Arg
35 40 45
Val Ile Pro Gly Phe Met Ile Gln Gly Gly Gly Phe Thr Glu Gln Met
50 55 60 Gln Gln Lys Lys Pro Asn Pro Pro Ile Lys Asn Glu Ala Asp Asn Gly
65 70 75 80
Leu Arg Asn Thr Arg Gly Thr Ile Ala Met Ser Arg Thr Ala Asp Lys
85 90 95
Asp Ser Ala Thr Ser Gln Phe His Ile Asp Val Ala Asp Asn Ala Phe
100 105 110
Leu Asp His Gly Gln Arg Asp Phe Gly Hie Ala Val Phe Gly Lys Val
115 120 125
Val Lys Gly Met Asp Val Ala Asp Lys Ile Ser Gln Val Pro Thr His
130 135 140
Asp Val Gly Pro Tyr Gln Asn Val Pro Ser Lys Pro Val Val Ile Leu 145 150 155 160
Ser Ala Lys Val Leu Pro
165
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 7:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 27 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: Autre acide nucléique
(A) DESCRIPTION: /desc = "AMORCE"
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 7:
AGCGGTACGT GACATTGCGA TGGTGCC 27
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 8:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 27 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: Autre acide nucléique
(A) DESCRIPTION: /desc = "AMORCE"
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 8:
GGCACCATCG CAATGTCACG TACCGCT 27
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 9:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 33 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: Autre acide nucléique
(A) DESCRIPTION: /desc = "AMORCE"
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 9:
GTTATCGGCA ACGTCGATGT GGAACTGGCT GGT 33
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 10:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 33 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: Autre acide nucléique
(A) DESCRIPTION: /desc = "AMORCE"
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 10:
ACCAGCCAGT TCCACATCGA CGTTGCCGAT AAC 33
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 11:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 30 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: Autre acide nucléique
(A) DESCRIPTION: /desc = "AMORCE"
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 11: ACCARATACC GCGTGACCGA AATCACGCTG 30
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 12:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 30 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: Autre acide nucléique
(A) DESCRIPTION: /desc = "AMORCE"
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 12:
CAGCGTGATT TCGGTCACGC GGTATTTGGT 30
Claims (2)
- 80) Enzyme recombinante purifiée à activité prolylpeptidasique selon la revendication 7, caractérisée en ce que ladite cyclophiline périplasmique d'Escherichia coli modifiée comprend la substitution au niveau du résidu en position 91 d'une alanine (Ala ou A) par une sérine (Ser ou S), la substitution au niveau du résidu en position 104, d'une phénylalanine (Phe ou F) par une histidine (His ou H), la substitution au niveau du résidu en position 106, d'une asparagine (Asn ou D) par un acide aspartique (Asp ou D) (SEQ ID N"4).9 ) Enzyme recombinante purifiée à activité prolylpeptidasique selon la revendication 8, caractérisée en ce que ladite cyclophiline périplasmique d'Escherichia coli modifiée comprend en outre, en position 122, la substitution d'une tyrosine (Tyr ou Y) par une histidine (His ou H) (SEQ ID N06).10 ) Séquence nucléique codant pour une enzyme recombinante purifiée à activité prolylpeptidasique constituée par une cyclophiline modifiée selon l'une quelconque des revendications 1 à 9.11") Séquence nucléique selon la revendication 10, caractérisée en ce qu'elle est susceptible d'être obtenue par une méthode comprenant(a) la mutagenèse dirigée d'une séquence d'ADN codant pour une cyclophiline naturelle issue d'un procaryote ou d'un eucaryote,(b) la production d'une banque de séquences d'ADN mutées obtenues en (a) et(c) le criblage de ladite banque et la sélection des séquences codant pour cyclophiline modifiée présentant à la fois une activité de prolylendopeptidase et de prolylexopeptidase.12") Séquence nucléique selon la revendication 11, caractérisée en ce que la séquence selon l'étape (a) est une séquence d'ADN codant pour une cyclo philine naturelle, de préférence la séquence codant pour la cyclophiline périplasmique d'E. coli (SEQ ID N"1).13 ) Séquence nucléique selon la revendication 11 ou la revendication 12, caractérisée en ce que l'étape (a) de mutagenèse dirigée est mise en oeuvre en présence des nucléotides de séquences SEQ ID N" 7-12.14") Séquence nucléique selon l'une quelconque des revendications 10 à 13, caractérisée en ce qu'elle est constituée par la séquence nucléique SEQ ID NO 3 ou la séquence nucléique SEQ ID N"5.
- 150) Vecteur d'expression, caractérisé en ce qu'il comprend une séquence d'acide nucléique codant pour une enzyme recombinante purifiée à activité prolylpeptidasique constituée par une cyclophiline modifiée selon l'une quelconque des revendications 1 à 9.16 ) Vecteur d'expression selon la revendication 15, caractérisé en ce qu'il inclut un système d'expression comprenant en particulier une origine de réplication dans un microorganisme hôte approprié, notamment une bactérie ou une cellule eucaryote, éventuellement un gène dont l'expression permet la sélection soit des bactéries, soit des cellules eucaryotes, transformées par ledit vecteur, une séquence régulatrice appropriée, notamment un promoteur convenable, un site de fixation aux ribosomes, optionnellement une séquence signal et une séquence nucléique selon l'une quelconque des revendications 10 à 14, lequel système est inséré dans une structure génétique appropriée, notamment choisie dans le groupe qui comprend des plasmides, des phages, des cosmides ou des chromosomes appropnés.17 ) Cellule hôte, transformée par un vecteur selon la revendication 15 ou la revendication 16, notamment une bactérie telle qu'E. coli.18 ) Procédé de préparation d'une enzyme recombinante purifiée à activité prolylpeptidasique dans une cellule hôte, caractérisé en ce qu'il comprend(a) la transformation d'une cellule hôte appropriée par un vecteur d'expression, selon la revendication 15 ou la revendication 16,(b) I'expression de l'enzyme recombinante purifiée à activité prolylpeptidasique constituée par une cyclophiline modifiée selon l'une quelconque des revendications 1 à 9 et(c) la purification de l'enzyme recombinante à activité prolylpeptidasique obtenue.19 ) Réactif biologique, caractérisé en ce qu'il est constitué par une enzyme recombinante purifiée à activité prolylpeptidasique selon l'une quelconque des revendications 1 à 9.20 ) Méthode de caractérisation d'une protéine, caractérisée en ce qu'elle comprend la dégradation de la protéine à analyser à l'aide d'une enzyme recombinante purifiée à activité prolylpeptidasique selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, seule ou en combinaison avec d'autres réactifs de coupure des protéineset l'analyse des produits de dégradation obtenus par des techniques d'analyse appropriées, telles que l'électrophorèse ou la chromatographie.21 ) Application d'une cellule hôte selon la revendication 17 à la bioconversion de produits agro-alimentaires.
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| EP0413440A2 (fr) * | 1989-07-19 | 1991-02-20 | Tonen Corporation | Peptidyl prolyl-cis, trans-isomérase |
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Patent Citations (1)
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| US9815875B2 (en) | 2008-02-19 | 2017-11-14 | Myocept Inc. | Postsynaptically targeted chemodenervation agents and their methods of use |
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