FR2761373A1 - Procede et kit pour l'extraction d'acides nucleiques d'un echantillon biologique complexe - Google Patents

Abstract

L'invention concerne un procédé et un kit d'extraction des acides nucléiques d'un échantillon biologique.Ce procédé est caractérisé en ce que, depuis l'étape de lyse jusqu'à l'étape de précipitation sélective, on fait circuler l'échantillon à travers une série de colonnes équipées chacune d'une garniture spécifique au traitement devant être effectué, le passage de l'échantillon d'une colonne à une autre disposés l'une au-dessus de l'autre, s'effectuant sous l'action combinée d'un fluide de transfert introduit dans la colonne du dessus et d'une pression exercée par le dessus de cette colonne.Application : analyses pour contrôle qualité.

Description

Procédé et kit pour l'extraction d'acides nucléiques d'un échantillon biologique complexe
La présente invention concerne un procédé et un kit pour l'extraction d'acides nucléiques d'un échantillon biologique complexe en vue de l'isolement des acides nucléiques contenus à l'intérieur de l'échantillon.

Les méthodes d'extraction ou d'isolement d'ADN ou d'ARN d'échantillons d'origine quelconque sont nombreuses.

Toutefois, toutes ces méthodes présentent un certain nombre de points communs. En particulier, ces procédés comprennent tous au moins une étape de lyse cellulaire par action de réactifs contenant des agents chaotropiques, des détergents ou des enzymes de dégradation et au moins une étape de purification des acides nucléiques, soit par action de solvants organiques type phénol, chloroforme par centrifugations successives, soit par passages de la solution de lyse sur des membranes sélectives, des gels de silice ou des résines anioniques. Ces passages sont réalisés par centrifugation sur colonne ou par tirage sous vide ou par gravitation. Dans quelques procédés décrits, on trouve également des procédés comprenant une troisième étape de précipitation sélective des acides nucléiques en phase alcoolique. Le précipité ainsi constitué est centrifugé de manière à récupérer le culot de centrifugation pour le remettre en suspension. Une fois remis en suspension, ce produit constitue alors l'acide nucléique purifié.

Le problème de la mise en oeuvre d'opérations de centrifugation est que, d'une part, elles peuvent provoquer une rupture des brins d'ADN et/ou d'ARN amenant ainsi à l'isolement de brins d'ADN et/ou d' ARN de faible poids moléculaire et que, d'autre part, elles nécessitent, après chaque centrifugation, une reprise soit de la phase solide, soit de la phase liquide et son mélange avec de nouveaux réactifs. Ces opérations ne peuvent être effectuées que manuellement. I1 en résulte des protocoles relativement longs à mettre en oeuvre. L'utilisation de la gravité, mise en oeuvre notamment dans le cadre d'un procédé décrit par la Société QIAGEN, qui à notre avis constitue le procédé le plus pertinent à l'égard de l'invention, rend le procédé particulièrement long. En outre, à nouveau, on a recours à la centrifugation au cours de l'étape de précipitation.

Enfin, rares sont les procédés qui présentent successivement ces trois étapes, à savoir une étape de lyse cellulaire, une étape de purification des acides nucléiques et une étape de précipitation sélective des ADN en phase alcoolique. Or, on constate que, en l'absence de mise en oeuvre de ces trois étapes, on ne peut garantir le traitement d'échantillons complexes.

Le but de la présente invention est donc de proposer un procédé ne nécessitant au cours de sa mise en oeuvre d'une part, aucune opération de centrifugation de manière à obtenir des brins d'ADN ou d'ARN de grande longueur, d'autre part, aucune manipulation de solvants organiques dangereux.

Un autre but de la présente invention est de proposer un procédé dont les étapes sont choisies de manière telle qu'elles permettent le traitement de n'importe quel type d'échantillon, y compris des échantillons particulièrement complexes de manière à rendre ce procédé universel et applicable à tout type d'échantillon.

Un autre but encore de la présente invention est de proposer un procédé de traitement d'échantillons rapide, ne nécessitant pas, au cours de sa mise en oeuvre, d'opérations manuelles fastidieuses.

Un autre but de la présente invention est de proposer un procédé de traitement d'échantillons aisément automatisable.

A cet effet, l'invention a pour objet un procédé d'extraction d'acides nucléiques d'un échantillon complexe en vue de l'isolement d'acides nucléiques purifiés à partir desquels tout type de technique de biologie moléculaire peut être mis en oeuvre tel que digestion, clonage, amplification génique, hybridation moléculaire ou similaire, du type comprenant une étape de lyse des cellules contenues dans ledit échantillon, une étape de purification de l'échantillon par lavages successifs et une étape de précipitation sélective en phase alcoolique des constituants de l'échantillon, au moins l'une de ces étapes étant conduite à l'intérieur d'une colonne équipée d'une garniture telle que membrane, filtre, matrice, résine ou similaire, caractérisé en ce que, depuis l'étape de lyse jusqu'à l'étape de précipitation sélective, on fait circuler l'échantillon à travers une série de colonnes équipées chacune d'une garniture spécifique au traitement devant être effectué, le passage de l'échantillon d'une colonne à une autre s'effectuant en disposant lesdites colonnes l'une au-dessus de l'autre, en introduisant, en entrée de la colonne du dessus, un fluide de transfert, en exerçant, par le dessus de cette colonne, une pression, cette pression forçant le fluide de transfert, apte à se charger en constituants de l'échantillon au cours de sa circulation à travers la colonne, à sortir de ladite colonne, en récupérant, en entrée de la colonne du dessous, le liquide de transfert chargé expulsé de la colonne du dessus de telle sorte que toute reprise de phase de l'échantillon est évitée.

Selon un mode de mise en oeuvre préféré du procédé de l'invention, on fait circuler l'échantillon à travers au moins trois colonnes, une première colonne dite de lyse équipée d'une membrane de filtration, une deuxième colonne dite de purification garnie d'une résine échangeuse d'ions, de préférence une résine anionique, et une troisième colonne dite de précipitation sélective garnie d'une membrane de filtration ou d'un gel imprégné d'un alcool, de préférence de l'isopropanol ou de l'éthanol.

L'invention a encore pour objet un kit pour l'extraction d'acides nucléiques d'un échantillon complexe pour la mise en oeuvre du procédé précédent, caractérisé en ce qu'il est constitué d'au moins trois colonnes, une première colonne dite de lyse équipée d'une membrane de filtration, une deuxième colonne dite de purification garnie d'une résine échangeuse d'ions, de préférence une résine anionique, et une troisième colonne dite de précipitation sélective garnie d'une membrane de filtration ou d'un gel apte à être imprégné d'un alcool, de préférence de l'isopropanol ou de l'éthanol et d'une série de réactifs spécifiques à chaque colonne.

L'invention sera bien comprise à la lecture de la description suivante d'un exemple de réalisation.

L'isolement et la purification d'acides nucléiques à partir d'échantillons d'origines diverses sont des étapes indispensables pour permettre la mise en oeuvre ultérieure de techniques de biologie moléculaire sur ledit échantillon. A titre d'exemple de techniques de biologie moléculaire, on peut citer les techniques de digestion, de clonage, d'amplification génique, d'hybridation moléculaire ou similaire. En conséquence, le procédé de traitement d'échantillons décrit ci-dessous peut être suivi d'une amplification génique par PCR (Réaction en Chaîne par Polymérase), suivie d'une révélation colorimétrique, pour permettre d'identifier de manière rapide la présence de bactéries, par exemple pathogènes, dans un échantillon d'origine alimentaire ou végétale dans le cadre de la fabrication industrielle de produits alimentaires, de semences ou autres. Les échantillons traités peuvent être des échantillons complexes. Par échantillon complexe on entend des matrices alimentaires telles que des plats cuisinés, des produits laitiers, des salades, des macérations de matrices alimentaires, des macérations de semences, des tissus animaux ou végétaux, etc.

Pour cette raison, le procédé d'extraction décrit cidessous doit inclure au moins trois étapes, à savoir une étape de lyse bactérienne, une étape de purification et une étape de précipitation sélective des acides nucléiques de manière à garantir l'efficacité de ce procédé et à le rendre universel indépendamment de l'échantillon à traiter.

La suppression de l'une de ces étapes le rendrait inévitablement inefficace pour des types d'échantillons donnés. Le procédé de l'invention se caractérise encore par l'absence d'opérations de centrifugation pour la mise en oeuvre de ces trois étapes.

Pour permettre la mise en oeuvre d'un tel procédé, il convient de disposer d'un kit constitué d'au moins trois colonnes et d'une série de réactifs adaptés à chaque type de colonne. La première colonne, dite de lyse, est équipée d'une membrane de filtration, la deuxième colonne, dite de purification, est garnie d'une résine échangeuse d'ions, de préférence une résine anionique, tandis que la troisième colonne, dite de précipitation sélective, est garnie d'une membrane de filtration ou d'un gel apte à être imprégné d'un alcool, de préférence de l'isopropanol ou de l'éthanol, pour permettre la précipitation des acides nucléiques lorsqu'ils sont au contact de cet alcool. Les réactifs utilisés seront décrits plus en détail ci-après.

I1 convient également de disposer d'un appareil apte à faire circuler un fluide à travers une colonne sous l'action d'une pression exercée par le dessus de la colonne. Un tel appareil est par exemple commercialisé par la Société Pharmacia sous la marque Easy Prep System. Le principe de fonctionnement de cet appareil est décrit dans le brevet européen EP-A-0.495.066 dont le contenu peut être intégré à la présente demande. Cet appareil sert à effectuer des réactions biochimiques dans des plaques de microtitrage et comprend des moyens pour recevoir et supporter une plaque de microtitrage que l'on veut traiter, ladite plaque de microtitrage comportant une pluralité d'alvéoles et chaque alvéole étant pourvue d'un orifice de sortie de fond. Cet appareil comprend encore un dispositif pour appliquer une pression de gaz aux alvéoles de ladite plaque de microtitrage, le liquide placé dans les alvéoles étant alors évacué sous l'action de cette pression à travers les orifices de sortie de fond de chaque alvéole.

Ce dispositif pour appliquer une pression de gaz comprend, dans le cas de cet appareil, un élément formant plaque, mobile, possédant au moins la même longueur et la même largeur que ladite plaque de microtitrage, cette plaque mobile possédant un bourrelet gonflable qui est conçu pour relier de manière étanche un dispositif d'application de pression à la plaque de microtitrage afin de créer ainsi un espace d'application de gaz délimité par la plaque de microtitrage, le bourrelet gonflable et l'élément formant plaque. On est ainsi en mesure d'appliquer une pression sensiblement identique aux orifices d'entrée de toutes les alvéoles. Ce dispositif peut être déplacé d'une position dans laquelle il établit un contact étanche avec la plaque de microtitrage par l'intermédiaire du bourrelet gonflable et une position dans laquelle il laisse la partie supérieure de la plaque de microtitrage accessible de manière à permettre la réalisation d'autres opérations, telles que la distribution de fluides à l'intérieur desdites alvéoles, une incubation du contenu des alvéoles, etc. Cet appareil est également conçu de manière à pouvoir supporter au moins deux plaques de microtitrage superposées.

Ainsi, pour la mise en oeuvre du procédé, objet de l'invention, au moyen d'un appareil du type de celui décrit ci-dessus, en vue d'un traitement en parallèle d'une pluralité d'échantillons, on dispose chaque colonne nécessaire à une opération, telle que l'opération de lyse ou de précipitation ou de purification, dans une alvéole d'une plaque de microtitrage comportant une pluralité d'alvéoles dont le fond est pourvu d'orifices d'évacuation de fluide, les alvéoles de ladite plaque équipées d'une colonne étant susceptibles d'être soumises simultanément à une pression de gaz appliquée aux orifices d'entrée des alvéoles de la plaque de microtitrage afin d'expulser les liquides contenus dans lesdites colonnes par les orifices de sortie de fond de chaque alvéole. Les alvéoles de la plaque ne contenant pas de colonne peuvent être fermées au moyen d'un bouchon de manière à ne pas interférer sur l'action d'application de pression. L'utilisation de plaques de microtitrage permet de traiter en parallèle plusieurs échantillons. Parallèlement, l'application d'une pression par le dessus de ladite colonne permet de travailler en série et d'éviter toute reprise de phase de l'échantillon. Dans le cas où les colonnes sont disposées à l'intérieur d'alvéoles de plaques de microtitrage, les deux plaques de microtitrage sont superposées et les alvéoles des deux plaques sont alignées de façon que l'orifice de sortie d'une alvéole de la plaque supérieure se trouve audessus de l'orifice d'entrée d'une alvéole correspondante de la plaque de microtitrage sous-jacente afin de permettre à un liquide de passer de la colonne disposée dans une alvéole de la plaque supérieure à la colonne disposée dans l'alvéole de la plaque sous-jacente lorsque ladite pression de gaz est appliquée.

Outre cette pression, il est nécessaire de faire agir un fluide de transfert constitué d'un liquide se présentant sous forme d'un produit pur ou d'un mélange de produits, la composition de ce fluide de transfert variant en fonction de l'étape à réaliser et en particulier de la garniture équipant la colonne. Toutefois, à chaque étape, ce fluide de transfert agit sur la colonne du dessus pour faciliter la libération, par la garniture de la colonne, des constituants devant être isolés, en particulier des fragments d'ADN et/ou d'ARN sur la garniture de la colonne du dessous en coopérant avec cette dernière pour faciliter la fixation des constituants à isoler dans ladite garniture. Ces fluides de transfert seront décrits plus en détail ci-après. En conséquence, un tel fluide de transfert favorise soit la libération des constituants devant être isolés par la garniture équipant la colonne, soit la rétention par cette garniture des constituants devant être isolés.

Comme il a d'ores et déjà été précisé ci-dessus, pour se prévaloir d'un procédé de traitement d'échantillons universel, c'est-à-dire applicable à des échantillons simples ou complexes, ce procédé nécessite la mise en oeuvre d'au moins trois étapes, à savoir une étape de lyse, une étape de purification et une étape de précipitation sélective. En conséquence, pour l'étape de lyse, on dépose l'échantillon en entrée de la première colonne, dite colonne de lyse, garnie d'une membrane de filtration, on soumet ladite colonne à une pression par le dessus pour éliminer les fragments les plus petits de l'échantillon, on introduit, en entrée de ladite colonne, un réactif de lyse que l'on laisse agir pendant une période de temps prédéterminée, on ajoute un fluide de transfert, on dispose la colonne suivante, dite de purification, au-dessous de la colonne de lyse, on soumet la colonne de lyse à une pression suffisante appliquée par le dessus sur la colonne de manière à permettre le passage du fluide de transfert chargé en lysat de la colonne de lyse à la colonne de purification.

Les réactifs utilisés avec la colonne de lyse, y compris le fluide de transfert, sont constitués de solutions incorporant des agents chaotropiques et/ou des détergents et/ou des enzymes de dégradation. A titre d'exemple, le réactif de lyse utilisé est une solution de thiocyanate de guanidium tandis que le fluide de transfert est une solution tamponnée de Tris HC1, à un pH de 7,5.

La membrane de filtration garnissant la colonne est une membrane, par exemple en Nylon (marque déposée), dont la dimension des pores est comprise dans la plage [0,2 - 2,5 ,'mu. La quantité d'échantillon initiale nécessaire à l'ensemble des opérations devant être effectuées peut être faible, par exemple de l'ordre de 300 Ctl. Les pressions appliquées sont des basses ou des hautes pression. Par basse pression on entend des pressions < 0,3 bar. Par haute pression on entend des pressions 2 0,5 bar.

Chaque application de pression s'effectue pendant un temps suffisant pour assurer une élimination optimale des constituants liquides ou solides à éliminer du contenu de la colonne. La distribution des réactifs dans chaque colonne peut s'effectuer de manière automatique au moyen par exemple de pompes intégrées dans l'appareil. Lorsqu'une application de pression est effectuée en l'absence d'un liquide de transfert, le liquide expulsé de la colonne est recueilli dans un bac de collecte de déchets puis éliminé.

Une fois l'opération de lyse terminée, on effectue l'étape de purification. Pour ce faire, on laisse incuber dans la colonne, dite de purification, garnie d'une résine anionique, le liquide de transfert chargé en lysat pendant une durée suffisante pour permettre la fixation sélective des constituants du lysat à la résine, on soumet ladite colonne à une pression appliquée par le dessus pour éliminer les impuretés, on introduit dans ladite colonne une solution de lavage, on applique par le dessus à ladite colonne une pression apte à éliminer ladite solution de lavage, on répète cette même opération de lavage plusieurs fois, on dispose la colonne suivante dite de précipitation au-dessous de la colonne de purification, on ajoute une solution de transfert dans ladite colonne de purification, on soumet cette dernière à une pression appliquée par le dessus sur ladite colonne pour permettre le passage de la solution de transfert chargée en constituants de l'échantillon préalablement retenus par la résine dans la colonne de précipitation.

On note que, entre ces deux étapes, aucune opération de reprise en suspension d'un culot ou d'extraction d'un surnageant n'est nécessaire. Les deux étapes s'enchaînent parfaitement sans opération manuelle fastidieuse. Il suffit simplement, une fois que le transfert de l'échantillon de la colonne de lyse à la colonne de purification a été effectué, d'éliminer la plaque de microtitrage contenant l'ensemble des colonnes de lyse pour la remplacer par la plaque de microtitrage contenant l'ensemble des colonnes de purification. En conséquence, l'étape de purification est, de manière analogue à l'étape de lyse, effectuée au moyen d'une plaque de microtitrage équipée de plusieurs colonnes de purification de manière à permettre un traitement en parallèle d'un grand nombre d'échantillons. Dans l'étape de purification, la résine utilisée est de préférence une résine anionique.

Les réactifs utilisés en combinaison avec la colonne de purification sont constitués d'une solution de lavage, telle qu'une solution de Tris HCl pH 7,5 ; lM KCl et d'un fluide de transfert comprenant une base, telle que du Tris, du PBS complété par des sels de manière à obtenir une concentration saline et/ou un pH du fluide de transfert apte à assurer la libération des constituants de l'échantillon par la résine contenue à l'intérieur de la colonne.

L'étape de précipitation sélective est, de manière analogue aux étapes de lyse et de purification, effectuée au moyen d'une plaque de microtitrage équipée de plusieurs colonnes de précipitation de manière à permettre un traitement en parallèle d'un grand nombre d'échantillons. En pratique, pour l'étape de précipitation, on laisse incuber l'échantillon recueilli dans la colonne de précipitation pendant une période de temps prédéterminée suffisante pour permettre la précipitation dudit échantillon au contact du contenu de la colonne, on soumet ladite colonne à une pression appliquée par le dessus pour éliminer tout ce qui n'a pas été précipité, on ajoute en entrée de colonne un réactif à base d'alcool, on soumet ladite colonne à une pression appliquée par le dessus pour expulser le réactif alcoolique, on répète cette opération de lavage plusieurs fois, on ajoute une solution de transfert dans ladite colonne, on dispose un tube de collecte au-dessous de ladite colonne, on soumet la colonne à une pression appliquée par le dessus pour récupérer l'échantillon constitué d'acides nucléiques purifiés dans ledit tube de collecte.

La garniture utilisée pour la colonne de précipitation est de préférence en fibres de verre.

Les réactifs utilisés en combinaison avec cette colonne de précipitation sont constitués d'une part de solutions alcooliques, en particulier à base d'éthanol à des concentrations variables pour assurer un lavage des constituants retenus sur la garniture de la colonne, d'autre part d'un fluide de transfert constitué par un tampon d'élution à base d'eau ou d'une base telle que PBS,
Tris ou similaire. A titre d'exemple, ce fluide de transfert est constitué par un tampon TE (Tris 100 mM pH 7;
EDTA 50 mM).

Un protocole opératoire reprenant l'ensemble des étapes est décrit ci-dessous.

Etape 1 : lyse bactérienne 1. Dépôt de l'échantillon (300 p1) sur une colonne de lyse purgée à haute pression de manière à retenir les gros débris sur la membrane de ladite colonne.

2. Addition de 200 pl d'un réactif de lyse incorporant des agents chaotropiques.

3. Incubation hors de l'appareil à 55 C pendant 30 minutes.

4. Addition de 1,6 ml de fluide de transfert constitué d'une solution de Tris HCl pH 7,5, ce fluide assurant la remise en suspension des fragments d'acides nucléiques.

5. Incubation à température ambiante pendant 5 minutes.

6. Positionnement de la plaque de microtitrage incorporant l'ensemble des colonnes de lyse dans l'unité de traitement de l'appareil et la plaque de microtitrage incorporant l'ensemble des colonnes de purification au-dessous de la plaque de lyse.

7. Purge pendant 4 minutes à haute pression de la colonne de lyse en appliquant une pression par le dessus.

Etape 2 : étape de purification
Le lysat a été transféré sur la colonne de purification au cours de l'opération 7 de l'étape 1.

1. Incubation à température ambiante pendant 5 minutes pour permettre la fixation des constituants du lysat à la résine de la colonne.

2. Transfert de la plaque de microtitrage incorporant l'ensemble de ces colonnes de purification dans l'unité de traitement de l'appareil.

3. Purge à basse pression des colonnes.

4. Elimination des liquides recueillis.

5. Dépôt de 1 ml d'une solution de lavage telle qu'une solution Tris HCl pH 7,5 ; KCl lM.

6. Purge à basse pression des colonnes de purification.

7. Répétition pendant 3 fois de l'opération.

Parallèlement à cette étape 2, préparer la plaque de microtitrage équipée des colonnes de précipitation sélective en déposant dans chaque colonne 640 pl d'isopropanol.

8. Positionnement de la plaque de microtitrage équipée de colonnes de précipitation au-dessous de la plaque de microtitrage incorporant l'ensemble de colonnes de purification.

9. Addition de 800 pl de tampon d'élution constitué de Tris
HCl pH 8,5 ; KCl 1M dans chaque colonne de purification de la plaque de microtitrage du dessus.

10. Incubation à température ambiante pendant 1 minute.

11. Purge pendant 4 minutes à basse pression des colonnes de purification. Au cours de cette purge, les fragments d'acides nucléiques de l'échantillon sont transférés de la colonne de purification à la colonne de précipitation.

12. Elimination de la plaque de microtitrage contenant les colonnes de purification.

Etape 3 : étape de précipitation sélective 1. Incubation à température ambiante pendant 10 minutes de la plaque de microtitrage contenant les colonnes de précipitation sélective de manière à assurer la précipitation des acides nucléiques.

2. Purge des colonnes à haute pression pour éliminer l'isopropanol.

3. Dépôt dans chaque colonne de 1 ml d'éthanol à 100 % constituant une solution de lavage du précipité.

4. Purge de chaque colonne à haute pression.

5. Dépôt dans chaque colonne de 1 ml d'éthanol à 70 %.

6. Purge de chaque colonne à haute pression.

7. Dépôt dans chaque colonne de 100 pi d'un tampon d'élution à base d'eau de manière à permettre la reprise du précipité en solution.

8. Incubation du contenu des colonnes pendant 5 minutes à température ambiante, de préférence sous agitation.

9. Positionnement de la plaque porte-tubes de collecte audessous de ladite plaque de microtitrage comprenant l'ensemble des colonnes de précipitation.

10. Purge des colonnes de précipitation à haute pression de manière à récupérer les acides nucléiques à l'intérieur des tubes de collecte.

La mise en oeuvre de ces étapes nécessite 1 heure et demi de travail et peut permettre le traitement simultané d'au moins 24 échantillons.

Claims (10)

REVENDICATIONS

1. Procédé d'extraction d'acides nucléiques d'au moins un échantillon complexe en vue de l'isolement d'acides nucléiques purifiés à partir desquels tout type de technique de biologie moléculaire peut être mis en oeuvre tel que digestion, clonage, amplification génique, hybridation moléculaire ou similaire, du type comprenant une étape de lyse des cellules contenues dans ledit échantillon, une étape de purification de l'échantillon par lavages successifs et une étape de précipitation sélective en phase alcoolique des constituants de l'échantillon, au moins l'une de ces étapes étant conduite à l'intérieur d'une colonne équipée d'une garniture telle que membrane, filtre, matrice, résine ou similaire, caractérisé en ce que, depuis l'étape de lyse jusqu'à l'étape de précipitation sélective, on fait circuler l'échantillon à travers une série de colonnes équipées chacune d'une garniture spécifique au traitement devant être effectué, le passage de l'échantillon d'une colonne à une autre s'effectuant en disposant lesdites colonnes lune au-dessus de l'autre, en introduisant, en entrée de la colonne du dessus, un fluide de transfert, en exerçant, par le dessus de cette colonne, une pression, cette pression forçant le fluide de transfert, apte à se charger en constituants de l'échantillon au cours de sa circulation à travers la colonne, à sortir de ladite colonne et en récupérant, en entrée de la colonne du dessous, le liquide de transfert chargé expulsé de la colonne du dessus de telle sorte que toute reprise de phase de l'échantillon est évitée.

2. Procédé d'extraction selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on fait circuler l'échantillon à travers au moins trois colonnes, une première colonne dite de lyse équipée d'une membrane de filtration, une deuxième colonne dite de purification garnie d'une résine échangeuse d'ions, de préférence une résine anionique, et une troisième colonne dite de précipitation sélective garnie d'une membrane de filtration ou d'un gel imprégné d'un alcool, de préférence de l'isopropanol ou de l'éthanol.

3. Procédé d'extraction selon l'une des revendications 1 et 2, caractérisé en ce que, pour l'étape de lyse, on dépose l'échantillon en entrée de la première colonne, dite colonne de lyse, garnie d'une membrane de filtration, en ce qu'on soumet ladite colonne à une pression par le dessus pour éliminer les fragments les plus petits de l'échantillon, en ce qu'on introduit, en entrée de ladite colonne, un réactif de lyse que l'on laisse agir pendant une période de temps prédéterminée, en ce qu'on ajoute un fluide de transfert, en ce qu'on dispose la colonne suivante, dite de purification, au-dessous de la colonne de lyse, en ce qu'on soumet la colonne de lyse à une pression suffisante appliquée par le dessus sur la colonne de manière à permettre le passage du fluide de transfert chargé en lysat de la colonne de lyse à la colonne de purification.

4. Procédé d'extraction selon l'une des revendications 1 et 2, caractérisé en ce que, pour l'étape de purification, on laisse incuber dans la colonne, dite de purification, garnie d'une résine anionique, le liquide de transfert chargé en lysat pendant une durée suffisante pour permettre la fixation sélective des constituants du lysat à la résine, en ce qu'on soumet ladite colonne à une pression appliquée par le dessus pour éliminer les impuretés, en ce qu'on introduit dans ladite colonne une solution de lavage, en ce qu'on applique par le dessus à ladite colonne une pression apte à éliminer ladite solution de lavage, en ce qu'on répète cette même opération de lavage plusieurs fois, en ce qu'on dispose la colonne suivante dite de précipitation au-dessous de la colonne de purification, en ce qu'on ajoute une solution de transfert dans ladite colonne de purification, en ce qu'on soumet cette dernière à une pression appliquée par le dessus sur ladite colonne pour permettre le passage de la solution de transfert chargée en constituants de l'échantillon, préalablement retenus par la résine, dans la colonne de précipitation.

5. Procédé d'extraction selon l'une des revendications 1 et 2, caractérisé en ce que, pour l'étape de précipitation, on laisse incuber dans la colonne de précipitation l'échantillon recueilli pendant une période de temps prédéterminée suffisante pour permettre la précipitation dudit échantillon au contact du contenu de la colonne, en ce qu'on soumet ladite colonne à une pression appliquée par le dessus pour éliminer tout ce qui n'a pas été précipité, en ce qu'on ajoute en entrée de colonne un réactif à base d'alcool, en ce qu'on soumet ladite colonne à une pression appliquée par le dessus pour expulser le réactif alcoolique, en ce qu'on répète cette opération de lavage plusieurs fois, en ce qu'on ajoute une solution de transfert dans ladite colonne, en ce qu'on dispose un tube de collecte au-dessous de ladite colonne, en ce qu'on soumet la colonne à une pression appliquée par le dessus pour récupérer l'échantillon, constitué d'acides nucléiques purifiés, dans ledit tube de collecte.

6. Procédé d'extraction selon l'une des revendications 1 à 5, en particulier pour le traitement en parallèle d'une pluralité d'échantillons, caractérisé en ce qu'on dispose chaque colonne nécessaire à une opération, telle que l'opération de lyse ou de précipitation ou de purification, dans une alvéole d'une plaque de microtitrage comportant une pluralité d'alvéoles dont le fond est pourvu d'orifices d'évacuation de fluide, les alvéoles de ladite plaque, équipées d'une colonne, étant susceptibles d'être soumises, de préférence simultanément, à une pression de gaz appliquée aux orifices d'entrée des alvéoles de la plaque de microtitrage afin d'expulser les liquides contenus dans lesdites colonnes par les orifices de sortie du fond de chaque alvéole.

7. Kit pour l'extraction d'acides nucléiques purifiés d'au moins un échantillon complexe pour la mise en oeuvre du procédé selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce qu'il est constitué d'au moins trois colonnes, une première colonne dite de lyse équipée d'une membrane de filtration, une deuxième colonne dite de purification garnie d'une résine échangeuse d'ions, de préférence une résine anionique, et une troisième colonne dite de précipitation sélective garnie d'une membrane de filtration ou d'un gel apte à être imprégné d'un alcool, de préférence de l'isopropanol ou de l'éthanol, et d'une série de réactifs spécifiques à chaque colonne.

8. Kit selon la revendication 7, caractérisé en ce que les réactifs utilisés avec la colonne de lyse, y compris le fluide transfert, sont constitués de solutions incorporant des agents chaotropiques et/ou des détergents et/ou des enzymes de dégradation.

9. Kit selon la revendication 7, caractérisé en ce que les réactifs utilisés en combinaison avec la colonne de purification sont constitués d'une solution de lavage, telle qu'une solution de Tris HCl pH 7,5 ; KCl 1M, et d'un fluide de transfert comprenant une base, telle que du tris, du PBS, complétée par des sels de manière à obtenir des concentrations salines et/ou des pH des solutions spécifiques aptes à assurer la libération des constituants de l'échantillon par la résine contenue à l'intérieur de ladite colonne.

10. Kit selon la revendication 7, caractérisé en ce que les réactifs utilisés en combinaison avec la colonne de précipitation sont constitués d'une part de solutions alcooliques, en particulier à base d'éthanol à des concentrations variables, d'autre part d'un fluide de transfert constitué par un tampon d'élution à base d'eau ou d'une base telle que PBS, Tris, ou similaire.