FR2759296A1 - Complexe non-covalent comprenant au moins un anticorps et un element de liaison aux immunoglobulines associe a une substance active, son procede de preparation et ses applications - Google Patents
Complexe non-covalent comprenant au moins un anticorps et un element de liaison aux immunoglobulines associe a une substance active, son procede de preparation et ses applications Download PDFInfo
- Publication number
- FR2759296A1 FR2759296A1 FR9701420A FR9701420A FR2759296A1 FR 2759296 A1 FR2759296 A1 FR 2759296A1 FR 9701420 A FR9701420 A FR 9701420A FR 9701420 A FR9701420 A FR 9701420A FR 2759296 A1 FR2759296 A1 FR 2759296A1
- Authority
- FR
- France
- Prior art keywords
- antibody
- protein
- immunoglobulin
- covalent complex
- complex according
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/38—Antigens from snakes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/385—Haptens or antigens, bound to carriers
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
- A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
- A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
- A61K47/6811—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin
- A61K47/6817—Toxins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/42—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins
- C07K16/4283—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins against an allotypic or isotypic determinant on Ig
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
- A61K2039/6031—Proteins
- A61K2039/6056—Antibodies
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/62—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the link between antigen and carrier
- A61K2039/625—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the link between antigen and carrier binding through the biotin-streptavidin system or similar
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Mycology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
Abstract
Complexe non-covalent comprenant au moins un anticorps ou un fragment d'anticorps capable de se lier à une molécule exprimée à la surface d'une cellule et un élément de liaison aux immunoglobulines (Igs) , associé à une substance active, ledit complexe ayant une affinité spécifique vis-à-vis de cellules cibles appropriées. Compositions contenant lesdits complexes et leurs applicationsLedit complexe non-covalent comprend (i) au moins un anticorps ou un fragment d'anticorps capable de se lier à une molécule exprimée à la surface d'une cellule et (ii) un élément de liaison à une immunoglobuline ou à un fragment d'immunoglobuline, associé à une substance active, lequel élément de liaison ne peut se lier qu'à un seul type de site sur l'immunoglobuline.
Description
La présente invention est relative à un complexe non-covalent comprenant au moins un anticorps ou un fragment d'anticorps capable de se lier à une molécule exprimée à la surface d'une cellule et un élément de liaison aux immunoglobulines (Igs), associé à une substance active, ledit complexe ayant une affinité spécifique vis-à-vis de cellules cibles appropriées.
L'invention est également relative à des compositions contenant lesdits complexes et à leurs applications.
Le transport de molécules ou substances actives au niveau de sites biologiques particuliers, organes ou cellules cibles, confére à ces substances, une efficacité améliorée et une toxicité moindre, pour l'organisme. Un tel processus est dénommé ci-après ciblage et correspond au transport de la substance active vers son site d'action préférentiel.
On obtient, selon le type de substance active, des complexes immunogènes (substance active: antigène ou immunogène), des complexes cytotoxiques (substance active: drogue) ou des complexes d'expression permettant le transfert d'un gène dans une cellule cible et son expression dans cette cellule (substance active: fragment d'acide nucléique (ADN ou ARN)).
Des systèmes de ciblage ont déjà été proposés. Par exemple
- dans le cas où la substance active est un antigène, il a déjà été proposé d'améliorer la réponse immune in vivo, en intervenant notamment au niveau de la présentation de l'antigène aux cellules T par les cellules présentatrices d'antigènes (CPAg ou APC, pour Antigen Presenting Celte), telles que les cellules B, les cellules dendritiques ou les macrophages, notamment à l'aide de conjugués covalents, qui améliorent la réponse immune in vivo:
* conjugués covalents augmentant la reponse immune, en l'absence d'adjuvants :
- dans le Brevet US 5,283,323 au nom de Berzofsky et al., il a été proposé de cibler l'antigène vers le système immun, au niveau de la stimulation des cellules T, en utilisant comme composition immunogène, un conjugué covalent antigène-anticorps anti-Ig, qui se lie aux Igs de surface des cellules B.
- dans le cas où la substance active est un antigène, il a déjà été proposé d'améliorer la réponse immune in vivo, en intervenant notamment au niveau de la présentation de l'antigène aux cellules T par les cellules présentatrices d'antigènes (CPAg ou APC, pour Antigen Presenting Celte), telles que les cellules B, les cellules dendritiques ou les macrophages, notamment à l'aide de conjugués covalents, qui améliorent la réponse immune in vivo:
* conjugués covalents augmentant la reponse immune, en l'absence d'adjuvants :
- dans le Brevet US 5,283,323 au nom de Berzofsky et al., il a été proposé de cibler l'antigène vers le système immun, au niveau de la stimulation des cellules T, en utilisant comme composition immunogène, un conjugué covalent antigène-anticorps anti-Ig, qui se lie aux Igs de surface des cellules B.
Ce conjugué permet notamment d'obtenir la stimulation des cellules
T in vitro, avec des concentrations en antigène, inférieures d'un facteur dix par rapport à celles utilisées avec l'antigène seul
- dans la Demande européenne 245 078, au nom de Connaught
Laboratories Lim., un conjugué utilisable dans une nouvelle procédure d'immunisation in vivo est décrit et comprend un antigène couplé à un anticorps spécifique de la structure de surface des cellules présentatrices de l'antigène et notamment un anticorps anti-molécule du CMH de classe II. L'anticorps et l'antigène sont couplés par l'avidine et la biotine : les anticorps sont biotinylés et l'avidine est couplée à l'antigène.
T in vitro, avec des concentrations en antigène, inférieures d'un facteur dix par rapport à celles utilisées avec l'antigène seul
- dans la Demande européenne 245 078, au nom de Connaught
Laboratories Lim., un conjugué utilisable dans une nouvelle procédure d'immunisation in vivo est décrit et comprend un antigène couplé à un anticorps spécifique de la structure de surface des cellules présentatrices de l'antigène et notamment un anticorps anti-molécule du CMH de classe II. L'anticorps et l'antigène sont couplés par l'avidine et la biotine : les anticorps sont biotinylés et l'avidine est couplée à l'antigène.
De tels conjugués permettent d'augmenter l'immunogénicité des antigènes présentant naturellement une faible immunogénicité, et sont particulièrement intéressants pour les petits peptides.
* conjugues covalents augmentant la réponse immune, en présence d'acuvants:
- la Demande de Brevet Européen 243 333 au nom de KabiGen AB décrit un conjugué covalent antigène - protéine de liaison aux Igs (protéine de fusion), dans lequel la protéine de liaison aux IgGs est l'une des protéines suivantes : protéine
A, fragment Z de protéine A ou protéine G, pour permettre la production d'anticorps ou l'augmenter, toutefois, pour générer des anticorps, cette composition est émulsifiée dans l'adjuvant complet de Freund.
- la Demande de Brevet Européen 243 333 au nom de KabiGen AB décrit un conjugué covalent antigène - protéine de liaison aux Igs (protéine de fusion), dans lequel la protéine de liaison aux IgGs est l'une des protéines suivantes : protéine
A, fragment Z de protéine A ou protéine G, pour permettre la production d'anticorps ou l'augmenter, toutefois, pour générer des anticorps, cette composition est émulsifiée dans l'adjuvant complet de Freund.
* d'autres conjugues covalents on également été décrits : ils ne modifient pas la spécificité de l'anticorps et/ou l'activité du conjugué : le Brevet US 5,204,449 au nom de Puri, par exemple, décrit ainsi un conjugué antigène-anticorps comprenant au moins un antigène et au moins un anticorps ayant une spécificité pour le
CMH de classe I ou de classe II, dans lequel l'antigène et l'anticorps peuvent être couplés chimiquement comme suit: (i) I'anticorps monoclonal peut etre modifié par oxydation de ses carbohydrates; (ii) couplage à l'aide du système avidine-biotine, (iii) couplage d'un antigène possédant un groupe hydrazide et d'un anticorps monoclonal oxydé, porteur de groupes aldéhydes, (iv) couplage par l'intermédiaire de la protéine
A: dans ce cas, soit l'antigène est lié chimiquement à la protéine A qui présente une affinité pour la portion Fc de l'anticorps, ce qui permet une liaison de forte affinité protéine A-anticorps, avec un minimum de perte de l'activité de l'anticorps, soit l'antigène porteur d'un groupe hydrazide est lié chimiquement à la protéine A et l'anticorps est oxydé,
- dans le cas où la substance active est une drogue, notamment une toxine, de nombreux conjugués anticorps spécifiques d'un type de cellules-substance active (agent capable de détruire la cellule) ont été décrits. En général, un anticorps monoclonal est préparé de manière à avoir une spécificité pour un antigène présent à la surface de la cellule cible, de telle sorte que l'anticorps monoclonal se liera à la cellule cible et lorsqu'il sera incorporé dans ladite cellule, il transportera son conjugué toxique à l'intérieur de cette dernière. Outre la ricine, d'autres agents peuvent être incorporés dans les immunotoxines, on peut citer notamment, les toxines bactériennes, végétales ou animales (ou leurs fragments actifs), les atomes radioactifs et des agents utilisés en chimiothérapie anticancéreuse (substances chimiques telles que les anthracyclines, substances modifiant le métabolisme des cellules cancéreuses, telles que des séquences nucléotidiques exprimant une protéine et séquences nucléotidiques antisens). Dans tous les cas, les immunotoxines ainsi constituées, dirigent la substance active (la toxine ou l'anticancéreux) vers le domaine pathologique et conduisent ainsi à l'élimination des cellules cibles.
CMH de classe I ou de classe II, dans lequel l'antigène et l'anticorps peuvent être couplés chimiquement comme suit: (i) I'anticorps monoclonal peut etre modifié par oxydation de ses carbohydrates; (ii) couplage à l'aide du système avidine-biotine, (iii) couplage d'un antigène possédant un groupe hydrazide et d'un anticorps monoclonal oxydé, porteur de groupes aldéhydes, (iv) couplage par l'intermédiaire de la protéine
A: dans ce cas, soit l'antigène est lié chimiquement à la protéine A qui présente une affinité pour la portion Fc de l'anticorps, ce qui permet une liaison de forte affinité protéine A-anticorps, avec un minimum de perte de l'activité de l'anticorps, soit l'antigène porteur d'un groupe hydrazide est lié chimiquement à la protéine A et l'anticorps est oxydé,
- dans le cas où la substance active est une drogue, notamment une toxine, de nombreux conjugués anticorps spécifiques d'un type de cellules-substance active (agent capable de détruire la cellule) ont été décrits. En général, un anticorps monoclonal est préparé de manière à avoir une spécificité pour un antigène présent à la surface de la cellule cible, de telle sorte que l'anticorps monoclonal se liera à la cellule cible et lorsqu'il sera incorporé dans ladite cellule, il transportera son conjugué toxique à l'intérieur de cette dernière. Outre la ricine, d'autres agents peuvent être incorporés dans les immunotoxines, on peut citer notamment, les toxines bactériennes, végétales ou animales (ou leurs fragments actifs), les atomes radioactifs et des agents utilisés en chimiothérapie anticancéreuse (substances chimiques telles que les anthracyclines, substances modifiant le métabolisme des cellules cancéreuses, telles que des séquences nucléotidiques exprimant une protéine et séquences nucléotidiques antisens). Dans tous les cas, les immunotoxines ainsi constituées, dirigent la substance active (la toxine ou l'anticancéreux) vers le domaine pathologique et conduisent ainsi à l'élimination des cellules cibles.
- dans le cas où la substance active est une séquence nucléique, des conjugués covalents comprenant des anticorps dirigés contre la protéine d'enveloppe rétrovirale gp70 biotinylés et des conjugués anticorps dirigés contre des marqueurs cellulaires spécifiques biotinylés sont reliés par de la streptavidine et sont utilisés pour infecter des cellules par un rétrovirus recombinant, portant un gène recombinant, ont été, par exemple décrits (P. Roux et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, 86, 90799083).
Toutefois, les conjugués covalents de l'Art antérieur ne sont pas adaptés à n'importe quelle situation; en effet, il est intéressant de disposer d'une structure qui soit suffisamment souple pour pouvoir s'adapter à n'importe quelle substance active et à n'importe quelle cible, ce qui n'est pas le cas des conjugués covalents selon l'art antérieur.
C'est pourquoi la Demanderesse s'est donné pour but de pourvoir à un complexe non-covalent, apte à augmenter la concentration locale d'une molécule ou substance active au niveau de sa cellule cible, qui réponde mieux aux besoins de la pra tique que les conjugués covalents décrits dans l'art antérieur, notamment en ce qu'il constitue un système plus simple que les systèmes covalents de l'art antérieur, plus souple à mettre en oeuvre et est en outre plus stable au stockage, de tels complexes présentent, en effet, I'avantage sur les complexes covalents de l'art antérieur de pouvoir être mis en oeuvre, non seulement dans le domaine de l'immunologie (compositions immunogènes et vaccinantes) mais également dans d'autres domaines, tels que la cancérologie (compositions cytotoxiques) ou l'expression des protéines (compositions stimulants l'expression des transgènes) et dans tous les cas, d'agir uniquement au niveau de sa cible spécifique, de manière significative, à des doses inférieures à celles habituellement utilisées. En outre, de tels systèmes sont particulièrement adaptés, lorsque la substance active est une séquence d'ADN, associée à un vecteur vivant (bactérie, virus...).
La présente invention a pour objet un complexe non-covalent, caractérisé en ce qu'il comprend (i) au moins un anticorps ou un fragment d'anticorps, capable de se lier à une molécule exprimée à la surface d'une cellule et (ii) un élément de liaison à une immunoglobuline ou à un fragment d'immunoglobuline, associé à une substance active, lequel élément de liaison ne peut se lier qu'à un seul type de site ou région sur l'immunoglobuline (Ig), tel qu'un site Fc ou un site Fab.
Selon un mode de réalisation avantageux dudit complexe noncovalent, ledit anticorps est dirigé contre une molécule exprimée à la surface des cellules présentatrices de l'antigène (CPAg), sélectionnée dans le groupe constitué notamment par les molécules du complexe majeur d'histocompatibilité (CMH), les immunoglobulines, les récepteurs de la transferrine ou les récepteurs du mannose (macrophage).
Selon une disposition avantageuse de ce mode de réalisation, ledit anticorps est sélectionné dans le groupe constitué par les anticorps anti-molécule du
CMH de classe II, les anticorps anti-IgM et les anticorps anti-IgG dirigés contre la région F(ab')2 d'une Ig.
CMH de classe II, les anticorps anti-IgM et les anticorps anti-IgG dirigés contre la région F(ab')2 d'une Ig.
Selon un autre mode de réalisation avantageux dudit complexe noncovalent, ledit anticorps est dirigé contre une molécule exprimée à la surface de cellules cancéreuses.
Selon un autre mode de réalisation avantageux dudit complexe noncovalent, ledit anticorps ou fragment d'anticorps est dirigé contre une molécule exprimée à la surface des cellules mucosales ou des cellules musculaires.
Selon un autre mode de réalisation avantageux dudit complexe noncovalent, ledit anticorps ou fragment d'anticorps est apte à se lier aux cellules exprimant un récepteur Fc à leur surface.
De tels anticorps peuvent avantageusement être mis en oeuvre dans des complexes immunogènes selon l'invention.
Selon un autre mode de réalisation avantageux dudit complexe noncovalent selon l'invention, l'élément de liaison aux immunoglobulines est sélectionné dans le groupe constitué par des protéines ou des fragments de protéines de liaison aux immunoglobulines qui ne se lient que dans la région Fc d'une immunoglobuline (IgG,
IgM, IgA, IgE ou IgD, par exemple), et sont issus de bactéries. Ces protéines ou fragments de protéines peuvent être moins affins que la protéine A de Staphylococcus aureus, comme le fragment ZZ. Ces protéines ou fragments de protéines peuvent être un fragment de protéine A d'au moins huit aminoacides (P.K. Ray et al., Indian J.
IgM, IgA, IgE ou IgD, par exemple), et sont issus de bactéries. Ces protéines ou fragments de protéines peuvent être moins affins que la protéine A de Staphylococcus aureus, comme le fragment ZZ. Ces protéines ou fragments de protéines peuvent être un fragment de protéine A d'au moins huit aminoacides (P.K. Ray et al., Indian J.
Biochem. Biophys., 1995, 32, 372-377), des protéines ou fragments de protéines de type II, issus des streptocoques de groupe A, des protéines ou fragments de protéines de type III, issus de streptocoques de groupe C, de groupe G ou de groupe L, tel que la protéine G, de préférence recombinante ou un de ses fragments peptidiques, des protéines ou fragments de protéines de type IV, issus du streptocoque de groupe G bovin, des protéines ou fragments de protéines de type V ou de type VI, issus de
Streptococcus zooepidemicus ou toute autre protéine ou fragment de protéine, issus de bactéries, de protozoaires ou de virus et se liant dans la région Fc d'une Ig.
Streptococcus zooepidemicus ou toute autre protéine ou fragment de protéine, issus de bactéries, de protozoaires ou de virus et se liant dans la région Fc d'une Ig.
La protéine A comprend cinq domaines différents de liaison aux Igs, à savoir les domaines E, D, A, B, et C ((M. Uhlen et al., J. Biol. Chem., 1984, 259, 3, 1695-1702). Le fragment Z est dérivé du domaine B de la protéine A par substitution de la séquence Asn-Gly par la séquence Asn-Ala, le fragment ZZ comprend deux séquences Z. La liaison du fragment ZZ aux immunoglobulines a plus particulièrement été étudiée par U.K Ljungberg et al. (Mol. Immunol, 1993, 30, 4, 1279-1285) et notamment ses capacités de liaison et ses affinités, comparées à celles de la protéine A la constante d'affinité du fragment ZZ pour les IgG est de 4,8.10-8 M-l, déterminée par saturation et de 4,3.10- Ml, déterminée par compétition, alors que celle de la protéine
A est de 26.104 M-l, par saturation et de 25. to-s Ml, par compétition.
A est de 26.104 M-l, par saturation et de 25. to-s Ml, par compétition.
Le fragment ZZ présente un certain nombre d'avantages par rapport à la protéine A complète: bien qu'il présente une affinité significativement moindre pour le site Fc des IgG, d'environ un facteur 5, il permet d'obtenir un ciblage in vitro aussi efficace que celui qui serait obtenu, en présence de protéine A. De plus, et de manière surprenante, in vivo, bien que l'affinité de liaison du fragment ZZ pour les IgG soit faible, les IgG endogènes ne semblent pas perturber sa liaison avec l'anticorps antimolécule du CMH , en outre, du fait qu'il ne se lie qu'au site Fc, il ne déclenche pas les activités biologiques de la protéine A qui se lie à la fois au site Fc et au site Fab, telles que l'activation du complément et précipitation des anticorps en réseau (J.J. Langone,
Advances in Immunology, 1982, 32, en particulier les pages 211-215 , A. Grov et al.,
Acta Path. Microbiol. Scan. Sect. C, 1976, 84, 333-336 , C. Endresen, Acta Path.
Advances in Immunology, 1982, 32, en particulier les pages 211-215 , A. Grov et al.,
Acta Path. Microbiol. Scan. Sect. C, 1976, 84, 333-336 , C. Endresen, Acta Path.
Microbiol. Scan. Sect. C, 1979, 87, 185-189).
Bien que le fragment ZZ soit moins affin que la protéine A, il présente le même niveau de présentation, à concentration égale et il fournit un ciblage aussi efficace, il fonctionne donc in vivo, malgré une compétitivité possible avec les Ig endogènes.
La protéine G (type III) présente 3 domaines différents de liaison aux
Igs, à savoir les domaines A, B et C (M. Erntell et al., Mol. Immunol., 1988, 25, 2, 121-126, M. Eliasson et al., Mol. Immunol., 1991, 28, 10, 1055-1061).
Igs, à savoir les domaines A, B et C (M. Erntell et al., Mol. Immunol., 1988, 25, 2, 121-126, M. Eliasson et al., Mol. Immunol., 1991, 28, 10, 1055-1061).
Les protéines de liaison aux Ig, issues de bactéries de type II, IV, V ou VI et se liant préférentiellement dans la région Fc d'une Ig, sont plus particulièrement décrites dans Bacterial Immunoglobulins binding protéines, Vol 1, 1990,
Academic Press Inc., Ed. Michael D.P. Boyle, par exemple la protéine Arp des streptocoques de groupe A ou la protéine ss des streptocoques de groupe B se lient de préférence dans la région Fc des IgA, des fragments issus de Branhamella catarrhalis,
Haemophilus influenzae et des streptocoques de groupe A, B, C et D, se lient de préférence dans la région Fc des IgD.
Academic Press Inc., Ed. Michael D.P. Boyle, par exemple la protéine Arp des streptocoques de groupe A ou la protéine ss des streptocoques de groupe B se lient de préférence dans la région Fc des IgA, des fragments issus de Branhamella catarrhalis,
Haemophilus influenzae et des streptocoques de groupe A, B, C et D, se lient de préférence dans la région Fc des IgD.
Selon un autre mode de réalisation avantageux dudit complexe noncovalent selon l'invention, l'élément de liaison aux immunoglobulines est sélectionné dans le groupe constitué par des protéines ou des fragments de protéines de liaison aux immunoglobulines qui ne se lient que dans la région Fab d'une Ig (IgG, IgM, IgA, IgE ou IgD, par exemple) et sont issus de bactéries tels que la protéine L de Peptostreptococcus magn2ls, un fragment de protéine A comprenant au moins l'un des domaines suivants A, B, C, D et/ou E, la protéine G, de préférence recombinante ou un fragment de protéine G, la protéine P ou un fragment de protéine P de Clostridium perfringens, ou toute autre protéine ou fragment de protéine, issus de bactéries, de protozoaires ou de virus et se liant dans la région Fab d'une Ig.
La protéine L de Peptostreptococcus magnums se lie de préférence à la chaîne légère de la région Fab (B.H. Nilson et al., J. Biol. Chem., 1992, 267, 4, 22342239).
Ces différents fragments peptidiques sont notamment décrits dans l'ouvrage Bacterial Immu7l0globl(1i7?s binding proteins, 1990, précité.
Selon un autre mode de réalisation avantageux dudit complexe noncovalent selon l'invention, la substance active est sélectionnée dans le groupe constitué par les antigènes d'intérêt, les drogues et les fragments d'acide nucléique d'intérêt (ADN ou ARN).
Selon une disposition avantageuse de ce mode de réalisation, lorsque la substance active est un antigène ou un immunogène, le complexe non-covalent selon l'invention comprend (i) un anticorps ou un fragment d'anticorps dirigé contre une molécule exprimée à la surface d'une cellule présentatrice d'antigène, notamment un anticorps anti-molécule du CMH, un anticorps anti-IgM ou un anticorps anti-IgG dirigé contre la région F(ab')2 d'une Ig et (ii) un élément de liaison aux immunoglobulines tel que défini ci-dessus, associé à un antigène.
Selon une modalité avantageuse de cette disposition, ledit complexe comprend (i) un anticorps anti-molécule du CMII de classe II et (ii) une protéine ou un fragment d'une protéine de liaison au Fc des Ig, moins affin que la protéine A, notamment le fragment ZZ de protéine A conjugué à un antigène, de préférence sous la forme d'une protéine de fusion.
De manière surprenante, un complexe non-covalent ZZ-antigène/anticorps anti-molécule du CMII de classe II est suffisamment stable et entraîne
in vitro, une réponse immune avec des quantités d'antigène significativement inférieures à celles provoquant habituellement une réponse immune (stimulation des cellules T) , la diminution de la quantité d'antigène est comprise entre un facteur 102 (par rapport au conjugué ZZ-antigène ) et un facteur 105 (par rapport à l'antigène non conjugué), pour l'obtention d'un même niveau de réponse,
in vivo, la production d'anticorps et l'induction d'une réponse T, en l'absence d'un quelconque adjuvant, alors que cela n'est pas possible avec le conjugué
ZZ-antigène;
une relation entre la stimulation T il vitro et la production d'anticorps in vivo.
in vitro, une réponse immune avec des quantités d'antigène significativement inférieures à celles provoquant habituellement une réponse immune (stimulation des cellules T) , la diminution de la quantité d'antigène est comprise entre un facteur 102 (par rapport au conjugué ZZ-antigène ) et un facteur 105 (par rapport à l'antigène non conjugué), pour l'obtention d'un même niveau de réponse,
in vivo, la production d'anticorps et l'induction d'une réponse T, en l'absence d'un quelconque adjuvant, alors que cela n'est pas possible avec le conjugué
ZZ-antigène;
une relation entre la stimulation T il vitro et la production d'anticorps in vivo.
Selon une autre disposition avantageuse de ce mode de réalisation, lorsque la substance active est une drogue, le complexe non-covalent selon l'invention comprend (i) un anticorps ou un fragment d'anticorps dirigé contre une molécule exprimée à la surface d'une cellule cible (oc-foetoprotéine, pour les cellules cancéreuses, par exemple) et (ii) un élément de liaison aux immunoglobulines, tel que défini cidessus, associé à une drogue qui peut notamment être sélectionnée parmi les substances chimiques cytotoxiques, les toxines (animales, végétales ou bactériennes) et les séquences nucléotidiques anti-sens.
Selon encore une autre disposition avantageuse de ce mode de réalisation, lorsque la substance active est un acide nucléique, le complexe non-covalent selon l'invention comprend (i) un anticorps ou un fragment d'anticorps dirigé contre une molécule exprimée à la surface d'une cellule cible et (ii) un élément de liaison aux immunoglobulines, tel que défini ci-dessus, associé à un acide nucléique.
De tels complexes non-covalents présentent un certain nombre d'avantages par rapport aux conjugués covalents de l'art antérieur
- de manière générale, ils constituent des systèmes versatiles et souples, du fait que l'élément de liaison associé à la substance active peut être associé à n'importe quel anticorps, en fonction de l'application recherchée, ceci représente une grande différence par rapport aux systèmes covalents, plus rigides , en outre, ils présentent un plus grande stabilité au stockage et peuvent avantageusement se présenter en deux flacons séparés;
- ils permettent un ciblage efficace de la substance active pour augmenter la concentration locale de la substance active à un endroit donné et éventuellement son endocytose par une cellule cible,
- dans le cas où la substance active est un antigène ou un immunogène, le complexe non-covalent selon l'invention est apte 171 vitro : à stimuler les lymphocytes T auxiliaires spécifique dudit antigène et 177 vivo: à augmenter la réponse
T auxiliaire et à induire la production d'anticorps et la réponse T cytotoxique et ce, en l'absence d'adjuvant. L'augmentation de la stimulation des lymphocytes T auxiliaires peut dans certaines conditions d'injection induire leur anergie (stade de non-réponse) et diminuer, voire annuler une réponse immunitaire inappropriée, telle qu'une réaction allergique ou autoimmune);
- dans le cas où la substance active est une drogue, le complexe noncovalent selon l'invention est apte à améliorer le pouvoir cytotoxique de ladite drogue (action uniquement au niveau des cibles spécifiques et promotion de l'endocytose)
- dans le cas où la substance active est un acide nucléique, le complexe non-covalent selon l'invention est apte à améliorer l'expression des transgènes.
- de manière générale, ils constituent des systèmes versatiles et souples, du fait que l'élément de liaison associé à la substance active peut être associé à n'importe quel anticorps, en fonction de l'application recherchée, ceci représente une grande différence par rapport aux systèmes covalents, plus rigides , en outre, ils présentent un plus grande stabilité au stockage et peuvent avantageusement se présenter en deux flacons séparés;
- ils permettent un ciblage efficace de la substance active pour augmenter la concentration locale de la substance active à un endroit donné et éventuellement son endocytose par une cellule cible,
- dans le cas où la substance active est un antigène ou un immunogène, le complexe non-covalent selon l'invention est apte 171 vitro : à stimuler les lymphocytes T auxiliaires spécifique dudit antigène et 177 vivo: à augmenter la réponse
T auxiliaire et à induire la production d'anticorps et la réponse T cytotoxique et ce, en l'absence d'adjuvant. L'augmentation de la stimulation des lymphocytes T auxiliaires peut dans certaines conditions d'injection induire leur anergie (stade de non-réponse) et diminuer, voire annuler une réponse immunitaire inappropriée, telle qu'une réaction allergique ou autoimmune);
- dans le cas où la substance active est une drogue, le complexe noncovalent selon l'invention est apte à améliorer le pouvoir cytotoxique de ladite drogue (action uniquement au niveau des cibles spécifiques et promotion de l'endocytose)
- dans le cas où la substance active est un acide nucléique, le complexe non-covalent selon l'invention est apte à améliorer l'expression des transgènes.
Selon un autre mode de réalisation de l'invention, l'élément de liaison aux immunoglobulines est conjugué de manière covalente à ladite substance active.
Selon un autre mode de réalisation de l'invention, l'élément de liaison aux immunoglobulines est associé à ladite substance par l'intermédiaire d'un vecteur.
Selon une disposition avantageuse de ce mode de réalisation, ledit vecteur est sélectionné dans le groupe constitué par des bactéries, des virus, des particules virales coque vide , des liposomes et des microsphères polymériques.
La présente invention a également pour objet des compositions pharmaceutiques comprenant un complexe non-covalent selon l'invention et au moins un véhicule pharmaceutiquement acceptable. Parmi ces compositions, on peut citer
une composition immunogène ou une composition vaccinale comprenant un complexe non-covalent selon l'invention, dans lequel la substance active est un antigène ou un immunogène,
une composition cytotoxique comprenant un complexe noncovalent selon l'invention, dans lequel la substance active est une drogue, et
une composition d'expression comprenant un complexe noncovalent selon l'invention, dans lequel la substance active est une séquence d'acide nucléique.
une composition immunogène ou une composition vaccinale comprenant un complexe non-covalent selon l'invention, dans lequel la substance active est un antigène ou un immunogène,
une composition cytotoxique comprenant un complexe noncovalent selon l'invention, dans lequel la substance active est une drogue, et
une composition d'expression comprenant un complexe noncovalent selon l'invention, dans lequel la substance active est une séquence d'acide nucléique.
La présente invention a également pour objet un procédé de préparation d'un complexe non-covalent selon l'invention, caractérisé en ce qu'il comprend
la préparation d'un élément de liaison aux immunoglobulines, associé à une substance active et
l'incubation dudit élément de liaison aux immunoglobulines, associé à une substance active avec un anticorps capable de se lier à une molécule exprimée à la surface d'une cellule, de préférence entre 10 minutes et 3 heures.
la préparation d'un élément de liaison aux immunoglobulines, associé à une substance active et
l'incubation dudit élément de liaison aux immunoglobulines, associé à une substance active avec un anticorps capable de se lier à une molécule exprimée à la surface d'une cellule, de préférence entre 10 minutes et 3 heures.
Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions, qui ressortiront de la description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de mise en oeuvre du procédé objet de la présente invention ainsi qu'aux dessins annexés, dans lesquels:
- la figure 1 illustre la stimulation de cellules T (cellules dénommées T1B2) par la protéine de fusion ZZ-toxine a de Naja nigricollis (-Q-, -)-) ou la toxine a (-O-, -)-), en présence (complexe selon l'invention : ---, simple mélanges des différents éléments, la toxine a n'étant pas conjuguée à ZZ : --) ou en l'absence (-O-,-O-) d'anticorps anti-CMH de classe II, dénommés 14-4-4S, les dilutions en série des différentes protéines sont réincubées une nuit dans des puits à 40C, avec ou sans anticorps 14-4-4S et les cellules T1B2 et les CPAg sont alors ajoutées. Figure 1A : 5.105 splénocytes sont utilisés comme CPAg figure 1B : 5.104 cellules A20 sont utilisées comme CPAg. La stimulation des cellules T est appréciée par le biais de la sécrétion d'interleukine-2 (IL-2), déterminée par la prolifération d'une lignée cellulaires
T cytotoxique dépendante de l'IL-2 (test CTLL), en utilisant de la méthyl-3H thymidine, 5 Ci/mmole, CEA, France); les données sont exprimées en cpm (ordonnées) et correspondent à l'incorporation de thymidine tritiée dans les cellules : les figures 1A et 1B comprennent en abscisse les concentrations (,uM) en toxine a libre ou conjuguée à
ZZ (ZZ-toxine a).
- la figure 1 illustre la stimulation de cellules T (cellules dénommées T1B2) par la protéine de fusion ZZ-toxine a de Naja nigricollis (-Q-, -)-) ou la toxine a (-O-, -)-), en présence (complexe selon l'invention : ---, simple mélanges des différents éléments, la toxine a n'étant pas conjuguée à ZZ : --) ou en l'absence (-O-,-O-) d'anticorps anti-CMH de classe II, dénommés 14-4-4S, les dilutions en série des différentes protéines sont réincubées une nuit dans des puits à 40C, avec ou sans anticorps 14-4-4S et les cellules T1B2 et les CPAg sont alors ajoutées. Figure 1A : 5.105 splénocytes sont utilisés comme CPAg figure 1B : 5.104 cellules A20 sont utilisées comme CPAg. La stimulation des cellules T est appréciée par le biais de la sécrétion d'interleukine-2 (IL-2), déterminée par la prolifération d'une lignée cellulaires
T cytotoxique dépendante de l'IL-2 (test CTLL), en utilisant de la méthyl-3H thymidine, 5 Ci/mmole, CEA, France); les données sont exprimées en cpm (ordonnées) et correspondent à l'incorporation de thymidine tritiée dans les cellules : les figures 1A et 1B comprennent en abscisse les concentrations (,uM) en toxine a libre ou conjuguée à
ZZ (ZZ-toxine a).
- la figure 2 illustre la réponse en anticorps anti-toxine de souris
BALB/c, immunisées soit avec le conjugué ZZ-a libre (-O-) ou le complexe ZZ-a anticorps 14-4-4S (-p-). La protéine de fusion est incubée une nuit à 40C avec ou sans anticorps 14-4-4S. Des groupes de 4 souris sont alors immunisées par voie sous-cutanée, à la base de la queue, sans adjuvants. Les souris sont saignées 7, 14 et 26 jours après l'injection et la présence d'anticorps anti-toxine est évaluée, conformément par ELISA , cette figure comporte en ordonnée l'inverse du titre en anticorps et en abscisse, le nombre de jours.
BALB/c, immunisées soit avec le conjugué ZZ-a libre (-O-) ou le complexe ZZ-a anticorps 14-4-4S (-p-). La protéine de fusion est incubée une nuit à 40C avec ou sans anticorps 14-4-4S. Des groupes de 4 souris sont alors immunisées par voie sous-cutanée, à la base de la queue, sans adjuvants. Les souris sont saignées 7, 14 et 26 jours après l'injection et la présence d'anticorps anti-toxine est évaluée, conformément par ELISA , cette figure comporte en ordonnée l'inverse du titre en anticorps et en abscisse, le nombre de jours.
- la figure 3 illustre la réponse en anticorps anti-toxine de souris
BALB/c, immunisées soit avec la toxine a (-O-), soit avec la protéine de fusion ZZ-a (---). Des groupes de 4 souris sont immunisées par voie sous-cutanée, à la base de la queue, avec ces différentes protéines, préalablement mélangées avec de l'adjuvant de
Freund complet. Les souris sont saignées 14 et 21 jours après l'injection et la présence d'anticorps anti-toxine est évaluée par ELISA , cette figure comporte en ordonnée,
I'inverse du titre en anticorps et en abscisse, le nombre de jours.
BALB/c, immunisées soit avec la toxine a (-O-), soit avec la protéine de fusion ZZ-a (---). Des groupes de 4 souris sont immunisées par voie sous-cutanée, à la base de la queue, avec ces différentes protéines, préalablement mélangées avec de l'adjuvant de
Freund complet. Les souris sont saignées 14 et 21 jours après l'injection et la présence d'anticorps anti-toxine est évaluée par ELISA , cette figure comporte en ordonnée,
I'inverse du titre en anticorps et en abscisse, le nombre de jours.
- la figure 4 illustre les résultats obtenus dans les mêmes conditions que celles de la figure 1. Des complexes protéines A-toxine a et anticorps 14-4-4S ou un mélange toxine a, ZZ et anticorps 14-4-4S sont comparés à des complexes selon l'invention ZZ-a et anticorps 14-4-4S. La figure 4A illustre les résultats obtenus avec toxine a seule (-E1-), le mélange toxine a, ZZ et anticorps 14-4-4S (la toxine a et le composé ZZ ne sont pas conjugués, -E-), toxine a + protéine A + anticorps 14-4-4S ( O-) (la toxine a et la protéine A ne sont pas conjuguées), conjugué ZZ-a (--) et complexe selon l'invention ZZ-toxine Oc et anticorps 14-4-4S (-A-) : les antigènes sont incubés une nuit à 40C, puis les splénocytes (CPAg) et les cellules T1B2 sont ajoutés et incubés 24h à 37"C. La figure 4B illustre des essais du même type que ceux effectués à la figure 4A , toutefois, L'antigène est dans ce cas l'érabutoxine a (Ea). Cette figure illustre les résultats obtenus avec l'Ea seule (-a-), un conjugué ZZ-Ea (--), un complexe selon l'invention ZZ-Ea + anticorps 14-4-4S (-O-), un conjugué protéine A
Ea (-a-), un conjugué protéine A-Ea + anticorps 14-4-4S (-A-), dans les mêmes conditions que celles exposées pour la figure 4A.
Ea (-a-), un conjugué protéine A-Ea + anticorps 14-4-4S (-A-), dans les mêmes conditions que celles exposées pour la figure 4A.
- la figure 5 illustre les résultats obtenus, dans les mêmes conditions que celles exposées pour la figure 1, I'anticorps 14-4-4S étant remplacé par un anticorps anti-IgM , cette figure illustre la stimulation de cellules T (cellules dénommées Tir2) par la protéine de fusion ZZ-toxine a de Naja nigricollis (-O---) ou la toxine a (-E-, -I-), en présence (complexe selon l'invention : -a-, différents éléments en mélange : -a-) ou en l'absence (-O-,-E1-) d'anticorps anti-IgM (RAM-R); les dilutions en série des différentes protéines sont réincubées une nuit dans des puits à 4"C, avec ou sans anticorps RAM-u et les cellules T1B2 et les CPAg sont alors ajoutées (5.10S splénocytes). La stimulation des cellules T est appréciée par le biais de la sécrétion d'interleukine-2 (IL-2), déterminée par la prolifération d'une lignée cellulaires T cytotoxique dépendante de l'IL-2 (test CTLL), en utilisant de la méthyl-3H thymidine, 5
Ci/mmole, CEA, France), les données sont exprimées en cpm (ordonnées) et correspondent à l'incorporation de thymidine tritiée dans les cellules : en abscisse, sont représentées les concentrations (nM) en toxine a libre ou conjuguée à ZZ (ZZ-toxine a).
Ci/mmole, CEA, France), les données sont exprimées en cpm (ordonnées) et correspondent à l'incorporation de thymidine tritiée dans les cellules : en abscisse, sont représentées les concentrations (nM) en toxine a libre ou conjuguée à ZZ (ZZ-toxine a).
II doit être bien entendu, toutefois, que ces exemples sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'invention, dont ils ne constituent en aucune manière une limitation.
Exemple 1: Augmentation in vitro de la présentation aux cellules T par un complexe non-covalent selon l'invention ZZ toxine a et anticorps anti-CMH.
Matériel et méthodes
* Protéines et peptides synthétiques:
I'érabutoxine a et la toxine a ont été purifiées respectivement à partir des venins de Laticauaa semifasciata et de Naja nigricollis, comme décrit dans
Fryklund L. et al., 1975 (ref 28). La pureté de la toxine est vérifiée à l'aide d'une
HPLC en phase inverse.
* Protéines et peptides synthétiques:
I'érabutoxine a et la toxine a ont été purifiées respectivement à partir des venins de Laticauaa semifasciata et de Naja nigricollis, comme décrit dans
Fryklund L. et al., 1975 (ref 28). La pureté de la toxine est vérifiée à l'aide d'une
HPLC en phase inverse.
* Construct
Sambrok et al., 1989, Cold Spring Harbor, Molecular cloning, a laboratory manual,
Cold Spring Harbor Laboratory Press).
Cold Spring Harbor Laboratory Press).
Aussi bien les vecteurs de sécrétion que les vecteurs d'expression sont des vecteurs Pharmacia. Les protéines de fusion sont purifiées comme décrit dans
F. Ducancel et al., 1989, et L. Pillet et al., 1993, précités.
F. Ducancel et al., 1989, et L. Pillet et al., 1993, précités.
* Essai de stimulation des cellules T
Hybridomes de cellules T les différents antigènes sont dilués en série dans des puits de microculture et 5 104 d'hybridomes de cellules T1B2 sont ajou- tés par puits avec comme cellules présentatrices de l'antigène, soit 5.104 de cellules
A20, soit avec 5.105 splénocytes.
Hybridomes de cellules T les différents antigènes sont dilués en série dans des puits de microculture et 5 104 d'hybridomes de cellules T1B2 sont ajou- tés par puits avec comme cellules présentatrices de l'antigène, soit 5.104 de cellules
A20, soit avec 5.105 splénocytes.
Les cellules sont mises en culture 24 heures à 37"C dans une atmosphère humidifiée contenant 7 % de CO2.
La présence d'IL-2 dans les surnageants de culture des hybridomes de cellules T et les cultures en masse est évaluée en déterminant la prolifération d'une lignée de cellules T cytotoxique IL-2 dépendante, en utilisant la méthyle3H thymidine, 5 Ci/mmole. Les données sont exprimées en cpm, selon le protocole décrit en détail dans M. Léonetti (J. Immunol.,1990, 145, 4214).
* Cellules utilisées
- l'hybridome B produisant l'anticorps anti-CMH 14-4-4S a été obtenu par K. OZATO (J. IMMUNOL., 1980, 124, 533) et est disponible sous le n"
ATCC HB-32,
- le lymphome B, appelé A20, a été obtenu par K.J. Kim , la procédure suivie pour son obtention est décrite en détail dans J. Immunol., 1979, 122, 549 et est disponible sous le n" ATCC TIB-208,
- l'hybridome T, spécifique de la toxine a et de l'érabutoxine a, appelé Tir2, a été obtenu par B. Maillère , la procédure suivie pour son obtention est décrite en détail dans J. Immunol., 1993, 150, 5270.
- l'hybridome B produisant l'anticorps anti-CMH 14-4-4S a été obtenu par K. OZATO (J. IMMUNOL., 1980, 124, 533) et est disponible sous le n"
ATCC HB-32,
- le lymphome B, appelé A20, a été obtenu par K.J. Kim , la procédure suivie pour son obtention est décrite en détail dans J. Immunol., 1979, 122, 549 et est disponible sous le n" ATCC TIB-208,
- l'hybridome T, spécifique de la toxine a et de l'érabutoxine a, appelé Tir2, a été obtenu par B. Maillère , la procédure suivie pour son obtention est décrite en détail dans J. Immunol., 1993, 150, 5270.
Résultats
* Stimulation des lymphocytes T auxiliaires spécifiques de l'antigène in vitro
Un complexe non-covalent selon l'invention comprenant un conjugué
ZZ-toxine et un anticorps monoclonal 14-4-4S, qui reconnaît spécifiquement la substance I-Ed de classe II du complexe majeur d'histocompatibilité murin, est évalué pour sa capacité de présentation aux cellules T in vitro.
* Stimulation des lymphocytes T auxiliaires spécifiques de l'antigène in vitro
Un complexe non-covalent selon l'invention comprenant un conjugué
ZZ-toxine et un anticorps monoclonal 14-4-4S, qui reconnaît spécifiquement la substance I-Ed de classe II du complexe majeur d'histocompatibilité murin, est évalué pour sa capacité de présentation aux cellules T in vitro.
Comme illustré à la figure 1, une augmentation remarquable de la présentation aux cellules T de la toxine de fusion est observée. De manière plus précise, en utilisant des cellules A20 comme CPAg (figure 1A) le complexe ZZtoxine/14-4-4S est respectivement 102 et 105 fois plus puissant pour stimuler les cellules T1B2 par rapport à un conjugué ZZ-toxine incubé seul et à la toxine nonfusionnée.
Des résultats similaires sont obtenus en utilisant des splénocytes comme CPAg (figure 1B). On n'observe pas d'augmentation de l'immunogénécité lorsque la toxine non-fusionnée est incubée soit avec le domaine ZZ libre, soit avec l'anticorps 14-4-4S (figures 1A et B). Ces résultats montrent que l'augmentation importante d'immunogénicité observée avec le complexe selon l'invention ZZ-toxine et anticorps 14-4-4S est associée à une capacité de l'anticorps 14-4-4S à cibler le conjugué ZZ-toxine et donc la toxine elle-même vers la molécule de classe II du complexe majeur d'histocompatibilité.
Exemple 2: Production d'anticorps in vivo, en l'absence d'adjuvants, avec un complexe non-covalent selon l'invention ZZ toxine Oc et anticorps anti-CMH.
Matériel et méthodes
* Immunisation des souris
Pour l'évaluation de la réponse immune in vivo à la toxine Oc et au conjugué ZZ-a, on injecte à des souris BALB/c (IFFA CREDO, France), à la base de la queue, 100 pI d'une émulsion d'adjuvants de Freund complète contenant 0,5 nmole, soit de toxine a, soit de ZZ-a.
* Immunisation des souris
Pour l'évaluation de la réponse immune in vivo à la toxine Oc et au conjugué ZZ-a, on injecte à des souris BALB/c (IFFA CREDO, France), à la base de la queue, 100 pI d'une émulsion d'adjuvants de Freund complète contenant 0,5 nmole, soit de toxine a, soit de ZZ-a.
Des échantillons sanguins sont prélevés 14 et 21 jours après l'injection. Pour les expériences concernant les cellules T, les rates sont prélevées 10 jours après l'immunisation des souris.
Pour l'évaluation de la réponse anticorps contre le complexe 14-4 4SlZZ-a: on injecte à des souris BALB/c, à la base de la queue, 100 pI d'une solution de tampon phosphate 0,1 M, pH 7,2 contenant 0, 1 nmole de ZZ-a ou de complexe ZZ a 14-4-4S. Les échantillons sanguins sont prélevés 7, 14 et 26 jours après l'immunisation.
* Test de stimulation des cellules T
Le test est réalisé dans les mêmes conditions que celles exposées à l'exemple 1.
Le test est réalisé dans les mêmes conditions que celles exposées à l'exemple 1.
Toutefois dans ce cas, ce sont les cellules de souris immunisées qui sont utilisées (culture en masse) . le test réalisé correspond au protocole décrit dans M.
Léonetti et al. (J. Immunol., 1990, 145, 4214).
Plus précisément, les rates sont prélevées et mises en suspension dans un milieu de prolifération. Les cellules (106 cellules/puits) sont mises en culture pendant 24 heures à 37"C dans une atmosphère humide à 7 % de CO2 avec des dilutions en série d'antigènes.
La présence d'lL-2 dans les surnageants de culture en masse est évaluée en déterminant la prolifération d'une lignée de cellules T cytotoxique IL-2 dépendante, en utilisant la méthyle3H thymidine, 5 Ci/mmole. Les données sont expfl- mées en cpm, dans les conditions précisées ci-dessus.
* Titration en anticorps par immunoessai
Des plaques de microtitration ELISA sont recouvertes avec de la toxine native (0,1 Fg/puits) dans un tampon phosphate 0,05 M pH 7,4 et incubées une nuit à 4"C, puis saturées avec un tampon phosphate 0,1 M pH 7,4 contenant de la sérum albumine bovine à 0,3 %. Les antisérums sont dilués en série dans le même tampon contenant de la sérum albumine bovine à 0,1 % et incubés une nuit à 40C.
Des plaques de microtitration ELISA sont recouvertes avec de la toxine native (0,1 Fg/puits) dans un tampon phosphate 0,05 M pH 7,4 et incubées une nuit à 4"C, puis saturées avec un tampon phosphate 0,1 M pH 7,4 contenant de la sérum albumine bovine à 0,3 %. Les antisérums sont dilués en série dans le même tampon contenant de la sérum albumine bovine à 0,1 % et incubés une nuit à 40C.
La liaison des anticorps est évaluée en utilisant un conjugué anticorps de chèvre anti-souris-peroxydase et de l'acide 2,2',-azino-bis (3-éthylbenz-thiazoline-6sulfonique) (ABTS).
Le titre est défini comme étant la dilution de sérum la plus élevée donnant une différence d'absorbance par rapport au contrôle négatif supérieure ou égale à 0,6. Pour ce contrôle, on utilise un pool de sérums collectés avant l'immunisation des souris.
Résultats
* Augmentation de la réponse T et production d'anticorps in vives en l'absence d'adjuvants
L'anticorps 14-4-4S est incubé avec le conjugué ZZ-toxine et injecté à la souris BALB/c. Les immunisations sont réalisées en l'absence d'adjuvants. Une semaine après l'immunisation, une réponse immune est observée, qui augmente progressivement pendant les 3 semaines suivantes (figure 2).
* Augmentation de la réponse T et production d'anticorps in vives en l'absence d'adjuvants
L'anticorps 14-4-4S est incubé avec le conjugué ZZ-toxine et injecté à la souris BALB/c. Les immunisations sont réalisées en l'absence d'adjuvants. Une semaine après l'immunisation, une réponse immune est observée, qui augmente progressivement pendant les 3 semaines suivantes (figure 2).
Ce résultat est particulièrement intéressant du fait que (i) I'obtention d'une réponse immune en l'absence d'adjuvants n'est pas observée avec l'hybride ZZtoxine et (ii) la quantité de toxine fusionnée injectée dans le complexe non-covalent selon l'invention peut être diminué à 0,1 nmole/souris, une valeur qui est 5 fois plus faible que celle utilisée en présence d'adjuvants, comme illustré à la figure 3.
Il y a lieu de noter qu'à cette dose et en l'absence d'adjuvant, la toxine libre est encore létale et ne peut donc pas être utilisée comme référence dans cette expérience.
Exemple 3: Comparaison entre un complexe selon l'invention comprenant un fragment ZZ et un complexe comprenant de la protéine A
Les conditions sont identiques à celles exposées à l'exemple 1.
Les conditions sont identiques à celles exposées à l'exemple 1.
Les résultats sont illustrés à la figure 4, qui montre une augmentation remarquable de la présentation aux cellules T aussi bien de la toxine Oc (figure 4A) que de l'èrabutoxine a (figure 4B). De manière plus précise, en utilisant des splénocytes comme CPAg, le complexe ZZ-toxine/anticorps est plus puissant pour stimuler les cellules T1B2 qu'un conjugué ZZ-toxine incubé seul ou que la toxine libre. De façon surprenante, le complexe ZZ-Ea/anticorps est aussi efficace que le complexe protéine
A-Ea/anticorps, pour stimuler les cellules T1B2 (figure 4B). Les effets d'augmentation ne sont pas observés lorsque la toxine non fusionnée est incubée avec ZZ libre et l'anticorps 14-4-4S ou avec la protéine A libre et l'anticorps 14-4-4S (figure 4A). Ce dernier point indique, de plus, que l'augmentation de la stimulation T n'est pas due à un effet mitogène lié à la présence conjointe de la toxine libre, de ZZ et de l'anticorps, dans le milieu.
A-Ea/anticorps, pour stimuler les cellules T1B2 (figure 4B). Les effets d'augmentation ne sont pas observés lorsque la toxine non fusionnée est incubée avec ZZ libre et l'anticorps 14-4-4S ou avec la protéine A libre et l'anticorps 14-4-4S (figure 4A). Ce dernier point indique, de plus, que l'augmentation de la stimulation T n'est pas due à un effet mitogène lié à la présence conjointe de la toxine libre, de ZZ et de l'anticorps, dans le milieu.
Exemple 4: Augmentation in vitro de la présentation aux cellules T par un complexe non-covalent selon l'invention ZZ- toxine a et anticorps anti-IgM.
Les conditions sont identiques à celles exposées à l'exemple 1.
Les résultats sont illustrés à la figure 5. Comme on peut le voir sur cette figure, I'incubation d'anticorps de lapin anti-IgM z de souris (Produit Jackson), en présence de conjugué ZZ-a augmente considérablement le pouvoir T stimulant de la toxine. En effet, ce complexe est respectivement 45 fois et 800 fois plus efficace que le conjugué ZZ-a incubé seul et que la toxine a incubée seule.
Ainsi que cela ressort de ce qui précède, I'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes de mise en oeuvre, de réalisation et d'application qui viennent d'être décrits de façon plus explicite , elle en embrasse au contraire toutes les variantes qui peuvent venir à l'esprit du technicien en la matière, sans s'écarter du cadre, ni de la portée, de la présente invention.
Claims (2)
- 80) Complexe non-covalent selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que l'élément de liaison à une immunoglobuline ou à un fragment d'immunoglobuline est sélectionné dans le groupe constitué par des protéines ou des fragments de protéines de liaison aux immunoglobulines, qui ne se lient que dans la région Fc d'une immunoglobuline et qui sont issus de bactéries, tel qu'un fragment de protéine A d'au moins huit aminoacides, la protéine G, de préférence recombinante ou un de ses fragments peptidiques, ou toute autre protéine ou fragment de protéine, issus de bactéries, de protozoaires ou de virus et se liant dans la région Fc d'une Ig.9 ) Complexe non-covalent selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que l'élément de liaison aux immunoglobulines est sélectionné dans le groupe constitué par des protéines ou des fragments de protéines de liaison aux immunoglobulines qui ne se lient que dans la région Fab d'une immunoglobuline et sont issus de bactéries, telles que la protéine L de Peptostreptococcus magnus, un fragment de protéine A comprenant au moins l'un des domaines suivantsA, B, C, D et/ou E, la protéine G, de préférence recombinante ou un fragment de protéine G, la protéine P ou un fragment de protéine P de Clostriaium perfringens, ou toute autre protéine ou fragment de protéine, issus de bactéries, de protozoaires ou de virus et se liant dans la région Fab d'une Ig.10 ) Complexe non-covalent selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisé en ce que la substance active est sélectionnée dans le groupe constitué par les antigènes d'intérêt, les drogues et les fragments d'acide nucléique d'intérêt.11") Complexe non-covalent selon la revendication 10, caractérisé en ce que lorsque la substance active est un antigène ou un immunogène, il comprend (i) un anticorps ou un fragment d'anticorps dirigé contre une molécule exprimée à la surface d'une cellule présentatrice d'antigène, notamment un anticorps anti-molécule du CMH, un anticorps anti-IgM ou un anticorps anti-IgG dirigé contre la régionF(ab')2 d'une Ig et (ii) un élément de liaison aux immunoglobulines qui ne se lie qu'à un seul type de site de ladite immunoglobuline, associé à un antigène.12") Complexe non-covalent selon la revendication 11, caractérisé en ce qu'il comprend (i) un anticorps anti-molécule du CMII de classe II et (ii) une protéine ou un fragment d'une protéine de liaison au Fc des Ig, notamment le fragmentZZ de protéine A conjugué à un antigène, de préférence sous la forme d'une protéine de fusion.13 ) Complexe non-covalent selon la revendication 10, caractérisé en ce que lorsque la substance active est une drogue, il comprend (i) un anticorps ou un fragment d'anticorps dirigé contre une molécule exprimée à la surface d'une cellule cible (a-fQtoprotéine, pour les cellules cancéreuses, par exemple) et (ii) un élément de liaison aux immunoglobulines qui ne se lie qu'à un seul type de site de ladite immunoglobuline, associé à une drogue qui peut notamment etre sélectionnée parmi les substances chimiques cytotoxiques, les toxines (animales, végétales ou bactériennes) et les séquences nucléotidiques anti-sens.14") Complexe non-covalent selon la revendication 10, caractérisé en ce que lorsque la substance active est un acide nucléique, il comprend (i) un anticorps ou un fragment d'anticorps dirigé contre une molécule exprimée à la surface d'une cellule cible et (ii) un élément de liaison aux immunoglobulines qui ne se lie qu'à un seul type de site de ladite immunoglobuline, associé à un acide nucléique.15 ) Complexe non-covalent selon l'une quelconque des revendications 1 à 14, caractérisé en ce que l'élément de liaison aux immunoglobulines est conjugué de manière covalente à ladite substance active.16 ) Complexe non-covalent selon la revendication 15, caractérisé en ce que la substance active est associée à l'élément de liaison sous la forme d'une protéine de fusion.17 ) Complexe non-covalent selon l'une quelconque des revendications 1 à 14, caractérisé en ce que l'élément de liaison aux immunoglobulines est associé à ladite substance par l'intermédiaire d'un vecteur.18 ) Complexe non-covalent selon la revendication 17, caractérisé en ce que ledit vecteur est sélectionné dans le groupe constitué par des bactéries, des virus, des particules virales coque vide , des liposomes et des microsphères polymériques.19 ) Composition immunogène, caractérisée en ce qu'elle comprend un complexe non-covalent selon l'une quelconque des revendications 11, 12 et 15 à 18 et au moins un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
- 200) Composition vaccinale, caractérisée en ce qu'elle comprend un complexe non-covalent selon l'une quelconque des revendications 11, 12 et 15 à 18 et au moins un véhicule pharmaceutiquement acceptable.21 ) Composition cytotoxique, caractérisée en ce qu'elle comprend un complexe non-covalent selon l'une quelconque des revendications 13 et 15 à 18 et au moins un véhicule pharmaceutiquement acceptable.22 ) Composition d'expression, caractérisée en ce qu'elle comprend un complexe non-covalent selon l'une quelconque des revendications 14 à 18 et au moins un véhicule pharmaceutiquement acceptable.23 ) Composition selon l'une quelconque des revendications 19 à 22, caractérisée en ce que l'anticorps dirigé contre une molécule exprimée à la surface d'une cellule et l'élément de liaison aux immunoglobulines associé à une substance active sont dans des contenants séparés, préalablement à leur utilisation.24 ) Procédé de préparation d'un complexe non-covalent selon l'une quelconque des revendications 1 à 18, caractérisé en ce qu'il comprendla préparation d'un élément de liaison aux immunoglobulines, associé à une substance active etl'incubation dudit élément de liaison aux immunoglobulines, associé à une substance active avec un anticorps ou un fragment d'anticorps capable de se lier à une molécule exprimée à la surface d'une cellule, de préférence entre 10 minutes et 3 heures.
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR9701420A FR2759296B1 (fr) | 1997-02-07 | 1997-02-07 | Complexe non-covalent comprenant au moins un anticorps et un element de liaison aux immunoglobulines associe a une substance active, son procede de preparation et ses applications |
| PCT/FR1998/000227 WO1998034956A1 (fr) | 1997-02-07 | 1998-02-06 | Complexe non-covalent comprenant au moins un anticorps et un element de liaison aux immunoglobulines associe a une substance active, son procede de preparation et ses applications |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR9701420A FR2759296B1 (fr) | 1997-02-07 | 1997-02-07 | Complexe non-covalent comprenant au moins un anticorps et un element de liaison aux immunoglobulines associe a une substance active, son procede de preparation et ses applications |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FR2759296A1 true FR2759296A1 (fr) | 1998-08-14 |
| FR2759296B1 FR2759296B1 (fr) | 1999-04-09 |
Family
ID=9503455
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FR9701420A Expired - Fee Related FR2759296B1 (fr) | 1997-02-07 | 1997-02-07 | Complexe non-covalent comprenant au moins un anticorps et un element de liaison aux immunoglobulines associe a une substance active, son procede de preparation et ses applications |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| FR (1) | FR2759296B1 (fr) |
| WO (1) | WO1998034956A1 (fr) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2011092675A2 (fr) | 2010-02-01 | 2011-08-04 | Commissariat A L'energie Atomique Et Aux Energies Alternatives | Complexe moleculaire de ciblage des antigènes vers les cellules présentatrice d'antigène et ses applications pour la vaccination |
| EP1542729B1 (fr) * | 2002-09-16 | 2013-11-06 | Neovacs | Produit immunogene stable comprenant des heterocomplexes antigeniques |
| WO2014083499A1 (fr) | 2012-11-27 | 2014-06-05 | Commissariat A L'energie Atomique Et Aux Energies Alternatives | Méthode pour obtenir des anticorps humains spécifiques d'un antigène par immunisation in vitro |
| WO2021239996A1 (fr) | 2020-05-28 | 2021-12-02 | Commissariat A L'energie Atomique Et Aux Energies Alternatives | Complexe immunomodulateur et ses applications pour la thérapie |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU2003275473A1 (en) | 2002-10-08 | 2004-05-04 | Genencor International, Inc. | Phenolic binding peptides |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1983004026A1 (fr) * | 1982-05-11 | 1983-11-24 | Genefusion S.A. | Agent cytotoxique |
| EP0245078A2 (fr) * | 1986-05-06 | 1987-11-11 | Connaught Laboratories Limited | Augmentation de l'immunogénicité d'antigènes |
| WO1993022438A1 (fr) * | 1992-05-07 | 1993-11-11 | Microbiological Research Authority | La proteine l et son procede de preparation par la technologie de l'adn recombine |
| US5283323A (en) * | 1985-08-07 | 1994-02-01 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Method of producing immune response |
-
1997
- 1997-02-07 FR FR9701420A patent/FR2759296B1/fr not_active Expired - Fee Related
-
1998
- 1998-02-06 WO PCT/FR1998/000227 patent/WO1998034956A1/fr active Application Filing
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1983004026A1 (fr) * | 1982-05-11 | 1983-11-24 | Genefusion S.A. | Agent cytotoxique |
| US5283323A (en) * | 1985-08-07 | 1994-02-01 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Method of producing immune response |
| EP0245078A2 (fr) * | 1986-05-06 | 1987-11-11 | Connaught Laboratories Limited | Augmentation de l'immunogénicité d'antigènes |
| WO1993022438A1 (fr) * | 1992-05-07 | 1993-11-11 | Microbiological Research Authority | La proteine l et son procede de preparation par la technologie de l'adn recombine |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| LJUNDGBERG U. K. ET AL.,: "The interaction between different domains of staphylococcal protein A and human polyclonal IgG, IgA,IgM and F(ab)2: separation of affinity from specificity", MOL. IMMUNOLOGY, vol. 30, no. 4, - 1993, pages 1279 - 1285, XP002044845 * |
| ROUX P ET AL: "A VERSATILE AND POTENTIALLY GENERAL APPROACH TO THE TARGETING OF SPECIFIC CELL TYPES BY RETROVIRUSES: APPLICATION TO THE INFECTION OF HUMAN CELLS BY MEANS OF MAJOR HISTOCOMPATIBILITY COMPLEX MURINE LEUKEMIA VIRUS-DERIVED VIRUSES", PROCEEDINGS OF THE NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES OF USA, vol. 86, no. 23, 1 December 1989 (1989-12-01), pages 9079 - 9083, XP000081882 * |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1542729B1 (fr) * | 2002-09-16 | 2013-11-06 | Neovacs | Produit immunogene stable comprenant des heterocomplexes antigeniques |
| WO2011092675A2 (fr) | 2010-02-01 | 2011-08-04 | Commissariat A L'energie Atomique Et Aux Energies Alternatives | Complexe moleculaire de ciblage des antigènes vers les cellules présentatrice d'antigène et ses applications pour la vaccination |
| WO2014083499A1 (fr) | 2012-11-27 | 2014-06-05 | Commissariat A L'energie Atomique Et Aux Energies Alternatives | Méthode pour obtenir des anticorps humains spécifiques d'un antigène par immunisation in vitro |
| WO2021239996A1 (fr) | 2020-05-28 | 2021-12-02 | Commissariat A L'energie Atomique Et Aux Energies Alternatives | Complexe immunomodulateur et ses applications pour la thérapie |
| FR3110838A1 (fr) | 2020-05-28 | 2021-12-03 | Commissariat A L'energie Atomique Et Aux Energies Alternatives | Complexe immunomodulateur et ses applications pour la thérapie |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| FR2759296B1 (fr) | 1999-04-09 |
| WO1998034956A1 (fr) | 1998-08-13 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Brune et al. | Plug-and-Display: decoration of Virus-Like Particles via isopeptide bonds for modular immunization | |
| EP0057140B1 (fr) | Nouveau composé polypeptidique thiolé provenant d'un fragment de la toxine tétanique, son procédé d'obtention et ses applications | |
| WO1993009221A1 (fr) | Apport cible de vecteur viral dans des cellules de mammifere | |
| EP0206852A1 (fr) | Conjugué constitué d'une adhésine de paroi de Streptococcus mutans, de nature protéique et d'un polysaccharide de Streptococcus mutans, sa préparation et son utilisation notamment dans des vaccins anti-caries | |
| FR2955773A1 (fr) | Complexe moleculaire de ciblage des antigenes vers les cellules presentatrices d'antigene et ses applications pour la vaccination | |
| CA2349679A1 (fr) | Exosomes modifies et utilisations | |
| FR2766826A1 (fr) | Vecteurs derives d'anticorps pour le transfert de substances dans les cellules | |
| LU86711A1 (fr) | Anticorps monoclonaux a reaction croisee et protection croisee vis-a-vis des serotypes de p.aeruginosa | |
| FR2959416A1 (fr) | Utilisation d'anticorps anti-cd71 pour la preparation d'un medicament | |
| Kwak et al. | Cutting edge: liposomal formulation of a self lymphoma antigen induces potent protective antitumor immunity | |
| CA2224413C (fr) | Immunovecteurs utilisables pour le transport intracellulaire et intranucleaire | |
| FR2759296A1 (fr) | Complexe non-covalent comprenant au moins un anticorps et un element de liaison aux immunoglobulines associe a une substance active, son procede de preparation et ses applications | |
| CA2539172C (fr) | Procede a haut rendement pour l'obtention d'anticorps humains neutralisant l'activite biologique d'une cytokine humaine | |
| EP1124577B1 (fr) | Utilisation d'une proteine ompa d'enterobacterie, pour le ciblage specifique vers les cellules presentatrices d'antigenes | |
| CN113518923A (zh) | 用于脂质化蛋白质结构的制备的方法 | |
| EP0468049A1 (fr) | Anticorps monoclonaux reconnaissant un peptide associe a un antigene majeur d'histocompatibilite | |
| EP2556089B1 (fr) | Hemi-anticorps a auto-assemblage | |
| EP0065320A1 (fr) | Procédé de couplage d'un médicament avec un composé polypeptidique thiolé provenant d'un fragment de la toxine tétanique et ses applications | |
| FR2701710A1 (fr) | Conjugués protéiques, compositions les contenant et leurs applications en tant que médicament et réactif de diagnostic. | |
| FR2822846A1 (fr) | Procede de preparation et de selection d'anticorps | |
| JP2021523727A (ja) | 大核酸の細胞内標的指向送達 | |
| CA1270778A (fr) | Cellules hybrides secretant des anticorps anti- idiotypiques, anticorps monoclonaux secretes par lesdites cellules hybrides, leur preparation et leur application | |
| Tomita et al. | Recent advances in antigen-based generation of monoclonal antibodies | |
| EP1446484B1 (fr) | Sequence nucleotidique codant pour une proteine d interet modifié; vecteur d expression et procede d obtention | |
| FR2816060A1 (fr) | Procede d'identification de nouvelles molecules se liant au recepteur lox et utilisation de ces molecules |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| ST | Notification of lapse |