FR2726825A1 - Sequence nucleotidique hybridant specifiquement avec une sequence nucleique genomique de campylobacter fetus, application dans le diagnostic d'une infection a campylobacter fetus et comme outil epidemiologique - Google Patents

Abstract

La présente invention a pour objet une séquence nucléotidique qui hybride spécifiquement avec une séquence d'acide nucléique génomique de Campylobacter fetus. Elle est notamment choisie parmi les séquences nucléotidique SEQ ID no 1 et SEQ ID no 2, les séquences complémentaires respectives de celles-ci, ainsi que les séquences qui en diffèrent par mutation, insertion, délétion ou substitution d'une ou plusieurs bases. Des fragments de cette séquence peuvent être utilisés comme amorces spécifiques pour l'amplification de séquences spécifiques de Campylobacter fetus et comme sondes nucléiques spécifiques de séquences nucléiques de Campylobacter fetus. L'invention a également pour objet une méthode de détection de la présence de souches de Campylobacter fetus dans un échantillon biologique, ainsi qu'un kit pour la mise en oeuvre de la méthode.

Description

La présente invention se rapporte à une séquence nucléique spécifique de Campylobacter fetus, ainsi qu'aux applications de cette séquence en tant que sonde nucléotidique spécifique pour la détection de séquences de Campylobacter fetus ou de fragments de cette séquence comme amorces nucléotidiques pour l'amplification d'ADN ou d'ARN de Campylobacter fetus dans un échantillon biologique.

Les infections à Campylobacter sont très répandues dans le monde entier, affectant aussi bien l'homme que les animaux sauvages ou domestiques.

Bien que découvertes au début du vingtième siècle, les bactéries appelées actuellement Campylobacter furent longtemps méconnues, car leurs particularités rendaient leur identification et leur culture difficiles.

D'abord isolés chez les ovidés et les bovidés et appelés
Vibrio fetus puis, plus tard, Campylobacter fetus, ce n'est qu'à partir de 1946 que les premiers cas de campylobactérioses humaines ont été décrits, mais ce n'est qu'à partir de 1972, lorsque des milieux sélectifs pour Campylobacter ont commencé à être mis au point, que l'importance des infections à Campylobacter a pu être prouvée et reconnue.

Depuis la désignation de l'espèce type
Campylobacter fetus, une douzaine d'autres espèces et sous-espèces ont été découvertes, le nombre exact variant selon les auteurs et les méthodes taxonomiques, qui proposent souvent de nouveaux critères de classification.

Parmi ces espèces, les plus rencontrées en pathologie humaine et/ou animale sont Campylobacter jejuni, Campylobacter coli et Campylobacter fetus.

Depuis le début du siècle, l'espèce C. fetus est connue comme l'agent bactérien responsable de nombreux cas d'avortement chez les ovidés et les bovidés.

Cette bactérie est aussi responsable d'infections graves chez l'espèce humaine. Le premier cas d'infection chez l'homme a été décrit en 1947 : une femme enceinte de 6 mois a avorté à la suite d'une septicémie à C. fetus.

Cette espèce bactérienne a un tropisme pour le tissu placentaire, les conséquences de l'infection pour la mère sont limitées mais la mortalité foetale et néonatale est voisine de 80%. Les malades dont le système immunitaire ne fonctionne plus correctement sont aussi la cible de cette bactérie. La manifestation type est alors une septicémie accompagnée parfois par une infection localisée au niveau des méninges, du péritoine ou d'un site endovasculaire. Aux Etats-Unis, les septicémies à
C. fetus déclarées aux "Centers for Disease Control" sont presque aussi nombreuses que les septicémies à C. jejuni.

Les statistiques publiées par les CDC montrent que les septicémies à C. fetus sont trois fois plus nombreuses chez l'homme que chez la femme. D'autre part, il est maintenant reconnu que le SIDA est un facteur de risque pour les infections extra-intestinales à Campylobacter, et notamment pour les septicémies à C. fetus. I1 est important de noter que les bactériologistes estiment que le nombre d'infections à C. fetus est largement sousestimé du fait de la difficulté à identifier les différentes espèces de Campylobacter en général et C. fetus en particulier.Par exemple, beaucoup de laboratoires maintiennent les hémocultures seulement pendant une semaine, utilisent des milieux sélectifs contenant de la
Céphalothine et incubent les cultures à 42"C. Or la plupart des souches de C. fetus est sensible à la
Cephalothine et ne pousse pas à 42"C, d'autre part 3 à 25 jours de culture peuvent être nécessaires pour un isolement primaire dans le sang. Dans les deux épidémies à C. fetus d'origine alimentaire reportées aux Etats
Unis, les souches ont été fortuitement isolées car elles étaient thermotolérantes et ont pu pousser à 42"C, ce qui est exceptionnel pour C. fetus.

Comme C. jejuni, C. fetus peut être responsable d'infections intestinales qui, dans les cas les plus graves peuvent entraîner de fortes pertes hydriques, ce qui peut être particulièrement dangereux pour les enfants et les nourrissons, très sensibles à la déshydratation.

Cependant, l'entérite à C. fetus reste souvent sans complications et les diarrhées peuvent même céder spontanément au bout d'une semaine. Toutefois les coprocultures peuvent rester positives jusqu'à quelques semaines ou même quelques mois, et, dans 5 à 10t des cas des rechutes peuvent survenir. Un traitement et un suivi rigoureux s'imposent donc, surtout pour les sujets immunodéprimés ou ayant des maladies graves (SIDA, cirrhose du foie, cancer, leucémie, etc.), chez lesquels les Campylobacter peuvent se comporter comme des bactéries opportunistes. Utilisée à temps, la thérapie antibiotique intraveineuse permet de guérir efficacement les infections à C. fetus.

Chez les animaux, les Campylobacter vivent habituellement en commensaux dans le tube digestif de nombreuses espèces : bovins, ovins, porcs, volailles, oiseaux sauvages, chiens et chats. Ces animaux, malades ou porteurs sains, constituent un large réservoir de germes, et donc un risque important de contamination. Des cas d'infections évidentes, chez les bovins et ovins, peuvent avoir pour conséquence, outre l'effet sur le bétail, la transmission à l'homme à travers la dissémination des germes dans l'environnement des animaux (terre, eaux). Même pour des animaux asymptomatiques, "porteurs sains", la transmission à l'homme peut se faire : soit par contact direct avec ces animaux ou leurs déjections, soit par consommation d'aliments ou d'eaux souillés (viandes contaminées pendant leur préparation et mal cuites, lait non pasteurisé, eau polluée, etc.).

Dans une optique de prévention, il est important donc, tant chez l'homme que chez l'animal, de pouvoir identifier le pathogène C. fetus le plus tôt possible, afin d'empêcher, par des mesures adéquates, toute contamination. Ceci est particulièrement le cas dans l'industrie agro-alimentaire, où des conditions de stérilité doivent être respectées. C'est également important en pathologie humaine, pour effectuer un suivi correct des malades traités à la suite d'une infection à C. fetus, afin d'éviter toute nouvelle rechute.

Enfin, dans le cas d'infections déclarées, il est très important de bien identifier le germe responsable, et ceci rapidement après le déclenchement de la maladie, afin de pouvoir appliquer un traitement correct et efficace qui empêcherait l'évolution de l'infection, voire la propagation d'épidémies. Or, l'identification des Campylobacter et la détermination de l'espèce incriminée n'est pas aisée. En effet, leur isolement nécessite des milieux spéciaux et leur détection classique ne se fait actuellement qu'après un enrichissement par culture d'au moins 48 heures. Ceci est très long lorsqu'un diagnostic rapide est nécessaire. D'autre part, étant donné que le diagnostic microbiologique se fait actuellement par des techniques bactériologiques et/ou biochimiques qui exploitent des différences phénotypiques existant entre les différentes espèces, des erreurs de diagnostic peuvent se produire, surtout lorsque des mutants apparaissent pour un caractère donné. Dans le cas précis des Campylobacter, on utilise en routine l'hydrolyse de l'hippurate (C. jejuni peut l'hydrolyser alors que les autres ne le peuvent pas).

Cependant, le nombre de souches de C. jejuni trouvées hyppurate négatives augmente régulièrement; cette observation rend ce critère de moins en moins fiable pour distinguer les différents espèces du genre
Campylobacter.

D'autre part, puisqu'il existe des souches de
C. coli résistantes à l'acide nalidixique (5% en France), il est nécessaire d'utiliser d'autres caractéristiques pour différencier C. coli et C. fetus.

Des méthodes d'identification et de classification des Campylobacter ont été proposées, utilisant soit des sondes radioactives (Ng et al., Mol. Cell.

Probes, 1987, 1, 233-243), soit des sondes non radioactives (Chevrier et al., J. Clin. Microbiol., 1989, 22, 321-326), mais ces méthodes utilisent des sondes génomiques totales et nécessitent un enrichissement par culture du pathogène à détecter, car le seuil de détection est assez élevé, environ 105 bactéries (Chevrier et al., ci-dessus).

Des approches plus sensibles utilisant l'hybridation moléculaire pour identifier les espèces
C. jejuni et C. Coli ont été proposées, mais aucune sonde nucléique connue à ce jour n'est utilisable pour réaliser un test rapide et spécifique pour détecter C.

fetus dans un échantillon biologique.

Les inventeurs ont à présent isolé des séquences d'ADN spécifiques de Campylobacter fetus et ont développé à partir de ces séquences une méthode d'identification basée sur la technique PCR et la technique d'hybridation moléculaire. L'association de ces deux techniques permet d'atteindre un seuil de détection très bas, ce qui potentiellement permet de détecter et d'identifier une seule bactérie C. fetus dans un échantillon biologique.

La présente invention a ainsi pour objet une séquence nucléotidique qui hybride spécifiquement avec un acide nucléique génomique de Campylobacter et qui n'hybride pas dans des conditions habituelles avec un acide nucléique génomique d'autres Campylobacter ni avec un acide nucléique génomique de bactéries proches du genre Campylobacter.

La séquence nucléotidique est notamment choisie parmi la séquence nucléotidique SEQ ID n 1, la séquence SEQ ID N" 2, les séquences complémentaires respectives de celles-ci, ainsi que les séquences qui en diffèrent par mutation, insertion, délétion ou substitution d'une ou plusieurs bases.

Par "séquences qui en diffèrent par mutation, insertion, délétion ou substitution d'une ou plusieurs bases", on entend les séquences qui hybrident avec la séquence SEQ ID n" 1, SEQ ID n" 2 ou leurs séquences complémentaires dans les conditions de stringence habituelles définies par SAMBROOK J., FRITSCH E.F. et
MANIATIS T. (1989) : Molecular Cloning : A Laboratory
Manual, Ed. Cold. Spring Harbor Laboratory 9.47-9.62).

Ces conditions sont déterminées à partir de la température de stringence moyenne Tm.

De préférence, les séquences les plus avantageuses sont celles qui hybrident dans l'intervalle de température (Tm - 15"C) à (Tm -20QC).

L'invention a également pour objet un vecteur de clonage contenant une séquence nucléotidique telle que définie ci-dessus, notamment les plasmides pipo1 et p1GO2, déposées à la Collection Nationale de Culture de
Microorganismes (CNCM), Institut Pasteur, Paris, le 4 octobre 1994 sous les n" respectifs I-1479 et I-1480.

Les dépôts ont été faits conformément aux dispositions du Traité de Budapest.

Les séquences nucléotidiques définies cidessus peuvent être des séquences d'ADN ou des séquences d'ARN.

La taille exacte du fragment IGO1 de séquence
SEQ ID n 1 est de 965 pb.

Le fragment IG02 de séquence SEQ ID n 2 a une longueur de 1581 pb.

Ces séquences sont spécifiques de l'espèce
C. fetus et n'hybrident pas avec 8 autres espèces représentatives du genre Campylobacter.

Une interrogation des banques de données "Genebank" et "EMBL" n'a fait ressortir aucune homologie entre d'une part les séquences SEQ ID n 1 et SEQ ID n 2 et d'autre part les séquences d'ADN connues.

Les séquences SEQ ID n 1 et SEQ ID n 2, des parties ou des variants fonctionnellement équivalentes de celles-ci, peuvent être utilisés dans des techniques d'hybridation moléculaire pour la détection et l'identification de Campylobacter fetus.

Les variants fonctionnellement équivalents comprennent des séquences dans lesquelles des paires de bases ont été mutées, délétées, insérées ou substituées, sans que les propriétés essentielles à la spécificité de ces fragments soient affectées.

Les séquences nucléotidiques selon l'invention ont des applications diagnostiques et épidémiologiques en médecine humaine ou vétérinaire, notamment comme sondes nucléiques spécifiques de Campylobacter fetus ou comme amorces oligonucléotidiques pour l'amplification d'une séquence spécifique de Campylobacter fetus.

Les sondes selon l'invention comprennent avantageusement au moins 18 nucléotides consécutifs parmi les séquences ou les fragments de séquences mentionnés ci-dessus.

Les sondes sont des sondes d'ADN ou des sondes d'ARN.

Les séquences nucléotidiques décrites dans cette invention peuvent ainsi être utilisées comme sondes pour détecter spécifiquement et de manière directe des souches de Campylobacter fetus dans un échantillon biologique.

Les fragments IGO1 et IGO2 ont été marqués au 32P et utilisés comme sondes dans un test d'hybridation, suivant la technique de Southern, sur 9 espèces du genre
Campylobacter (C. jejuni, C. Coli, C. lari, C. fetus subsp. fetus, C. fetus subsp. venerealis, C. sputorum subsp. sputorum et C. feacalis) digérées par l'enzyme
Hind III. Comme prévu, une hybridation a été observée pour les deux sondes avec C. fetus. D'autre part, aucune hybridation n'est observée avec 1'ADN des autres espèces.

La sonde ioeî hybride sur plusieurs fragments : le nombre (entre 5 et 10) et la taille de ces fragments dépendent de la souche étudiée. La sonde IGO2 hybride avec un seul fragment dont la taille est comprise entre 1 et 2 kb. Ces observations permettent de conclure que les sondes IGO1 et IG02 sont spécifiques de l'espèce C. fetus et peuvent être utilisée dans un test d'identification comportant une hybridation moléculaire. De plus la sonde IGO1 est utilisable pour des expériences de typage moléculaire des souches appartenant à l'espèce C. fetus.

Les séquences non marquées peuvent être utilisées directement comme sondes, cependant les séquences sont généralement marquées par un élément radioactif (32p, 35S, 3H, 125I) ou par une molécule non-radioactive (biotine, acétylaminofluorène, digoxigénine, 5-bromodésoxyuridine) pour obtenir des sondes utilisables pour de nombreuses applications.

Dans ce dernier cas, on pourra utiliser l'une des méthodes de marquage décrites dans FR 2 422 956 et
FR 2 518 755. La technique d'hybridation peut être réalisée de manières diverses (Matthews, J.A. et Kricka,
L.J., Anal. Biochem. 1988, 169, 1-25). La méthode la plus générale consiste à immobiliser l'acide nucléique extrait des cellules de Campylobacter fetus sur un support (nitrocellulose, Nylon, polystyrène,...) et à incuber, dans des conditions bien définies, l'acide nucléique cible immobilisé avec la sonde. Après l'hybridation, l'excès de sonde est éliminé et les molécules hybrides formées sont détectées par la méthode appropriée (mesure de la radioactivité, de la fluorescence ou de l'activité enzymatique liée à la sonde...).

Dans une autre application, la sonde (ou les sondes dérivées) d'acide nucléique décrites ici peuvent être utilisées comme sondes de capture. Dans ce procédé, la sonde est immobilisée sur un support et sert à capturer par hybridation spécifique l'acide nucléique cible extrait de C. fetus. Si nécessaire, le support solide est séparé de l'échantillon et le duplex formé entre la sonde de capture et l'acide nucléique cible est ensuite détecté grâce à une seconde sonde de détection marquée par un élément facilement détectable.

Lorsqu'une quantité suffisante d'acide nucléique de Campylobacter fetus peut être extraite à partir des prélèvement à analyser, les séquences décrites dans le brevet sont utilisables pour détecter et identifier les souches appartenant à Campylobacter fetus directement dans ces prélèvements. Dans le cas contraire, une culture rapide en milieu liquide peut être réalisée avant l'extraction de l'acide nucléique de Campylobacter fetus, ou bien la petite quantité d'acide nucléique extraite de prélèvement peut être soumise à une technique d'amplification, comme par exemple la technique PCR, ou à toute autre système d'amplification enzymatique in vitro.

Les séquences SEQ ID n 1 et SEQ ID n 2 ou les fragments obtenus à partir de ces séquences peuvent également être utilisés pour sélectionner des amorces oligonucléotidiques, notamment pour la technique PCR.

Cette technique nécessite le choix de paires d'oligonucléotides encadrant le fragment qui doit être amplifié (brevet U.S. n 4 683 202). Ces amorces oligodésoxyribonucléotidiques ou oligoribonucléotidiques ont avantageusement une longueur comprise entre 18 et 30 et de préférence de 18 à 22 nucléotides. L'une des deux amorces est complémentaire du brin (+) de la matrice et l'autre amorce est complémentaire du brin (-). I1 est important que ces amorces ne possèdent pas de structure secondaire ou de séquence complémentaire l'une de l'autre.D'autre part, la longueur et la séquence de chaque amorce doivent être choisies de manière à ce que les amorces ne s'hybrident pas avec d'autres acides nucléiques provenant de cellules procaryotes ou eucaryotes, en particulier avec les acides nucléiques des
Campylobacter n'appartenant pas à l'espèce fetus et avec 1'ADN ou 1'ARN humain pouvant éventuellement contaminer le prélèvement.

Les amplimères sélectionnés comme amorces spécifiques pour l'amplification de séquences nucléiques de souches appartenant à Campylobacter fetus sont choisis par exemple en suivant la méthode décrite par Griffais et Coll. (Nucleic Acids Res. 1991, 19, 3887-3891).

A partir des séquences SEQ ID n 1 (IGO1),
SEQ ID n 2 (IG02), les inventeurs ont choisi des oligonucléotides pour réaliser un test PCR. Grâce à ces oligonucléotides, ils ont obtenu une amplification spécifique de Campylobacter fetus, aucune amplification n'était visible avec un acide nucléique d'autres Campylobacter, sus-cités, ni avec 1'ADN extrait des cellules suivantes :Escherichia coli, Helicobacter pylore
Helicobacter mustelae, Salmonella typhimurium, Wollinella curva, Enterococcus faecalis, Streptococcus agalaetiae,
Mycobacterium avium, Edwardsiella tarda, Citrobacter amalonaticus, Kiebsiella pneumoniae, Enterobacter asburiae, Acinetobacter lwoffii, Pasteurella multocida,
Vibrio harveyi, Serratia marcescens, Salmonella enterica subsp. salamae, Salmonella enterica subsp. diarizonae,
Bacillus anthracis, cellules humaines.

Un couple d'amorces tout particulièrement préféré est représenté par les oligonucléotides IG100 et IG101 issus de la séquence SEQ ID n 1, de séquences IG100 : sGCT AAG GGT GAG GTT GAT GGG 3 IG101 : 5 AAG TTA TTC TTC AAA TCT ACC 3
Un second couple d'amorces tout particulièrement préféré est représenté par les oligonucléotides IG200 et IG201, issus de la séquence SEQ ID n 2 de séquences.

IG200 : sCGC ACA AGG CGG AGT ACG TC In201 : sAGC AGG AAT GCC GCA TGC TG 3
Les fragments amplifiés peuvent être identifiés après une électrophorèse en gel d'agarose ou de polyacrylamide, ou après une électrophorèse capillaire, ou encore après une technique chromatographique (filtration sur gel, chromatographie hydrophobe ou sur échangeur d'ions). La spécificité de l'amplification peut être contrôlée par hybridation moléculaire en utilisant comme sondes les séquences nucléotidiques SEQ ID n 1 ou
SEQ ID n 2, des fragments de celles-ci, des plasmides contenant ces séquences ou des fragments de celles-ci, des oligonucléotides complémentaires de ces séquences ou fragments de séquences ou des produits d'amplification.

Ces sondes peuvent être marquées ou non par des éléments radioactifs ou par des molécules non radioactives.

La présente invention a également pour objet une méthode de détection de la présence des souches de
Campylobacter fetus dans un échantillon biologique, caractérisée par les étapes suivantes
i) mise en contact de l'échantillon biologique avec un couple de fragments oligonucléotidiques dits amorces, tels que définis précédemment, l'acide nucléique contenu dans l'échantillon ayant, le cas échéant, été préalablement rendu accessible à l'hybridation et dans des conditions permettant une hybridation des amorces à l'acide nucléique des souches appartenant à Campylobacter fetus
ii) amplification de l'acide nucléique des souches de Campylobacter fetus
iii) mise en évidence de l'amplification de fragments d'acide nucléique correspondant au fragment encadré par les amorces
iv) vérification éventuelle de la séquence du fragment amplifié, par exemple par hybridation de sonde spécifique, par séquençage ou par analyse de sites de restriction.

La présente invention a en outre pour objet un kit ou coffret pour la détection de la présence de souches appartenant à Campylobacter fetus dans un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'il comporte les éléments suivants
- un couple de fragments oligonucléotidiques tels que définis précédemment ;
- les réactifs nécessaires pour effectuer une amplification d'acide nucléique de souches appartenant à Campylobacter fetus
- éventuellement, un composant permettant de vérifier la séquence du fragment amplifié, plus particulièrement une sonde nucléique telle que définie précédemment.

Ce kit contient plus avantageusement la ou les sondes marquées ou non. Celles-ci peuvent être en solution ou immobilisées sur un support. Le kit peut également contenir les réactifs nécessaires pour la lyse des bactéries et ltextraction des acides nucléiques cibles, ainsi que les solutions d'hybridation et de lavage correspondant à la méthode choisie.

L'invention a également pour objet l'utilisation de la séquence SEQ ID n" 1 ou les séquences dérivées telles que définies ci-dessus comme outil épidémiologique, en épidémiologie moléculaire.

En effet, le fragment spécifique étant présent plusieurs fois sur le génome de C. fetus, sa répétitivité peut servir d'outil pour repérer et classer des souches identiques et, évidemment, pour établir des liens quant à la source et à la propagation de l'infection.

L'invention est illustrée plus en détail dans les exemples qui suivent, pour lesquels on se réfèrera aux figures annexées sur lesquelles
- la fig. 1 représente les résultats obtenus après amplification avec le couple d'amorces IG100 et IG101;
- la fig. 2 représente les résultats obtenus après amplification avec le couple d'amorces IG200 et IG201.

EXEMPLE 1 :
Construction de la banque génomique de
C. fetus. Criblage de la banque et détermination de la séquence du fragment spécifique
L'ADN génomique (200 ug) de la souche type
Campylobacter fetus sous-espèce fetus CIP 53.96T est digéré partiellement par l'endonucléase de restriction
Hind III (500 U d'enzyme) dans le tampon recommandé par le fournisseur pendant 1 heure à 37 C. L'ADN génomique ainsi digéré est séparé par électrophorèse sur gel d'agarose à 0,5%. Les fragments dont la longueur est comprise entre 30 et 40 kb sont électroélués et précipités en éthanol après extractions au phénol/chloroforme (1/1).

Le vecteur est le cosmide pHC79. I1 est digéré de la même manière et déphosphorylé pour éviter toute autoligation.

La ligation s'effectue en mélangeant 900 ng de vecteur et 670 ng de fragments d'ADN 30/40 kb, le mélange est laissé à 14"C pendant 18 heures après avoir ajouté 2,5 unités de T4-DNA ligase dans le tampon approprié.

Les cosmides recombinants sont encapsidés in vitro et utilisés pour transfecter les bactéries (E. coli
HB 101). Les bactéries transformées sont incubées 1 heure à 37"C en milieu LB, puis étalées sur milieu sélectif
Agar contenant 25 ,ug/ml d'ampillicine. Les colonies résistantes à l'ampicilline sont toutes testées pour leur sensibilité à la tétracycline, en effet le fragment d'ADN de 30/40 kb est inséré dans le vecteur de manière à inactiver le gène de résistance à la tétracycline (Tet) et à conserver le gène de résistance à l'ampicilline (Amp).

I1 est effectué une mini préparation d'ADN des 96 premières colonies résistantes à l'ampicilline (Ampr) et sensibles à la tétracycline (tels) selon la technique de la lyse alcaline. L'ADN de ces préparations est ensuite digéré par l'endonucléase de restriction Hind
III, analysé en électrophorèse sur gel d'agarose à 0,8%, puis transféré sur des filtres de Nylon. L'ADN est fixé de façon irréversible par 3 minutes d'exposition aux W à 254 nm.

Ces différents filtres sont incubés pendant 16-18 heures à 65oC dans un tampon 6X SSC (1X SSC correspond à 0,15M NaCl et 0,015M citrate de Na) contenant 10% de sulfate de dextrane, une solution de Denhardt 5X concentrée (une solution de Denhardt 1X correspond à 0,02% de Ficoll, 0,02% de polyvinylpyrrolidone et 0,02% d'albumine sérique bovine), l0mM EDTA, 0,5% de SDS, 100 pg/ml d'ADN dénaturé de sperme de saumon et 1'ADN génomique, radiomarqué au 32P par multipriming, de l'une des deux espèces suivantes : C. hyointestinalis CIP 103746T et C. fetus subsp. fetus CIP 53.96T.

Après hybridation, les filtres sont lavés 1 fois 5-15 minutes en 2X SSC à 65"C, 2 fois 15 minutes en 2X SSC + 0,1% SDS à 65"C et enfin 1 fois 15-30 minutes en 0,1X SSC à 65"C. Les filtres encore humides sont mis en autoradiographie à -80 C avec écran intensifiant de 15 minutes à 3 jours.

Les résultats de ces hybridations ont permis d'isoler deux clones cosmidiques : l'un (C35) contient un fragment d'environ 0,9 kb (fragment nommé IG01) et l'autre (C3) un fragment d'environ 1,7 kb (fragment nommé IG02). Ces fragments ont été clonés dans un vecteur pUC18 et préparés en grande quantité. Les plasmides résultant ont été dénommés pIGO1 et pIG02.

La spécificité des fragments a été vérifiée comme décrit dans l'exemple n 2.

Les fragments IGO1 et IG02 ont été clonés et séquencés selon la méthode de Sanger en utilisant la trousse de séquençage "T7 sequencing kit" (Pharmacia).

Toutes les réactions de séquençage ont été réalisées avec du dATP marqué au 35S.

Les séquences complètes des deux fragments sont représentées dans le listage joint à la description.

La comparaison entre les banques de données "Genebank" et "EMBL" et les 965 nucléotides du fragment IGO1 (séquence SEQ ID n" 1) et les 1581 nucléotides du fragment IG02 (séquence SEQ ID n" 2) ainsi déterminés, ne fait ressortir aucune homologie significative avec les séquences connues aujourd'hui.

EXEMPLE 2
Expériences d'hybridation moléculaire (technique de Southern) entre les ADN de différentes bactéries appartenant au genre Campylobacter et les séquences d'acide nucléique de l'invention
Après culture en atmosphère microaérophile sur milieu approprié (gélose au sang de mouton à 5%, Biomérieux), les Campylobacter sont traités de la manière suivante : les bactéries de chaque boîte de Petri sont récoltées avec 3 ml de tampon TE-100 (Tris-HCl pH 8 100 mM, EDTA 100 mM), centrifugées pendant 5 minutes à 5000 g, le culot est dispersé dans 8 ml de TE-100. A cette suspension, on ajoute 1 ml de TE-100 contenant 9 mg de lysozyme.Le mélange est incubé pendant 30 minutes à 37 OC. Un ml de SDS à 10% est ajouté, le mélange est incubé alors à 56"C pendant 30 minutes. Puis on ajoute 55 p1 d'une solution de protéinase K, le mélange est incubé à 56"C entre 5 et 10 minutes puis laissé à 37"C pendant une nuit. Les ARN sont éliminés en ajoutant 10 p1 de RNAse A (10 mg/ml) et en incubant le mélange pendant 30 minutes à 37"C. Enfin, les ADN sont extraits en utilisant un mélange phénol/chloroforme/alcool isoamylique (25:24:1) et précipités par l'éthanol. Les
ADN ainsi extraits subissent une digestion totale par l'enzyme Hind III. Les fragments obtenus sont ensuite séparés par électrophorèse sur gel d'agarose à 0,8% en
TAE avant d'être transférés sur membrane de Nylon selon la technique de Southern.

Les fragments transférés sont analysés par hybridation moléculaire. Dans cet exemple, nous avons utilisé comme sondes, séparément, le fragment IG01 et le fragment 1G02 obtenus après hydrolyse des plasmides pIGO1 et pIG02. pIGOl a été coupé par les enzymes Hind III et
Hae III, pIG02 a été digéré par l'enzyme Hind III. Les deux sondes ont été marquées par du 32p.

Les autoradiographies montrent que la sonde IGO1 détecte 5 à 10 fragments dans 1'ADN de l'espèce C.

fetus. Avec la même sonde, aucune hybridation n'est visible avec 1'ADN de différentes souches appartenant à d'autres espèces de Campylobacter même après 72 heures d'exposition.

La sonde IG02 détecte spécifiquement 1'ADN de l'espèce C. fetus (C. fetus subsp. fetus et C. fetus subsp. venerealis) et n'hybride pas sur les ADN génomiques d'autres Campylobacter. Un seul fragment dont la taille est voisine de 1,7 kb s'hybride avec la sonde IG02.

L'ensemble de ces résultats nous amène à conclure que les fragments IGO1 et IG02 sont utilisables pour le typage et pour la détection spécifique des bactéries appartenant à l'espèce C. fetus.

EXEMPLE 3
Amplification enzymatique in vitro de 1'ADN de C. fetus avec les amorces définies à partir des séquences d'acide nucléique faisant l'objet de l'invention.

Choix des amorces
I1 a été démontré que c'est essentiellement l'extrémité 3' des amorces oligonucléotidiques qui détermine la spécificité de la PCR (PCR Protocols,
M. Innis et col., Academic Press Inc.). I1 est donc important que cette région 3' soit parfaitement spécifique de la cible à amplifier.

Etant donné que le génome de Campylobacter présente un très faible pourcentage de guanine et cytosine (entre 28 et 38% de G+C), les inventeurs ont pensé que des amorces dont l'extrémité 3' était riche en
G+C pouvaient présenter un important degré de spécificité.

Ils ont recherché, à l'intérieur des séquences IGO1 et IG02, des zones riches en G+C et qui sont présentes une seule fois sur ces séquences. C'est à partir de ces régions que la séquence des amorces a été orientée et complétée de façon à obtenir une longueur d'environ 20 nucléotides.

Synthèse des amorces oligonucléotidiques
Les amorces dérivées de la séquence IGO1 et IG02 ont été synthétisées sur un automate "Cyclone Plus" (Millipore) basé sur la chimie des phosphoramidites.

Après la synthèse, la solution d'oligonucléotide est transférée dans un tube et incubée avec de l'hydroxyde d'ammonium concentré pendant 16 heures à 55 OC. L'oligonucléotide est précipité à l'éthanol, puis le culot est lavé avec de l'éthanol à 708 et séché. Finalement, le culot est repris dans 1 ml d'eau distillée stérile. La concentration de chaque amorce est déterminée au spectrophotomètre.

Amplification
La technique d'amplification enzymatique in vitro (PCR), est réalisée selon le protocole décrit par
Saiki et al. (Science, 1988, 239, 487-491) en utilisant les amorces oligonucléotidiques à la concentration de 10 pM, 30-100 ng d'ADN de différentes souches de Campylobacter et 0,5 unité de Taq polymérase dans un tampon contenant 25 mM de KC1, 20mM de Tris-HCl pH 8,5, 1,5 mM de MgCl2, 200 uM de désoxyribonucléotides triphosphates et 100 pg/ml d'albumine sérique bovine, le volume final de la réaction étant de 50 ul. Les paramètres des étapes de la PCR ont été choisis de la façon suivante : 5 minutes à 94"C, 1 minute à 50"C, 1 minute à 72"C (1 fois), puis 1 minute à 94"C, 1 minute à 50"C, 1 minute à 72"C (38 fois) et 1 minute à 94"C, 1 minute à 50"C, 5 minutes à 72 C (1 fois). Trente cycles sont ainsi réalisés en utilisant un appareil automatique. Après le dernier cycle, les échantillons sont maintenus à 4"C jusqu'à l'analyse.

Analyse électrophorétique sur un gel d'agarose des échantillons amplifiés
Dix p1 des échantillons amplifiés sont déposés sur un gel d'agarose à 2% dans un tampon TBE (0,04 M Tris-borate, 0,001M EDTA) contenant 1 pg/ml de bromure d'éthidium. Les fragments amplifiés sont visualisés sous UV et les gels sont photographiés en utilisant un film Polaroid 667.

Les figures 1 et 2 montrent les résultats des amplifications obtenus avec, d'une part, les amorces IG100 et IG101, et, d'autre part avec les amorces IG200 et In201 sur différents ADN de bactéries appartenant au genre Campylobacter ou à d'autres genres. Seul, 1'ADN des souches appartenant à l'espèce C. fetus donne un fragment dont la longueur correspond à la longueur théorique attendue avec ces couples d'amorces.

Il est important de noter que ces couples d'amorces permettent de détecter spécifiquement l'espèce
C. fetus; les isolats de malades et les échantillons biologiques infectés par C. fetus pourront donc être identifiés, rendant ainsi la méthode utilisable dans le domaine de la bactériologie clinique et en médecine vétérinaire.

LISTE DES SEOUENCES
I - INFORMATIONS GENERALES
(1) DEMANDEUR : Institut Pasteur
(2) TITRE DE L'INVENTION
Séquences nucléotidiques hybridant spécifi
quement avec une séquence nucléique génomique
de Campylobacter fetus, application dans le
diagnostic d'une infection à Campylobacter
fetus et comme outil épidémiologique.

(3) NOMBRE DE SEQUENCES : 6 II - INFORMATIONS POUR SEQ. ID N 1
CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE
TYPE : Nucléotide
LONGUEUR : 965 paires de bases
NOMBRE DE BRINS : double
CONFIGURATION : linéaire
TYPE DE MOLECULE : ADN
ORGANISME : Campylobacter fetus
NOM : IGO1
DESCRIPTION DE LA SEQUENCE GGCCTTTGAAGTTATTCTTCAAATCTACCTTAAGCACATCATTACCAGCACCACCATCTA
TCTTATCCCCAGGATTTAAAGTACTCTCAGCAGCAGTACCTACCACCCCACTAATAAGAT
CTCCACCCTCAGTACCAGTAATAGTATCATTCTCAGTAGTAAGAGCTATCTTATTTAAAC
CAGCCTCATCTATACTCTCTTTTAACCCATCAACCTCACCCTTAGCACTCTCAACACTAC
TACTATTACTAGTAACATTATTAATTATATCAACAGTC TTTTGTATTAAAGCATTTTGTT
GATCAGGAGTAAGACCATCAAGTGGAAGTTTAGCTATAGTATCAGCAACATAATTACTAA
CAATTACCTTATTATTAAATAGAn:TTGAT TAGC CCCAGCATTACTAGGATCTTTAGCAG
CATTCACGAAGTGTCCTACTAAATCAGCCTTACTTACTGTACCATTATCTAAAAGATCAA
CCCAATACTTAAGACCAGCTTTTGCTCATCACTAACAAACTCAGTTAAATTAACAGCATT
CTTAAATAAATGCTTTACAAACGACTCATTATTATTTAAAGTCTCGCCAAGAAAACTCTT
AGTAATATCTAAATTAAGTATAGCATTAGATGTC TCAATCATACCCCATCCATTAGC AC T
ACTCTCATTTACCCAATAAGTATTACCTTCACCCTCTGTAGGTCTTCCAAAAAGAACTAT
AAATAGCTCTGAAACTTCn;ATTTTGAAATCATACGAAC TCC TTAATAAAATAAAATAAA
ATCCAGACAAACAAACACTAACTAGTCTTATACTTTATTATTATACTTACAAGGTATCAA
AGAGTATTTGGTTTGTTTATTAGGAGTATTAAGC TATTT GTAAC TTTTATCCGATATAAT
TATGTTTATTAACATAATGAAGATAACATAATGTTTATTAACCGTATTAATGAATTAC A
AGCTT
III - INFORMATIONS POUR SEQ. ID N 2
CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE
TYPE : Nucléotide
LONGUEUR : 1581 paires de bases
NOMBRE DE BRINS : double
CONFIGURATION : linéaire
TYPE DE MOLECULE : ADN
ORGANISME : Campylobacter fetus
NOM : IG02
DESCRIPTION DE LA SEQUENCE AAGCTTATGGGAATGAGTGCGACTTTGTAAATTTGAGATAACTCCACCGCTTGCAATACC
GTTTTGTGTTAAAGCGATCTTAAAAAAAC TAAAATTTCCCAAAC TCCAAGCCAAAAAAGG
CTCTAAAAGTTCATCTGCTTTCTC m GCAAACTCCTATTTTGGTCTTTATACCGCTATT
TTTTAAAATTTGCTCACCGCCTTTTGCATTTTCGCTACTATCAATTGCCCCTATAATAAC
TTGCTTAAAACCAAGCTCTTTTAACAAATTCGCACAAGGCGGAGTACGTCCTTGATGTGA
GCAAGGTTCAAGCGTCACATAAGCAGTTGATCCATTTAGTAAATTTGAATGATTTTGCAT
TATGAAATTATAAAGTTCGTTTGTATCATTTATCTCGTCAAAATCTTGCTTAAAAGCCGG
ATTTTTCATCTCTAAAGCATATTTTATAGCGTTTAATTCAGCATGCGGCATTCCTGCTTT
TTCATGAGCATTTATCGATAAAATTI'CAC CATTTTTACC TGTTATAACACATC CCAC GGc
AGGATTAGGATACGTAAGAAACTGAAACTCCCATGC TTTATTTATAGC TATATTCATATA
ATATTCATTACACATCTTAATCTTTCTTTTATAAAATCAATTC C TTATTATAGTCAATTT
GCAATTAAAAGCTACCTTAAACGGTAGTTTTGATTCTC TCTAGCTAATTTTTGCATCTCT
TCAAAATTCTGCTTACTTAACCATAAAAGTTCGTCGAATTTAAATC CAAGCATAAC TATA
CGATAGAGCTCTGGTTTGTTTTTCTTCCAATTATATAAAGTTTTTACATCAATTTTAAGG
ATACCTGCCATATCTCTTTTGCTTAGCTTTCTTTCCATAATCGTTCCTTGAAATATAAAA
ACAAAATTTATCAAAAATTACCATCTTTTGCAACAAAGAAAATATTACTATATATTATAA
TAAATCCATAGAAATATTACTATGTTTTATTTTAATAGACAAATGTATATATTTATAAAA
AATTGAGACTAGAAAAAAGGTGCAAAATTATGGAGTACATAATATATTGCGAAAGTATCT
GTGGAGAAAAAAGATACTTTATGATTCAAGACAAATTTAGCACTTTACCATACATAGTAA
GGAATAGCGGAATCATATATAAAGTAATAAAATACATGAAAATAAACGAAAAAAATATAG
AAAATGAAATTATGGAAAAGGTTTACCACCCAAACTGCTTTTTTTACGATATAAACACTC
TTTATGCAGAGAAAAATTCATGGCAAAAAGTTGAGTGGTAAACTACCACTCCATATAGGT
TTTAGCCTTCTTTATATTTTCAAATTTGAC TTCAATTGATTCATTATTTTTGATATTTAT
ACATATATTATCATCTTTTACGGATACTATC TTACCTTTAATC TCGGTC TTATCATTTAG
TATAATTTTAGCAAATTCGCCTATACTAAGCGTAAAATGTTC TATTTTACTAAGTTTTCT
CTCAAGCCCAGGGCTTGAAACCTCTAAAATCCACTCTCCGCTTACTGGCGGCATTACATC
GTAAATAGGAGAAAGAAGCTT
IV - INFORMATIONS POUR SEQ. ID N 3
CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE
TYPE : Nucléotide
LONGUEUR : 21 bases
NOMBRE DE BRINS : simple
CONFIGURATION : linéaire
TYPE DE MOLECULE : oligonucléotide
ORGANISME : Campylobacter fetus
NOM : IG100
DESCRIPTION DE LA SEQUENCE IG100 : 5 GCT AAG GGT GAG GTT GAT GGG 3
V - INFORMATIONS POUR SEQ.ID N 4
CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE
TYPE : Nucléotide
LONGUEUR : 21 bases
NOMBRE DE BRINS : simple
CONFIGURATION : linéaire
TYPE DE MOLECULE : oligonucléotide
ORGANISME : Campylobacter fetus
NOM : IG101
DESCRIPTION DE LA SEQUENCE
IG101 : 5 AAG TTA TTC TTC AAA TCT ACC 3
VI - INFORMATIONS POUR SEQ. ID N 5
CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE
TYPE : Nucléotide
LONGUEUR : 20 bases
NOMBRE DE BRINS : simple
CONFIGURATION : linéaire
TYPE DE MOLECULE : oligonucléotide
ORGANISME : Campylobacter fetus
NOM : IG200
DESCRIPTION DE LA SEQUENCE IG200 : 5CGC ACA AGG CGG AGT ACG TC 3
VII - INFORMATIONS POUR SEQ. ID N 6
CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE
TYPE : Nucléotide
LONGUEUR : 20 bases
NOMBRE DE BRINS : simple
CONFIGURATION : linéaire
TYPE DE MOLECULE : oligonucléotide
ORGANISME : Campylobacter fetus
NOM : IG201
DESCRIPTION DE LA SEQUENCE IG201 : 5 AGC AGG AAT GCC GCA TGC TG 3

Claims (13)

REVENDICATIONS

1. Séquence nucléotidique qui hybride spécifiquement avec un acide nucléique génomique de Campylobacter fetus et qui n'hybride pas dans les conditions habituelles avec un acide nucléique genomique d'autres

Campylobacter ni avec un acide nucléique génomique de bactéries proches du genre Campylobacter.

2. Séquence nucléotidique selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle est choisie parmi les séquences nucléotidiques SEQ ID n 1 et SEQ ID n" 2, les séquences complémentaires respectives de celles-ci, ainsi que les séquences qui en diffèrent par mutation, insertion, délétion ou substitution d'une ou plusieurs bases.

3. Sonde nucléique spécifique des acides nucléiques de Campylobacter fetus, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins 18 nucléotides consécutifs choisis parmi les séquences nucléotidiques selon la revendication 1 ou 2.

4. Sonde nucléique spécifique des acides nucléiques de Campylobacter fetus selon la revendication 3, caractérisée en ce qu'elle est choisie parmi la séquence nucléotidique SEQ ID n 1, la séquence nucleotidique SEQ ID n 2, les séquences complémentaires de celles-ci, ainsi que les séquences qui en diffèrent par mutation, insertion, délétion ou substitution d'une ou plusieurs bases.

5. Sonde nucléique selon la revendication 3 ou 4, caractérisée en ce qu'elle est immobilisée sur un support et utilisée comme sonde de capture.

6. Couples d'amorces oligonucléotidiques spécifiques pour l'amplification d'une séquence nucléique de Campylobacter fetus, caractérisés en ce qu'ils comprennent des paires d'oligonucléotides ayant de 18 à 30 nucléotides, de préférence 18 à 22 nucléotides choisis parmi les séquences selon la revendication 1 ou 2.

7. Couples d'amorces oligonucléotidiques spécifiques pour l'amplification d'une séquence nucléique de Campylobacter fetus selon la revendication 6, caractérisé en ce qu'ils sont constitués par les paires oligonucléotidiques de séquences IG100 : 5 GCT AAG GGT GAG GTT GAT GGG 3 IG101 : 5 AAG TTA TTC TTC AAA TCT ACC 3 IG200 : 5 CGC ACA AGG CGG AGT ACG TC IG201 : 5 AGC AGG AAT GCC GCA TGC TG 3

8.Fragment d'acide nucléique obtenu en amplifiant un acide nucléique de C. fetus par une technique d'amplification génique, notamment par la technique PCR au moyen d'un couple d'amorces oligonucléotidiques selon la revendication 6 ou la revendication 7.

9. Vecteur de clonage caractérisé en ce qu'il contient une séquence nucléotidique selon la revendication 1 ou 2.

10. Plasmides déposes à la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes sous les n I-1479 et I-1480.

11. Méthode de détection de la présence de

Campylobacter fetus dans un échantillon biologique, caractérisée par les étapes suivantes

a) mise en contact de l'échantillon biologique avec un couple d'amorces selon la revendication 6 ou 7, l'acide nucléique de Campylobacter fetus contenu dans l'échantillon biologique ayant, le cas échéant, été rendu préalablement accessible à une hybridation, et dans des conditions permettant une hybridation des amorces a l'acide nucléique appartenant à Campylobacter fetus

b) amplification de l'acide nucléique appartenant à Campylobacter fetus

c) mise en évidence de l'amplification de fragments d'acide nucléique de Campylobacter fetus correspondant au fragment encadré par les amorces

d) vérification éventuelle de la séquence du fragment amplifié.

12. Kit de détection de la présence de Campylobacter fetus dans un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'il comprend les éléments suivants

- un couple d'amorces selon la revendication 6 ou 7

- les réactifs nécessaires pour effectuer une amplification d'un acide nucléique de Campylobacter fetus

- éventuellement un composant permettant de vérifier la séquence du fragment amplifié, plus particu lièrement une sonde nucléique selon l'une des revendications 3 à 5.

13. Utilisation de la séquence nucleotidique

SEQ ID n" 1 ainsi que de la séquence complémentaire de celle-ci et des sequences qui en diffèrent par mutation, insertion, délétion ou substitution d'une ou plusieurs bases comme outil épidémiologique pour repérer et classer des souches de Campylobacter fetus.