FR2664704A1 - Procede de detection d'une substance biologique dans un milieu liquide selon une technique de filtration permettant de retenir la substance biologique sur des particules ne traversant pas le filtre. - Google Patents
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Abstract
Procédé de détection d'une substance biologique utilisant une technique de filtration sur membrane. Un premier ligand, par exemple un anticorps, reconnaissant ladite substance est fixé sur des particules solides ne traversant pas la membrane. Un second ligand reconnaissant la substance est fixé sur un polymère, par exemple de petites particules capables de traverser la membrane. Un agent traceur est fixé sur les petites particules ou incorporé dans les petites particules: par exemple, il s'agit de petites particules colorées ou fluorescentes. On introduit dans un conteneur muni de la membrane un échantillon liquide à examiner, les petites et les grosses particules. Lorsqu'on établit le vide à l'extérieur du conteneur, le liquide passe à travers la membrane mais les petites particules restent fixées aux grosses particules si la substance biologique recherchée est présente.
Description
La présente invention a pour objet un procédé de détection et /ou de dosage dtune substance dans un milieu liquide selon une méthode utilisant une technique de filtration.
La demande de brevet internationale WO 87/03690 décrit un système de détection comprenant un premier ligand immobilisé par fixation sur des particules solides, un second ligand marqué avec un agent traceur, et un dispositif de séparation par filtration des phases liquides et solides, les particules ayant des dimensions suffisantes pour être retenues par le filtre. Si la substance recherchée est présente, elle se fixe sur les particules grâce au premier ligand, et elle est donc retenue sur la phase solide. Sa présence peut alors être révélée grâce au second ligand marqué.
La présente invention a pour objet un procédé de détection ou de dosage utilisant une technique de filtration, dans lequel le second ligand et l'agent traceur sont fixés sur un polymère qui est constitué soit de petites particules capables de traverser la membrane, soit d'un polymère linéaire soluble. Un tel système facilite la standardisation des fabrications, puisque le second ligand et l'agent traceur peuvent être fixés séparément sur le polymère. En outre, l'utilisation de petites particules sur lesquelles est fixé le second ligand permet notamment de faciliter la lecture lorsque ces particules sont colorées ou fluorescentes. Le procédé de l'invention est adaptable à des dispositifs permettant une automatisation totale des tests de détection ou de dosage.
La présente invention a donc pour objet un procédé de détection et/ou de dosage d'au moins une substance biologique dans un milieu liquide la contenant ou susceptible de la contenir, dans lequel on met en contact, dans un conteneur muni d'une membrane filtrante, ledit milieu liquide d'une part avec au moins un premier ligand fixé sur un support solide, ledit premier ligand ayant une affinité pour ladite ou l'une desdites substances biologiques, et ledit support solide ayant des dimensions suffisantes pour être retenu par la membrane, et d'autre part avec au moins un second ligand ayant une affinité pour ladite ou l'une desdites substances biologiques, ledit second ligand étant lié à un agent traceur, l'ensemble second ligand-agent traceur étant capable de traverser la membrane, on laisse incuber pendant un temps suffisant pour permettre la formation des complexes entre les ligands et la substance biologique si elle est présente, on élimine le milieu liquide par filtration à travers la membrane et on détecte ou dose selon les techniques usuelles l'agent traceur éventuellement retenu sur la membrane, caractérisé par le fait que ledit second ligand est fixé sur un polymère sur lequel est également fixé ou dans lequel est incorporé ledit agent traceur.
Le support solide sur lequel est fixé le premier ligand est constitué de particules solides, ces particules ayant des dimensions suffisantes pour être retenues par la membrane filtrante. Dans ce qui suit, ces particules sont parfois appelées "grosses particules".
Selon un premier mode de réalisation, le polymère sur lequel est fixé le second ligand est constitué de petites particules solides ayant des dimensions suffisamment faibles pour pouvoir traverser la membrane filtrante. L'agent traceur est fixé sur lesdites petites particules ou incorporé dans celles-ci.
Les petites et les grosses particules peuvent être réalisées en un matériau polymère hydrophobe, et préparées notamment selon la technique connue de polymérisation en émulsion. On peut régler la taille des particules, de façon connue, en faisant varier la proportion d'amorceur de polymérisation et/ou en ajoutant un agent tensioactif.
Les ligands peuvent être fixés sur les particules par adsorption, ou encore par établissement d'une liaison covalente, éventuellement par l'intermédiaire d'un bras espaceur, selon les méthodes connues.
On peut utiliser notamment des particules comportant en surface des groupements fonctionnels réactifs permettant la fixation par covalence du ligand ou d'un agent de couplage bifonctionnel possédant un autre groupement réactif capable de réagir avec le ligand avec formation d'une liaison covalente.
On peut utiliser des particules ayant un coeur polymère hydrophobe, par exemple en polystyrène, et comportant en surface des groupements aldéhyde, par exemple grâce à une couche de poly-(formyl styrène), de telles particules pouvant être obtenues selon un procédé consistant à effectuer la polymérisation en émulsion aqueuse d'un monomère hydrophobe tel que le styrène, pour former des particules constituant le coeur, puis à ajouter à l'émulsion aqueuse contenant les particules de coeur un second monomère comportant un substituant formyle, tel que le formyl-styrène, de façon à former sur les particules de coeur une couche superficielle polymère contenant des groupements formyle qui permettent de fixer ultérieurement, sur les particules, des ligands aminés, par formation d'une base de Schiff puis réduction éventuelle de la double liaison du groupement imine de la base de Schiff.Un tel procédé est décrit dans la demande de brevet français déposée par la Société demanderesse le 18 Juin 1990 sous le n" 90.07591.
On peut également utiliser des particules comportant en surface des bras hydrophiles terminés par un groupement aldéhyde. De telles particules peuvent être obtenues par exemple selon un procédé décrit dans la demande de brevet français nO 2.634.023.
Un des avantages de l'utilisation du second ligand fixé à des petites particules est de pouvoir utiliser des petites particules colorées ou fluorescentes, l'agent traceur étant alors constitué par l'agent colorant ou l'agent fluorescent fixé sur les particules ou incorporé dans lesdites particules. La détection ou le dosage est particulièrement aisé dans ce cas.
Comme agent colorant, on peut utiliser par exemple le colorant orange commercialisé par ICI sous la dénomination WAXOLINE Orange EP/FW constitué par le colorant Solvent Yellow 14 (n" 12055) et le colorant bleu commercialisé par ICI sous la dénomination WAXOLINE Blue AP/FW constitué par le colorant Solvent Blue 36 (n" 61551).
Comme agent fluorescent, on peut utiliser par exemple le diphénylhexatriène (DPH).
La réalisation de particules marquées avec un agent colorant ou un agent fluorescent est connue en soi ; voir par exemple le brevet US nO 4419453.
Les grosses particules sur lesquelles le premier ligand est fixé peuvent également être des particules colorées et sont alors d'une couleur différente de celle des petites particules. Bien entendu, dans le cas où l'on utilise deux types de particules colorées, les colorations seront choisies pour présenter un contraste suffisant facilitant la lecture.
Les dimensions des petites particules et des grosses particules peuvent etre variables, à condition de choisir un filtre dont les dimensions des pores sont telles que les grosses particules sont retenues tandis que les petites particules ne le sont pas. Généralement, les petites particules ont des dimensions inférieures à 0,5 jim, et en particulier des dimensions inférieures à 0,2 pm. Les grosses particules ont généralement des dimensions supérieures à 0,5 pm, et en particulier des dimensions au moins égales à 1 pm.
Selon un autre mode de réalisation, le polymère sur lequel sont fixés le second ligand et l'agent traceur est un polymère linéaire soluble dans le milieu. Parmi ces polymères linéaires, on citera notamment les polymères de polylysine, de polyacrylamide ou de polyvinylamine ; voir par exemple Nardelli B. et al., J. Immunol. Methods 120, 233-239 (1989) et
Sundl et al., Nucleosides & Nucleotides, 7 (5 et 6), 655-659 (1988).
Sundl et al., Nucleosides & Nucleotides, 7 (5 et 6), 655-659 (1988).
La fixation du second ligand et de l'agent traceur sur le polymère linéaire peut être réalisée de façon connue en soi, notamment à l'aide de groupements fonctionnels portés par le polymère, ou encore à l'aide d'agents de couplage bifonctionnels.
Dans le second mode de réalisation, ainsi que dans le premier mode de réalisation, l'agent traceur peut être une enzyme, une molécule colorée ou une molécule fluorescente. L'enzyme est de préférence une enzyme permettant une détection par formation d'un produit coloré. La fixation de tels agents enzymatiques, colorés ou fluorescents, ainsi que leur détection, sont effectuées selon des techniques connues qui ne seront pas rappelées ici. On peut utiliser par exemple un substrat PNPP (paranitrophényl phosphate) en milieu soluble pour la détection colorimétrique, un substrat MUP (méthyl-4 umbelliferryl phosphate) en milieu soluble pour la détection fluorimétrique, ou un substrat BCIP/NBT (bromo-5-chloro-4-indolyl-3phosphate) en système précipitant.
La membrane de filtration peut être réalisée en tout matériau approprié. On peut utiliser par exemple des membranes de nylon, en particulier à surface modifiée afin d'éviter ltadsorption des protéines, comme par exemple la membrane commercialisée sous la marque LOPRODYNE par la firme PALL ; des membranes en PVDF (polyvinylidène difluorure) telles que celles commercialisées sous la marque DURAPORE par la firme MILLIPORE ; des membranes de polycarbonate telles que celles commercialisées sous la marque
PCTE par PORETICS ; des membranes en polymères poly-sulfonés tels que celles commercialisées sous la marque SUPOR par la firme GELMAN ; des membranes inorganiques (en céramique) à pores en forme de nids d'abeilles telles que celles commercialisées sous la marque ANOPORE par ANOTEC.
PCTE par PORETICS ; des membranes en polymères poly-sulfonés tels que celles commercialisées sous la marque SUPOR par la firme GELMAN ; des membranes inorganiques (en céramique) à pores en forme de nids d'abeilles telles que celles commercialisées sous la marque ANOPORE par ANOTEC.
De préférence, on utilise des membranes filtrantes présentées sous la forme de plaques à plusieurs puits, dont elles constituent le fond et/ou les parois latérales, telles que celles qui sont décrites dans les demandes de brevet européen 02172043 et 0339769. On peut utiliser en particulier de telles plaques à plusieurs puits adaptables sur un dispositif collecteur permettant de mettre en dépression, à l'aide d'une pompe à vide, l'espace en relation avec la face inférieure des filtres, afin de faciliter ou de déclencher la filtration. On pourra utiliser par exemple les systèmes de ce type commercialisés par les firmes PALL, MILLIPORE et COSTAR CORPORATION.
Les ligands ayant une affinité pour la substance biologique à détecter sont choisis notamment parmi des sondes nucléotidiques, des lectines, des antigènes, des haptènes et des anticorps. Les sondes nucléotidiques permettent de reconnatre des séquence d'ADN ou d'ARN ; les lectines permettent de reconnaltre des glycoconjugués ; les antigènes ou les haptènes permettent de reconnaltre des anticorps, et inversement.
De préférence, les premier et second ligands reconnaissent des sites différents de la substance biologique. On utilise par exemple deux anticorps monoclonaux reconnaissant deux épitopes différents présents sur la substance biologique à détecter. De tels systèmes permettent de réaliser des complexes de type sandwich selon la méthode dite simultanée.
Le procédé de l'invention permet la détection et le dosage de toutes substances biologiques telles que celles mentionnées ci-dessus, et par exemple l'hCG (hormone humaine chorionogonadotrophine), la CEP (protéine
C-réactive), etc...
C-réactive), etc...
Pour mettre en oeuvre le procédé, on opère dans des conditions telles que le complexe premier ligand-substance biologique-second ligand puisse se former après avoir ajouter les premier et second ligands soit séparément soit simultanément. On laisse incuber pendant un temps suffisant, puis on procède à la filtration pour éliminer le liquide réactionnel, et enfin on procède à la lecture, à la détection ou au dosage de l'agent traceur retenu par la membrane selon les méthodes connues.
Le procédé de l'invention peut être utilisé pour détecter la présence de plusieurs substances biologiques dans un échantillon à examiner.
Par exemple, on peut utiliser des supports solides particulaires (grosses particules) sur lesquels sont fixés plusieurs premiers ligands différents capables de reconnaltre chacun une substance différente, et utiliser autant de types de second ligand correspondants capables de reconnaître chacun une desdites substances, chaque type de second ligand étant lié à un agent traceur différent. Un tel système peut être utilisé en particulier lorsque la présence d'une substance biologique dans l'échantillon à examiner est exclusive de la présence des autres substances biologiques que le système est susceptible de détecter.
Par exemple, dans un tel système, les seconds ligands différents entre-eux sont fixés chacun sur des petites particules colorées et/ou fluorescentes de couleur et/ou de fluorescence différente.
On peut également utiliser plusieurs types de premier ligand différents fixés chacun sur des supports solides particulaires, lesdits premiers ligands différents étant capables de reconnaître chacun une substance biologique différente. Les divers types de grosses particules sont localisées chacun sur un secteur différent de la membrane de filtration.
Pour cela, il suffit de diviser la membrane en plusieurs secteurs et de déposer avec précaution sur chaque secteur une suspension de grosses particules liées à un premier ligand, les particules déposées sur chaque secteur étant liées à un meme premier ligand, et les premiers ligands liés aux particules de secteurs différents étant différents entre eux, c' est-à-dire de reconnaltre chacun une substance biologique distincte. On établit ensuite le vide à l'extérieur de la membrane pour bien appliquer les grosses particules sur la membrane filtrante, puis on sèche les membranes.
Les grosses particules restent alors localisées sur le secteur où elles ont été déposées, même lorsqu'on ajoute, dans le conteneur muni de la membrane, la solution contenant la ou les substances à détecter et les seconds ligands. Bien entendu, on utilise autant de seconds ligands correspondants qu'il y a de substances à détecter. I1 est possible de rendre les divers secteurs repérables, par exemple en utilisant des grosses particules colorées de couleurs différentes. Dans un tel système, on utilise bien entendu autant de types de petites particules liées à un second ligand qu'il y a de secteurs sur la membrane de filtration.On peut ainsi détecter une substance biologique présente dans un échantillon en repérant le ou les secteurs sur lesquels on détecte la présence d'agent traceur fixé, ou bien encore on peut utiliser des agents traceurs différents pour chaque type de second ligand différent et on détectera alors la présence d'une substance biologique en détectant la présence de l'agent traceur correspondant fixé sur le secteur correspondant à ladite substance. On peut dans ce dernier cas utiliser par exemple des petites particules colorées ou fluorescentes de couleur ou de fluorescence différente, chaque couleur correspondant à des petites particules liées à un second ligand capable de reconnaître une substance déterminée. On conçoit aisément qu'un tel système à plusieurs secteurs permet la détection multiple de substances biologiques susceptibles d'être présentes simultanément dans l'échantillon à examiner.
Bien entendu, les systèmes de détection multiple décrits ci-dessus pour des seconds ligands liés à de petites particules peuvent être réalisés de façon analogue avec des seconds ligands liés à un polymère linéaire soluble.
L'invention a également pour objet une trousse ou un système instrumental de diagnostic ou de dosage d' au moins une substance biologique, comprenant au moins un conteneur muni d'une membrane filtrante ainsi que, dans des conteneurs appropriés, au moins un premier ligand fixé sur un support solide particulaire, ledit support solide ayant des dimensions suffisantes pour être retenu par la membrane, ledit premier ligand étant doué d'affinité pour ladite substance biologique à déterminer, et au moins un second ligand fixé sur un polymère sur lequel est également fixé un agent traceur, ledit second ligand étant capable de reconnaître la même substance biologique que le premier ligand.Dans de telles trousses ou système de diagnostic, lesdits conteneur muni d'une membrane filtrante, ligands, support solide et agent traceur et/ou polymère sont notamment tels que définis précédemment.
Dans les dessins annexés, la figure 1 représente schématiquement l'un des modes de réalisation du procédé de l'invention. Les cercles hachurés représent des particules de latex (coloré ou non) de grande taille, ne pouvant pas traverser la membrane filtrante représentée par un trait interrompu épaissi. Les petits cercles noirs représentent des particules de latex coloré ou fluorescent de petite taille capables de traverser la membrane filtrante. Sur les particules de grande taille et de petite taille sont fixés des anticorps capables de reconnaître une substance biologique symbolisée par un triangle. Dans la partie A de la figure 1, les particules sont dispersés au sein du liquide contenant l'échantillon à examiner.Dans la partie B, on a établi le vide, le liquide est éliminé et des petites particules sont retenues sur les grosses particules auxquelles elles sont fixées par l'intermédiaire de la substance biologique qui est ici présente.
Les exemples suivants illustrent l'invention sans toutefois la limiter.
Exemple I @@Préparation des phases solides
Protocole I: Synthèse d'un latex de 1
La synthèse du latex 1 est effectuée par polymérisation en deux étapes.
Protocole I: Synthèse d'un latex de 1
La synthèse du latex 1 est effectuée par polymérisation en deux étapes.
a) Synthèse d'un latex semence
Dans un réacteur de Il, à double enveloppe de thermostatisatiorl, équipé d'une agitation mécanique, d'une sonde de température. d'une arrivée d'azote et d'un réfrigérant sont placés - 708g d'H2O bouillie et désoxygénée par bullage d'azote - 0,66g de NaCl dissous dans 20g d'H20 bouillie et désoxygénée.
Dans un réacteur de Il, à double enveloppe de thermostatisatiorl, équipé d'une agitation mécanique, d'une sonde de température. d'une arrivée d'azote et d'un réfrigérant sont placés - 708g d'H2O bouillie et désoxygénée par bullage d'azote - 0,66g de NaCl dissous dans 20g d'H20 bouillie et désoxygénée.
La température est amenée à 70 C et l'agitation est maintenue à 340tours/minute jusqu'S la fin de la polymérisation. 83,32g de styrène sont alors ajoutés. Après stabilisation de la température à 70 C, 0,6g de persulfate de potassium (amorceur), dissous dans 20g d'H2O bouillie désoxygénée, sont ajoutés au mélange.
La synthèse est terminée après 22 h de polymérisation et un latex d'un diamètre 750nm est obtenu à 9,9% de taux de solide.
b) Synthèse du latex 1
Dans un réacteur de il. identique à celui décrit dans le protocole 1 a), sont placés 101,5g de latex 750nm à 9,9%, 0,95g de NaCI dans 20g d'H2O bouillie désoxygénée et 637g d'H2O bouillie désoxygénée. La température est amenée à 60 O et l'agitation maintenue à 350 tours par minute. 21,5 g de styrène sont alors ajoutés. Afin de laisser le styrène diffuser vers les particules, la solution est maintenue à 60 C sous agitation pendant 5 heures.
Dans un réacteur de il. identique à celui décrit dans le protocole 1 a), sont placés 101,5g de latex 750nm à 9,9%, 0,95g de NaCI dans 20g d'H2O bouillie désoxygénée et 637g d'H2O bouillie désoxygénée. La température est amenée à 60 O et l'agitation maintenue à 350 tours par minute. 21,5 g de styrène sont alors ajoutés. Afin de laisser le styrène diffuser vers les particules, la solution est maintenue à 60 C sous agitation pendant 5 heures.
0,3g de K2S208 dans 20g d'HzO bouillie désoxygénée sont alors ajoutés. La polymérisation dure 8 heures et le latex obtenu présente une taille de1p et le taux de solide est amené à 5%.
Protocole 2 : Coloration du latex 1
Dans un ballon de 500 ml équipé d'une agitation mécanique, d'une double enveloppe de thermostatisation, d'une sonde de température, d'une arrivée d'azote, d'une ampoule de coulée et d'un réfrigérant, sont introduits 340g de latex à 5%. La température est amenée à 70 C et l'agitation est maintenue à 200 tourslminute.
Dans un ballon de 500 ml équipé d'une agitation mécanique, d'une double enveloppe de thermostatisation, d'une sonde de température, d'une arrivée d'azote, d'une ampoule de coulée et d'un réfrigérant, sont introduits 340g de latex à 5%. La température est amenée à 70 C et l'agitation est maintenue à 200 tourslminute.
2,5g de colorant (ref : Waxoline orange EPFW ICI) dissous dans 1209 d'acétonitrile filtrés sur laine de quartz sont placés dans l'ampoule de coulée. Le colorant est alors introduit goutte à go@@@ dans le latex.
Une fois l'incorporation terminée, l'acétonitrile est éliminé à l'évaporateur rotatif et le latex orange, de diamètre t avec un taux de solide de 5%, est obtenu.
Protocole 3 : Synthèse de particules colorées de petite taille a) Synthèse
Dans un réacteur identique à celui décrit dans le protocole I sont placés : 876g d'H20 ultrapure bouillie et désoxygénée, 1,25g de NaHOO3 et 1,5g de diheptylsulfosuccinate de sodium. La température est amenée à 85 O et
I'agitation est maintenue à 200 tours/minute.
Dans un réacteur identique à celui décrit dans le protocole I sont placés : 876g d'H20 ultrapure bouillie et désoxygénée, 1,25g de NaHOO3 et 1,5g de diheptylsulfosuccinate de sodium. La température est amenée à 85 O et
I'agitation est maintenue à 200 tours/minute.
104g de styrène distillé sont alors ajoutes. Après stabilisation de la température, 2,Ig de Na2S2O3 dans 15g d'H20 ultrapure bouillie, (système redox), sont ajoutés ainsi qu'aussitôt 3g de K2S208 dans 25g d'H20 ultrapure bouillie. Après 4 heures de polymérisation, un latex de diamètre 100nm à un taux solide de 10% est obtenu.
b) Coloration des particules de latex
II est procédé selon le même principe qu'indiqué dans le protocole 2 avec -les conditions suivantes
- 400g de latex 10% à 70 C. agltation : 300 tours/minute
- 2,52 de colorant dans 150g de CH3CN (ref: Waxoline blue APFW ICI)
Après évaporation du solvant, un latex bleu de taille 100nm est obtenu.
II est procédé selon le même principe qu'indiqué dans le protocole 2 avec -les conditions suivantes
- 400g de latex 10% à 70 C. agltation : 300 tours/minute
- 2,52 de colorant dans 150g de CH3CN (ref: Waxoline blue APFW ICI)
Après évaporation du solvant, un latex bleu de taille 100nm est obtenu.
Protocole 4 : Fluorescence des particules de latex
Il est possible d'incorporer un composé fluorescent dans ce même latex coloré ou non en procédant comme suit: 1009 de latex 10% sont placés dans un ballon équipé dune ampoule à coulée. 80 mg de diphényl -1,6 héxatriène -1,3,5 (DPH) sont dissous dans 20g de THF et ajoutés goutte à goutte au latex sous une agitation de 200 t/min.Le solvant est ensuite éliminé à I'évaporateur rotatif et un latex bleu fluorescent de 100nm, présentant un taux de solide d'environ 10%, est obtenu avec 0,8% de DPH.
Il est possible d'incorporer un composé fluorescent dans ce même latex coloré ou non en procédant comme suit: 1009 de latex 10% sont placés dans un ballon équipé dune ampoule à coulée. 80 mg de diphényl -1,6 héxatriène -1,3,5 (DPH) sont dissous dans 20g de THF et ajoutés goutte à goutte au latex sous une agitation de 200 t/min.Le solvant est ensuite éliminé à I'évaporateur rotatif et un latex bleu fluorescent de 100nm, présentant un taux de solide d'environ 10%, est obtenu avec 0,8% de DPH.
Il. Couplage des anticorps
Exemple du test de grossesse
Détermination de la présence d'hormone humaine choriogonadotropine dans un fluide biologique, sérum ou urine esentiellement. Cette hormone présente deux sous-unités différentes a et ,B, la première étant similaire à une sous-unité des hormones LH, FSH et TSH, la seconde permettant la spécificité du test
Les deux anticorps utilisés dans ledit test sont des anticorps monoclonaux spécifiques de chacune de ces sous-unités.
Exemple du test de grossesse
Détermination de la présence d'hormone humaine choriogonadotropine dans un fluide biologique, sérum ou urine esentiellement. Cette hormone présente deux sous-unités différentes a et ,B, la première étant similaire à une sous-unité des hormones LH, FSH et TSH, la seconde permettant la spécificité du test
Les deux anticorps utilisés dans ledit test sont des anticorps monoclonaux spécifiques de chacune de ces sous-unités.
L'anticorps spécifique de la sous-unité ss (anti ,B-hCG) est fixé sur le latex de plus grande taille, I'anticorps spécifique de la sous-unité a est couplé avec l'élément permettant la révélation (petit latex, ou polymère d' enzymes).
Le couplage d'anticorps sur latex est effectué en tampon tris 50 mM -pH=9,5 à une concentration en anticorps de 40 mg/g pour le latex de grande taille et de 80 mg/g pour le latex de petite traille, et à un taux de solide en latex de 2%. Le couplage dure 5 h sous agitation rotative, puis une
centrifugation à 12000 tours/minute pendant 5 minutes permet d'éliminer
les anticorps non fixés, le culot étant repris par un tampon tris 0,1 M,
NaCI, 0,15 M pH = 8,2 contenant 10 mg/ml de BSA, de façon à obtenir un
taux de solide final de 1%.
centrifugation à 12000 tours/minute pendant 5 minutes permet d'éliminer
les anticorps non fixés, le culot étant repris par un tampon tris 0,1 M,
NaCI, 0,15 M pH = 8,2 contenant 10 mg/ml de BSA, de façon à obtenir un
taux de solide final de 1%.
Après sensibilisation, il est Important que la taille du petit latex ne
dépasse pas 300nm, afin d'éviter une préflltration sur 0,45 .
dépasse pas 300nm, afin d'éviter une préflltration sur 0,45 .
Exemple 2- : Réalisation du test - Révélation avec latex colorés
Le dosage est réalisé en mettant en contact 100 l de fluide biologique avec 100 lii d'un mélange des deux latex colorés orange et bleu à des taux de solide respectifs de 0,08% et 0,4%, dans un puits équipés d'une membrane.
Le dosage est réalisé en mettant en contact 100 l de fluide biologique avec 100 lii d'un mélange des deux latex colorés orange et bleu à des taux de solide respectifs de 0,08% et 0,4%, dans un puits équipés d'une membrane.
Une incubation d'environ 5 minutes est nécessaire pour la formation du complexe immunologique.
L'ensemble des dispositifs est ensuite mis au contact du vide.
Un résultat positif donne un résultat bleu, alors qu'un résultat négatif
donnera une coloration orange. Une coloration verte uniforme correspond
au seuil de détection.
donnera une coloration orange. Une coloration verte uniforme correspond
au seuil de détection.
Une sensibilité d'environ 100 mU/ml est obtenue avec cette révélation
colorée.
colorée.
<tb>
hC@ <SEP> <SEP> @@@ <SEP> 100.000 <SEP> 10.000 <SEP> 1.000 <SEP> 500 <SEP> 250 <SEP> 125 <SEP> 100 <SEP> 62.5 <SEP> 31.25 <SEP> 25 <SEP> 10 <SEP> 0
<tb> <SEP> Coloration <SEP> bleu <SEP> bleu <SEP> bleu <SEP> bleu <SEP> bleu <SEP> bleu <SEP> vert <SEP> vert <SEP> orange <SEP> orange <SEP> orange <SEP> orange
<tb> <SEP> Intanse <SEP> Intanse <SEP> vert <SEP> orange
<tb>
Exemple 3 : Révélation par un polymère enzymatique
en système précipitant
Dans le cas d'une révélation enzymatique de la formation du complexe
Immunologique, le couple anticorps-petit latex coloré est remplacé par le couple conjugué traditionnel anticorps-enzyme.
<tb> <SEP> Coloration <SEP> bleu <SEP> bleu <SEP> bleu <SEP> bleu <SEP> bleu <SEP> bleu <SEP> vert <SEP> vert <SEP> orange <SEP> orange <SEP> orange <SEP> orange
<tb> <SEP> Intanse <SEP> Intanse <SEP> vert <SEP> orange
<tb>
Exemple 3 : Révélation par un polymère enzymatique
en système précipitant
Dans le cas d'une révélation enzymatique de la formation du complexe
Immunologique, le couple anticorps-petit latex coloré est remplacé par le couple conjugué traditionnel anticorps-enzyme.
L'enzyme utilise ici est la phosphatase alcaline et le substrat précipitant est constitué du mélange BCIP/NBT augmenté d'un polymère de l'acide acrylamldomethylpropane sulfonique(poly AMPS,)
BCIP : Bromo-5 Chloro-4 Indolyl-3 phosphate
NBT : Nitrobleu tetrazolium
La manlpulation est la même que précédemment, exceptée la nécessité d'une deuxième étape consistant en l'additin du substrat, en laissant le vide dans un premier temps, pour effectuer un lavage, puis en laissant 3 mi d'incubation ensuite afin de laisser la coloration se développer.
BCIP : Bromo-5 Chloro-4 Indolyl-3 phosphate
NBT : Nitrobleu tetrazolium
La manlpulation est la même que précédemment, exceptée la nécessité d'une deuxième étape consistant en l'additin du substrat, en laissant le vide dans un premier temps, pour effectuer un lavage, puis en laissant 3 mi d'incubation ensuite afin de laisser la coloration se développer.
Coloration positif : coloration violette (++)
Coloration négative : coloration jaune. (-)
Coloration négative : coloration jaune. (-)
<tb> hCG <SEP> @@@ <SEP> 100.000 <SEP> 10.000 <SEP> 1.000 <SEP> 600 <SEP> 260 <SEP> 125 <SEP> 100 <SEP> 12.5 <SEP> 31.26 <SEP> 26 <SEP> 10 <SEP> 0
<tb> R@@@ukei <SEP> <SEP> +++ <SEP> ++++ <SEP> +++ <SEP> +++ <SEP> +++ <SEP> ++ <SEP> ++ <SEP> ++ <SEP> + <SEP> + <SEP>
Exemple 4
Révélation enzymatique en système soluble a) Mesure colo@métrique
La manlpulation est effectuée dans une plaque de microtitration 96 puits équipée de la membrane LOPRODYNE 0,45 .
<tb> R@@@ukei <SEP> <SEP> +++ <SEP> ++++ <SEP> +++ <SEP> +++ <SEP> +++ <SEP> ++ <SEP> ++ <SEP> ++ <SEP> + <SEP> + <SEP>
Exemple 4
Révélation enzymatique en système soluble a) Mesure colo@métrique
La manlpulation est effectuée dans une plaque de microtitration 96 puits équipée de la membrane LOPRODYNE 0,45 .
La révélation est effectuée à l'aide du substrat de la phosphatase alcaline para-nitrophénylphosphate à raison de 2,1 gll en tampon diéthanolamine, HCl pH=9.8 (D.E.A., 1,29 M ; Mg SO4 7H2O. 0,56 mM, NaN3 0,015 M ; HCl 0,012 N, Chlorure de benzalkonium, 0,025 g/l). 200 l de substrat sont distribués par puits. On laisse la coloration se développer pendant envlron 10 minutes, puis le système est bloqué par 100 l de NaOH 1N.L'ensemble est ensuite transféré grâce à l'appareil LTV1 de PALL dans une plaque de microtitration 96 puits et la lecture est effectuée par mesure de D.O. à 405 nm sur I'Axia MicroReader (bioMérieux): b) Mesure flvorimétrique
La révélation fluorimétrique est effectuée à l'aide du substrat Methyl-4 umbelliferylphosphate 2,7 mg/l dans un tampon glycine 0,1M pH=10,3 contenant MgCl2 1 mM : ZnCl2 0,1 mM : NaN3 0,5 g/l et 230 mg/l d'albumine. Le protocole suivi est le me me que précédemment avec comme agent bloquant le tampon KH2PO4-KOH 0,5M pH=10,4 contenant EDTA 10mM.
La révélation fluorimétrique est effectuée à l'aide du substrat Methyl-4 umbelliferylphosphate 2,7 mg/l dans un tampon glycine 0,1M pH=10,3 contenant MgCl2 1 mM : ZnCl2 0,1 mM : NaN3 0,5 g/l et 230 mg/l d'albumine. Le protocole suivi est le me me que précédemment avec comme agent bloquant le tampon KH2PO4-KOH 0,5M pH=10,4 contenant EDTA 10mM.
La lecture est effectuée ultérleurement au fluorimètre dans des microcuves.
Les résultats obtenus en fluorescence et par colorimétrie donnent des sensibilités- respectives de 3 mUI/ml et 25 mUI/ml
Exemple 5 : Révélation avec un polymère fluorescent
La mesure est effectuée en reprenant les phases solides retenues sur la membrane, et en les plaçant dans les cuves pour la mesure de la fluorescence, l'excitation étant fixée à 360 nm et l'émission à 430 nm.
Exemple 5 : Révélation avec un polymère fluorescent
La mesure est effectuée en reprenant les phases solides retenues sur la membrane, et en les plaçant dans les cuves pour la mesure de la fluorescence, l'excitation étant fixée à 360 nm et l'émission à 430 nm.
La molécule fluorescente utilisée est le diphénylhexatriène incorporé dans un latex de diamètre 100 nm.
Les résultats obtenus sur un ensemble de trois manipulations identiques et en utilisant la gamme en hCG suivante 0-0,001-0,005-0,01-0,05-0,1-0,5-2-10-25-50-100-125-250-500-1000-3000 mUI/ml, montrent que ce test est reproductible. La sensibilité est de 0,5 mUI/ml.
La figure 2 montrent les résultats comparatifs obtenus par cette technique (cercles vides) et la technique utilisant la phosphatase alcaline et un substrat (HUM) donnant un produit fluorescent (carrés pleins).
Le terme UAF signifiant unité arbitraire de fluorescence.
La méthode utilisant des particules fluorescentes apparat plus sensible qu'une détection enzymatique.
Claims (23)
1. Procédé de détection et/ou de dosage d'au moins une substance biologique dans un milieu liquide la contenant ou susceptible de la contenir, dans lequel on met en contact, dans un conteneur muni d'une membrane filtrante, ledit milieu liquide d'une part avec un premier ligand fixé sur un support solide particulaire, ledit premier ligand ayant une affinité pour ladite substance biologique, et ledit support solide ayant des dimensions suffisantes pour être retenu par la membrane, et d'autre part avec un second ligand ayant une affinité pour ladite substance biologique, ledit second ligand étant lié à un agent traceur, l'ensemble second ligand-agent traceur étant capable de traverser la membrane, on laisse incuber pendant un temps suffisant pour permettre la formation des complexes entre les ligands et la substance biologique si elle est présente, on élimine le milieu liquide par filtration à travers la membrane et on détecte ou dose selon les techniques usuelles l'agent traceur éventuellement retenu sur la membrane, caractérisé par le fait que ledit second ligand est fixé sur un polymère sur lequel est également fixé ou dans lequel est incorporé ledit agent traceur.
2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que ledit polymère est constitué de petites particules ayant des dimensions suffisamment faibles pour pouvoir traverser la membrane.
3. Procédé selon la revendication 2, caractérisé par le fait que lesdites petites particules sont des particules colorées, et que l'agent traceur est constitué par le colorant des particules.
4. Procédé selon la revendication 3, caractérisé par le fait que le support solide sur lequel est fixé ledit premier ligand est constitué de particules colorées, d'une couleur différente de celle des petites particules.
5. Procédé selon la revendication 2, caractérisé par le fait que lesdites petites particules sont des particules fluorescentes, et que l'agent traceur est constitué par l'agent fluorescent fixé sur, ou contenu dans les petites particules.
6. Procédé selon l'une quelconque des revendications 2 à 5, caractérisé par le fait que les petites particules ont des dimensions inférieures à 0,5 jim et en particulier des dimensions inférieures à 0,2 jjm.
7. Procédé selon l'une quelconque des revendications 2 à 6, caractérisé par le fait que lesdites petites particules sont réalisées en un matériau polymère hydrophobe.
8. Procédé selon l'une quelconque des revendications 2 à 6, caractérisé par le fait que lesdites petites particules sont obtenues au départ de particules contenant des groupements fonctionnels permettant la fixation par covalence du second ligand et/ou de l'agent traceur.
9. Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que ledit polymère est un polymère linéaire soluble dans le milieu.
10. Procédé selon la revendication précédente, caractérisé par le fait que ledit polymère linéaire soluble est choisi parmi les polymères de polylysine, de polyacrylamide et de polyvinylamine.
11. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé par le fait que l'on utilise des supports solides particulaires sur lesquels sont fixés plusieurs premiers ligands différents capables de reconnaître chacun une substance biologique différente, et que l'on utilise autant de types de second ligand différents correspondants, fixés chacun sur un polymère, chaque type de second ligand étant lié à un agent traceur différent.
12. Procédé selon la revendication 11, caractérisé par le fait que lesdits seconds ligands différents sont fixés chacun sur des petites particules colorées et/ou fluorescentes de couleur et/ou de fluorescence différente.
13. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, caractérisé par le fait que l'on utilise plusieurs type de premier ligand, différents capables de reconnaltre chacun une substance biologique différente et fixés chacun sur des supports solides particulaires localisés chacun sur un secteur différent de la membrane de filtration, et que l'on utilise autant de seconds ligands différents correspondants que de premiers ligands.
14. Procédé selon la revendication 13 > caractérisé par le fait que l'on repère le ou les secteurs sur lesquels on détecte la présence d'agent traceur fixé.
15. Procédé selon la revendication 13 ou 14, caractérisé par le fait que lesdits seconds ligands différents sont chacun liés à un agent traceur différent.
16. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé par le fait que lesdits ligands sont choisis parmi des sondes nucléotidiques, des lectines, des antigènes, des haptènes et des anticorps.
17. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé par le fait que lesdits premier et second ligand reconnaissent des sites différents de ladite substance biologique.
18. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé par le fait que lesdits ligands sont des anticorps reconnaissant l'hCG.
19. Procédé selon la revendication 18, caractérisé par le fait que le premier ligand est un anticorps dirigé contre la sous-unité bêta de l'hCG et que le second ligand est un anticorps dirigé contre la sous-unité alpha de l'hCG.
20. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé par le fait que l'agent traceur est une enzyme ou un agent fluorescent.
21. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé par le fait que ledit conteneur est constitué par des puits présents sur une plaque de microtitration, et par le fait que le fond desdits puits est constitué par ladite membrane filtrante.
22. Trousse ou système instrumental de diagnostic ou de dosage d'au moins une substance biologique comprenant des conteneurs munis d'une membrane filtrante ainsi que, dans des conteneurs appropriés, au moins un premier ligand fixé sur un support solide, ledit support solide ayant des dimensions suffisantes pour ne pas traverser la membrane, ledit premier ligand étant doué d'affinité pour ladite substance biologique à déterminer, et au moins un second ligand fixé sur un polymère sur lequel est également fixé un agent traceur, ledit second ligand étant capable de reconnaltre la même substance biologique que le premier ligand.
23. Trousse ou système instrumental selon la revendication précédente, caractérisée par le fait que lesdits conteneur muni d'une membrane filtrante, ligands, support solide, agent traceur et/ou polymère sont tels que définis dans l'une quelconque des revendications 1 à 21.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR9008825A FR2664704B1 (fr) | 1990-07-11 | 1990-07-11 | Procede de detection d'une substance biologique dans un milieu liquide selon une technique de filtration permettant de retenir la substance biologique sur des particules ne traversant pas le filtre. |
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|---|---|
| FR2664704A1 true FR2664704A1 (fr) | 1992-01-17 |
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0684474A1 (fr) * | 1994-05-25 | 1995-11-29 | Societe De Recherche Et De Developpement En Activation Et Communication Cellulaire | Procédé et dispositif pour la mise en évidence d'un analyte dans un échantillon |
Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| EP0070527A1 (fr) * | 1981-07-17 | 1983-01-26 | Toray Industries, Inc. | Procédé pour l'essai de matériaux biologiques actifs et agents de marquage à cet effet |
| JPS5975152A (ja) * | 1982-10-23 | 1984-04-27 | Tatsuo Suzuta | 螢光免疫ラテツクス粒子 |
| WO1987003690A1 (fr) * | 1985-12-10 | 1987-06-18 | Murex Corporation | Immunoanalyse de composants de liaison lies a des particules |
| EP0293779A1 (fr) * | 1987-06-05 | 1988-12-07 | Daiichi Pure Chemicals Co. Ltd. | Essai immunologique utilisant l'agglutination de latex |
| EP0310872A1 (fr) * | 1987-10-07 | 1989-04-12 | Hygeia Sciences, Inc. | Technique d'essai immunologique par capture de sol métallique, nécessaire à utiliser dans celle-ci et composé contenant du métal capté |
| EP0352139A2 (fr) * | 1988-07-21 | 1990-01-24 | Pak Leong Lim | Détection des antigènes ou anticorps |
| EP0360088A2 (fr) * | 1988-09-23 | 1990-03-28 | Abbott Laboratories | Réactifs indicateurs, essais diagnostiques et trousses de réactifs utilisant les particules organiques de latex polymère |
-
1990
- 1990-07-11 FR FR9008825A patent/FR2664704B1/fr not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (7)
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| EP0684474A1 (fr) * | 1994-05-25 | 1995-11-29 | Societe De Recherche Et De Developpement En Activation Et Communication Cellulaire | Procédé et dispositif pour la mise en évidence d'un analyte dans un échantillon |
| FR2720508A1 (fr) * | 1994-05-25 | 1995-12-01 | Rech Developp Activ Commun | Procédé de mise en évidence d'un analyte dans un échantillon et dispositif pour mettre en Óoeuvre le procédé. |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| FR2664704B1 (fr) | 1997-05-30 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
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