FR2649587A1 - Compositions mycobactericides inodores - Google Patents

Abstract

L'invention concerne des compositions liquides mycobactéricides sans phénol, ayant une faible odeur et un faible potentiel d'irritation. Ces compositions consistent en un solvant contenant un glycol, une aldéhyde ayant de 2 à 6 atomes de carbone, des tensioactifs anioniques spécifiques, et des sels tampons pour stabiliser le pH dans la gamme de 6 à 7,4. Le rapport du glycol à l'aldéhyde est compris entre 0,1 et 6,0. Plus ce rapport est bas, plus l'activité mycobactéricide est grande. Ces compositions inodores peuvent tuer le Mycobactérium tuberculosis (suivant le procédé quantitatif de l'EPA), en dix minutes ou moins, à 20 degre(s)C. Application à la décontamination et désinfection de surfaces inertes ou vivantes, notamment de la peau.

Description

COMPOSITIONs MYCOBACTERICIDES INODORES La présente invention concerne des

solutions mycobactéricides exemptes de phénol.

Bien que l'on ait évalué beaucoup de solutions gluta-

raldéhyde/tensioactif pour leur activité sporicide ou bactéricide, très peu d'entre elles ont été étudiées à fond du point de vue de leur activité mycobactéricide. Il est bien connu qu'il n'y a pas de relation directe entre les résistances des spores et celles des mycobactéries aux désinfectants chimiques. Par exemple, tandis que sous certaines conditions, les phénols et l'alcool isopropylique peuvent être extrêmement efficaces contre M.Tuberculosis, les mêmes substances chimiques ont toujours présenté une très faible activité sporicide. Il est également bien connu que les cellules de M.Tuberculosis sont parmi les plus résistants des micro-organismes végétatifs et, après les endospores bactériens, ces cellules représentent le plus sérieux défi pour les germicides chimiques. C'est pourquoi, jusqu'à récemment, l'efficacité des solutions de glutaraldéhyde pour détruire rapidement M. Tuberculosis sur les supports vivants ou inertes, a été débattue par plusieurs auteurs. Rubbo et consorts ( J. Appl. Bact., 30: 78-87, 1967) furent les premiers à mettre en doute l'efficacité tuberculocide des solutions alcalines à 0,2% de glutaraldéhyde vendues sous la marque CIDEX (Surgikos, Johnson and Johnson Company). Une étude de T. Bergan et A. Lysad, en 1971, relate l'action anti-tuberculeuse de plusieurs types de désinfectants, utilisant une méthode adaptée des tests de Kelsey-Sykes pour les désinfectants. On en a conclu qu'une solution de glutaraldéhyde à 0,2% n'est pas suffisamment active, la croissance se poursuivant après une seconde addition de bactéries. En novembre 1976, Boucher et consorts présentent un rapport à l'Agence pour la Protection de l'Environnement (EPA) des Etats-Unis, concernant une étude comparative de l'efficacité tuberculocide des compositions acides et basiques de glutaraldéhyde (0,2%) . Ces conclusions, basées sur des centaines de tests de l'Association Officielle des Chimistes Analystes (AOAC), utilisant plus de 4000 tubes à essais et effectués à la Fondation pour la Recherche de l'Ontario, sont que les solutions basiques de glutaraldéhyde à 0,2% ne tuent pas M. Tuberculosis var. bovis (BCG) en 10 minutes ni meme en 20 minutes, à 20 C. Bien que les temps tuberculocides semblent être plus courts ( 15 à 20 minutes) avec des solutions acides puissantes de glutaraldéhyde à pH 3,5, les résultats ne sont pas statistiquement significatifs. On a remarqué que l'utilisation de différents neutralisants (bisulfite de sodium ou sérum de cheval) produit différents résultats. En suivant une méthode identique, de légères variations de température entre C et 25 C donnent également de larges variations dans

l'activité tuberculocide.

En novembre 1976, F.M. Collins et V.Montalbine ont rapporté (Journ. Clin. Microb., p 408-412, Nov. 1976) qu'une solution alcaline à 0,2% de glutaraldéhyde inactivait 105 cellules viables de M.Tuberculosis H 37 Rv présentes à la surface de "porcelain penicylinders" en 3 minutes à 18 C. Une puissante solution acide de glutaraldéhyde requière 5 minutes pour etre tuberculocide à la même température. Cette méthode était différente de la procédure AOAC ( un test de tout ou rien) et les résultats étaient si optimistes qu'ils furent reçus avec scepticisme. Pendant cette période, de nombreuses contradictions résultant de l'utilisation de la méthode AOAC ( ou d'autre procédures dérivées), ont attiré l'attention de nombreux scierntifiques intéressés par une méthode plus précise. En octobre 1984, J.M.Ascenzi. T.M. Wendt et J.W. McDowell, dans une publication intitulée " Importanst Information Concerning the Reuse of Glutaraldehyde-based Disinfectants and their Tuberculocidal Activityl' (Information importante concernant la réutilisation de désinfectants à base de glutaraldéhyde et de leur activité tuberculocide), évaluaient d'abord sept compositions stérilisantes connues de glutaraldéhyde avec une nouvelle technique quantitative considérée comme très précise et reproductible. Ils ont fait varier les temps de contact (1, 2, 5, et 20 minutes) à une température standard de 20 C et aucun des désinfectants testés n'a montré une capacité à tuer complètement les populations-tests de mycobactéries en 10 ou minutes. Le tableau I montre les résultats spécifiques se rapportant à cette étude. C'était extrêmement important dès lors que ces solutions commerciales avaient été reconnues pour leur efficacité tuberculocide en 10 et 20 minutes par la méthode AOAC. L'Agence pour la Protection de l'Environnement (EPA), ayant autorité en matière d'étiquetage des stérilisants et des désinfectants, a convoqué un groupe d'experts, en septembre 1985, pour évaluer cette nouvelle méthode

quantitative et pour la comparer à la vieille méthode AC.-.

Toutefois,l'EPA décidait que tous les enregistrés ou requérants de tous les pesticides anti-microbiens comportant

des revendications existantes de tuberculocide, pour des

solutions fraîches ou de réemploi, devraient tester à nouveau leurs produits, avec l'une des trois options suivantes: -a) la nouvelle méthode quantitative -b) l'ancienne méthode AOAC mais avec une modification substantielle du temps d'exposition et de la température, -c) la méthode standard AOAC utilisant des temps d'exposition de 10 et 20 minutes dans un autre laboratoire que celui-d'o

étaient issus les résultats originaux.

La procédure d'appel des données tuberculocides a été ouverte

le 13 juin 1986 et les résultats publiés le 17 février 1989.

Seuls 43 produits, sur un total de 144, ont satisfait aux données requises dans la procédure d'appel. Parmi les produits à base de glutaraldéhyde, seuls 60% ont satisfait aux exigences de la procédure d'appel. Seulement 4 sociétés testè:ent leurs produits avec la nouvelle méthode quantitative plus t -écise. Des écarts énormes apparaissent en comparant la méthode quantitative avec l'ancienne approche AOAC. Par exemple, à 20 C une solution standard alcaline (CIDEX 2%) a demandé 70 minutes pour détruire M.Tuberculosis, le CIDEX Formula 2 heures et le CIDEX Machine 4 heures. Précédemment, ces solutions prétendaient à un temps de destruction de 10 minutes à 20 C avec la méthode AOAC (J.M. Ascenzi et Co, Surgikos, Res. Div., oct. 1984). L'influence de la température peut être appréciée par les résultats qui montrent qu'une solution alcaline à 2 % (CIDEX) tue M. tuberculosis en 70 minutes à 20 C et en seulement 10 minutes à 30 C. Le brevet US No. 3 917 850 montre qu'un mélange de glutaraldéhyde et de phénol (ou de phénate) en présence d'un composé anionique peut

manifester une certaine synergie mycobactéricide.

La nouvelle méthode quantitative de J.M.Ascenzi,T.M. Wendt et J.W. McDowell a paru dans la note PR 80-1 du 28 mai 1986, section 2, de l'Agence pour la Protection de l'Environnement, intitulée "Tuberculocidal Efficacy Testing " (Méthode efficace de Test tuberculocide). Celle-ci utilise un concept de courbe de mortalité (ou décès) dans laquelle une suspension d'approximativement 106 unités formant des colonies (cfu) de M. Bovis BCG est ajoutée à chaque ml -de désinfectant, dans

des tubes maintenus à la température appropriée.

Les aldéhydes ont. une forte odeur et leurs vapeurs peuvent être très irritantes pour les muqueuses. Pour résoudre ce problème, les chercheurs ont essayer de combiner les aldéhydes avec différents glycols (brevet US 3'886'269). Par l'entremise de liaisons hydrogène, les glycols et aldéhydes forment des complexes physiques (par ex. des molécules plus grandes) qui ont une tension de vapeur plus basse et qui sont moins irritants pour les yeux et la peau. Cette méthode fut d'abord suggérée par Trujillo et Lindell dans une p:blication intitulée New Formaldehyde Based Disinfectants".Nou :ux désinfectants à base de formaldéhyde) (J. Appl. Microb..106-110, July 1973). La meme année, Harriet Field, au Queer. .lary Veteran's Hospital à Montréal, Canada, rapportait l'élimination des vapeurs nocives de la glutaraldéhyde, en utilisant du propylène-glycol et du glycérol. La complexion directe d'une solution de glutaraldéhyde avec le triéthylène glycol a été mentionnée pour la première fois par Boucher, en été 1975. Le 15 février 1977, la première composition -:ommerc!.le de glutaraldéhyde/triéthylène glycol a été admise par]e département de l'Agriculture des Etats-Unis (USDA) sous le nom commercial d'AGROCIDE 2. Une version concentrée de cette formule fut enregistrée plus tard, le 2 février 1979 par P'EPA, sous le numéro 15136-5. Entre 1976 et 1977, H.D. Muller, de la University of Georgia College of Agriculture, émit divers rapports décrivant le remplacement réussi de la formaldéhyde par les solutions de glutaraldé-hyde/triéthylène de Boucher, pour des applications dans les abattoirs de volailles (Evaluation of AGROCIDE in a commercial broiler hatchery, Field Trial II, October 20, 1976 by Harry D. Muller, Ext. Poultry Sci, University of Georgia, Athens, Georgia). L'utilisation de ces complexes de triéthylène glycol en milieu hospitalier fut mentionnée ultérieurement en novembre 1978 par Boucher (Respiratory Care 23 (11): 1063-1072). Les solutions de glutaraldéhyde/triéthylène glycol de Boucher et Muller avaient

été activées avec un tensioactif non ionique, le Tergitol 15-S-

12. La formule originale, enregistrée par le Département de l'Agriculture des Etats-Unis (USDA) au début de 1977, a été commercialisée dans ce pays depuis 1975 sous les appellations AGROCIDE, MC 25, WAVICIDE-06 et 05. Dans toutes ces formules, la quantité de triéthylène glycol désodorisant (TEG) était 10 fois supérieure à la concentration de dialdéhyde. En d'autres termes, une formule à 0,5% de glutaraldéhyde contenait 3% de

TEG tandis qu'une-solution à 0,25% contenait 1,5% de TEG.

La présente invention à pour but le développement d'une famille de désinfectants de surface à base de glutaraldéhyde qui sont extremement efficaces contre les mycobactéries. Pour atteincdre cet objectif, il a été nécessaire de trouver des produits chimiques qui font éclater rapidement la paroi cellulaire protectrice, riche en lipides, de Mycobactérium tuberculosis et qui permettent donc une pénétration plus rapide des radicaux aldéhydes des bactéricides, qui

interagissent alors avec les acides nucléiques.

On a découvert que les tensioactifs anioniques du type sulfate

d'alkyl, sulfonate d'alkyl, sulfate d'alcool ou sulfonate d'alkyl-

aryl remplissaient ces conditions pour obtenir une destruction rapide de la paroi cellulaire lipidique en présence d'hydrates et de monomères de glutaraldéhyde. Par ex., un des tensioactifs préférés, le dodécylsulfate de sodium (SDS) a montré qu'il était de loin plus efficace pour solubiliser les complexes lipido-protéiques des parois cellulaires de mycobactéries que les meilleurs tensioactifs non ioniques utilisés dans les compositions actuelles des solutions de

glutaraldhéhyde (voir brevets U.S. No. 3 968 248 et 4 436 754).

On a aussi découvert que l'addition de molécules de glycol pour désodoriser les solutions de glutaraldéhyde (voir Brevet U.S. No. 3 886 269) pouvait affecter grandement l'effet tuberculocide des mélanges glycol/glutaraldéhyde. L'activité mycobactéricide apparaît inversement proportionnelle au rapport du glycol aux aldéhydes dans une formulation de

glut araldéhyde.

Un des objetss de la présente invention est d'ébaucher les conditions sous lesquelles une glutaraldéhyde désodorisée (par ex. complexée avec un glycol) peut optimiser son activité tuberculocide par l'addition d'un tensioactif anionique approprié. Un autre objet de l'invention est d'évaluer l'activité tuberculocide de désinfectants en utilisant la méthode approuvée par l'agence pour la Protection de!'Environnement

(EPA), dans des conditions strictes et controlées.

Un autre objet de l'invention est de montrer que des solutions de glutaraldéhyde contenant des tensioactifs anioniques spécifiques peuvent détruire M. tuberculosis, sur des surfaces, plus rapidement que des formulations non ioniques de

glut araldéhyde.

Un autre objet de l'invention est encore de déterminer l'influence de l'addition de glycol sur l'activité mycobactéricide de compositions anioniques de glutaraldéhyde lorsqu'elles sont

testées suivant la procédure quantitative de l'EPA.

Un autre objet encore de la présente invention, est d'établir l'étendue du gain, s'il en est, dans l'activité tuberculocide lorsqu'on remplace les tensioactifs non ioniques par des tensioactifs anioniques, dans les stérilisants prêts à l'emploi

pour les hopitaux, contenant de 0,5 à 5% de glutaraldéhyde.

A cet effet, une solution mycobactéricide exempte de phénol, selon la présente invention, est caractérisée en ce qu'elle contient: a) un solvant consistant en un alkanol de faible poids moléculaire ou de l'eau; b) une monrio ou une dialdéhyde saturée contenant de 2 à environ 6 atomes de carbone; c) un agent réducteur d'odeur choisi dans le groupe des composés glycols constitué par: l'éthylène glycol, le propylène glycol, le diéthylène glycol, le triéthylène glycol, le polyéthylène glycol ou le polypropylène glycol; d) un tensioactif anionique ayant un groupement hydrophile chargé négativement, choisi dans le groupe constitué par les sulfates d'alkyle, le sulfonates d'alkyle, les sulfates d'alcools, les sulfonates d'alkyl-aryle, et les sulfosuccinates de dialkyle; e) des sels tampons stabilisant le pH de la solution dans la

gamme de 6 à ",4.

Dans des formes de réalisation préférées, ladite dialdéhyde est la glutaraldéhyde, ledit réducteur d'odeur est le triéthylène glycol, et/ou le tensioactif est le dodécylsulfate

de sodium.

De préférence, les composés glycols sont présents dans un rapport compris entre 0,1 et 6,0 relativement aux mono et dialdéhydes saturées. Le tensioactif anionique peut représenter de 0,02% à 10% en poids de la solution. L'aldéhyde saturée peut représenter de 0,1% à 16% en poids de la solution. Dans une forme de particulièrement avantageuse de l'invention, une solution capable de détruire Mycobactérium Tuberculosis sur des surfaces en 10 minutes au maximum, se caractérise par un contenu en aldéhyde de 0,5% ou plus (en poids), déterminé selon le procédé quantitatif du 28 mai 1986 de l'Agence pour la

Protection de l'Environnement (EPA) des Etats-Unis.

Une solution selon l'invention contient de préférence au moins un sel tampon choisi dans le groupe constitué par: les carbonates, bicarbonates, phosphates et borates de métaux alcalins, les sels organiques d'acide carboxylique, et les

mélanges de ceux-ci.

Dans une forme de réalisation avantageuse, la solution a un pH compris entre 5,9 et 6,32 obtenu par un méla,.ae de phos.hate monobasique de potassium ou de sodium, et de phosphate

dibasique de sodium anhydre.

Comme on le décrira plus amplement ci-après, on a donc trouvé qu'en remplaçant les tensioactifs non ioniques par des anioniques tels les sulfonates d'alkyle (ARCTIC SYNTEX A, marque déposée de Colgate Co), des sulfates d'alcool (DUPONOL

WA, marque déposée de DuPont Co), et des sulfonates d'alkyl-

aryle (SANTOMERSE 3, marque déposée de Monsanto, ou ALKANOL B, marque déposée de DuPont Co), cette classe de tensioactifs présente une supériorité mycobactéricide lorsqu'elle est

ajoutée à des solutions désinfectantes de glutaraldéhyde.

Une autre découverte significative réside dans le fait que l'ajout de molécules de glycol pour désodoriser la glutaraldéhyde affecte fortement l'activité tuberculocide de la solution glycol/glutaraldéhyde. Le tableau IV montre les résultats obtenus avec des compositions de glutaraldéhyde

tant anioniques que non ioniques.

On décrira ci-dessous différentes formes de réalisation de solutions selon la présente invention, en référence aux

tableaux et aux dessins annexés.

Dans les dessins, les figures 1 et 2 représentent, en fonction du temps T, le taux de survivance S/S(O), c'est-à-dire le niveau d'activité de l'organisme Mycobactéria Tuberculosis, déterminé quantitativement selon les procédures de l'EPA

publiées le 28 mai 1986.

La figure 1 montre la destruction de M.Bovis (BCG), par des formulations de glutaraldéhyde contenant la meme quantité de substance active (2%) mais avec deux types différents de tensioactifs (voir tableau II). L'échantillon No. 1256 comporte 0,25% d'un tensioactif non ionique, tandis que l'échantillon No. 2353 comporte 0,25% d'un tensioactif anionique. ' A concentrations égales, le tensioactif anionique montre un taux de destruction plus élevé. La figure 2 montre les différents taux de survivance pour des formulations avec et sans glycol, mais avec la meme quantité de glutaraldéhyde (0,5%) et d'un tensioactif non ionique (0,062%) . L'échantillon No. 2077 contient 3% de triéthylène glycol (Tableau IV) tandis que l'échantillon No. 1546 n'en a pas (Tableau II). Un rapport du glycol aux aldéhydes égal à 6 diminue considérablement l'activité tuberculocide. Dans les dessins, les temps T, exprimés en minutes, sont au maximum de 10 minutes dans la figure 1 et de 30 minutes dans la figure 2. Le log S/S(O) se rapporte aux moyennes calculées du nombre de survivants, divisées par le nombre initial, pour chaque temps T. Dans la légende des figures, M représente la valeur moyenne du taux de survivance, LSIC95 représente la limite supérieure de son intervalle de

confiance à 95 %.

Des microphotographies électroniques de fines sections de M. Tuberculosis montrent une paroi épaisse formée de trois couches entourant une membrane plasmatique qui a aussi une structure en trois couches. Du point de vue chimique, la paroi de la mycobactérie est très complexe et présente beaucoup de caractéristiques uniques. Le trait le plus marquant de celleci est son contenu important en lipides (supérieur à 60% de son poids sec) , qui explique la plupart des propriétés inhabituelles de ces microorganismes: a) la relative imperméabilité aux colorants b) la résistance aux acides, et c) l'inhabituelle résistance à la destruction par les acides et

les bases.

L'épine dorsale de la paroi de la cellule mycobactérienne est une structure covalente consistant en 2 polymères liés d'une manière covalente par des liaisons phosphodiesters, un peptidoglycane et un arabinogalactane. Il y a au moins 70% de la réticulation du peptidoglycane qui est due aux liens peptidiques entre les molécules de l'acide mésodiaminopimélique (DPA). Il y a un grand nombre d'autres substances qui sont

également associées au complexe mycolate-arabinogalactane-

peptidoglycane. Des préparations "grossières" de parois cellulaires contiennent de grandes quantités d'acides aminés qui sont présents sous forme de lipoprotéines ou de glycoprotéines. En plus des g!1colipides liés aux peptidoglycanes, d'autres substances lipidiques sont présentes à la surface cellulaire: 'Tfacteur cordon" (cord factor) (tréhalose 6, 6'dimicolate), sulfatides et mycosides, toutes ces substances étant importantes du point de vue de l'activité biologique. La caractéristique de résistance aux acides du bacille de la tuberculose est liée à son contenu lipidique. On suppose que la résistance aux acides des mycobactéries est basée sur le principe de la barrière lipidique, suivant lequel une augmentation du caractère hydrophobe des couches superficielles suit la complexion du colorant avec les résidus de l'acide mycolique présent dans les parois cellulaires. Ceci empeche l'émission de la fuchsine phénique qui a été captée à

l'intérieur de la cellule.

On suppose que la rapidité de la réaction destructrice dépend de la pénétration des radicaux aldéhydes à travers les

couches de la paroi protectrice de la cellule.

Les composés anioniques sont les agents tensioactifs préférés qui peuvent faciliter la pénétration de la barrière lipidique et dissoudre les membranes cellulaires sous forme de complexes

tensioactif-lipide-protéine. Les complexes tensioactif-lipide-

protéine sont dissous plus tard, pour donner des complexes tensioactifprotéine, et tensioactif-lipide. Un autre avantage de l'utilisation d'un agent anionique, par ex. le dodécylsulfate de sodium (SDS), est sa forte activité dénaturante qui dissocie les protéines en chaines polypeptidiques. Les effets du SDS

(2% poids/vol.) sont étudiés pour la première fois, par A.D.

Russel et consorts (Int. Symp. Resist Microorg. to Disinfectants, octobre 1973, Poznan, Pologne) qui montrent que, à 35 C, des cellules entières et des parois cellulaires de E. Coli sont désintégrées en quelques minutes, ce qui est dû à l'extraction des lipoprotéines des parois. Le prétraitement des cellules et des parois de E. Coli avec de la glutaraldéhyde réduit grandement la lyse consécutive au SDS et l'effet protecteur de la glutaraldéhyde est plus grand avec les cellules qu'avec les parois cellulaires. Aucun résultat n'a été publié concernant le mélange de glutaraldéhyde et SDS pour

démontrer l'influence d'une telle composition binaire.

On croit que la présence de SDS dans la solution de glutaraldéhyde facilite la destruction des couches protectrices lipidiques et, de ce fait, permet une pénétration plus rapide et une réaction létale des monomères de glutaraldéhyde. Les principaux agents destructeurs, dans les solutions de glutaraldéhyde, semblent être les aldéhydes terminales des monomères de glutaraldéhyde. Apparemment, ces aldéhydes réagissent à différents niveaux dans les mycobactéries. Etant donné que la glutaraldéhyde est un agent d'alkylation, elle peut réagir chimiquement avec les groupes sulfhydriles, hydroxyles, amino et carboxyles des protéines ( Hoffman RK, Inhibition and Destruction of the Microbial Cell, Acad Press, London-New-York, pp 225-258, 1941). La glutaraldéhyde peut aussi réagir avec les groupes amino des acides nucléiques, dans lesquels elle provoque des altérations dans l'arrangement du DNA et subséquemment, altère la synthèse protéique ( Sangar and al, Journal of Gen. Virology, 21: 399-406, 1973). Bien que le peptidoglycane des mycobactéries ne soit pas identique à la chaine de peptidoglycane des spores de B. subtilis (Hughes RC and Thurman PF, Biochem. J. 119: p. 925, 1970), il y a approximativement 30 à 50% des groupes NH2 disponibles,- dans les enveloppes isolées de B.subtilis, qui peuvent réagir avec la glutaraldéhyde et favoriser la réticulation des chaines. Il y a beaucoup de sites possibles, dans une mycobactérie, pour réagir avec les aldéhydes. Cependant, pour une inactivation rapide de M. tuberculosis, il faut une dissolution instantanée de la paroi à multiples couches - lipidiques, permettant la pénétration des entités destructrices aux sites critiques, On sait bien que, pour réaliser cette disi olution, on ne peut utiliser de tensioactifs cationiques (Bi) Davis, Microbiology,

Mycobacteria, Chap. 37,p.727, Harper and Row, Ned!-York, 1980).

Les tensioactifs non ioniques, du type polyoxyéthylène, tel le TRITON X100 (appellation commerciale appartenant à la Compagnie Rohm et Haas) et TERGITOL 15-S-12, ont été utilisé antérieurement, mais avec des succès limités. La présente

invention a montré que la complexion du triéthylène glycol.

(testé à des concentrations six fois plus grandes que celles de la glutaraldéhyde), conduit à une diminut on substantielle de l'activité tuberculocide. Les courbes de survivance des dessins annexés montrent qu'en utilisant des solutions de glutaraldéhyde contenant un glycol, il se produit un retard (environ 15 minutes) avant que l'on observe une destruction mycobactéricide importante. On croit que les molécules de triéthylène glycol se combinent d'abord aux monomères d'aldéhydes pour former des complexes physiques. Cette étape initiale (durant les 15 premières minutes) diminue le nombre d'aldéhydes actives disponibles pour diffuser et réagir avec les microorganismes, aux sites critiques. La formation de complexes moléculaires plus grands peut ralentir la pénétration

des monomères d'aldéhydes au travers de la barrière lipidique.

Pour réduire le ralentissement de l'activité destructrice, du à la présence des complexes glycols, on pourrait diminuer la

concentration du glycol dans la formulation de glutaraldéhyde.

TERGITOL est une appellation commerciale, appartenant à Union Carbide Chemical Company, pour des intermédiaires non ioniques, biodégradables, comprenant les éthoxylates et les éthoxylates d'alcools secondaires linéaires. La formule du 15-S-12 est

donnée plus loin.

Des agents importants de la présente invention comprennent la désodorisation, ainsi que la diminution de l'irritation de la membrane de la muqueuse et que la diminution de la corrosion possible des métaux. Ainsi que nous le voyons dans le tableau V, un compromis est nécessaire pour obtenir une forte activité tuberculocide dans une solution inodore. On teste deux solutions ayant un faible taux de glutaraldéhyde (0,5%) et la meme quantité (0,0625%) de tensioactif, et o seul varie le rapport glycol/gluta-raldéhyde (G/A) de 0 à 6. Dans les deux cas, l'efficacité mycobactéricide de la solution diminue rapidement lorsque le rapport G/A est supérieur à 2. Comme prévu, aux environs de G/A = environ 1,2, o l'activité tuberculocide est maximum, la formulation glutaraldéhyde/tensioactif anionique est supérieure à celle de la formulation glutaraldéhyde/tensioactif non ionique. Les faibles concentrations en glutaraldéhyde (< 0,5% poids/vol.) ne

créent pas sérieusement des problèmes d'odeur ni de corrosion.

La détermination de l'absence d'odeur s'effectue de la manière suivante: du personnel excercé de laboratoire, ayant un sens olfactif normal, observe et mesure l'atmosphère et l'environnement d'une pièce de 60 m3 (fermée et non ventilée), dans laquelle on place un large récipient en verre, ouvert et contenant 1 gallon (3,785 1) du produit à tester. La solution reste au moins 24h. dans ce récipient en verre. La solution de glutaraldéhyde/tensioactif à 0,5% donne un résultat de 0,33 en moyenne pour l'indice d'irritation primaire, ce qui est une valeur très basse, considérée comme valeur "irritante minimale". Même les tests les plus sensibles de l'irritation de l'oeil chez le lapin montrent que la solution de glutaraldéhyde à 0,5% est à la limite de l'induction d'effets inflammatoires. On obtient une forte efficacité tuberculocide (par ex. < 10 minutes à 20 C), peu d'odeur, pratiquement pas de corrosion, en utilisant une formulation aqueuse de glutaraldéhyde (à 0,5%) avec tensioactif anionique (à 0,0625%). Cependant, d'autres applications, telle l'activité virucide, nécessitent de plus grandes concentrations en glutaraldéhyde. La meilleure composition inodore inclut du glycol avec un rapport G/A inférieur à 2. Plus le rapport G/A est faible, plus l'activité

mycobactéricide est grande.

Tous les tests décrits dans la présente demande, sont effectués à 20 C, température recommandée dans l'ancienne méthode AOAC. Après contact des bactéries avec le désinfectant testé, pendant des intervalles de temps variés, on enlève des aliquotes du désinfectant et on les ajoute à un volume égal de solution neutralisante (dans notre étude, il s'agit du métabisulfite de sodium à 0,5%). On dilue ensuite chaque essai de désinfectant neutralisé, qui contient des mycobactéries. On compte les bactéries viables, dans chaque dilution, en utilisant la technique defiltration sur membranes (dimensions des pores 0,4 micromètres). On place ces membranes avec les mycobactéries, sur de l'agar à Mycobacteria 7 H 11. On

met sur plaques chaque désinfectant, en cinq exemplaires.

L'incubation a lieu à 37 C, pendant 21 jours. Les colonies poussant sur la membrane sont comptés à l'aide d'un microscope optique à haute résolution. Toutes les données sont rapportées dans des tableaux de moyennes et mises sous forme de graphiques, en portant en ordonnées le rapport S/S(O)du nombre moyen de survivants au nombre initial et en abscisse le temps. Pour faciliter l'interprétation et la comparaison, on

utilise du papier semi-logarithmique. pour les graphiques.

Pour éliminer l'influence du pH, on tamponne toutes les solutions dans la gamme de pH de 6 à 7,4 et de préférence entre 5,90 et 6,32, avec un mélange de phosphate monobasique

de potassium et de phosphate dibasique de sodium anhydre.

Le composant clé est le monomère de glutaraldéhyde qui est en équilibre réversible avec les polymères lorsque l'on travaille en milieu acide (R.M. G. Boucher, Proc. West Pharmacol. Soc. 16: 282-288, 1973). Le taux de glutaraldéhyde est donné dans la première colonne et varie de 0 à 2% (poids/vol.). On titre la glutaraldéhyde en utilisant la méthode à l'hydrochlorure

d'hydroxylamine (Union Carbide, BB-TL-2003, 1986).

On mentionne ci-dessous deux types de tensioactifs: un non ionique et un anionique. Ces deux types d'agents tensioactifs sont largement utilisés dans les formules de désinfectants pour leurs actions spécifiques sur les composants clés des microorganismes (protéines, enzymes, membranes). Dans le cas des protéines, les tensioactifs non ioniques ne montrent pas d'interactions ou alors très faiblement, tandis que les tensioactifs anioniques montrent une intense interaction avec protéines et polymères. Habituellement, les agents anioniques dissolvent les couches lipidiques protectrices des mycobactéries qui ne sont pas affectées par les agents non ioniques. Généralement, les tensioactifs non ioniques n'inactivent pas ni ne dénaturent les enzymes, tandis que l'on s'attend à ce que les tensioactifs anioniques affectent

l'activité enzymatique.

On a testé comme tensioactif non ionique typique le TERGITOL -S-12 qui a été utilisé avec succès dans une formule de stérilisants acides de glutaraldéhyde (Brevet U.S. No. 3 968 248), connus sous les noms commerciaux de SONACIDE, WAVICIDE, STERALL et BANICIDE. C'est un éthoxylate d'alcools linéaires isomères, dont la formule développée peut s'écrire comme suit:

CH3-(CH2) =-CH(CH2).-CH3

O-(CH2CH20)12-H

o (n+n') = 8 à 12 Le nombre total d'atomes de carbone dans la partie hydrophobe de la molécule est compris entre Il et 15. Ce composé est très stable et est largement utilisé dans l'industrie pour permettre le blanchiment, la coloration, la finition, le dégraissage au solvant, etc. Grace a son caractère peu moussant et ses propriétés mouillantes, ce tensioactif a été utilisé dans de

nombreux détergents pour lave-vaiselle.

Comme tensioactif anionique typique, on utilise la molécule de dodécylsulfate de sodium (SDS) gui est chargée négativement. La formule développée de cette molécule est la suivante: o Il CH3-(CH2)X-O-S-O-Na+

0

avec x= 11.

segment hydrophile Le dodécylsulfate de sodium a souvent été utilisé dans le passé comme additif dans les formules de désinfectants à base de phénol. La quantité de tensioactif ajoutée à nos solutions de gluraraldéhyde est toujours calculée sur la base d'un rapport de 1 à 8, parce que ce rapport a été utilisé avec succès dans les solutions stérilisantes commerciales du type WAVICIDE. En d'autres termes, une solution à 2% de glutaraldéhyde contiendra 0,25% (poids-vol.) de tensioactif anionique ou non-ionique tandis qu'une solution à 0,5% de glutaraldéhyde contiendra 0,062% de tensioactif. Les memes règles s'applicuent aux solutions glycol/glutaraldéhyde

mentionnées dans le tableau IV.

Le pourcentage de tensioactif est indiqué entre parenthèses dans la colonne composition lorsque l'on teste les tensioactifs non ioniques ou anioniques en absence de glutaraldéhyde. Pour montrer l'influence du vieillissement sur les différentes solutions de glutaraldéhyde, certains tests sont effectués

avec des compositions vieillies jusqu'à 11 mois.

Dans les tests du tableau II, les courbes de survivance des mycobactéries des échantillons 1144 et 1143 montrent de très petites différences. Ceci suggère que le tensioactif non ionique ne contribue pas fortement à la pénétration de l'aldéhyde réactive destructrice. Cependant, si l'on remplace le tensioactif non ionique par un tensioactif anionique, tout le reste étant identique, le temps de mort de M.bovis (BCG) est toujours plus court. Il est réduit de 33% avec la formulation à 0,5% (poids/vol.) de glutaraldéhyde et de 20% avec la formule à 2% (voir figure 1). La formule de glutaraldéhyde aqueuse non ionique (c'est-à-dire sans glycol) donne les mêmes résultats (un temps de destruction de 15 minutes à 20 C) dans le cas de solutions vieillies de 2 ou de 11 mois. Ainsi qu'on s'y attendait, les tensioactifs ne montrent pas d'activité tuberculocide lorsqu'ils agissent seuls, aux concentrations utilisées dans nos expériences. La même augmentation de l'activité létale a été observée auparavant (voir R. Boucher, demande de brevet U.S. No. 07/286.738 du 20 décembre 1988), en remplaçant les tensioactifs non ioniques par des anioniques dans des formulations virucides de glutaraldéhyde. Le tableau III montre par exemple les résultats obtenus avec un virus lipophile tel que Herpès Simplex et avec le virus plus résistant Coxsackie B6. Bien qu'il y ait une certaine similitude dans le comportement virucide et mycobactéricide des formulations tensioactif/gluta-raldéhyde, il est impossible de prévoir l'activité mycobactéricide à partir des données obtenues avec les virus. La résistance de M. tuberculosis aux désinfectants est plus grande, de plusieurs ordres de grandeurs, que celle observée avec le virus Coxsackie B6. Le pourcentage de glycol est indiqué entre parenthèses dans la colonne de composition des tableaux II et IV, lorsque le

triéthylène glycol est testé en absence de glutaraldéhyde.

Pour comprendre l'influence du vieillissement sur les différentes formules de glutaraldéhyde/glycol, quelques tests

ont été effectués avec des compositions vieilles de 14 mois.

Tous les tests du tableau IV ont été effectués à 20 C suivant la méthode quantitative EPA. Tous les tests sont effectués avec des solutions tamponnées dans la gamme de pH

de 6 à 6,3.

Les données du tableau II montrent que la présence ou l'absence de tensioactifs non ioniques ne semble pas influencer l'efficacité tuberculocide de solutions aqueuses de glutaraldéhyde. Le même phénomène a été observé avec des solutions glycol/glutaraldéhyde (échantillons 0215 et 1784). Cependant, contrairement aux résultats obtenus avec les solutions aqueuses sans glycol, la présence de tensioactifs

anioniques (1403 et 1407) n'augmente DaQ l'.%ffin--ni t-

tuberculocide dans ces conditions.

L'activité mycobactéricide d'échantillons agés de 9 mois (0217) est comparable à celle de solutions âgées de 2 mois (1403 et 1417). Cependant, comme attendu, les échantillons ggés de 14 mois montrent un fort jaunissement de la solution et demandent un temps plus long (40 minutes) pour tuer M. tuberculosis. Les tests furent aussi réalisés avec l'échantillon 2077, qui contenait la meme quantité de glutaraldéhyde et de tensioactif non ionique que les échantillons sans glycol 1144 et 1546 Comme on le voit sur la courbe de survivance (figure 2) la

présence de triéthylène-glycol double le temps "tuberculocide".

Des tests similaires, réalisés avec des solutions anioniques contenant le meme 0.5% de glutaraldéhyde (1145 et 2355), montrent une augmentation du temps " tuberculocide" de 10 à 30

minutes en présence de glycol.

Dans l'art antérieur, des accroissements significatifs de l'activité létale ont été observés seulement avec de grandes quantités de phénols (au moins 1,7%) en présence de 2,5% de glutaraldéhyde. Une si grande concentration en phénol provoque non seulement une forte odeur mais accroit l'odeur de

glutaraldéhyde à cause d'une évaporation accrue de celle-ci.

(voir brevet U.S. No. 4 436 754). L'influence du phénol sur la présente formulation de glutaraldéhyde/glycol, contenant deux tensioactifs différents, est indiquée par les échantillons témoins 2078 et 2079 du tableau IV, qui montre une influence

totalement négative du phénol dans nos conditions opératoires.

La production de solutions mycobactéricides contenant les trois produits chimiques suivants: glutaraldéhyde aqueuse, triéthylène glycol (TEG) et dodécylsulfate de sodium (SDS), est très facile vu que le TEG et le SDS se dissolvent tous deux en quelques minutes dans une solution aqueuse de glutaraldéhyde acide sous faible agitation à la température ambiante. D'autres substances peuvent etre ajoutées aux compositions nouvelles et originales faisant l'objet de la présente invention, pourvu qu'elles n'aient aucun effet dommageable sur l'activité mycobactéricide des solutions. Par exemple, de petites quantités de sels de l'acide éthylènediamine tétra-acétique (EDTA), ou de lysozyme peuvent être ajoutées pour accélérer la destabilisation des couches protectrices faites de lipides et de peptidoglycanes. D'autres sels tel le glucinate de sodium peuvent aussi etre ajoutés pour neutraliser la précipitation d'ions' calcium durant la

dilution de la formulation par de l'eau dure. Des agents anti-

mousse tels que des composés organo-silicones, des agents anti-corrosifs comme le nitrite de sodium, des colorants et des parfums pour améliorer l'image commerciale peuvent aussi être ajoutés, pour autant qu'ils n'affectent pas négativement

les mécanismes destructeurs.

Bien que divers exemples spécifiques du concept de l'invention aient été décrits dans un but illustratif, l'invention ne devrait pas ëtre interprétée comme étant limitée à ceux-ci, ni aux faits spécifiques mentionnés ici. Il est aussi bien entendu que des changements, des modifications, et des variantes peuvent être prévus sans sortir du champ de la présente invention. Par exemple, connaissant les excellentes propriétés mycobactéricides des solutions alcooliques, les alkanols de faible poids moléculaire tels que méthanol, éthanol, isopropanol et semblables, peuvent être utilisés comme solvants, au lieu de l'eau filtrée désionisée. Un mélange des deux types de solvants peut aussi etre utilisé. Ces modifications mineures de la composition en solvant seront dictées par la nature de l'application: décontamination des instruments, de surfaces vivantes ou inertes, décontamination de la peau, nettoyage de blessures, etc.

TABLEAU I

Nombres d'organismes de M. Bovis BCG survivants après une exposition à des solutions fraîches de désinfectants à base de glutaraldéhyde, à 20 C, pendant des intervalles

de temps variés.

Temps Solutio de Solution de (rmin) CIDEX.) CIDEX FORMULA;' Sporicidir Sonacide@O Steril-Ize) GlutareS) umiicide @ 0 4.02 x 105 4.47 x 105 4.47 x 105 4.47 x 105 4.47 x 105 4.47 x 105 4.47 x 105 1 3.90 x 104 5.30 x 104 3.58 x 105 3.42 x 105 5.85 x 104 5.35 x 104 6.75 x 104 2 2.28 x 104 5.35 x 104 2.77 x 105 3.50 x 105 2.98 x 104 5.30 x 104 4.90 x 104 1.80 x 104 4. 00 x 104 1.26 x 105 2.27 x 105 2.40 x 104 3.70 x 104 3.96 x 10 9.80 x 103 2.07 x 104 6.30 x 104 1.10 x 105 7.30 x 103 2.16 x 104 1.51 x 104 1.01 x 103 6.67 x 103 3.96 x 104 1.02 x 10 2.53 x 102 7.86 x 103 3.91 x 103 Reproduction de la page 3 de l'article de J. M. Ascenzi, T. M. Wendt, and J.W. McDowell: "Important Information Concerning the Reuse of Glutaraldehyde-Based Disinfectants'and their

Tuberculocidal Activity", published by Research Division, Surgikos, Inc., octobre 1984.

o PON co -'-

TABLEAU II

Tests mycobactéricides de mycobactérium tuberculosis (TB) effectués selon la méthode quantitative de P'EPA,

notice PR 80-1, du 28 mai 1986.

Glut = glutaraldéhyde TA = tensioactif Concentration de Temps de desSolutions Echantillon Composition glutaraldéhyde truction du TB PH Age 1546 et 1144 Glut + TA non-ionique 0.5 % 15 min. 5.9-6.32 11 et 2 mois 1143 Glut 0.5 % 15 min. 6.30 2 mois 1145 Glut + TA anionique 0.5 % 10 min. 6.40 2 mois 1147 TA anionique (0.062 %) 0.0 % pas destruction 6.35 2 mois 1150 TA non-ionique (0.062 %) 0.0 % pas destruction 6.38 2 mois 1255 Glut + TA non-ionique 2.0 % 10 min. 6.30 2 1/2 mois 1256 Glut + TA non- ionique 2.0 % 10 min. 6.30 2 1/2 mois 2353 Glut + TA anionique 2.0 % 8 min. 6.29 I mois Les tensioactifs mentionnés dans les tableaux 11, 111 et IV sont le dodécylsulfate de sodium (anionique) et

l'éthoxylate d'alcools linéaires isomères (non-ionique), qui sont mentionnés dans la présente description.

IN) o o Ln Co

TABLEAU III

Etude d'inactivation de deux virus à l'aide de la formule tensioactif/glutaraldéhyde % d'activité virale restante après 10 minutes d'exposition Type de virus testés Glutaraldéhyde (0.006 %) + tensioactif non-ionique (0.05 %) 100 % Coxsackie Virus B6 (CBV) Glutaraldéhyde (0.006 %) + tensioactif anionique (0.05 %) 40 % Coxsackie Virus B6 (CBV) Glutaraldéhyde (0.0025 %) + tensioactif non-ionique (0.0005 %) 50 % HerpesSimplex Virus Type I (HSV) Glutaraldéhyde (0.0025 %) + tensioactif anionique (0.0005 %) 32 % Herpes Simplex Virus Type I (HSV)

Tests virucides effectués selon la notice de l'EPA DIS/TSS-7 du 12 novembre 1981.

os o (3o ",4 s

TABLEAU IV

Tests mycobactéricides effectués selon la méthode quantitative de I'EPA, notice PR 80-1 du 28 mai 1986.

Glut = glutaraldéhyde TEG = triéthylène glycol TB = mycobacterium bacillus TA = tensioactif Concentration dé Temps de des- Solutions Echantillon Composition glutaraldéhyde truction de TB PH Age 0148 et 0215 Glut + TEG + TA non-ionique 0.25 % 30 min. 6.13-6.00 6 mois 1788 Glut + TEG + TA non-ionique 0.25 % 30 min. 6.22 3 mois Ni 1784 Glut + TEG 0.25 % 30 min. 6.20 3 mois 1362 TEG (1.5%) + TA non-ionique (0.031%) 0.00 % pas destruction 6.34 3 mois 1257 Glut + TEG + TAanionique 0.25 % 40 min. 6.35 14 mois 0217 Glut + TEG + TA anionique 0.25 % 30 Min. 5.97 9 mois 1403 et 1417 Glut + TEG + TA anionique 0.25 6 30 min. 6.25-6.31 2 mois 1361 et 1792 TEG (1.5%) + TA anionique (0.031%) 0.00 % pas destruction 6.32-6.28 2 ois 2077 Glut + TEG + TA non-ionique 0.50 % 30 min. 5.90 2 mois 2355 Glut + TEG + TA anionique 0.50 % 30 min. 6.04 I mois 2080 TEG (3%) + TA anionique (0.062%) 0.00 96 pas destruction 6.31 2 mois 2078 Glut + TEG + TA non-ionique + Phénol 0.50 6 60 min. 6,07 2 mois 2079 Glut + TEG + TA anionique + (0.5%) 0.50 % pas destruction 6.31 2 mois Phénol (0.5%) o' \o co -,

TABLEAU V

Influence du rapport glycol/aldéhyde (G/A) sur l'activité mycobactéricide de Mycobacterium Tuberculosis (TB) (a) Glutaraldéhyde (0.5 %) + solution anionique (0.0625 %)

G/A O 0.1 0.25 0.75 1 1.2 2 6

Triéthylène glycol sans 0.05 0.125 0.375 0.5 0.6 I 3 en % (poids/vol.) Contrôle de l'odeur * - + + + + + + + o'x Temps de destruction en minutes du TB 10 10 15 15 20 20 à 30 30 à40 30 à h40 (b) Glutaraldéhyde (0.5 %) + solution non-ionique (0.0625 %)

G/A O 0.1 0.25 0.75 I 1.2 2 6

Triéthylène glycol en % (poids/vol.) sans 0.05 0.125 0.375 0.5 0.6 I 3 Contrôle de l'odeur * - + + + + + + Temps de destruction en minutes du TB 15 15 20 20 30 30 à 40 30 à 40 30 à 40

* Un taux de 0.5 % en glutaraldéhyde est le seuil pour le contrôle de l'odeur.

\o tA Cl Co "-,

Claims (10)

RRVENDICATIONS

1. Solution mycobactéricide exempte de phénol, caractérisée en qu'elle contient: a) un solvant consistant en un alkanol de faible poids moléculaire ou de l'eau; b) une mono ou dialdéhyde saturée contenant de 2 à environ 6 atomes de carbone; c) un agent réducteur d'odeur choisi dans le groupe des composés glycols constitué par: l'éthylène glycol, le propylène glycol, le diéthylène glycol, le triéthylène glycol, le polyéthylène glycol ou le polypropylène glycol; d) un tensioactif anionique ayant une groupement hydrophile chargé négativement choisi dans le groupe constitué par: les sulfates d'alkyle, le sulfonates d'alkyle, les sulfates d'alcools, les sulfonates d'alkyl-aryle, et les sulfosuccinates de - dialkyle; e) des sels tampons stabilisant le pH de la solution dans la

gamme de 6 à' 7,4.

2. Solution selon la revendication 1, caractérisée en ce que

ladite dialdéhyde est la glutaraldéhyde.

3. Solution selon la revendication 1, caractérisée en ce que

ledit réducteur d'odeur est le triéthylène glycol.

4. Solution selon la revendication 1, caractérisée en ce que le

tensioactif est le dodécylsulfate de sodium.

5. Solution selon la revendication 1, caractérisée en ce que les composés glycols sont présents dans un rapport compris entre 0,1 et 6,0 relativement aux mono et dialdéhydes saturées.

6. Solution selon la revendication 1, caractérisée en ce que le tensioactif anionique représente de 0,02% à 10% en poids de la solution.

7. Solution selon la revendication 1, caractérisée en ce que l'aldéhyde saturée représente de 0,1% à 16% en poids de la solut.ion.

8. Solution selon la revendication 1, capable de détruire Mycobactérium Tuberculosis sur des surfaces en 10 minutes au maximum, caractérisée en ce qu'elle a un contenu en aldéhyde de 0,5% ou plus (en poids), déterminé selon le procédé quantitatif du 28 mai 1986 de l'Agence pour la Protection de

l'Environnement (EPA) des Etats-Unis.

9. Solution selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle contient un sel tampon choisi dans le groupe constitué par: les carbonates, les bicarbonates, les phosphates et les borates de métaux alcalins, les sels organiques d'acide

carboxylique, et les mélanges de ceux-ci.

10. Solution selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle a un pH compris entre 5,9 et 6,32 obtenu par un mélange de phosphate mono-basique de potassium ou de sodium,

et de phosphate dibasique de sodium anhydre.