FR2588383A1

FR2588383A1 - NOVEL PROCESS FOR RECOVERING AND DETERMINING MICROQUANTITES OF DESOXYRIBONUCLEIC ACID IN A CELLULAR BIOLOGICAL LIQUID

Info

Publication number: FR2588383A1
Application number: FR8514730A
Authority: FR
Inventors: Gilbert Fournie; Martine Taminh; Nee Gayral; Jean Conte; Jean-Pierre Bouche
Original assignee: Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Current assignee: Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Priority date: 1985-10-04
Filing date: 1985-10-04
Publication date: 1987-04-10
Also published as: FR2588383B1; EP0238593A1; WO1987002064A1

Abstract

The method disclosed is intended for the recovery and dosing of microquantities of DNA and comprises a first step of elimination of the proteins which are present, a second step of recovery of the DNA, which step comprises the precipitation of DNA by addition of a coprecipitation agent and a precipitation agent, a third step of marking by ''Nick Translation'' of the DNA to be recovered, and a fourth step of dosing. Application to the recovery and dosing of microquantities of DNA in an acellular biological liquid.

Description

La présente invention est relative a un nouveau procédé de récupération et de dosage de microquantités d' acide désoxyribonucléique (ADN) dans un liquide biologique acellulaire en particulier le plasma sanguin. The present invention relates to a novel method for recovering and assaying microquantities of deoxyribonucleic acid (DNA) in an acellular biological fluid, particularly blood plasma.

Le dosage de 1'ADN circulant et notamment de 1'ADN présent dans le sang, en position extra-cellulaire, présente un grand intérêt tant sur le plan physiologique que sur le plan pathologique. The assay of the circulating DNA, and in particular the DNA present in the blood, in the extracellular position, is of great interest both physiologically and pathologically.

1. Sur le plan physiologique, la présence d'ADN circulant chez des personnes "en situation normale" peut dépendre de deux types de phénomènes qui peuvent être qualifiés de passifs ou d'actifs. D'un côté, en effet, la mort cellulaire est un phénomène physiologique normal et permanent qui peut se traduire au delà de la lyse cellulaire, par la libération dans le sang d'une certaine quantité d'acides nucléiques. 1. Physiologically, the presence of circulating DNA in "normal" individuals may depend on two types of phenomena that can be classified as passive or active. On the one hand, cell death is a normal and permanent physiological phenomenon that can be translated beyond cell lysis, by the release into the blood of a certain quantity of nucleic acids.

D'un autre côté, il est possible que la présence d'ADN dans le sang soit (en partie) le résultat d'un phénomène actif d'excrétion de 1'ADN par certaines cellules. Ce processus pourrait (pour certains auteurs) représenter un mécanisme d'information ou de communication inter-cellulaire.On the other hand, it is possible that the presence of DNA in the blood is (in part) the result of an active phenomenon of excretion of DNA by certain cells. This process could (for some authors) represent an inter-cellular information or communication mechanism.

2. D'un point de vue pathologique, il est possible que dans certaines circonstances, 1'ADN circulant puisse se trouver "anormalement présent" (soit d'un point de vue quantitatif, soit d'un point de vue qualitatif) dans le sang. 2. From a pathological point of view, it is possible that under certain circumstances, circulating DNA may be "abnormally present" (either quantitatively or qualitatively) in the blood.

La signification de ce phénomène n'est pas univoque
a) Il est possible que 1'ADN circulant puisse jouer un rôle pathogène. Plusieurs mécanismes peuvent être invoqués (i) présent dans le sang en quantité anormalement élevée, 1'ADN circulant peut perturber du fait de ses propriétés physico-chimiques (notamment de sa haute viscosité) le fonctionnement normal de la micro-circulation dans certains tissus et/ou organes. Celez peut être le cas par exemple au cours de la mise en oeuvre de traitements cytolytiques chez des patients atteints de néoplasie ou de leucémie (ii) 1'ADN peut être également responsable de l'activation de mécanismes pathogènes telle l'activation des systèmes de la coagulation et du complément (iii) on peut encore supposer que 1'ADN puisse, dans certaines circonstances, jouer un rôle pathogène du fait de propriétés "génétiques" spécifiques, en s'intégrant au génome de l'hôte par un phénomène semblable à une transformation ; (iv) enfin, 1'ADN circulant pourrait jouer un rôle pathogène par I'intermédiaire de la formation de complexes immuns ADM-anticorps anti-ADN. C'est le mécanisme physiopathologique qui a été retenu depuis une vingtaine d'années pour expliquer le développement des lésions tissulaires (en particulier glomerulaires) apparaissant chez les patients atteints de lupus érythémateux disséminé (LED) ainsi que chez les souris développant de manière spontanée des maladies lupiques comparables, telles les souris NZBxNZW.La mise en évidence in vitro d'une affinité particulière de 1'ADN pour le collagène pourrait expliquer la généralisation au sein de l'organisme des dépôts de tels complexes et suggère que, dans certaines circonstances, 1'ADN adsorbe sur des structures collagéniques pourrait jouer le rôle d'immunoadsorbant vis à vis d'anticorps anti-ADN libres. I1 faut ajouter que les résultats d'études expérimentales effectuées chez des souris "non lupiques" infectées par des endotoxines bactériennes ou infectées par Escherichia coli suggèrent que la formation de complexes ADN-anticorps anti-ADN peut également jouer un rôle pathogène lors du développement de diverses glomérulonéphrites a complexes immuns.The meaning of this phenomenon is not unambiguous
a) Circulating DNA may play a pathogenic role. Several mechanisms can be invoked (i) present in the blood in abnormally high amounts, the circulating DNA can disturb because of its physicochemical properties (especially its high viscosity) the normal functioning of the microcirculation in certain tissues and tissues. or organs. This may be the case, for example, during the implementation of cytolytic treatments in patients with neoplasia or leukemia. (Ii) DNA may also be responsible for the activation of pathogenic mechanisms such as the activation of coagulation and complement (iii) it can still be assumed that DNA may, under certain circumstances, play a pathogenic role due to specific "genetic" properties, integrating into the host genome by a phenomenon similar to a transformation; (iv) finally, circulating DNA could play a pathogenic role through the formation of ADM-DNA antibody immune complexes. It is the physiopathological mechanism that has been retained for twenty years to explain the development of tissue lesions (particularly glomerular) occurring in patients with systemic lupus erythematosus (SLE) as well as in spontaneously developing mice. comparable lupus diseases, such as NZBxNZW mice. In vitro demonstration of a particular affinity of DNA for collagen could explain the generalization within the body of deposits of such complexes and suggests that under certain circumstances, DNA adsorbed on collagenous structures could act as an immunoadsorbent against free anti-DNA antibodies. It should be added that the results of experimental studies carried out in "non-lupus" mice infected with bacterial endotoxins or infected with Escherichia coli suggest that the formation of DNA-anti-DNA antibody complexes can also play a pathogenic role in the development of various immune complex glomerulonephritis.

b) A côté de la possibilité du rôle pathogène que peut jouer 1'ADN circulant,la présence "anormale" d'ADN (sur un plan quantitatif ou qualitatif) peut revêtir une signification étiopathogénique ou physiopathologique. I1 est possible tout d'abord que, au cours de certaines affections (infectieuses en particulier), 1'ADN "spécifique d'un agent pathogène" (viral par exemple) puisse être présent dans le sang. La détection et l'identification de cet ADN peut revêtir alors un intérêt étiologique. I1 a, par exemple, été montré que des patients porteurs chroniques de l'antigène de l'hépatite B possèdent dans leur plasma de 1'ADN circulant capable de s'hybrider avec de 1'ADN extrait de particules virales du virus de l'hépatite B.D'un autre côté, il est également possible que la libération dans le sang d'ADN en quantité anormalement élevée traduise des processus pathologiques précis. On peut envisager par exemple qu'une atteinte inflammatoire vasculaire s'accompagne du passage "rapide" de matériel nucléaire dans le sang du fait de l'absence de 'filtre enzymatique tissulaire" et de la libération "directe" de matériel nucléaire dans le secteur vasculaire. b) In addition to the possibility of the pathogenic role that circulating DNA may play, the "abnormal" presence of DNA (quantitatively or qualitatively) may have an etiopathogenic or physiopathological significance. It is possible first of all that, during certain (particularly infectious) affections, the "pathogen-specific" DNA (viral for example) may be present in the blood. Detection and identification of this DNA may then be of etiological interest. For example, chronic hepatitis B antigen-bearing patients have been shown to have circulating DNA in their plasma capable of hybridizing with DNA extracted from viral particles of the hepatitis B virus. Hepatitis B. On the other hand, it is also possible that the release of abnormally high amounts of DNA into the blood translates specific pathological processes. For example, it may be envisaged that a vascular inflammatory attack is accompanied by the "rapid" passage of nuclear material into the blood due to the absence of a "tissue enzymatic filter" and the "direct" release of nuclear material into the sector. vascular.

Compte tenu de l'intérêt que présente le dosage de 1'ADN circulant, différentes techniques, colorimétriques, fluorimétriques ou immunologiques ont été proposées. In view of the interest involved in circulating DNA assay, various techniques, colorimetric, fluorimetric or immunological, have been proposed.

Cependant, l'utilisation de ces techniques,en perticu- lier pour le dosage de 1ADN plasmatique, rencontre des limites et présente des difficultés : ces difficultés ou limites se rapportent essentiellement à la spécificité, à la sensibilité et au caractère quantitatif des méthodes proposées. However, the use of these techniques, in particular for the plasma DNA assay, has limitations and presents difficulties: these difficulties or limits relate essentially to the specificity, sensitivity and quantitative nature of the methods proposed.

a) La spécificité : deux aspects concernant le problème de la spécificité doivent être considérés ; (i) de nombreuses substances peuvent interférer avec les méthodes colorimétriques (telle la classique méthode de Burton),fluorimétriques ou immunologiques. Dans ces conditions, ne peuvent être considérés comme interprétables que les résultats des méthodes comportant un dosage contrôle de 1'ADN après traitement des échantillons par une préparation purifiée de désoxyribonucléase ; (ii) le second aspect à considérer est le fait qu'il devrait être nécessaire de déterminer avec exactitude si 1'ADN "spécifiquement" mis en évidence (ou dosé) dans le sang se trouvait bien en situation extracellulaire au moment du prélèvement et ne provenait pas de la lyse artificielle des cellules nuclées du sang. (a) Specificity: two aspects concerning the problem of specificity must be considered; (i) many substances may interfere with colorimetric methods (such as the classic Burton method), fluorimetry or immunology. In these circumstances, only the results of methods comprising a DNA control assay after treatment of the samples with a purified deoxyribonuclease preparation can be considered as interpretable; (ii) the second aspect to be considered is the fact that it should be necessary to accurately determine whether DNA "specifically" detected (or assayed) in the blood was in an extracellular situation at the time of collection and did not come from the artificial lysis of nucleated blood cells.

b) La sensibilité : les méthodes ci-dessus mentionnées possèdent une sensibilité limitée qui ne permet en aucune manière de doser 1'ADN circulant chez les sujets normaux. b) Sensitivity: the methods mentioned above have a limited sensitivity which does not allow in any way to measure the circulating DNA in normal subjects.

La sensibilité maximale rapportée dans la littérature est de 20 à 50 ng/ml pour 1'ADN en double hélice et de 100ngXml pour 1'ADN en simple hélice (STEItaMAI4, ARTH. RHEUM. 1982, 25, 1425-143C),concentrations qui ne sont pas atteintes chez les sujets normaux.The maximum sensitivity reported in the literature is 20 to 50 ng / ml for double-helix DNA and 100 ng / ml for single-helix DNA (STEItaMAI4, ARTH, RHEUM, 1982, 25, 1425-143C), concentrations which are not affected in normal subjects.

c) Le caractère quantitatif : les techniques immunologiques qui sont parmi les plus sensibles ne sont pas quantitatives et ce, pour plusieurs raisons i) le principe même de la méthode peut faire que celle-ci
n'est à la base que semi-quantitative C'est le cas de
la contre-immunoélectrophorèse ii) la taille des molécules d'ADN est très variable et pour
une même quantité d'ADN, le nombre de molécules pouvant
réagir avec le "substrat immunologique" (les anticorps
anti-ADN en l'occrrrence) est variable d'un échantillon
à l'autre (iii) certaines substances (telles des proteines capables de fixer 1'ADN de manière spécifique ou non) peuvent interférer dans le dosage.(c) Quantitative nature: immunological techniques, which are among the most sensitive, are not quantitative, for several reasons: (i) the very principle of the method may make it
only semi-quantitative basis This is the case of
counter-immunoelectrophoresis ii) the size of the DNA molecules is very variable and for
the same amount of DNA, the number of molecules
react with the "immunological substrate" (antibodies
anti-DNA in the occrrrence) is variable of a sample
to the other (iii) some substances (such as proteins capable of binding DNA specifically or not) may interfere with the assay.

Pour surmonter ces limites et difficultés, il a été proposé de purifier les préparations d'ADN plasmatique préalablement à leur dosage, en les débarrassant des divers constituants qui les accompagnent dans le plasma, en particulier des protéines. D'autre part, il a été proposé (cf. To overcome these limitations and difficulties, it has been proposed to purify the plasma DNA preparations prior to their assay, by ridding them of the various constituents that accompany them in the plasma, in particular proteins. On the other hand, it has been proposed (cf.

RAPTIS et al. J. CLIN. INVEST., 66, Décembre 1980, 13911399) de quantifier et de caractériser 1'ADN plasmatique normal et 1'ADN plasmatique provenant de patients atteints de lupus érythémateux systémique (SLE) après l'avoir purifié et l'avoir marqué in vitro en utilisant la technique de "Dlick Translation"-elle-même décrite précédemment dans
RIGBY et al., J. MOL. BIOL. (1977), 113, 237 - 251-
Comme on le sait, le marquage à l'aide de la technique de "Nick Translation" consiste à incorporer des molécules de désoxyribonucléotides dans 1'ADN. Cette technique utilise deux enzymes, la désoxyribonucléase et l'ADN-polymérase d'Escherichia coli. La désoxyribonucléase réalise des coupures -ou nicks- dans les brins d'ADN.RAPTIS et al. J. CLIN. Invest., 66, December 1980, 13911399) to quantify and characterize normal plasma DNA and plasma DNA from patients with systemic lupus erythematosus (SLE) after purifying and labeling it in vitro using the "Dlick Translation" technique, itself described previously in
RIGBY et al., J. MOL. BIOL. (1977), 113, 237 - 251-
As is known, tagging using the "Nick Translation" technique involves incorporating deoxyribonucleotide molecules into the DNA. This technique uses two enzymes, deoxyribonuclease and Escherichia coli DNA polymerase. The deoxyribonuclease makes cuts - or nicks - in the DNA strands.

L'ADN-polymérase peut alors, sous l'effet de son activité exo.nucléasique 5'-3', détacher des nucléotides du côté 5'- de la coupure. L'élimination des nucléotides et l'addition séquentielle de nucléotides sur le côté 3'- entrainent la progression de la coupure ("Translation") le long de 1'ADN. En remplaçant les nucléotides pré-existants par des nucléotides marqués soit par un isotope radioactif soit par une substance pouvant être révélee à l'aide d'une réaction enzymatique, il est possible de préparer des
ADN marqués d'activité spécifique très élevée, l'activité spécifique de 1' ADN étant fonction de l'activité spécifique des substrats et de l'étendue du remplacement des nucléotides.The DNA polymerase can then, under the effect of its 5'-3 'exonucleic activity, detach nucleotides from the 5'-side of the cleavage. The elimination of nucleotides and the sequential addition of nucleotides on the 3'- side cause the translation to progress along the DNA. By replacing the pre-existing nucleotides with nucleotides labeled either with a radioactive isotope or with a substance that can be revealed by an enzymatic reaction, it is possible to prepare
DNA labeled with very high specific activity, the specific activity of the DNA being a function of the specific activity of the substrates and the extent of nucleotide replacement.

Alors que RIGBY et Al. ont utilisé comme matière première,de l'ADN d'origine cellulaire, RAPTIS a appliqué la technique de"Nick Translationin vitro à de 1'ADN circu lantplasmatiquepurifié, pour obtenir un ADN marqué in vitro qui, en raison de sa radioactivité très élevée, permet une très grande sensibilité de mesure. While RIGBY et al. Used as raw material, DNA of cellular origin, RAPTIS applied the technique of "Nick Translationin vitro to purified circulating plasmatic DNA, to obtain a DNA labeled in vitro which, because its very high radioactivity, allows a very high sensitivity of measurement.

Selon RAPTIS et Al. la réaction de"Nick Trains la tion"doit être réalisée dans un milieu contenant 50 mM de tampon Tris-HCl, pH 7,6, 10 mM de 2-mercaptoéthanol, 5 mM de MgC12 et 50 vg/ml de BSA (sérum-albumine bovine) mis en contact avec 0,25 nmoles de chacun des quatre dXTP marqués, par réaction, et 1U/réaction (ou 0,1 p1) de préparation enzymatique (ADN-polymérase), tandis que le produit résultant est extrait à deux reprises par du phénol redistillé. According to RAPTIS et al., The "Nick Trains tion" reaction must be carried out in a medium containing 50 mM Tris-HCl buffer, pH 7.6, 10 mM 2-mercaptoethanol, 5 mM MgCl 2 and 50 μg / ml. of BSA (bovine serum albumin) contacted with 0.25 nmol of each of the four labeled dXTPs, by reaction, and 1U / reaction (or 0.1 μl) of enzymatic preparation (DNA polymerase), while the product resulting is extracted twice with redistilled phenol.

L'ADN plasmatique soumis à la réaction de"Nick
Translation"est obtenu selon RAPTIS et Al. à partir de plasma dilué 4 fois dans 50 mM de tampon Tris-HCl, pH 8,5, 20 mM d'EDTA contenant 1 % de dodécylsulfate de sodium,puis incubé (20 ml) avec 50 ml de pronase, pendant 4 heures à 370C, l'incubation étant suivie d'extractions séquantielles avec du phénol, un mélange 24::1 de chloroforme et d'alcool isoamylique, et de l'éther, de dialyse contre 20 mM de tampon
Tris-HCl, pH 7,6, 10 mM de NaCl, 5 mM d'EDTA, d'une digestion de l'extrait par 10 Vg/ml de ribonucléase pancréatique pendant 30 minutes à 370C et éventuellement d'une étape de purification comprenant une adsorption sur une colonne de
BND-cellulose à pH 8,1 et une élution, d'une précipitation par de l'éthanol, suivie d'une remise en suspension du résidu solide dans 100 ul de tampon Tris-HCl, 10 mM, pH 7,6 et 1 mM d'EDTA.Plasma DNA submitted to Nick's reaction
Translation "is obtained according to RAPTIS et al. From plasma diluted 4 times in 50 mM Tris-HCl buffer, pH 8.5, 20 mM EDTA containing 1% sodium dodecyl sulfate, and then incubated (20 ml) with 50 ml of pronase, for 4 hours at 37 ° C., the incubation being followed by sequential extractions with phenol, a 24: 1 mixture of chloroform and isoamyl alcohol, and ether, dialysis against 20 mM of buffer
Tris-HCl, pH 7.6, 10 mM NaCl, 5 mM EDTA, digestion of the extract with 10 μg / ml pancreatic ribonuclease for 30 minutes at 370 ° C. and optionally a purification step comprising adsorption on a column of
BND-cellulose at pH 8.1 and elution, precipitation with ethanol, followed by resuspension of the solid residue in 100 μl of Tris-HCl buffer, 10 mM, pH 7.6 and 1 mM EDTA.

Enfin, la détermination de la radioactivité des fractions résultant de l'analyse par sedimentation neutre par un gradient de saccharose et de fractions résultant de l'analyse par centrifugation à l'équilibre dans du CsCl, comparée à une courbe standard des comptages/minute obtenus en fonction de la quantité d'ADN de phages X utilisée dans chaque réaction de Nick Translation, permet d'obtenir la quantité d'ADN, à condition que celle-ci se trouve dans une gamme comprise entre 0,01 et 0,1 ijg d'ADN de phages A. Finally, the determination of the radioactivity of the fractions resulting from the analysis by neutral sedimentation by a sucrose gradient and fractions resulting from the analysis by equilibrium centrifugation in CsCl, compared to a standard curve of the counts / minute obtained depending on the amount of phage X DNA used in each Nick Translation reaction, gives the amount of DNA, provided that it is in a range of 0.01 to 0.1 μg. of phage DNA A.

Cette méthode relativement peu sensible et passablement complexe, est issue de la méthode de RIGBY et
Al. qui, si elle préconise la méthode relativement simple de comptage de la radioactivité sur des disques de papier-filtre, utilise cependant comme mélange réactionnelpour la"Nick
Translation",pour 120 p1, 50 mM de phosphate de potassium (pH 7,4), 5 mM de MgC12, 15 M de dTTP et de dGTP et 15 à 20 M de [α;32P] dCTP, avec une concentration d'ADN de l'ordre de 15 g/ml, et une incubation d'une minute à la température ambiante avec 1,33 ng dans 10 p1 d'ADN-ase I activée, puis à 140C avec 6 vg (4 p1) d'ADNpolymérase I suivies de l'adjonction de 60 ijl d'EDTA 0,25 M (pH 7,4) (éventuellement suivie d'une extraction par du phénol) et d'un chauffage de 10 minutes à 680C.This relatively insensitive and fairly complex method is derived from the method of RIGBY and
Al. Which, though it advocates the relatively simple method of counting radioactivity on filter paper discs, however uses as a reaction mixture for the "Nick"
Translation "for 120 μl, 50 mM potassium phosphate (pH 7.4), 5 mM MgCl2, 15 M dTTP and dGTP and 15-20 M [32 P] dCTP, with a concentration of DNA of the order of 15 g / ml, and incubation for one minute at room temperature with 1.33 ng in 10 μl of activated DNA-ase I, then at 140 ° C. with 6 μg (4 μl) of DNA polymerase I followed by the addition of 60 μl of 0.25 M EDTA (pH 7.4) (optionally followed by phenol extraction) and heating for 10 minutes at 6 ° C.

Cette méthode peut être mise en oeuvre sur de faibles volumes, de l'ordre du microlitre, mais elle est inutilisable pour le but que s'est fixée la présente invention, à savoir la récupération de microquantités d'ADN dans un milieu biologique liquide acellulaire. This method can be implemented on small volumes, of the order of a microliter, but it is unusable for the purpose that the present invention has set itself, namely the recovery of microquantities of DNA in an acellular liquid biological medium .

La présente invention a pour but de pourvoir à un procédé de récupération et de dosage de microquantités d'ADN, qui répond mieux aux nécessités de la pratique que les procédés proposés dans l'Art antérieur, notammenten ce que le nouveau procédé conforme à la présente invention - est réellement quantitatif, ce que ne sont pas les methodes
basées sur des réactions immunochimiques telles que la
réaction d'inhibition de la fixation de 1'ADN décrite par
LEON et Al. dans 1'Article cité plus haut, ou la méthode de contre-immunoélectrophorèse décrite par DAVIS.- et DIVIS dans ARTH. RHEUM. (1973), 16, 52-58 - est spécifique de 1'ADN et ne peut être influencé ni par
des anticorps anti-ADN ou d'autres protéines qui fixent
1'ADN, qui peuvent interférer dans les tests basés sur des
réactions immunologiques, ni par des substances suscepti
bles d'interférer dans les tests colorimétriques ou fluo
rimétriques précédemment décrits (cf. notamment, STEINMAN,
J. CLIN, INVEST. (1975), 56, 512-515) - ne requiert que quelques microlitres de plasma, est rapide,
fiable et est d'une très grande sensibilité, et peut être
mis en oeuvre simultanément sur de nombreux échantillons.The object of the present invention is to provide a method for recovering and assaying micro-quantities of DNA, which better meets the requirements of the practice than the methods proposed in the prior art, especially since the new method complies with the present invention. invention - is actually quantitative, which are not the methods
based on immunochemical reactions such as
DNA binding inhibition reaction described by
LEON et al. In the aforementioned article, or the method of counter-immunoelectrophoresis described by DAVIS.- and DIVIS in ARTH. RHEUM. (1973), 16, 52-58 - is specific to DNA and can not be influenced by
anti-DNA antibodies or other proteins that bind
DNA, which can interfere with tests based on
immunological reactions, nor by substances
interfering in colorimetric or fluorescent tests
previously described (see, in particular, STEINMAN,
J. CLIN, INVEST. (1975), 56, 512-515) - requires only a few microliters of plasma, is fast,
reliable and is of a very high sensitivity, and can be
implemented simultaneously on many samples.

La présente invention a pour objet un procédé de récupération et de dosage de microquantitês d'ADN dans un liquide biologique acellulaire, en particulier le plasma sanguin, qui est caractérisé en ce qu-'il comprend les étapes successives suivantes - une première étape d'élimination des protéines présentes dans le liquide biologique acellulaire dans lequel on veut doser 1'ADN, qui consiste à extraire un mélange dudit liquide biologique et d'acide éthylènediamine tétraacétique (EDTA) par du phénol saturé par du Tris-hydroxyaminométhane (pH 8 environ), pour obtenir une phase aqueuse pratiquement dépourvue de protéines et contenant sensiblement la totalité de 1'ADN ;; - une deuxième étape de récupération de 1'ADN de ladite solu
tion aqueuse, qui consiste à précipiter 1'ADN par adjonc
tion à ladite solution d'un agent coprécipitant approprié
et d'un agent de précipitation avantageusement constitué
par un alcool inférieur, en présence d'un tampon approprié
tel que le tampon Tris-hydroxyaminométhane ou analogue ; - une troisième étape, de marquage par "Nick translation",
de 1'ADN récupéré, qui consiste à incuber 1'ADN avec un
ou plusieurs désoxynucléotides-triphosphates marqués et
avec de l'ADN-polymérase I et de la désoxyribonucléase I,
dans un milieu réactionnel qui comprend le Tris-hydroxy
aminométhane, le chlorure de magnésium, la sérumalbumine
bovine, le 5-merceptoéthanol et le glycérol ;; - une quatrième étape de dosage de 1'ADN par toute méthode
appropriée révélant le marqueur incorporé à 1 lDN. The present invention relates to a method for recovering and assaying microquantities of DNA in an acellular biological fluid, in particular blood plasma, which is characterized in that it comprises the following successive steps - a first step of removal of the proteins present in the acellular biological fluid in which the DNA is to be assayed, which consists in extracting a mixture of said biological fluid and of ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA) with phenol saturated with Tris-hydroxyaminomethane (pH approximately 8) to obtain an aqueous phase substantially free of proteins and containing substantially all of the DNA; a second step of recovering DNA from said solution
aqueous solution, which consists of precipitating DNA by adjunc
said solution with a suitable coprecipitating agent
and a precipitation agent advantageously constituted
by a lower alcohol, in the presence of an appropriate buffer
such as tris-hydroxyaminomethane buffer or the like; a third step, marking by "Nick translation",
recovered DNA, which incubates the DNA with a
or more labeled deoxynucleotide triphosphates and
with DNA polymerase I and deoxyribonuclease I,
in a reaction medium which comprises Tris-hydroxy
aminomethane, magnesium chloride, serum albumin
bovine, 5-merceptoethanol and glycerol; a fourth step of assaying the DNA by any method
suitable for revealing the marker incorporated in the DNA.

Selon un mode de mise en oeuvre préféré du procédé conforme à la présente invention, le marquage par "Nick Translation" de 1'ADN récupéré est réalisé, au cours de la troisième étape du procédé, à l'aide d1au moins un désoxynucléotide-triphosphate marqué par un isotope radioactif, auquel cas la quatrième étape du procédé qui comprend le dosage de 1'ADN, consiste à compter la radioactivité présente sur un filtre de papier sur lequel a été déposé 1'ADN marqué et qui a éventuellement subi des lavages par des agents de lavage appropriés, puis a été séché, par comptage direct ou après immersion dans un liquide scintillant, en fonction de la nature du radioisotope de marquage. According to a preferred embodiment of the method according to the present invention, the "Nick Translation" labeling of the recovered DNA is carried out, during the third step of the method, using at least one deoxynucleotide triphosphate. labeled in a radioactive isotope, in which case the fourth step of the method which comprises the assay of DNA, is to count the radioactivity present on a paper filter on which the labeled DNA has been deposited and which has optionally been washed by appropriate washing agents, and then dried, by direct counting or after immersion in a scintillating liquid, depending on the nature of the radioisotope of marking.

Selon un autre mode de mise en oeuvre préféré du procédé conforme à la présente invention, le marquage par "Nick Translation" de 1'ADN récupéré au cours de la deuxième étape, est réalisé au cours de la troisième étape à l'aide d'au moins un désoxynucléotide triphosphate marqué chimiquement par une substance pouvant être révélée à l'aide d'une réaction enzymatique, auquel cas la quatrième étape du procédé qui comprend le dosage de 1'ADN consiste à révéler 1'ADN après fixation du complexe enzymatique approprié, en présence d'un substrat chromogène. According to another preferred embodiment of the method according to the present invention, the "Nick Translation" marking of the DNA recovered during the second step is carried out during the third step with the aid of at least one deoxynucleotide triphosphate chemically labeled with a substance which can be revealed by an enzymatic reaction, in which case the fourth step of the method which comprises the assay of the DNA is to reveal the DNA after fixing the appropriate enzymatic complex in the presence of a chromogenic substrate.

Selon une disposition avantageuse de ce mode de mise en oeuvre, le ou les nucléotides incorporés dans 1'ADN sont marqués par la biotine et l'enzyme utilisée pour sa ou leur détection est liée à l'avidine. According to an advantageous arrangement of this embodiment, the nucleotide (s) incorporated in the DNA are labeled with biotin and the enzyme used for its detection is linked to avidin.

Selon un mode de mise en oeuvre avantageux du procédé conforme à la présente invention, le liquide biologique acellulaire tel que le plasma humain, dans lequel on cherche à doser 1'ADN, est mélangé à raison de quelques microlitres, au cours de la première étape du procédé, avec de l'acide éthylènediamine tétra acétique (EDTA) pour obte nit lue concentration finale d'EDTA de l'ordre de 10 à 20 mM (pH 8 environ) et la solution obtenue est extraite par du phénol saturé d'un tampon approprié tel que Tris-hydroxyaminométhane 0,1 M, pH 8 environ, notamment. According to an advantageous embodiment of the process according to the present invention, the acellular biological fluid such as human plasma, in which the DNA is to be assayed, is mixed at a rate of a few microliters during the first stage. of the process, with ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA) to obtain the final concentration of EDTA of the order of 10 to 20 mM (pH about 8) and the resulting solution is extracted with phenol saturated with appropriate buffer such as 0.1 M Tris-hydroxyaminomethane, pH about 8, in particular.

Selon un autre mode de mise en oeuvre avantageux du procédé conforme à la présente invention, l'agent de coprécipitation introduit au cours de la deuxième étape du procédé, est pris dans le groupe qui comprend la gélatine, les diamines telles que la spermidine, les acides ribonucléiques, des polynucléotides de synthèse, des protéines comportant des groupes réactifs possèdant des charges positives tels qu'albumines méthylées et toute substance présentant une affinité particulière pour 1'ADN et n'inhibant pas la réaction de "Nick translation". According to another advantageous embodiment of the process according to the present invention, the coprecipitation agent introduced during the second stage of the process is taken from the group which comprises gelatin, diamines such as spermidine, ribonucleic acids, synthetic polynucleotides, proteins having reactive groups having positive charges such as methylated albumin and any substance having a particular affinity for DNA and not inhibiting the "Nick translation" reaction.

Selon encore un autre mode de mise en oeuvre avantageux du procédé, conforme à la présente invention, l'agent de précipitation mis en oeuvre au cours de la seconde étape du procédé, est de l'éthanol. According to yet another advantageous embodiment of the process according to the present invention, the precipitating agent used during the second stage of the process is ethanol.

Selon une modalité particulière de ce mode de mise en oeuvre, l'éthanol ou autre alcool inférieur utilisé comme agent de précipitation, est ajouté quelles que soient la température d'incubation et la température de centrifuga tion, en quantité appropriée pour obtenir une concentration finale en éthanol égale ou supérieure à 66 %. According to a particular embodiment of this embodiment, the ethanol or other lower alcohol used as a precipitation agent is added whatever the incubation temperature and the centrifugation temperature, in an amount appropriate to obtain an ultimate concentration. in ethanol equal to or greater than 66%.

Selon encore un autre mode de mise en oeuvre avantageux du procédé conforme à la présente invention, la phase aqueuse contenant 1'ADN, un agent de précipitation et un agent de coprécipitation, est centrifugée pour provoquer la précipitation de 1'ADN et le précipité est lavé par une nouvelle addition d'éthanol ou autre agent de précipitation analogue, puis la solution obtenue est à nouveau centrifugée et le précipité, essentiellement constitué par de 1'ADN, est récupéré. According to yet another advantageous embodiment of the process according to the present invention, the aqueous phase containing the DNA, a precipitating agent and a coprecipitation agent is centrifuged to cause the precipitation of the DNA and the precipitate is washed with a further addition of ethanol or other similar precipitating agent, then the resulting solution is centrifuged again and the precipitate, essentially consisting of DNA, is recovered.

Selon une modalité avantageuse de ce mode de mise en oeuvre, 1'ADN précipité est récupéré par addition d'eau, éventuellement sous agitation. According to an advantageous embodiment of this embodiment, the precipitated DNA is recovered by addition of water, optionally with stirring.

Selon un autre mode de mise en oeuvre du procédé conforme à la présente invention, le marquage par "Nick
Translation" est effectué, au cours de la troisième étape du procédé, par incubation de 1'ADN récupéré, avec 2 à 50 picomoles d'un ou de plusieurs desoxynucléotides-triphosphates marqués, éventuellement environ 80-120 picomoles de désoxynucléotides-triphosphates non marqués, environ 0,25 Unité d'ADN-polymérase I et environ 5 picogranames de désoxyribonucléase I, en présence d'un tampon tel que Tris-hydroxyaminométhane (5-12mM), de chloruredemagnésium (2-5mM), de
B-mercapto-éthanol (7-15mM), d'albumine bovine (20-60 microgrammes/ml) et de glycérol (environ 0,5 % poids/volume).According to another embodiment of the method according to the present invention, the marking by "Nick
Translation "is carried out, during the third step of the method, by incubation of the recovered DNA, with 2 to 50 picomoles of one or more labeled desoxynucleotide triphosphates, optionally about 80-120 picomoles of unlabeled deoxynucleotide triphosphates. , about 0.25 units of DNA polymerase I and about 5 picogranames of deoxyribonuclease I, in the presence of a buffer such as Tris-hydroxyaminomethane (5-12mM), magnesium chloride (2-5mM),
B-mercapto-ethanol (7-15mM), bovine albumin (20-60 micrograms / ml) and glycerol (about 0.5% w / v).

Selon une modalite avantageuse de ce mode de mise en oeuvre, l'incubation ?st réalisée dune température comprise entre 15 et 370C environ, pendant une durée de 1 à 3 heures. According to an advantageous embodiment of this embodiment, the incubation is carried out at a temperature of between approximately 15 and 370 ° C. for a period of 1 to 3 hours.

Selon encore un autre mode de mise en oeuvre du procédé conforme à la présente invention au cours de la quatrième étape du procédé, le filtre sur lequel est déposé 1'ADN est lavé, de préférence sous agitation, par une solution de forte molarité permettant d'éliminer les nu nucléotides marqués non incorporés à 1'ADN tout en conservant sur le filtre la totalité de l1ADN marqué. According to yet another embodiment of the process according to the present invention during the fourth step of the process, the filter on which the DNA is deposited is washed, preferably with stirring, with a solution of high molarity allowing Remove the labeled nucleotides not incorporated in the DNA while retaining on the filter all the labeled DNA.

Outre les dispositions qui precedent, l'invention comprend encore d'autres dispositions qui ressortiront de la description qui va suivre. In addition to the foregoing, the invention further comprises other provisions which will emerge from the description which follows.

La présente invention vise plus particulière- ment le nouveau procédé de récupération et dosage de microquantités d'ADN dans un liquide biologique acellulaire, en particulier le plasma sanguin, conforme aux dispositions qui précèdent, les analyses biologiques utilisant ce procédé, ainsi que les situations physiologiques élucidées et les diagnostics établis grâce au procédé conforme à la présente invention. The present invention is more particularly directed to the novel process for recovering and assaying micro-quantities of DNA in an acellular biological fluid, in particular blood plasma, in accordance with the foregoing provisions, the biological analyzes using this method, as well as the physiological situations. elucidées and the diagnostics established by the process according to the present invention.

L'invention sera mieux comprise à l'aide du complement de description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de mise en oeuvre et d'application du procédé objet de la présente invention. The invention will be better understood with the aid of the additional description which follows, which refers to examples of implementation and application of the method which is the subject of the present invention.

I1 doit être bien entendu, toutefois, que ces exemples sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de 11 invention, dont ils ne constituent en aucune manière une limitation. It should be understood, however, that these examples are given solely by way of illustration of the subject matter of the invention, of which they in no way constitute a limitation.

Exemple 1
Récupération et dosage de microguantités d'ADN
présentés dans du plasma sanguin
1ère étape
Dans un tube conique en polypropylène de 1,5 ml (tube Eppendorf) on mélange 10 p1 de plasma prélevé sur acide éthylènediaminetétraacétique et 50 pl d'acide éthy lènediaminetétraacétique à 15 mM. On ajoute 25 microlitres de phénol saturé par du Trishydroxyaminométhane 0,1 M, pH 8.Example 1
Recovery and assay of DNA microguantities
presented in blood plasma
1st step
In a 1.5 ml polypropylene conical tube (Eppendorf tube) 10 μl of plasma taken from ethylenediaminetetraacetic acid and 50 μl of 15 mM ethylene diamine tetraacetic acid are mixed. 25 microliters of phenol saturated with 0.1 M Trishydroxyaminomethane, pH 8 are added.

On mélange. Après incubation de 3 minutes, à la température de la pièce, on centrifuge 5 minutes à 12 000 g.We blend. After incubation for 3 minutes, at room temperature, centrifuged for 5 minutes at 12,000 g.

2ème étape
a) une solution mère de gélatine (DIFCO) à 5 % en (poids/volume) dans de l'eau bidistillée, est chauffée à 1100C pendant 30 minutes.2nd step
a) a 5% w / v gelatin solution (DIFCO) in bidistilled water is heated at 1100C for 30 minutes.

b) 40 microlitres de la phase supérieure (phase aqueuse) sont transférés dans un autre tube Eppendorf contenant 10 1 de la qélatine préparée comme ci-dessus,à 0,3% (poids/volume) dans du
tampon Trishydroxyaminométhane 0,0025 M, pH 8.0n ajoute 105 micro
litres d'éthanol absolu à -200C. Le tube est agité, incubé
5 minutes à 40C puis centrifugé 15 minutes à 40C à 12 000 g.b) 40 microliters of the upper phase (aqueous phase) are transferred to another Eppendorf tube containing 10 1 of the gelatin prepared as above, at 0.3% (weight / volume) in
0.0025 M Trishydroxyaminomethane buffer, pH 8.0n adds 105 micro
liters of absolute ethanol at -200C. The tube is shaken, incubated
5 minutes at 40C then centrifuged for 15 minutes at 40C at 12,000 g.

Le surnageant est éliminé par pîpetage et après addition de
200 microlitres d'éthanol à 85 % à -200C, le tube est immé
diatement centrifugé dans les mêmes conditions que précédem
ment. Le surnageant est totalement éliminé par pipetage
puis séchage sous vide. 25 microlitres d'eau bidistillée à
600C sont ajoutés et le tube est incubé 2 å 3 minutes à 600C
puis centrifugé quelques secondes et placé à 40C.The supernatant is removed by piling and after addition of
200 microliters of 85% ethanol at -200C, the tube is immersed
diatement centrifuged under the same conditions as before
is lying. The supernatant is totally eliminated by pipetting
then vacuum drying. 25 microliters of doubly distilled water
600C are added and the tube is incubated 2 to 3 minutes at 600C
then centrifuged a few seconds and placed at 40C.

3ème étape
L'ADN dissous dans 25 microlitres d'eau bi
distillée est incubé dans 25 microlitres contenant 17 pico
moles de désoxyribocytidine 5' triphosphate marqués au tri tium et 100 picomoles de désoxyriboadénine triphosphate, de désoxyriboguanine triphosphate et de désoxyribothymine triphosphate, 0,25 Unités d'ADN polymérase I et 5 picogrammes de désoxyribonucléase I, du trishydroxyaminométhane (7,5 mM), du chlorure de magnésium (3,5 mM), du Beta-mercaptoéthanol (10 mM), de l'albumine bovine (50 microgrammes/ml) et du glycérol (0,5 %, poids/volume). Les tubes sont incubés 1,5 heure à 370C.3rd step
DNA dissolved in 25 microliters of bi water
distilled is incubated in 25 microliters containing 17 pico
moles of tri-labeled deoxyribocytidine 5 'triphosphate and 100 picomoles of deoxyriboadenine triphosphate, deoxyriboguanine triphosphate and deoxyribothymine triphosphate, 0.25 units of DNA polymerase I and 5 picograms of deoxyribonuclease I, trishydroxyaminomethane (7.5 mM), magnesium chloride (3.5 mM), beta-mercaptoethanol (10 mM), bovine albumin (50 micrograms / ml) and glycerol (0.5%, w / v). The tubes are incubated for 1.5 hours at 370C.

4ème étape
Les 50 microlitres de la réaction sont déposés 2 sur un carré de papier Whatmann DE 81 de 2,25 cm . Le filtre est séché puis placé dans un bécher et lavé sous agitation rotative, successivement 3 fois 5 minutes par 100 ml de solution de formate d'ammonium (HCOONH4) 0,3 M et d'hydrogène phosphate disodique (Na2HPO4) 0,01 M pH 7,8 2 fois 5 minutes par 100 ml d'éthanol à 95 % et 1 fois 5 minutes par 50 ml de diéthyléther. Le filtre est séché à la chaleur puis placé dans un tube pour comptage radioactif, contenant 5 ml de liquide scintillant ("Ready Solve" Beckman, par exemple).Dans ces conditions, l'activité spécifique obtenue pour une efficacité de comptage de 30 % environ, est de 10 000 à 15 000 cpm par nanogramme d'ADN et la radioactivité retenue sur le filtre non spécifiquement en l'absence d'ADN est de 30C à 600 cpm.4th step
The 50 microliters of the reaction are deposited on a 2.25 cm square Whatmann DE 81 paper. The filter is dried and then placed in a beaker and washed with rotary stirring, successively 3 times 5 minutes per 100 ml of 0.3 M ammonium formate solution (HCOONH 4) and 0.01 M disodium hydrogen phosphate (Na 2 HPO 4). pH 7.8 2 times 5 minutes per 100 ml of 95% ethanol and 1 time 5 minutes per 50 ml of diethyl ether. The filter is heat-dried and placed in a radioactive counting tube containing 5 ml of Beckman's "Ready Solve", for example. Under these conditions, the specific activity obtained for a counting efficiency of 30% approximately, is 10,000 to 15,000 cpm per nanogram of DNA and the radioactivity retained on the filter not specifically in the absence of DNA is 30C at 600 cpm.

Exemple 2
Dosage d'ADN dans le plasma de souris auxquelles
avait été injec-té un lipopolysaccharide d'ori
gine bactérienne.Example 2
DNA assay in mouse plasma to which
had been injected a lipopolysaccharide of ori
bacterial germ.

Pour déterminer l'efficacité du procédé conforme à la présente invention dans le cadre de recherches physiologiques et pathologiques, on a effectué une estimation en série de 1'ADN présent dans le plasma de souris ayant reçu une injection d'un lipopolysaccharide d'origine bactérienne / connu comme capable d'entraîner dans le sang de ces souris la libération massive d'ADN en position extra-cellulaire, FOURNIÉ & Al. J. Exp. Méd. To determine the effectiveness of the method according to the present invention in the context of physiological and pathological investigations, a serial estimate of the DNA present in the plasma of mice injected with a lipopolysaccharide of bacterial origin has been carried out. / known to be capable of driving in the blood of these mice the massive release of extracellular DNA, SUPPLIED & Al. J. Exp. Med.

140, 1189-1206 7. L'expérimentation a été menée comme suit des souris femelles de race C57B1/6 âgées de 8 semaines ont reçu une injection de 100 ssg d'un lipopolysaccharide d'origine bactérienne dans les conditions décrites par FOURNIÉ & Al. (référencé ci-dessus).140, 1189-1206 7. The experiment was conducted as follows of 8 week old C57B1 / 6 female mice injected with 100 ssg of a bacterial lipopolysaccharide under the conditions described by FOURNIÉ & Al. (referenced above).

Des prélèvements de sang ont été collectés par ponction à partir des sinus orbitaux, à différents intervalles de temps après l'injection du lipopolysaccharide et 1'ADN libéré dans le plasma a été dosé par le procédé conforme à la présente invention, respectivement

Blood samples were collected by puncture from the orbital sinuses at different time intervals after injection of the lipopolysaccharide and the DNA released into the plasma was assayed by the method according to the present invention, respectively

<tb> 2h, <SEP> 4h, <SEP> gh, <SEP> 1Oh, <SEP> 12h, <SEP> 18h <SEP> | <SEP> <SEP> après <SEP> l'injection <SEP> du
<tb> 2 <SEP> jours, <SEP> 3 <SEP> jours <SEP> et <SEP> 7 <SEP> jours <SEP> 3 <SEP> <SEP> lipopolysaccharide
<tb>
Les dosages effectués ont fait ressortir
une augmentation significative de 1'ADN circulant
déjà 2h après l'injection du lipopolysaccharide ; ;
la présence de quantités élevées d'ADN (supérieures
à 1 ssg/ml) de 10 à 18 h parès l'injection du lipo
polysaccharide ;
la persistance d'une augmentation significative de
1'ADN dans le plasma au jour 3
le retour à des taux normaux d'ADN au jour 7.<tb> 2h, <SEP> 4h, <SEP> gh, <SEP> 1Oh, <SEP> 12h, <SEP> 18h <SEP> | <SEP><SEP> after <SEP> injection <SEP> of
<tb> 2 <SEP> days, <SEP> 3 <SEP> days <SEP> and <SEP> 7 <SEP> days <SEP> 3 <SEP><SEP> lipopolysaccharide
<Tb>
The dosages carried out have highlighted
a significant increase in circulating DNA
already 2 hours after injection of the lipopolysaccharide; ;
the presence of high amounts of DNA (higher
at 1 ssg / ml) from 10 to 18 hours after the injection of the lipo
polysaccharide;
the persistence of a significant increase in
DNA in plasma at day 3
the return to normal levels of DNA at day 7.

Exemple 3
Vérification de la précision du dosage effec
tué par le procédé conforme à la présente
invention
Pour vérifier la valeur du procédé conforme à la présente invention, de 1'ADN a été évalué dans un échantillon de plasma dans lequel avait été ajoutée une quantité connue d'ADN. La valeur trouvée a été comparée à celle obtenue pour le plasma seul (c'est-a-dire sans addition d'ADN) et à la valeur obtenue pour un échantillon d'ADN traité de façon analogue. Example 3
Verification of the accuracy of the assay
killed by the process in accordance with this
invention
To verify the value of the method according to the present invention, DNA was evaluated in a plasma sample in which a known amount of DNA had been added. The value found was compared to that obtained for the plasma alone (i.e. without addition of DNA) and the value obtained for a DNA sample treated in a similar manner.

Le Tableau I ci-dessous fait apparaître les résultats suivants
TABLEAU I
Dosage d'ADN dans des échantillons de plasma
(1)

Table I below shows the following results
TABLE I
DNA assay in plasma samples
(1)

<tb> <SEP> Plasma(2) <SEP> seul <SEP> Plasma <SEP> ADN <SEP> seul
<tb> <SEP> + <SEP> ADN <SEP> froid
<tb> <SEP> cpm(3) <SEP> 1527 <SEP> 352 <SEP> 7438 <SEP> 818 <SEP> 6206 <SEP> 663
<tb> <SEP> ng(4) <SEP> 0,17 <SEP> 0,04 <SEP> 0,83 <SEP> 0,09 <SEP> 0,69 <SEP> 0,07 <SEP>
<tb> ng <SEP> 0,17* <SEP> 0,04 <SEP> 0,83 <SEP> * <SEP> 0,09 <SEP> 0,69 <SEP> * <SEP> 0,07 <SEP>
<tb> (1) Le dosage de 1'ADN a été effectué sur les 2/3 de
i : 15 1 de plasma (plasma seul)
ii : 15 iil de plasma auquel avait été ajouté 1,5 ng
d'ADN froid
iii : 1,5 ng d'ADN froid après traitement par le phénol
et précipitation par l'éthanol en présence
de gélatine en tant qu'agent coprécipitant,
conformément à l'invention
La réaction de"Nick Translation" a été effectuée en
1 heure à 370C.<tb><SEP> Plasma (2) <SEP> alone <SEP> Plasma <SEP> DNA <SEP> alone
<tb><SEP> + <SEP> DNA <SEP> cold
<tb><SEP> cpm (3) <SEQ> 1527 <SEQ> 352 <SEQ> 7438 <SEQ> 818 <SEJ> 6206 <SEQ> 663
<tb><SEP> ng (4) <SEP> 0.17 <SEP> 0.04 <SEP> 0.83 <SEP> 0.09 <SEP> 0.69 <SEP> 0.07 <SEP>
<tb> ng <SEP> 0.17 * <SEP> 0.04 <SEP> 0.83 <SEP> * <SEP> 0.09 <SEP> 0.69 <SEP> * <SEP> 0.07 <September>
<tb> (1) The DNA assay was performed on 2/3 of
i: 15 1 plasma (plasma only)
ii: 15 μl of plasma to which 1.5 μg had been added
cold DNA
iii: 1.5 ng of cold DNA after phenol treatment
and ethanol precipitation in the presence
gelatin as a coprecipitating agent,
according to the invention
The reaction of "Nick Translation" was made in
1 hour at 370C.

(2) Plasma humain prélevé chez un sujet sain (3) Résultats calculés à partir de 4 prélèvements, exprimés
comme étant la moyenne t une déviation standard de cpm
du 3H dCTP incorporé. Ces résultats sont corrigés
3
pour la fixation non spécifique du H dCTP libre sur
des filtres DE81 (411 + 37).(2) Human plasma taken from a healthy subject (3) Results calculated from 4 samples, expressed
as being the average t a standard deviation of cpm
3H dCTP incorporated. These results are corrected
3
for nonspecific binding of free H dCTP on
DE81 filters (411 + 37).

(4) Nanogrammes d'ADN trouvés dans les échantillons trai-
tés (moyenne t une déviation standard de 4 prélève
ments) calculés à partir de l'activité spécifique
(9003 t 212 cpm/ng) obtenue sur un échantillon stan
dard de 1 ng d'ADN marqué par "Nick translation" en
présence de gélatine.(4) Nanograms of DNA found in the samples processed
tees (average t a standard deviation of 4 samples
calculated from the specific activity
(9003 t 212 cpm / ng) obtained on a stan sample
sting of 1 ng of DNA labeled "Nick translation" in
presence of gelatin.

Les résultats réunis dans le Tableau I cidessus font apparaître que
1. L'ADN peut etre détecté dans le plasma,
2. La quantité d'ADN trouvée dans les échantillons pré
parés par addition d'ADN froid à un plasma, est con
forme aux valeurs trouvées dans le plasma seul et
dans les échantillons d'ADN seul.The results summarized in Table I above show that
1. DNA can be detected in the plasma,
2. The amount of DNA found in pre samples
prepared by addition of cold DNA to a plasma, is con
form to the values found in the plasma alone and
in the DNA samples alone.

A noter que le pourcentage de récupération d'ADN radiomarqué (68 t 8 n = 8) et le pourcentage de récupération de 1'ADN marqué par "Nick Translation" après traitement par le phénol et précipitation par l'éthanol (67 t 9 ; n = 8) sont similaires. Le pourcentage de récuparation de 1'ADN radiomarqué, est identique pour tous les échantillons, qu'ils aient été traités en présence ou en l'absence de plasma.Note that the percent recovery of radiolabelled DNA (68 t 8 n = 8) and the percentage recovery of Nick Translation-labeled DNA after phenol treatment and ethanol precipitation (67 t 9; n = 8) are similar. The percentage of recapture of the radiolabelled DNA is identical for all the samples, whether treated in the presence or absence of plasma.

I1 ressort des exemples d'application qui précèdent que le procédé qui fait l'objet de la présente invention permet de doser quantitativement 1'ADN dans le plasma et constitue un procédé facile à mettre en oeuvre, pouvant être exécuté à l'aide d'un kit de"Nick Translation" disponible dans le commerce et ne requérant qu'un appareillage pour le comptage d'échantillons radioactifs. Le procédé conforme à la présente invention est reproductible, suffisamment sensible pour détecter de 1'ADN dans des échantillons de 10 p1 à des concentrations comprises entre 12 et 800 ng/ml, encore qu'il puisse détecter des concentrations d'ADN moindres, aussi basses que 1,5 ng/ml, avec cependant une reproductibilité des résultats d'un échantillon à l'autre moins bonne que des concentrations inférieures à 12 ng/ml. From the above examples of application, it can be seen that the method which is the subject of the present invention makes it possible to quantitatively assay the DNA in the plasma and constitutes an easy process to implement, which can be carried out with the help of a "Nick Translation" kit available commercially and requiring only equipment for counting radioactive samples. The method according to the present invention is reproducible, sufficiently sensitive to detect DNA in 10 p1 samples at concentrations between 12 and 800 ng / ml, although it can detect lower DNA concentrations, as well. lower than 1.5 ng / ml, with however reproducible results from one sample to another less good than concentrations lower than 12 ng / ml.

Le procédé conforme à la présente invention semble présenter une spécificité très grande à l'égard de 1'ADN : l'incorporation de dCTP tritié dans des échantillons de ARN est 104 inférieure à ce qu'elle est dans les échantillons d'ADN, ceci étant probablement lié à une contamination des préparations d'ARN par de 1'ADN. The method according to the present invention seems to have a very high DNA specificity: the incorporation of tritiated dCTP into RNA samples is lower than it is in the DNA samples, probably related to contamination of the RNA preparations with DNA.

Le procédé conforme à l'invention permet de récupérer pratiquement la totalité de 1'ADN contenu dans le plasma, qui est intégralement marqué par "Nick Translation". The process according to the invention makes it possible to recover practically all the DNA contained in the plasma, which is completely marked by "Nick Translation".

En outre, le procédé conforme à la présente invention est plus rapide que les procédés proposés dans l'Art antérieur et permet de marquer 1'ADN extrait du plasma, par Nick Translation, en moins de 4 heures. In addition, the method according to the present invention is faster than the methods proposed in the prior art and makes it possible to mark the DNA extracted from the plasma, by Nick Translation, in less than 4 hours.

Le procédé conforme à la présente invention devrait, en raison des avantages qu'il présente, dont certains ont été précisés dans ce-qui précède, permettre une meilleure compréhension de la signification pathophysiologique de l'augmentation des taux d'ADN plasmatique chez l'homme aussi bien que dans des conditions expérimentales et devrait être un outil de grande valeur pour l'étude des maladies du type lupus dans le développement desquelles sont impliqués des complexes ADN-anti-ADN et plus généralement pour l'établissement notamment, de diagnostics d'affections bactériologiques, virologiques, parasitologiques, génétiquement transmises, cancéreuses ou vasculaires. The method according to the present invention should, because of the advantages it presents, some of which have been specified in the foregoing, allow a better understanding of the pathophysiological significance of the increase in plasma DNA levels in the as well as under experimental conditions and should be a valuable tool for the study of lupus-like diseases in the development of which DNA-DNA complexes are involved and more generally for the establishment, in particular, of diagnostic diagnoses. bacteriological, virological, parasitological, genetically transmitted, cancerous or vascular diseases.

Ainsi que cela ressort de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes de mise en oeuvre, de réalisation et d'application qui viennent d'être décrits de façon plus explicite ; elle en embrasse au contraire toutes les variantes qui peuvent venir à l'esprit du technicien en la matière, sans s'écarter du cadre, ni de la portée, de la présente invention. As is apparent from the above, the invention is not limited to those of its modes of implementation, implementation and application which have just been described more explicitly; it encompasses all the variants that may come to the mind of the technician in the field, without departing from the scope or scope of the present invention.

Claims

1. A method for recovering and assaying microquantities of DNA in an acellular biological fluid, in particular blood plasma, characterized in that it comprises the following successive stages - a first step of elimination of the proteins present

in the acellular biological liquid in which we want

assay DNA, which consists of extracting a mixture of said

biological fluid and ethylenediamine tetraactic acid

(EDTA) by phenol saturated with Tris-hydroxyaminomethane

(approximately pH 8), to obtain an essentially aqueous phase

devoid of protein and substantially containing the tota

DNA ligation - a second step in recovering DNA from said solution

aqueous solution, which consists of precipitating DNA by addition

said solution of a suitable coprecipitating agent and

a precipitation agent advantageously constituted by

a lower alcohol, in the presence of a suitable buffer such

Tris-hydroxyaminomethane buffer or the like - a third step, labeled by "Nick Translation", of

Recovered DNA, which consists of incubating the DNA with one or more

labeled deoxynucleotide-triphosphates and with

DNA polymerase I and deoxyribonuclease I, in a

a reaction medium which comprises tris-hydroxyaminomethane,

magnesium chloride, bovine serum albumin, 5

merceptoethanol and glycerol - a fourth step of assaying DNA that consists of assaying

DNA by any appropriate method revealing the marker in

in the DNA.

2. Method according to claim 1, characterized

in that the "Nick Translation" marking of the received DNA

is carried out during the third stage of the process,

using at least one labeled deoxynucleotide triphosphate

radioactive isotope, in which case the fourth step of the

The method, which comprises the assay of DNA, consists in counting the radioactivity present on a paper filter on which the labeled DNA has been deposited and which has been washed with suitable washing agents and then dried by direct counting. or after immersion in a scintillating liquid, depending on the nature of the radioisotope of marking.

3. Process according to claim 1, characterized in that the "Nick Translation" labeling of the DNA recovered during the second step is carried out during the third step using at least one deoxynucleotide triphosphate. chemically labeled with a substance which can be revealed by an enzymatic reaction, in which case the fourth step of the method which comprises the assay of the DNA is to reveal the DNA after fixing the appropriate enzyme compound, in the presence of a chromogenic substrate.

4. Method according to claim 1 and any one of claims 2 or 3, characterized in that the acellular biological fluid such as human plasma, in which it is desired to assay 1'ad, is mixed at a rate of a few microlitresf to during the first step of the process, with ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA) to obtain a final concentration of EDTA of the order of 10 to 20 mSI (approximately pH 8) and the solution obtained is extracted with phenol saturated with a suitable buffer such as 0.1 M Tris-hydroxyaminomethane, pH approximately 8, in particular.

5. Method according to claim 1, characterized in that the coprecipitation agent introduced during the second step of the process, is taken from the group which comprises gelatin, diamines such as spermidine, ribonucleic acids, polynucleotides synthesis, proteins having reactive groups having positive charges such as methylated albumin and any substance having a particular affinity for DNA and not inhibiting the Nick Translation reaction.

6. Process according to any one of claims 1 to 5, characterized in that the precipitating agent used during the second step of the process is ethanol.

7. Method according to any one of claims 1 to 6, characterized in that the ethanol or other lower alcohol used as a precipitating agent, is added regardless of the incubation temperature and the centrifugation temperature, in an appropriate amount. to obtain a final ethanol concentration equal to or greater than 66%.

Process according to any one of claims 1 to 7, characterized in that the aqueous phase containing the DNA, a precipitating agent and a coprecipitation agent is centrifuged to cause the precipitation of the DNA.

9. Method according to claim 8, characterized in that the precipitate is washed with ethanol or other similar precipitating agent, then the solution obtained is centrifuged again and the precipitate, essentially consisting of DNA, is recovered. .

The method of claim 9 or claim 9, wherein said precipitated DNA is recovered by addition of water.

11. Method according to any one of claims 1 to 10, characterized in that the marking by "Nick

Translation "is carried out, during the third step of the method, by incubation of the recovered DNA, with 2 to 50 picomoles of one or more labeled deoxynucleotide triphosphates, optionally about 80-120 picomoles of unlabeled deoxynucleotide triphosphates. about 0.25 units of DNA polymerase I and about 5 picograms of deoxyribonuclease I, in the presence of a buffer such as Tris-hydroxyaminomethane (5-12 mM), magnesium chloride (2-5 mM), β-mercaptoethanol (7-15 mMD, bovine albumin (20-60 micrograms / ml) and glycerol (about 0.5% w / v).

12. The method of claim 11, characterized in that the incubation is carried out at a temperature between 15 and 370C, for a period of 1 to 3 hours.

13. Process according to any one of Claims 1 to 12, characterized in that during the fourth step of the process, the filter on which the DNA is deposited is washed, preferably with stirring, with a strong solution. molarity to remove labeled nucleotides not incorporated in the DNA while retaining on the filter all of the labeled DNA.