EP0238593A1 - Recovery and dosing of dna in an acellular biological liquid - Google Patents

Recovery and dosing of dna in an acellular biological liquid

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Publication number
EP0238593A1
EP0238593A1 EP86905859A EP86905859A EP0238593A1 EP 0238593 A1 EP0238593 A1 EP 0238593A1 EP 86905859 A EP86905859 A EP 86905859A EP 86905859 A EP86905859 A EP 86905859A EP 0238593 A1 EP0238593 A1 EP 0238593A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
dna
labeled
approximately
recovered
during
Prior art date
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Pending
Application number
EP86905859A
Other languages
German (de)
French (fr)
Inventor
Gilbert Fournie
Martine Taminh
Jean Conte
Jean-Pierre Bouche
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Original Assignee
Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
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Publication date
Application filed by Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM filed Critical Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Publication of EP0238593A1 publication Critical patent/EP0238593A1/en
Pending legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay

Definitions

  • the present inyention is relatiye nouvea a process for recovering and laicroquantitês dosage of 1 saloxyxibonuclêique acid (DNA) in a cell free biological fluid especially the "blood plasma.
  • DNA Assay circulating including the DNA in blood, in the extra-cellular position, is of great interest both physiologically and pathologically.
  • DNA can also be responsible for the activation of pathogenic mechanisms such as activation of the coagulation and complement systems;
  • pathogenic mechanisms such as activation of the coagulation and complement systems;
  • the circulating DNA could play a pathogenic role via the formation of immune complexes DNA-antibody anti-DNA.
  • DNA "specific to a pathogen" may be present in the blood.
  • the detection and identification of this DNA may therefore be of etiological interest. It has for example been shown that antigen chronic patients with Hep B tite have in their plasma circulating DNA capabl of s '' hybridize with DNA extracted from virus particles of the virus of hepatitis B. On the other hand, it is also possible-that the release into the blood of DNA in abnormally high quantity -translates.the 1 precise pathological processes. We can consider, for example, that an inflamatory vascular injury is accompanied by the "rapid" passage of nuclear material in the blood due to the absence of a tissue enzymatic filter " ' and the direct" release of nuclear material in the sector. vascular.
  • labeling using the "Nick Translation” technique consists in incorporating deoxyribonucleotide molecules into DNA.
  • This technique uses two enzymes, deoxyribonuclease and r - - 1 DNA polymerase from Escherichia coli.
  • the deoxyribonuclease cuts or nicks the strands of DNA.
  • the DNA polymerase can then, under the effect of its 5'-3 'exo-nuclease activity, detach nucleotides from the 5'- side of the cut. Elimination of nucleotides and addi - "-
  • RAPTIS applied the technique of "Nick Translation” in vitro to purified circu ⁇ lantplasmatic DNA, in order to obtain DNA labeled in vitro which, due to its very high radioactivity , allows very high measurement sensitivity.
  • the "Nick Transaction" reaction must be carried out in a medium containing 50 mM of Tris-HCl buffer, pH 7.6, 10 M of 2-mercaptoethanol, 5 mM of MgCl 2 and 50 ⁇ g / ml of BSA (bovine serum albumin) brought into contact with 0.25 noles of each of the four labeled dXTPs , per reaction, and 1 ⁇ / reaction (or 0.1 ⁇ l) of enzyme preparation (DNA polymerase), while the resulting product is extracted twice with redistilled phenol.
  • BSA bovine serum albumin
  • the plasma DNA subjected to the "Nick Translation" reaction is obtained according to RAPTIS et al. From plasma diluted 4 times in 50 mM Tris-HCl buffer, pH 8.5, 20 mM EDTA containing 1% of sodium dodecyl sulfate, then incubated (20 ml) with 50 ml of pronase, for 4 hours at 37 ° C, the incubation being followed by sequential extractions with phenol, a 24: 1 mixture of chloroform and isoamy alcohol - liquique, and ether, dialysis against 20 m of buffer
  • This method can be implemented on small volumes, of the order of microliter, but it cannot be used for the purpose set by the present invention, namely the recovery of DNA microquantities in an acellular liquid biological medium
  • the aim of the present invention is to provide a method for recovering and assaying DNA microquantities which better meets the needs of the practice than the methods proposed in the prior art, in particular in that the new process in accordance with the present invention: - is truly quantitative, which are not the methods based " on immunochemical reactions such as the reaction for inhibiting the DNA binding described by LEON et Al. in the Article cited above, or the method of counterimmunoelectrophoresis described by DAVIS and DAVIS in ARTH. RHEUM. (1973), 1-6, 52-58;
  • the subject of the present invention is a method for recovering and assaying micro amounts of DNA in an acellular biological fluid, in particular the blood plasma, which is characterized in that it comprises the following successive steps: - a first step of elimination of the proteins present in the biological fluid acellular in which we want to assay the DNA, which consists in extracting a mixture of said biological liquid and ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA) with phenol saturated with Tris-hydroxyaminomethane (pH 8 approximately), to obtain an aqueous phase practically free proteins and containing substantially all of the DNA;
  • EDTA ethylenediamine tetraacetic acid
  • a second step for recovering the DNA from said aqueous solution which consists in precipitating the DNA by adding to said solution an appropriate coprecipitating agent and a precipitation agent advantageously consisting of a lower alcohol , in the presence of a suitable buffer such as the buffer ' Tris-hydroxyaminomethane u analog;
  • a third step, of labeling by "Nick translation", "of the recovered DNA which consists in incubating the DNA with one or more labeled deoxynucleotides-triphosphates and with DNA polymerase I and deoxyribonuclease I, in a reaction medium which comprises Tris-hydroxy ⁇ aminomethane, magnesium chloride, bovine serum albumin, 5-merceptoethanol and glycerol;
  • the labeling by "Nick Translation" of the recovered DNA is carried out, during the third step of the method, using at least one deoxynucleotide -triphosphate marked by a radioactive isotope, in which case the fourth step of the process which includes the determination of DNA, consists in counting the radioactivity present on a paper filter on which the DNA has been deposited marked and possibly washed by appropriate washing agents, then was dried, by direct counting or after immersion in a scintillating liquid, depending on the nature of the labeling radioisotope.
  • the labeling by "Nick Translation" of the DNA recovered during the second step is carried out during the third step.
  • the fourth step of the process which comprises the assay of DNA consists in revealing the DNA after fixation of the appropriate enzyme complex, in the presence of a chromogenic substrate.
  • the nucleotide (s) incorporated in the DNA are labeled with biotin and the enzyme used; for its or their detection is related to avidin.
  • the biologic and acellular liquid such as human plasma, in which one seeks to assay the DNA, is mixed at the rate of a few microliters, the first step of the process, with ethylenediamine tetra acetic acid (EDTA) to obtain a final concentration of EDTA of the order of 10 to 20 (approximately pH 8) and the solution obtained is extracted with saturated phenol d 'A suitable buffer such as 0.1 M Tris-hydroxy ⁇ aminomethane, pH approximately 8, in particular.
  • EDTA ethylenediamine tetra acetic acid
  • the co-precipitation agent introduced during the second stage of the process is taken from the group which comprises the Latin, the dia ines such as spermidine, ribonucleic acids, synthetic polynucleotides, proteins comprising reactive groups possessing positive charges such as methylated albumin and any substance having a particular affinity for DNA and not inhibiting the "Nick Translation" reaction.
  • the precipitating agent used during the second step of the process is ethanol.
  • ethanol or other lower alcohol used as precipitation agent is added whatever the incubation temperature and the temperature of cen trifugation, in an appropriate amount to obtain a final concentration in ethanol equal to or greater than 66%.
  • the aqueous phase containing the DNA, a precipitation agent and a coprecipitation agent is centrifuged to cause the precipitation of the DNA and the precipitate is washed with a new addition of ethanol or " other similar precipitation agent " , then the solution obtained " is again centrifuged and the precipitate, essentially consisting of DNA, is recovered.
  • the precipitated DNA is recovered by adding water, optionally with stirring.
  • the marking with "Nick Translation” is carried out, during the third step
  • the incubation is carried out at a temperature between 15 and 37 ° C approximately, for a period of 1 to 3 hours
  • the filter on which the DNA is deposited is washed, preferably with stirring, with a solution of high molarity allowing the elimination of the labeled nucleotides not incorporated into the DNA while preserving the tortality of the labeled DNA on the filter.
  • the present invention relates more particularly to the new process for recovering and assaying micro-amounts of DNA in an acellular biological fluid, in particular blood plasma, in accordance with the above provisions, biological analyzes using this process, as well as the physiological situations elucidated and the diagnoses established by the process in accordance with the present invention.
  • the DNA dissolved in 25 microliters of bi-distilled water is incubated in 25 microliters containing 17 pico-moles of deoxyribocytidine 5 'triphosphate labeled with tri- tium and 100 picomoles of deoxyriboadenine triphosphate, deoxyriboguanine triphosphate and deoxyribothymine tri ⁇ phosphate, 0.25 Units of DNA polymerase I and 5 picograms of deoxyribonuclease I, trishydroxyaminomethane (7.5 mM) of magnesium chloride (3.5 mM), Beta-mercaptoethanol (10 M), bovine albumin (50 micrograms / ml) and glycerol (0.5%, weight / volume).
  • the tubes are incubated 1.5 hrs at 37 ° C.
  • the process according to the present invention seems to have a very specificity with regard to DNA: the incorporation of tritiated dCTP into samples.
  • the process according to the invention makes it possible to recover practically all of the DNA contained in the plasma, which. is fully marked with "Nick Translation
  • the method according to the present invention is faster than the methods proposed in the prior art and makes it possible to mark the DNA extracted from the plasma, by Nick Translation, in less than 4 hours.

Abstract

Procédé de récupération et de dosage des microquantités d'ADN. Le procédé comprend: une première étape d'élimination des protéines présentes, une deuxième étape de récupération de l'ADN qui consiste à précipiter l'ADN par adjonction d'un agent de coprécipitation et d'un agent précipitant, une troisième étape de marquage par ''Nick Translation'' de l'ADN à récupérer, et une quatrième étape de dosage. Application à la récupération et au dosage de microquantités d'ADN dans un liquide biologique acellulaire.Method for recovering and assaying DNA microquantities. The method comprises: a first step of removing the proteins present, a second step of recovering the DNA which consists in precipitating the DNA by adding a coprecipitation agent and a precipitating agent, a third step in labeling by '' Nick Translation '' of the DNA to be recovered, and a fourth assay step. Application to the recovery and determination of DNA microquantities in an acellular biological fluid.

Description

Récupération et dosage d'ADN dans un liquide biologique acellulaire. Recovery and assay of DNA in an acellular biological fluid.
La présente inyention est relatiye à un nouvea procédé de récupération et de dosage de laicroquantitês d1 acide désoxyxibonuclêique (ADN) dans un liquide biologique acellulaire en particulier le" plasma sanguin. Le dosage de l'ADN circulant et notamment de l'ADN présent dans le sang, en position extra-cellulaire, présente un grand intérêt tant sur le plan physiologique que sur le plan pathologique.The present inyention is relatiye nouvea a process for recovering and laicroquantitês dosage of 1 désoxyxibonuclêique acid (DNA) in a cell free biological fluid especially the "blood plasma. DNA Assay circulating including the DNA in blood, in the extra-cellular position, is of great interest both physiologically and pathologically.
1. Sur le plan physiologique, la présence d'ADN circulant chez des personnes "en situation normale" peut dép dre de deux types de phénomènes qui peuvent être qualifiés de passifs ou d'actifs. D'un côté, en effet, la mort cellu¬ laire est un phénomène physiologique normal et permanent qui peut se traduire au delà de la lyse cellulaire, par la libé- ration dans le sang d'une certaine quantité d'acides nucléiq D'un autre côté, il est possible que la présence d'ADN dans sang soit (en partie) le résultat d'un phénomène actif d'exc tion de l'ADN par certaines cellules. Ce processus pourrait (pour certains auteurs) représenter un mécanisme d'informati ou de communication inter-cellulaire. 2. D'un point de vue pathologique,, il est possible que dans certaines circonstances/ l'ADN circulant puisse se trouver "anormalement présent" (soit d'un point de vue quan¬ titatif, soit d'un point de vue qualitatif) dans le sang. La signification de ce phénomène n'est pas univoque : a) Il est possible que l'ADN circulant puisse jouer un rôle pathogène. Plusieurs mécanismes peuvent être invoqués : (i) présent dans le sang en quantité anormalement élevée, l'ADN circulant peut perturber du fait de ses propriétés physico-chimiques {notamment de sa haute viscosité) le fonc¬ tionnement normal de la micro-circulation dans certains tissus et/ou organes. Cela peut être le cas par exemple au cours de la mise en oeuvre de traitements cytolytiques chez des patients atteints de néoplasie ou de leucémie ; (ii) l'ADN peut être également responsable de l'activation de mécanismes pathogènes telle l'activation des systèmes de la coagulation et du complément ; (iii) on peut encore supposer que l'ADN puisse, dans cer- __- taines circonstances, jouer u rôle pathogène du fait de propriétés "génétiques" spécifiques, en s'intégrant au génome de l'hôtè par.un phénomène" semblable à -une transfor¬ mation ; (iv) enfin, l'ADN circulant pourrait jouer un rôle pathogène par 1'intermédiaire de la formation de complexes immuns ADN-anticorps anti-ADN. C'est le mécanisme physiopa- thologique qui a été retenu depuis une vingtaine d'années pour expliquer le développement des lésions tissulaires (en particulier glomêrulaires) apparaissant chez les patients atteints de lupus érythémateux disséminé (LED) ainsi que chez les souris développant de manière spontanée des ala- dies lupiques comparables, telles les souris NZBxNZ . La mise en évidence in vitro d'une affinité particulière de l'ADN pour le collagène pourrait expliquer la généralisation au sein de l'organisme des dépôts de tels complexes et suggère que, dans certaines circonstances, l'ADN édsorbé sur des structures collagéniques pourrait jouer le rôle d'ixnmuno- adsorbant vis à vis d'anticorps anti-ADN libres. Il faut ajouter que les résultats d'études expérimentales effectuées chez des souris "non lupiques" infectées par des endotoxin bactériennes ou infectées par Escherichia coli suggèrent que la formation de complexes ADN-anticorps anti-ADN peut également jouer un rôle pathogène lors du développement de diverses glomérulonéphrites à complexes immuns. b) A côté de la possibilité du rôle pathogène que peut jouer l'ADN circulant, la présence "anormale" d'ADN (sur un plan quantitatif ou qualitatif) peut revêtir une significa¬ tion étiopathogénique ou physiopathologique. Il est possi- ble tout d'abord que, au cours de certaines affections1. Physiologically, the presence of circulating DNA in people "in a normal situation" can depend on two types of phenomena which can be qualified as passive or active. On the one hand, in fact, cell death is a normal and permanent physiological phenomenon which can result beyond cell lysis, by the release into the blood of a certain quantity of nucleic acids D ' on the other hand, it is possible that the presence of DNA in blood is (in part) the result of an active phenomenon of DNA excision by certain cells. This process could (for some authors) represent a mechanism of information or inter-cellular communication. 2. From a pathological point of view, it is possible that in certain circumstances / circulating DNA may be "abnormally present" (either from a quantitative point of view, or from a qualitative point of view ) in the blood. The significance of this phenomenon is not unequivocal: a) It is possible that circulating DNA can play a pathogenic role. Several mechanisms can be invoked: (i) present in the blood in an abnormally high quantity, the circulating DNA can disturb because of its physicochemical properties (in particular its high viscosity) the normal functioning of the micro-circulation in certain tissues and / or organs. This may be the case, for example, during the implementation of cytolytic treatments in patients suffering from neoplasia or leukemia; (ii) DNA can also be responsible for the activation of pathogenic mechanisms such as activation of the coagulation and complement systems; (iii) we can still assume that the DNA can, in cer- _ _ - tain circumstances u play pathogenic role due to "genetic" specific properties, integrating in the host genome PAR.UN phenomenon " similar to a transformation; (iv) finally, the circulating DNA could play a pathogenic role via the formation of immune complexes DNA-antibody anti-DNA. It is the pathophysiological mechanism which has been retained for about twenty years to explain the development of tissue lesions (in particular glomerular) appearing in patients with systemic lupus erythematosus (SLE) as well as in mice spontaneously developing comparable lupus diseases, such as mice NZBxNZ: The demonstration in vitro of a particular affinity of DNA for collagen could explain the generalization within the organism of deposits of such complexes and suggests that, in certain under certain circumstances, DNA absorbed on collagenic structures could play the role of immunosorbent with respect to free anti-DNA antibodies. It should be added that the results of experimental studies carried out in "non-lupus" mice infected with bacterial endotoxin or infected with Escherichia coli suggest that the formation of DNA-anti-DNA antibody complexes may also play a pathogenic role during the development of various glomerulonephritis with immune complexes. b) Besides the possibility of the pathogenic role that circulating DNA can play, the "abnormal" presence of DNA (quantitatively or qualitatively) can take on an etiopathogenic or physiopathological significance. It is possible first of all that, during certain affections
(infectieuses en particulier), l'ADN "spécifique d'un agent pathogène" (viral par exemple) puisse être présent dans le sang. La détection et l'identification de cet ADN peut revêt alors un intérêt étiologique. Il a, par exemple, été montré que des patients porteurs chroniques de l'antigène de l'hép tite B possèdent dans leur plasma de l'ADN circulant capabl de s''hybrider avec de l'ADN- extrait de particules virales du virus de l'hépatite B. D'un autre côté, il esi également possible-que la libération dans le sang d'ADN en quantité anormalement élevée -traduise.des1processus pathologiques précis. On peut envisager par exemple qu'une atteinte infla matoire vascuiaire s'accompagne du passage "rapide" de matériel nucléaire dans le sang du fait de l'absence de filtre enzymatique tissulaire"' et de la libération "directe de matériel nucléaire dans le secteur vasculaire.(infectious in particular), DNA "specific to a pathogen" (viral for example) may be present in the blood. The detection and identification of this DNA may therefore be of etiological interest. It has for example been shown that antigen chronic patients with Hep B tite have in their plasma circulating DNA capabl of s '' hybridize with DNA extracted from virus particles of the virus of hepatitis B. On the other hand, it is also possible-that the release into the blood of DNA in abnormally high quantity -translates.the 1 precise pathological processes. We can consider, for example, that an inflamatory vascular injury is accompanied by the "rapid" passage of nuclear material in the blood due to the absence of a tissue enzymatic filter "' and the direct" release of nuclear material in the sector. vascular.
Compte tenu de l'intérêt que présente le dosage de l'ADN circulant, différentes techniques, colorimétriques, fluorimétriques ou im unologiques ont été proposées.Given the advantage of assaying circulating DNA, different techniques, colorimetric, fluorimetric or im unological have been proposed.
Cependant, l'utilisation de ces techniques,en parti lier pour le dosage de l'ADN plasmatique, rencontre des limites et présente des difficultés : ces difficultés ou limites se rapportent essentiellement à la spécificité, à la sensibilité et au caractère quantitatif des méthodes pro posées. a) La spécificité : deux aspects concernant le probl de la spécificité doivent être considérés ; (i) de nombreus substances peuvent interférer avec les méthodes colorimétri- ques (telle la classique méthode de Burton) fluorimétriques ou i munologiques. Dans ces conditions, ne peuvent être considérés comme interprétables que les résultats des 5 méthodes comportant «in dosage contrôle de l'ADN après trai¬ tement des échantillons par une préparation purifiée de désoxyribonucléase ; (ii) le second aspect à considérer est le fait qu'il devrait être nécessaire de déterminer avec exactitude si l'ADN "spécifiquement" mis en évidence (ou 10 dosé) dans le sang se trouvait bien en situation extra¬ cellulaire au moment du prélèvement et ne provenait pas de la lyse artificielle des cellules nuclées du sang. b) La sensibilité : les méthodes ci-dessus mentionnée possèdent une sensibilité limitée qui ne permet en aucune 15 manière de doser l'ADN circulant chez les sujets normaux. La sensibilité maximale rapportée dans la littérature est de 20 à 50 ng/ml pour l'ADN en doublé- hélice et de lOOng/ml pour"l'ADN en simple hélice (STEINMAN, ARTH. RHEUM. 1982, 25, 1425-143Déconcentrations qui ne sont pas atteintes chez "20- les ^sujets normaux. c) Le caractère quantitatif : _ les techniques immunolo¬ giques qui sont parmi les plus sensibles ne sont pas quantitatives et ce pour plusieurs raisons : i) le principe même de la méthode peut faire que celle-ci 25 n'est à la base que semi-quantitative. C'est le cas de la contre-immunoélectrophorèse ; * ii) la taille des molécules d'ADN est très variable et pour une même quantité d'ADN, le nombre de molécules pouvant réagir avec le "substrat immunologique" (les anticorps 30 anti-ADN en l'occurrence) est variable d'un échantillon à 1'autre ; (iii) certaines substances (telles des protéines capables d fixer l'ADN de manière spécifique ou non) peuvent interfér dans le dosage. 35 Pour surmonter ces limites et difficultés, il a été proposé de purifier les préparations d'ADN plasmatiqu préalablement â leur dosage, en les débarrassant des divers constituants qui les accompagnent dans le plasma, en parti¬ culier des protéines. D'autre part, il a été proposé (cf. RAPTIS.. et al. J. CLIN. INVEST., 6, Décembre 1980, 1391- 5 1399) de quantifier et de caractériser l'ADN plasmatique normal et l'ADN plasmatique provenant de patients atteints de lupus érythémateux systémique (SLE) après l'avoir purifi et l'avoir marqué in vitro en utilisant la technique de "Nick Translation"-elle-même décrite précédemment dans 0 RIGBY et al., J. MOL. BIOL. (1977), 1_1_3, 237 - 251-.However, the use of these techniques, in particular for the determination of plasma DNA, encounters limits and presents difficulties: these difficulties or limits relate essentially to the specificity, sensitivity and quantitative nature of the pro methods. asked. a) Specificity: two aspects concerning the problem of specificity must be considered; (i) many substances can interfere with colorimetric methods (such as the classic Burton method) fluorimetric or munological. Under these conditions, the results of the 5 methods comprising "in DNA control assay after treatment of the samples with a purified preparation of deoxyribonuclease can only be considered interpretable; (ii) the second aspect to be considered is the fact that it should be necessary to determine with precision whether the DNA "specifically" detected (or measured) in the blood was indeed in an extracellular situation at the time of sample and did not come from artificial lysis of nucleated blood cells. b) Sensitivity: the methods mentioned above have a limited sensitivity which in no way makes it possible to assay the DNA circulating in normal subjects. The maximum sensitivity reported in the literature is 20 to 50 ng / ml for DNA in double helix and lOOng / ml for " DNA in single helix (STEINMAN, ARTH. RHEUM. 1982, 25, 1425-143Deconcentrations which are not affected by "the 20- ^ normal subjects c) quantitative. _ the immunolo¬ cal techniques that are among the most sensitive are not quantitative for several reasons: i) the principle of the method can make that this is basically only semi-quantitative. This is the case with counter-immunoelectrophoresis; * ii) the size of the DNA molecules is very variable and for the same amount of DNA, the number of molecules that can react with the "immunological substrate" (anti-DNA antibodies in this case) is variable one sample to another; (iii) certain substances (such as proteins capable of fixing DNA in a specific manner or not) may interfere in the assay. To overcome these limitations and difficulties, it has been proposed to purify plasma DNA preparations. prior to their dosage, by ridding them of the various constituents which accompany them in the plasma, in particular proteins. On the other hand, it has been proposed (cf. RAPTIS .. et al. J. CLIN. INVEST., 6, December 1980, 1391-5 1399) to quantify and characterize normal plasma DNA and plasma DNA from patients with systemic lupus erythematosus (SLE) after having purified it and having marked it in vitro using the technique of "Nick Translation" - itself described previously in 0 RIGBY et al., J. MOL. BIOL. (1977), 1_1_3, 237 - 251-.
Comme on le sait, le marquage à l'aide de la technique de "Nick Translation" consiste à incorporer des molécules de désoxyribonucléotides dans l'ADN. Cette tech¬ nique utilise deux enzymes, la désoxyribonucléase et r- -1 l'ADN-polymérase d'Escherichia coli. La désoxyribonucléase réalise des coupures -ou-nicks- dans les brins d'ADN. L'ADN-polymérase peut alors, sous l'effet de son activité exo-nucléasique 5'-3', détacher des nucléotides du côté 5'- de la coupure. L'élimination des nucléotides et l'addi-"-As is known, labeling using the "Nick Translation" technique consists in incorporating deoxyribonucleotide molecules into DNA. This technique uses two enzymes, deoxyribonuclease and r - - 1 DNA polymerase from Escherichia coli. The deoxyribonuclease cuts or nicks the strands of DNA. The DNA polymerase can then, under the effect of its 5'-3 'exo-nuclease activity, detach nucleotides from the 5'- side of the cut. Elimination of nucleotides and addi - "-
20 tion séquentielle de nucléotides sur le" côté 3'- en¬ traînent "la progression de la coupure ("Translation") le long de l'ADN. En remplaçant les nucléotides pré-existants par des nucléotides marqués soit par un isotope radio¬ actif soit par une substance pouvant être révélée à l'aide20 sequential tion of nucleotides on the " 3'-side drag " the progression of the cut ("Translation") along the DNA. By replacing the pre-existing nucleotides with nucleotides labeled either with a radioactive isotope or with a substance which can be revealed using
25 d'une réaction enzymatique, il est possible de préparer des ADN marqués d'activité spécifique très élevée, l'activité spécifique de l'ADN étant fonction de l'activité spécifique des substrats et de l'étendue du remplacement des nucléotides.25 of an enzymatic reaction, it is possible to prepare labeled DNAs of very high specific activity, the specific activity of the DNA being a function of the specific activity of the substrates and of the extent of replacement of the nucleotides.
Alors que RIGBY et Al. ont utilisé comme matiWhile RIGBY and Al. Used as mati
30 première,de l'ADN d'origine cellulaire, RAPTIS a appliqué la technique de"Nick Translation"in vitro à de l'ADN circu¬ lantplasmatique purifié, pour obtenir un ADN marqué in vitr qui, en raison de sa radioactivité très élevée, permet une très grande sensibilité de mesure.30 first, DNA of cell origin, RAPTIS applied the technique of "Nick Translation" in vitro to purified circu¬ lantplasmatic DNA, in order to obtain DNA labeled in vitro which, due to its very high radioactivity , allows very high measurement sensitivity.
35 Selon RAPTIS et Al. la réaction de"Nick Tran tion"doit être réalisée dans un milieu contenant 50 mM de tampon Tris-HCl, pH 7,6, 10 M de 2-mercaptoéthanol, 5 mM de MgCl2 et 50 yg/ml de BSA (sérum-albumine bovine) mis en contact avec 0,25 n oles de chacun des quatre dXTP marqués, par réaction, et 1ϋ/réaction (ou 0,1 yl) de préparation 5 enzy atique (ADN-polymérase) , tandis que le produit résultan est extrait à deux reprises par du phénol redistillé.35 According to RAPTIS et al. The "Nick Transaction" reaction must be carried out in a medium containing 50 mM of Tris-HCl buffer, pH 7.6, 10 M of 2-mercaptoethanol, 5 mM of MgCl 2 and 50 μg / ml of BSA (bovine serum albumin) brought into contact with 0.25 noles of each of the four labeled dXTPs , per reaction, and 1ϋ / reaction (or 0.1 µl) of enzyme preparation (DNA polymerase), while the resulting product is extracted twice with redistilled phenol.
L'ADN plasmatique soumis à la réaction de"Nick Translation"est obtenu selon RAPTIS et Al. à partir de plasm dilué 4 fois dans 50 mM de tampon Tris-HCl, pH 8,5, 20 mM 10 d'EDTA contenant 1 % de dodécylsulfate de sodium,puis incubé (20 ml) avec 50 ml de pronase, pendant 4 heures à 37°C, l'incubation étant suivie d'extractions séquentielles avec du phénol, un mélange 24:1 de chloroforme et d'alcool isoamy- lique, et de l'éther, de dialyse contre 20 m de tamponThe plasma DNA subjected to the "Nick Translation" reaction is obtained according to RAPTIS et al. From plasma diluted 4 times in 50 mM Tris-HCl buffer, pH 8.5, 20 mM EDTA containing 1% of sodium dodecyl sulfate, then incubated (20 ml) with 50 ml of pronase, for 4 hours at 37 ° C, the incubation being followed by sequential extractions with phenol, a 24: 1 mixture of chloroform and isoamy alcohol - liquique, and ether, dialysis against 20 m of buffer
1.5 Tris-HCl, pH 7,6, 10 mM de NaCl, 5 M d'EDTA, d'une diges¬ tion de l'extrait par 10 yg/ml de ribonucléase pancréatique pendant 30 minutes à 37°C et éventuellement d'une étape de purification comprenant une adsorption sur une colonne de .BND-cellulose à pH 8,1 et une _élution, d'une précipitation1.5 Tris-HCl, pH 7.6, 10 mM NaCl, 5 M EDTA, digestion of the extract with 10 μg / ml of pancreatic ribonuclease for 30 minutes at 37 ° C. and optionally a purification step comprising an adsorption on a column of .BND-cellulose at pH 8.1 and an elution, of a precipitation
20 " par de -l'éthanol, suivie d'une remise, en suspension du résidu solide dans 100 yl de tampon Tris-HCl, 10" mM, pH 7,6 et 1 mM d'EDTA".20 " with ethanol, followed by resuspension, suspension of the solid residue in 100 μl of Tris-HCl buffer, 10 " mM, pH 7.6 and 1 mM EDTA " .
Enfin, la détermination de la radioactivité des fractions résultant de l'analyse par sédimentation neutrFinally, the determination of the radioactivity of the fractions resulting from the analysis by neutral sedimentation
25 par un gradient de saccharose et de fractions résultant de l'analyse par centrifugation à l'équilibre dans du CsCl, comparée à une courbe standard des comptages/minute obtenus en fonction de la quantité d'ADN de phages λ utilisée dans chaque réaction de Nick Translation, permet d'obtenir la25 by a sucrose and fraction gradient resulting from the analysis by equilibrium centrifugation in CsCl, compared to a standard curve of counts / minute obtained as a function of the quantity of phage DNA λ used in each reaction of Nick Translation, gets the
30 quantité d'ADN, à condition que celle-ci se trouve dans une gamme comprise entre 0,01 et 0,1 yg d'ADN de phages λ.30 amount of DNA, provided that it is in a range between 0.01 and 0.1 µg of phage λ DNA.
Cette méthode relativement peu sensible et passablement complexe, est issue de la méthode de RIGBY et Al. qui, si elle préconise la méthode relativement simple deThis relatively insensitive and fairly complex method is derived from the method of RIGBY et Al. Which, if it recommends the relatively simple method of
35 comptage de la radioactivité sur des disques de papier-filtr utilise cependant comme mélange réactionnelpour la"Nick Translation",pour 120 yl, 50 mM de phosphate de potassium (pH 7,4), 5 M de MgCl-, 15 yM de dTTP et de dGTP et 15 à 20 yM de fa pJ àATP et de |a P} dCTP, avec une concentra¬ tion d'ADN de l'ordre de 15 yg/ml, et une incubation d'une minute à la température ambiante avec 1,33 ng dans 10 yl d'ADN-ase I activée,-puis à 14°C avec 6 yg (4 yl) d'ADN- poly érase I suivies de l'adjonction de 60 yl d'EDTA 0,25 M (pH 7,4) (éventuellement suivie d'une extraction par du phénol) et d'un chauffage de 10 minutes à 68°C. Cette méthode peut être mise en oeuvre sur de faibles volumes, de l'ordre du microlitre, mais elle est inutilisable pour le but que s'est fixée la présente in¬ vention, à savoir la récupération de microquantités d'ADN dans un milieu biologique liquide acellulaire. La présente invention a pour but de pourvoir à un procédé de récupération et de dosage de microquantités d'ADN, qui répond mieux aux nécessités de la pratique que les procédés proposés dans l'Art antérieur, notammenten ce que le nouveau procédé conforme à la présente invention : - est réellement quantitatif, ce que ne sont pas les méthod basées" sur des réactions immunochimiques telles que la réaction d'inhibition de la fixation de l'ADN décrite par LEON et Al. dans l'Article cité plus haut, ou la méthode de contre-immunoélectrophorêse décrite par DAVIS et DAVIS dans ARTH. RHEUM. (1973), 1_6, 52-58 ;35 count of radioactivity on filter paper discs, however, used as reaction mixture for "Nick Translation ", for 120 yl, 50 mM potassium phosphate (pH 7.4), 5 M MgCl-, 15 yM dTTP and dGTP and 15 to 20 yM fa pJ to ATP and | a P} dCTP, with a DNA concentration of the order of 15 μg / ml, and a one minute incubation at room temperature with 1.33 ng in 10 μl of activated DNA-ase I, then at 14 ° C with 6 µg (4 µl) of DNA polyerase I followed by the addition of 60 µl of 0.25 M EDTA (pH 7.4) (optionally followed by phenol extraction) and heating for 10 minutes at 68 ° C. This method can be implemented on small volumes, of the order of microliter, but it cannot be used for the purpose set by the present invention, namely the recovery of DNA microquantities in an acellular liquid biological medium The aim of the present invention is to provide a method for recovering and assaying DNA microquantities which better meets the needs of the practice than the methods proposed in the prior art, in particular in that the new process in accordance with the present invention: - is truly quantitative, which are not the methods based " on immunochemical reactions such as the reaction for inhibiting the DNA binding described by LEON et Al. in the Article cited above, or the method of counterimmunoelectrophoresis described by DAVIS and DAVIS in ARTH. RHEUM. (1973), 1-6, 52-58;
- est spécifique de l'ADN et ne peut être influencé ni par des anticorps anti-ADN ou d'autres protéines qui fixent l'ADN, qui peuvent interférer dans les tests basés sur de réactions immunologiques, ni par des substances suscepti- blés d'interférer dans les tests colori étriques ou fluo- rimétriques précédemment décrits (cf. notamment, STEINMAN J. CLIN, INVEST. (1975), 5_6, 512-515) ;- is specific for DNA and cannot be influenced by either anti-DNA antibodies or other proteins that bind DNA, which may interfere in tests based on immunological reactions, or by substances susceptible to d 'interfere in the colorimetric or fluorometric tests previously described (cf. in particular, STEINMAN J. CLIN, INVEST. (1975), 5_6, 512-515);
- ne requiert que quelques microlitres de plasma, est rapid fiable et est d'une très grande sensibilité, et peut être mis en oeuvre simultanément sur de nombreux échantillons.- requires only a few microliters of plasma, is fast reliable and is very sensitive, and can be used simultaneously on numerous samples.
La présente invention a pour objet un procédé de récupération et de dosage de microquantités d'ADN dans un liquide biologique acellulaire, en particulier le plasma sanguin, qui est caractérisé en ce qu'il comprend les étapes successives suivantes : - une première étape d'élimination des protéines présentes dans le liquide biologique acellulaire dans lequel on veut doser l'ADN, qui consiste à extraire un mélange dudit liquide biologique et d'acide éthylènediamine tétraacétique (EDTA) par du phénol saturé par du Tris-hydroxyaminométhane (pH 8 environ) , pour obtenir une phase aqueuse pratiquement dépourvue de protéines et contenant sensiblement la totalité de l'ADN ;The subject of the present invention is a method for recovering and assaying micro amounts of DNA in an acellular biological fluid, in particular the blood plasma, which is characterized in that it comprises the following successive steps: - a first step of elimination of the proteins present in the biological fluid acellular in which we want to assay the DNA, which consists in extracting a mixture of said biological liquid and ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA) with phenol saturated with Tris-hydroxyaminomethane (pH 8 approximately), to obtain an aqueous phase practically free proteins and containing substantially all of the DNA;
- une deuxième étape de récupération de l'ADN de ladite solu¬ tion aqueuse, qui consiste à précipiter l'ADN par adjonc- tion à ladite solution d'un agent coprécipitant approprié et d'un agent de précipitation avantageusement constitué par un alcool inférieur, en présence d'un tampon approprié tel que le-tampon' Tris-hydroxyaminométhane u analogue ;a second step for recovering the DNA from said aqueous solution, which consists in precipitating the DNA by adding to said solution an appropriate coprecipitating agent and a precipitation agent advantageously consisting of a lower alcohol , in the presence of a suitable buffer such as the buffer ' Tris-hydroxyaminomethane u analog;
- une troisième étape, de marquage par "Nick translation", "de l'ADN récupéré, qui consiste à incuber l'ADN avec un ou plusieurs-désoxynucléotides-triphosphatês marqués et avec de. l'ADN-polymérase I et de la désoxyribonucléase I, dans un milieu réactionnel qui comprend le Tris-hydroxy¬ aminométhane, le chlorure de magnésium, la sérumalbumine bovine, le 5-merceptoéthanol et le glycérol ;a third step, of labeling by "Nick translation", "of the recovered DNA, which consists in incubating the DNA with one or more labeled deoxynucleotides-triphosphates and with DNA polymerase I and deoxyribonuclease I, in a reaction medium which comprises Tris-hydroxy¬ aminomethane, magnesium chloride, bovine serum albumin, 5-merceptoethanol and glycerol;
- une quatrième étape de dosage de l'ADN par toute méthode appropriée révélant le marqueur incorporé à 1:ADN.- A fourth step of DNA assay by any appropriate method revealing the marker incorporated into 1 : DNA.
Selon un mode de mise en oeuvre préféré du procédé conforme à la présente invention, le marquage par "Nick Translation" de l'ADN récupéré est réalisé, au cours de la troisième étape du procédé, à l'aide d'au moins un désoxynucléotide-triphosphate marqué par un isotope radio¬ actif, auquel cas la quatrième étape du procédé qui com¬ prend le dosagede l'ADN, consiste à compter la radioacti- vite présente sur un filtre de papier sur lequel a été dé¬ posé l'ADN marqué et qui a éventuellement subi des lavages par des agents de lavage appropriés, puis a été séché, par comptage direct ou après immersion dans un liquide scintillant, en fonction de la nature du radioisotope de marquage. Selon un autre mode de mise en oeuvre pré¬ féré du procédé conforme à -la présente invention, le mar¬ quage par "Nick Translation" de l'ADN récupéré au cours de la deuxième étape, est réalisé au cours de la troisième étape à l'aide d'au moins un désoxynucléotide triphos- phate marqué chimiquement par une substance pouvant être révélée à l'aide d'une réaction enzymatique, auquel cas la quatrième étape du procédé qui comprend le dosage de l'ADN consiste à révéler l'ADN après fixation du complexe enzymatique approprié, en présence d'un substrat chromo- gène.According to a preferred embodiment of the method in accordance with the present invention, the labeling by "Nick Translation" of the recovered DNA is carried out, during the third step of the method, using at least one deoxynucleotide -triphosphate marked by a radioactive isotope, in which case the fourth step of the process which includes the determination of DNA, consists in counting the radioactivity present on a paper filter on which the DNA has been deposited marked and possibly washed by appropriate washing agents, then was dried, by direct counting or after immersion in a scintillating liquid, depending on the nature of the labeling radioisotope. According to another preferred embodiment of the process according to the present invention, the labeling by "Nick Translation" of the DNA recovered during the second step is carried out during the third step. using at least one triphosphate deoxynucleotide chemically labeled with a substance which can be revealed by means of an enzymatic reaction, in which case the fourth step of the process which comprises the assay of DNA consists in revealing the DNA after fixation of the appropriate enzyme complex, in the presence of a chromogenic substrate.
Selon une disposition avantageuse de ce mode de mise en oeuvre, le ou les nucléotides incorporés dans -l'ADN sont marqués par la biotine et l'enzyme utilisée ; pour sa ou leur détection est liée à l'avidine. -" Selon un mode de mise en oeuvre avantageux du procédé conforme à la présente invention, le liquide biolo que acellulaire tel que le plasma humain, dans lequel on cherche à doser l'ADN, est mélangé à raison de quelques microlitres, au cours de la première étape du procédé, ave de l'acide éthylènediamine tétra acétique (EDTA) pour obte nir une concentration finale d'EDTA de l'ordre de 10 à 20 (pH 8 environ) et la solution obtenue est extraite par du phénol saturé d'un tampon approprié tel que Tris-hydroxy¬ aminométhane 0,1 M, pH 8 environ, notamment.According to an advantageous arrangement of this embodiment, the nucleotide (s) incorporated in the DNA are labeled with biotin and the enzyme used; for its or their detection is related to avidin. - " According to an advantageous mode of implementation of the process in accordance with the present invention, the biologic and acellular liquid such as human plasma, in which one seeks to assay the DNA, is mixed at the rate of a few microliters, the first step of the process, with ethylenediamine tetra acetic acid (EDTA) to obtain a final concentration of EDTA of the order of 10 to 20 (approximately pH 8) and the solution obtained is extracted with saturated phenol d 'A suitable buffer such as 0.1 M Tris-hydroxy¬ aminomethane, pH approximately 8, in particular.
Selon un autre mode de mise en oeuvre avanta¬ geux du procédé conforme à la présente invention, l'agent de coprecipitation introduit au cours de la deuxième éta¬ pe du procédé, est pris dans le groupe qui comprend la gé¬ latine, les dia ines telles que la spermidine, les acides ribonucléiques, des polynucléotides de synthèse, des protéines comportant des groupes réactifs possédant des charges positives tels qu'albumines méthylées et toute substance présentant une affinité particulière pour l'ADN et n'inhibant pas la réaction de "Nick Translation". .Selon encore un autre mode de mise en oeuvre avantageux du procédé conforme à la présente invention, l'agent de précipitation mis en oeuvre au cours de la seconde étape du procédé, est de l'éthanol.According to another advantageous embodiment of the process in accordance with the present invention, the co-precipitation agent introduced during the second stage of the process is taken from the group which comprises the Latin, the dia ines such as spermidine, ribonucleic acids, synthetic polynucleotides, proteins comprising reactive groups possessing positive charges such as methylated albumin and any substance having a particular affinity for DNA and not inhibiting the "Nick Translation" reaction. According to yet another advantageous embodiment of the process according to the present invention, the precipitating agent used during the second step of the process is ethanol.
Selon une modalité particulière de ce mode de mise en oeuvre, l'éthanol ou autre alcool inférieur uti¬ lisé comme agent de précipitation, est ajouté quelles que soient la température d'incubation et la température de cen trifugation, en quantité appropriée pour obtenir une concen tration finale en éthanol égale ou supérieure à 66%. Selon encore un autre mode de mise en oeuvre avantageux du procédé conforme à la présente invention, la phase aqueuse contenant l'ADN, un agent de précipitation et un agent de copr cipitation, est centrifugée pour provoquer la précipitation de l'ADN et le précipité est lavé par une nouvelle addition d'éthanol ou" autre agent"-de- précipitation analogue, puis la solution obtenue"est à nouveau centrifu¬ gée et le précipité, essentiellement constitué par de l'ADN, est récupéré.According to a particular modality of this mode of implementation, ethanol or other lower alcohol used as precipitation agent, is added whatever the incubation temperature and the temperature of cen trifugation, in an appropriate amount to obtain a final concentration in ethanol equal to or greater than 66%. According to yet another advantageous embodiment of the process in accordance with the present invention, the aqueous phase containing the DNA, a precipitation agent and a coprecipitation agent, is centrifuged to cause the precipitation of the DNA and the precipitate is washed with a new addition of ethanol or " other similar precipitation agent " , then the solution obtained " is again centrifuged and the precipitate, essentially consisting of DNA, is recovered.
Selon encore une modalité avantageuse de ce mode de mise en oeuvre, l'ADN précipité est récupéré par addition d'eau, éventuellement sous agitation.According to yet another advantageous modality of this embodiment, the precipitated DNA is recovered by adding water, optionally with stirring.
Selon un autre mode de mise en oeuvre du procé dé conforme à la présente invention, le marquage par "Nick Translation" est effectué, au cours de la troisième étapeAccording to another embodiment of the process according to the present invention, the marking with "Nick Translation" is carried out, during the third step
du procédé, par incubation de l'ADN récupéré, avec .2 à 50 picomoles d'un ou de plusieurs désoxynucléotides-triphosphat marqués, éventuellement environ 80-120 picomoles de désoxy- nucléotides-triphosphates non marqués, environ 0,25 Unité d'ADN-polymérase I et environ 5 picogrammes de désoxyribo¬ nucléase I, en présence d'un tampon tel que Tris-hydroxy¬ aminométhane (5-12mM) , de chlorure de magnésium (2-5mM) , de B-mercapto-éthanol (7-15mM), d'albumine bovine (20-60 micro¬ grammes/ml) et de glycérol (environ 0,5 % poids/volume). Selon une modalité avantageuse de ce mode de mise en oeuvre, l'incubation est réalisée à une température com¬ prise entre 15 et 37°C environ, pendant une durée de 1 à 3 heures of the method, by incubation of the recovered DNA, with .2 to 50 picomoles of one or more labeled deoxynucleotides-triphosphates, optionally about 80-120 picomoles of unlabeled deoxynucleotides-triphosphates, about 0.25 Units of DNA polymerase I and approximately 5 picograms of deoxyribo¬ nuclease I, in the presence of a buffer such as Tris-hydroxy¬ aminomethane (5-12mM), magnesium chloride (2-5mM), B-mercapto-ethanol ( 7-15mM), bovine albumin (20-60 micro¬ grams / ml) and glycerol (about 0.5% weight / volume). According to an advantageous modality of this mode of implementation, the incubation is carried out at a temperature between 15 and 37 ° C approximately, for a period of 1 to 3 hours
Selon encore un autre mode de mise en oeuvre du procédé conforme à la présente invention, au cours de la quatrième étape du procédé, le filtre sur lequel est déposé l'ADN est lavé, de préférence sous agitation, par une - solution de forte molarité permettant d'éliminer les nu¬ cléotides marqués non incorporés à l'ADN tout en conservant sur le filtre la tortal-ité de l'ADN marqué. ""- " Outre les dispositions qui précèdent, l'inven¬ tion comprend encore d'autres dispositions qui ressortiront de la description qui va suivre.According to yet another embodiment of the process in accordance with the present invention, during the fourth step of the process, the filter on which the DNA is deposited is washed, preferably with stirring, with a solution of high molarity allowing the elimination of the labeled nucleotides not incorporated into the DNA while preserving the tortality of the labeled DNA on the filter. "" - "In addition to the foregoing provisions, the invention also comprises other provisions which will become apparent from the description which follows.
La présente invention vise plus particulière¬ ment le nouveau procédé de récupération et dosage de micro- quantités d'ADN dans un liquide biologique acellulaire, en particulier le plasma sanguin, conforme aux dispositions qui précèdent, les analyses biologiques utilisant ce procé¬ dé, ainsi que les situations physiologiques élucidées et les diagnostics établis grâce au procédé conforme à la présente invention.The present invention relates more particularly to the new process for recovering and assaying micro-amounts of DNA in an acellular biological fluid, in particular blood plasma, in accordance with the above provisions, biological analyzes using this process, as well as the physiological situations elucidated and the diagnoses established by the process in accordance with the present invention.
L'invention sera mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de mise en oeuvre et d'application du procédé objet de la présente invention. II doit être bien entendu, toutefois, que ces exemples sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'invention, dont ils ne constituent en aucune manière une limitation. Exemple 1 Récupération et dosage de microquantités d'ADN présentés dans du plasma sanguin 1ère étape :The invention will be better understood using the additional description which follows, which refers to examples of implementation and application of the process which is the subject of the present invention. It should be understood, however, that these Examples are given solely by way of illustration of the subject of the invention, of which they do not in any way constitute a limitation. EXAMPLE 1 Recovery and Determination of DNA Microquantities Presented in Blood Plasma 1st Step:
Dans un tube conique en polypropylène de 1,5 ml (tube Eppendorf) on mélange 10 yl de plasma prélevé s acide êthylènediaminetétraacëtique et 50 yl d'acide éthy- lênediaminetétraacétique à 15 mM. On ajoute 25 microlitres de phénol saturé par du Trishydroxyaminométhane 0,1 M, pH 8. On mélange. Après incubation de 3 minutes, à la température de la pièce, on centrifuge 5 minutes à 12 000 g. 2ëme étape : a) une solution mère .de gélatine (DIFCO) à- 5- % en (poids/volume) dans de l'eau bidistillée, est chauffée à 110°C pendant 30 minutes.In a 1.5 ml conical polypropylene tube (Eppendorf tube), 10 μl of plasma taken from ethylenediaminetetraacetic acid and 50 μl of ethylenediaminetetraacetic acid at 15 mM are mixed. 25 microliters of phenol saturated with 0.1 M Trishydroxyaminomethane, pH 8, are added. Mixing is carried out. After incubation for 3 minutes, at room temperature, centrifugation is carried out for 5 minutes at 12,000 g. 2nd stage: a) a stock solution of gelatin (DIFCO) at 5-% by weight ( weight / volume) in double distilled water, is heated at 110 ° C. for 30 minutes.
. "'" "b) 40 microlitres de la phase supérieure (phase aqueu sont"transférés dans un autre tube Eppendorf contenant Ï0 μl de l gélatine préparée comme ci-dessus,à 0,3% (poids/volume) dans du, tampon Trishydroxyaminométhane 0,0025 M, pH 8.On ajoute 105 mic litres d'éthanol absolu à -20°C. Le tube est agité, incubé 5 minutes à 4°C puis centrifugé 15 minutes à 4°C à 12 000 g. » Le surnageant est éliminé par pipetage et après addition de 200 microlitres d'éthanol à 85 % à -20°C, le tube est immé¬ diatement centrifugé dans les mêmes conditions que précédem ment. Le surnageant est totalement éliminé par pipetage puis séchage sous vide. 25 microlitres d'eau bidistillée à 60°C sont ajoutés et le tube est ncubé 2 à 3 minutes à 60° puis centrifugé quelques secondes et placé à 4°C. 3ëme étape : . "' "" b) 40 microliters of the upper phase (aqueous phase are " transferred to another Eppendorf tube containing 0.1 μl of gelatin prepared as above, at 0.3% (weight / volume) in Trishydroxyaminomethane buffer 0.0025 M, pH 8. 105 μl of absolute ethanol are added at -20 ° C. The tube is shaken, incubated for 5 minutes at 4 ° C. and then centrifuged for 15 minutes at 4 ° C. at 12,000 g. " supernatant was removed by pipetting, and after addition of 200 microliters of 85% ethanol at -20 ° C, the tube is imme diately ¬ centrifuged under the same conditions as precedesM ment. the supernatant was completely removed by pipetting and then vacuum drying. 25 microliters of bidistilled water at 60 ° C. are added and the tube is incubated for 2 to 3 minutes at 60 ° then centrifuged for a few seconds and placed at 4 ° C. 3rd step:
L'ADN dissous dans 25 microlitres d'eau bi¬ distillée est incubé dans 25 microlitres contenant 17 pico- moles de désoxyribocytidine 5' triphosphate marqués au tri- tium et 100 picomoles de désoxyriboadénine triphosphate, de désoxyriboguanine triphosphate et de désoxyribothymine tri¬ phosphate, 0,25 Unités d'ADN polymérase I et 5 picogrammes de désoxyribonucléase I, du trishydroxyaminométhane (7,5 mM) du chlorure de magnésium (3,5 mM) , du Beta-mercaptoéthanol (10 M) , de l'albumine bovine (50 microgrammes/ml) et du glycérol (0,5 %, poids/volume) . Les tubes sont incubés 1,5 heu à 37°C.The DNA dissolved in 25 microliters of bi-distilled water is incubated in 25 microliters containing 17 pico-moles of deoxyribocytidine 5 'triphosphate labeled with tri- tium and 100 picomoles of deoxyriboadenine triphosphate, deoxyriboguanine triphosphate and deoxyribothymine tri¬ phosphate, 0.25 Units of DNA polymerase I and 5 picograms of deoxyribonuclease I, trishydroxyaminomethane (7.5 mM) of magnesium chloride (3.5 mM), Beta-mercaptoethanol (10 M), bovine albumin (50 micrograms / ml) and glycerol (0.5%, weight / volume). The tubes are incubated 1.5 hrs at 37 ° C.
4ëme étape : Les 50 microlitres de la réaction sont déposés4th step: The 50 microliters of the reaction are deposited
2 sur un carré de papier Whatmann DE 81 de 2,25 cm . Le filtr est séché puis placé dans un bêcher et lavé sous agitation rotative, successivement 3 fois 5 minutes par 100 ml de solution de formate d'ammonium (HCOONH.) 0,3 M et d'hydro- gène phosphate disodique (Na2HP0.) 0,01 M pH 7,8 2 fois2 on a 2.25 cm Whatmann DE 81 paper square. The filter is dried then placed in a beaker and washed with rotary stirring, successively 3 times 5 minutes with 100 ml of 0.3 M solution of ammonium formate (HCOONH.) And of disodium hydrogen phosphate (Na 2 HP0 .) 0.01 M pH 7.8 2 times
5 minutes par 100 ml d'éthanol à 95 % et 1 -fois 5 minutes p 50 ml de diéthyléther. Le^ filtre est séché à la chaleur pui placé dans un tube pour comptage radioactif, contenant 5 ml de liquide "scintillant ("Ready Solve" Beckman, par exe pie). Dans ces conditions, l'activité spécifique obtenue pour une efficacité de comptage de 30 % environ, est de 10 000 à 15 000 cpm par nanogramme d'ADN et la Radioactivit retenue sur le filtre non spécifiquement en l'absence d'ADN est de 300 à 600 cpm. Exemple 25 minutes per 100 ml of 95% ethanol and 1-time 5 minutes p 50 ml of diethyl ether. The ^ filter is dried in the heat and then placed in a tube for radioactive counting, containing 5 ml of " scintillant " liquid (Beckman "Ready Solve", for example). Under these conditions, the specific activity obtained for counting efficiency approximately 30% is 10,000 to 15,000 cpm per nanogram of DNA and the radioactivity retained on the filter not specifically in the absence of DNA is 300 to 600 cpm.
Dosage d'ADN dans le plasma de souris auxquelles avait été injecté un lipopolysaccharide d'ori gine bactérienne.Determination of DNA in the plasma of mice to which a lipopolysaccharide of bacterial origin was injected.
Pour déterminer l'efficacité du procédé conforme à la présente invention dans le cadre de recher¬ ches physiologiques et pathologiques, on a effectué une estimation en série de l'ADN présent dans le plasma de souris ayant reçu une injection d'un lipopolysaccharide d'origine bactérienne J_ connu comme capable d'entraîner dans le sang de ces souris la libération massive d'ADN en position extra-cellulaire, FOURNI & Al. J. Exp. Méd. 140, 1189-1206 _7. L'expérimentation a été menée comme suit : des souris femelles de race C57B1/6 âgées de 8 semaines ont reçu une injection de 100 μg d'un lipopolysacchari¬ de d'origine bactérienne dans les conditions décrites par FOURNIE & Al. (référencé ci-dessus).To determine the effectiveness of the process in accordance with the present invention in the context of physiological and pathological research, a serial estimate was made of the DNA present in the plasma of mice having received an injection of a lipopolysaccharide bacterial origin J_ known as capable of causing in the blood of these mice the massive release of DNA in extra-cellular position, FOURNI & Al. J. Exp. Med. 140, 1189-1206 _7. The experiment was carried out as follows: female mice of race C57B1 / 6 aged 8 weeks old received an injection of 100 μg of a lipopolysacchari¬ of bacterial origin under the conditions described by FOURNIE & Al. (Referenced here -above).
Des prélèvements de sang ont été collectés par ponction à partir des sinus orbitaux, à différents inter- valles de temps après l'injection du lipopolysaccharide et l'ADN libéré dans le plasma a été dosé par le procédé conforme à la présente invention, respectivement :Blood samples were collected by puncture from the orbital sinuses, at different time intervals after the injection of the lipopolysaccharide and the DNA released in the plasma was assayed by the method according to the present invention, respectively:
2hr h7 8h 10h/ 12hf χ8h après l'injection du 2 h r H 7 8 h 10 h / 12 h f χ 8 h after injection of
2 jours, 3 jours et 7 jours j lipopolysaccharide Les dosages effectués ont fait ressortir :2 days, 3 days and 7 days with lipopolysaccharide The dosages carried out revealed:
. une. augmentation significative de l'ADN circulant déjà 2h après l'injection du lipopolysaccharide ; . la présence de quantités élevées d'ADN (supérieures :. à 1 μg/ml) de 10 "à 18 -h parés l^injection du lipo- polysaccharide ; -" ' . ' . a. significant increase in circulating DNA already 2 hours after injection of the lipopolysaccharide; . the presence of high amounts of DNA (upper: 1 mcg / ml.) from 10 "to 18 -h ^ trimmed the injection of lipopolysaccharide -". '
. la persistance d'une augmentation significative de l'ADN dans le plasma au jour 3 ; . le retour à des taux normaux d'ADN au jour 7. Exemple 3 Vérification de la précision du dosage effec¬ tué par le procédé conforme à la présente invention. the persistence of a significant increase in DNA in plasma on day 3; . the return to normal levels of DNA on day 7. Example 3 Verification of the accuracy of the assay carried out by the method according to the present invention
Pour vérifier la valeur du procédé conforme à la présente invention, de l'ADN a été évalué dans un échantillon de plasma dans lequel avait été ajoutée une quantité connue d'ADN. La valeur trouvée a été comparée à celle obtenue pour le plasma seul (c'est-à-dire sans addi¬ tion d'ADN) et à la valeur obtenue pour un échantillon d'ADN traité de façon analogue. Le Tableau I ci-dessous fait apparaître les résultats suivants :To verify the value of the process according to the present invention, DNA was evaluated in a plasma sample to which a known amount of DNA had been added. The value found was compared to that obtained for plasma alone (that is to say without DNA addition) and to the value obtained for a DNA sample treated in an analogous manner. Table I below shows the following results:
TABLEAU ITABLE I
Dosage d'ADN dans des -échantillons de plasma (DDetermination of DNA in plasma samples (D
(1) Le dosage de l'ADN a été effectué sur les 2/3 de : i : 15 μl de plasma (plasma seul) ii : 15 μl de plasma auquel avait été ajouté 1, 5 ng d'ADN froid iii :.1,5 ng d'ADN froid après traitement par le phénol" et précipitation par l'éthanol en présence de gélatine en tant qu'agent coprécipitant, conformément à l'invention. La réaction de"Nick Translation" a été effectuée en 1 heure à 37°C. (2) Plasma humain prélevé chez un sujet sain (1) Measurement of the DNA was performed on 2/3 of: i: 15 .mu.l of plasma (plasma alone) ii: 15 .mu.l of plasma which had been added 1, 5 ng of DNA cold iii. 1.5 ng of cold DNA after treatment with phenol " and precipitation with ethanol in the presence of gelatin as coprecipitating agent, in accordance with the invention. The" Nick Translation "reaction was carried out in 1 hour at 37 ° C. (2) Human plasma taken from a healthy subject
(3) Résultats calculés à partir de 4 prélèvements, exprimés comme étant la moyenne + une déviation standard de cpm du H dCTP incorporé. Ces résultats sont corrigés pour la fixation non spécifique du H dCTP libre sur des filtres DE81 (411 + 37) .(3) Results calculated from 4 samples, expressed as the mean + a standard deviation of cpm from the incorporated H dCTP. These results are corrected for the non-specific binding of free H dCTP on DE81 filters (411 + 37).
(4) Nanogrammes d'ADN trouvés dans les échantillons trai¬ tés (moyenne + une déviation standard de 4 prélève¬ ments) calculés à partir de l'activité spécifique(4) DNA nanograms found in the processed samples (average + a standard deviation of 4 samples) calculated from the specific activity
(9003 + 212 cpm/ng) obtenue sur un échantillon stan- dard de 1 ng d'ADN marqué par "Nick translation" en présence de gélatine.(9003 + 212 cpm / ng) obtained on a standard sample of 1 ng of DNA labeled with "Nick translation" in presence of gelatin.
Les résultats réunis dans le Tableau I ci- dessus font apparaître que : 1. L'ADN peut être détecté dans le plasma, 2. La quantité d'ADN trouvée dans les échantillons pré¬ parés par addition d'ADN froid à un plasma, est con¬ forme aux valeurs trouvées dans le plasma seul et dans les échantillons d'ADN seul. A noter que : le pourcentage de récupération d'ADN radiomarqué (68 ± 8 ; n ≈ 8) et le pourcentage de récupération de l'ADN marqué par "Nick Translation" après traitement par le phénol et précipitation par l'éthanol (67 ± 9 ; n = 8j sont simi¬ laires. Le pourcentage de récuparation de l'ADN radio- marqué, est identique pour tous les échantillons, qu'ils aient été traités en présence ou en l'absence de-plasma.The results collated in Table I above show that: 1. DNA can be detected in the plasma, 2. The amount of DNA found in the samples prepared by adding cold DNA to a plasma, conforms to the values found in plasma alone and in DNA samples only. Note that: the percentage of recovery of radiolabelled DNA (68 ± 8; n ≈ 8) and the percentage of recovery of DNA marked with "Nick Translation" after treatment with phenol and precipitation with ethanol (67 ± 9; n = 8j are similar The percentage of recovery of radio-labeled DNA is identical for all the samples, whether they were treated in the presence or in the absence of plasma.
Il "ressort des exemples d'application qui pré¬ cèdent que le procédé qui fait l'objet de la présente invent -permet.de doser- quantitativement. l'ADN dans le plasma et constitue un procédé facile à mettre en oeuvre,"pouvant être exécuté à l'aide d'un kit de "Nick Translation"disponible dans le commerce et ne requérant qu'un appareillage pour le comptage d'échantillons radioactifs. Le procédé conforme à la présente invention est reproductible, suffisamment sensible pour détecter de l'ADN dans des échantillons de " It emerges from the examples of application which precede that the method which is the subject of the present invention - allows quantitative determination of the DNA in the plasma and constitutes an easy-to-implement method" be carried out using a commercially available "Nick Translation" kit requiring only equipment for counting radioactive samples. The method according to the present invention is reproducible, sensitive enough to detect DNA in samples of
10 yl à des concentrations comprises entre 12 et 800 ng/ l, encore qu'il puisse détecter des concentrations d'ADN moindres, aussi basses que 1,5 ng/ml, avec cependant une reproductibilité des résultats d'un échantillon à l'autre moins bonne que des concentrations inférieures à 12 ng/ml.10 yl at concentrations between 12 and 800 ng / l, although it can detect lower DNA concentrations, as low as 1.5 ng / ml, with however reproducibility of the results from sample to sample other worse than concentrations below 12 ng / ml.
Le procédé conforme à la présente invention semble présenter une spécificité très grande à l'égard de l'ADN : l'incorporation de dCTP tritié dans des échan-The process according to the present invention seems to have a very specificity with regard to DNA: the incorporation of tritiated dCTP into samples.
4 tillons de ARN est 10 inférieure à ce qu'elle est dans les échantillons d'ADN, ceci étant probablement lié à une contamination des préparations d'ARN par de l'ADN.4 tons of RNA is less than it is in DNA samples, this is probably related to a contamination of RNA preparations with DNA.
Le procédé conforme à l'invention permet de récupérer pratiquement la totalité de l'ADN contenu dans le plasma, qui. est intégralement marqué par "Nick Translation En outre, le procédé conforme à la présente invention est plus rapide que les procédés proposés dans l'Art antérieur et permet de marquer l'ADN extrait du plasma, par Nick Translation, en moins de 4 heures.The process according to the invention makes it possible to recover practically all of the DNA contained in the plasma, which. is fully marked with "Nick Translation In addition, the method according to the present invention is faster than the methods proposed in the prior art and makes it possible to mark the DNA extracted from the plasma, by Nick Translation, in less than 4 hours.
Le procédé conforme à la présente invention devrait, en raison des avantages qu'il présente, dont cer¬ tains ont été précisés dans ce qui précède, permettre une meilleure compréhension de la signification pathophysiolo¬ gique de l'augmentation des taux d'ADN plasmatique chez l'homme aussi bien que dans des conditions expérimentales et devrait être un outil de grande valeur pour l'étude des maladies du type lupus dans le développement desquelles sont-impliqués des complexes ADN-anti-ADN et plus gé¬ néralement pour l'établissement notamment, de diagnostics d'affections bactériologiques, ^irologiques, parasitolό- giques, génétiquement transmises, cancéreuses ou vasculaireThe process in accordance with the present invention should, because of the advantages which it has, some of which have been specified in the foregoing, allow a better understanding of the pathophysiological significance of the increase in plasma DNA levels. in humans as well as in experimental conditions and should be a valuable tool for the study of lupus-type diseases in the development of which DNA-anti-DNA complexes are involved and more generally for establishment, in particular, of diagnoses of bacteriological, ^ irological, parasitological, genetically transmitted, cancerous or vascular affections
Ainsi que cela ressort de ce qui précède, 1""invention ne se limite nullement à ceux de ses modes de mise en oeuvre, de réalisation et d'application qui viennen d'être décrits de façon plus explicite ; elle en embrasse au contraire toutes les variantes qui peuvent venir à l'esprit du technicien en la matière, sans s'écarter du cadre, ni de la portée, de la présente invention. As is apparent from the foregoing, 1 "" invention in no way limited to those of its implementation, embodiments and applications which viennen to be more explicitly described; on the contrary, it embraces all the variants which may come to the mind of the technician in the matter, without departing from the framework, or the scope, of the present invention.

Claims

REVENDICATIONS 1. Procédé de récupération et de dosage de microquantités d'ADN dans un liquide biologique acellulaire, en particulier le plasma sanguin, caractérisé en ce qu'il 5 comprend les étapes successives suivantes : CLAIMS 1. Process for recovering and measuring microquantities of DNA in an acellular biological fluid, in particular blood plasma, characterized in that it comprises the following successive steps:
- une première étape d'élimination des protéines présentes dans le liquide biologique acellulaire dans lequel on veut doser l'ADN, qui consiste à extraire un mélange dudit liquide biologique et d'acide éthylènediamine tétraacétique- a first step of eliminating the proteins present in the acellular biological fluid in which the DNA is to be measured, which consists of extracting a mixture of said biological fluid and ethylenediamine tetraacetic acid
10 (EDTA) par du phénol saturé par du Tris-hydroxyaminométhane (pH 8 environ) , pour obtenir une phase aqueuse pratiquement dépourvue de protéines et contenant sensiblement la tota¬ lité de l'ADN ;10 (EDTA) with phenol saturated with Tris-hydroxyaminomethane (pH approximately 8), to obtain an aqueous phase practically devoid of proteins and containing substantially all of the DNA;
- une deuxième étape de récupération de l'ADN de ladite solu- 15 tion aqueuse, qui consiste à précipiter l'ADN par adjonctio à ladite solution d'un agent coprécipitant approprié et d'un, agent de précipitation avantageusement- constitué par." un alcool inférieur, en présence d'un tampon approprié tel que le tampon Tris-hydroxyaminométhane ou analogue ;- a second step of recovering the DNA from said aqueous solution, which consists of precipitating the DNA by adding to said solution a suitable coprecipitating agent and a precipitating agent advantageously consisting of. " a lower alcohol, in the presence of a suitable buffer such as Tris-hydroxyaminomethane buffer or the like;
20 " - une troisième étape, de" marquage par "Nick Translation", de l'ADN récupéré, qui consiste à incuber l'ADN avec un ou plu¬20 " - a third step, of " Nick Translation" marking of the recovered DNA, which consists of incubating the DNA with one or more
/" sieurs désoxynucléotides-triphosphates marqués et avec de l'ADN polymérase I et de la désoxyribonucléase I, dans un milieu réactionnel qui comprend le Tris-hydroxyaminométhane,/ " several deoxynucleotides-triphosphates labeled and with DNA polymerase I and deoxyribonuclease I, in a reaction medium which comprises Tris-hydroxyaminomethane,
25 le chlorure de magnésium, la sérumalbumine bovine, le 5- merceptoéthanol et le glycérol ;25 magnesium chloride, bovine serum albumin, 5-merceptoethanol and glycerol;
- une quatrième étape de dosage de l'ADN qui consiste à doser l'ADN par toute méthode appropriée révélant le marqueur in¬ corporé à l'ADN.- a fourth step of assaying the DNA which consists of assaying the DNA by any appropriate method revealing the marker incorporated into the DNA.
30 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le marquage par "Nick Translation" de l'ADN récu¬ péré est réalisé, au cours de la troisième étape du procédé, à l'aide d'au moins un désoxynucléotide-triphosphate marqué par un isotope radioactif, auquel cas la quatrième étape du30 2. Method according to claim 1, characterized in that the marking by "Nick Translation" of the recovered DNA is carried out, during the third step of the method, using at least one deoxynucleotide- triphosphate labeled with a radioactive isotope, in which case the fourth step of
35 procédé qui comprend le dosage de l'ADN, consiste à compter la radioactivité présente sur un filtre papier sur le¬ quel a été déposé l'ADN marqué et qui a subi des lava¬ ges par des agents de lavage appropriés, puis a été sé¬ ché, par comptage direct ou après immersion dans un li- quide scintillant, en fonction de la nature du radio- isotope de marquage.35 process which includes the determination of DNA, consists of counting the radioactivity present on a paper filter on which the labeled DNA has been deposited and which has undergone washing with appropriate washing agents, then has been dried, by direct counting or after immersion in a liquid scintillating quide, depending on the nature of the marking radioisotope.
3. Procédé selon la revendication 1, caracté¬ risé en ce que le marquage par "Nick Translation" de l'ADN récupéré au cours de la deuxième étape, est réali- se au cours de la troisième étape à l'aide d'au moins un désoxynucléotide triphosphate marqué chimiquement par une substance pouvant être révélée à l'aide d'une réaction enzymatique, auquel cas la quatrième étape du procédé qui comprend le dosage de l'ADN consiste à révé- 1er l'ADN après fixation du composé enzymatique appro¬ prié, en présence d'un substrat chromogène.3. Method according to claim 1, characterized in that the marking by "Nick Translation" of the DNA recovered during the second step is carried out during the third step using at least one deoxynucleotide triphosphate chemically labeled with a substance which can be revealed using an enzymatic reaction, in which case the fourth step of the process which includes the determination of the DNA consists of revealing the DNA after fixation of the enzymatic compound appropriate, in the presence of a chromogenic substrate.
4.". Procédé selon la revendication 1 et l'une quelconque des revendications 2 ou 3, caractérisé en_ ce que le liquide biologique acellulaire tel que le plasma humain, dans lequel- on cherche à doser l'ADN, est mélangé à raison de quelques microlitres, au cours de la première étape du procédé, avec de l'acide éthylènediamine tétra-acétique (EDTA) pour obtenir une concentration final d'EDTA de l'ordre de 10 à 20 mM (pH 8 environ) et la solut obtenue est extraite par du phénol saturé d'un tampon ap¬ proprié tel que Tris-hydroxyaminométhane 0,1 M, pH 8 envi¬ ron, notamment.4. " . Method according to claim 1 and any one of claims 2 or 3, characterized in that the acellular biological liquid such as human plasma, in which one seeks to determine the DNA, is mixed at a rate of a few microliters, during the first step of the process, with ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA) to obtain a final concentration of EDTA of the order of 10 to 20 mM (pH approximately 8) and the solution obtained is extracted with phenol saturated with an appropriate buffer such as 0.1 M Tris-hydroxyaminomethane, pH approximately 8, in particular.
5. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'agent de coprecipitation introduit au cours de la deuxième étape du procédé, est pris dans le groupe qui comprend la gélatine, les diamines telles que la sper idin les acides ribonucléiques, des polynucléotides de synthèse les protéines comportant des groupes réactifs possédant de charges positives telles qu'albumines méthylées et toute substance présentant une affinité particulière pour l'ADN et n'inhibant pas la réaction de "Nick Translation".5. Method according to claim 1, characterized in that the coprecipitation agent introduced during the second step of the process is taken from the group which includes gelatin, diamines such as speridin, ribonucleic acids, polynucleotides synthesis of proteins containing reactive groups with positive charges such as methylated albumins and any substance having a particular affinity for DNA and not inhibiting the "Nick Translation" reaction.
6. Procédé selon l'une quelconque des reven¬ dications 1 à 5, caractérisé en ce que l'agent de préci¬ pitation mis.en oeuvre au -cours de la deuxième étape du procédé, est de l'éthanol.6. Process according to any one of claims 1 to 5, characterized in that the precipitation agent used during the second stage of the process is ethanol.
7. Procédé selon l'une quelconque des reven¬ dications 1 à 6, caractérisé en ce que l'éthanol ou autre alcool inférieur utilisé comme agent de précipitation, est ajouté quelles que soient la température d'incubation et la température de centrifugation, en quantité appropriée pour obtenir une concentration finale en éthanol égale ou supérieure à 66 %.7. Method according to any one of claims 1 to 6, characterized in that the ethanol or other lower alcohol used as a precipitation agent is added whatever the incubation temperature and the centrifugation temperature, in appropriate quantity to obtain a final ethanol concentration equal to or greater than 66%.
8_ Procédé selon l'une quelconque des revendi¬ cations 1 à 7, caractérisé en ce que la phase aqueuse conte nant l'ADN, un agent de précipitation et un agent de copre¬ cipitation, est centrifugée pour provoquer la précipitation "de- l'ADN. ' .-'-8_ Method according to any one of claims 1 to 7, characterized in that the aqueous phase containing DNA, a precipitation agent and a copre¬ precipitation agent, is centrifuged to cause precipitation " of- l 'DNA. ' .- ' -
3. Procédé selon la revendication 8, caractéris î en ce que le précipité est lavé par de l'éthanol ou autre. agent de précipitation analogue, puis la solution obtenue est à nouveau centrifugée et le précipité, essentiellement constitué par de l'ADN, est récupéré.3. Method according to claim 8, characterized in that the precipitate is washed with ethanol or the like. analogous precipitation agent, then the solution obtained is centrifuged again and the precipitate, essentially consisting of DNA, is recovered.
10. Procédé selon la revendication 9 ou la reven dication 9, caractérisé en ce que l'ADN précipité est récu péré par addition d-'eau.10. Method according to claim 9 or claim 9, characterized in that the precipitated DNA is recovered by adding water.
11. Procédé selon l'une quelconque des revendi¬ cations 1 à 10,caractérisé en ce que le marquage par" ick Translation"est effectué, au cours de la troisième étape du procédé, par incubation de l'ADN récupéré, avec 2 à 50 pic moles d'un ou de plusieurs désoxynucléotides-triphosphates marqués, éventuellement environ 80-120 picomoles de désoxyn cléotides-triphosphates non marqués, environ 0,25 Unité d'ADN-polymérase I et environ 5 picogrammes de désoxyribo- nucléase-I, en présence d'un tampon tel que Tris-hydroxy- aminométhane (5-12 mM) , de chlorure de magnésium (2-5 mM) , de B-mercapto-éthanol (7-15 mM) , d'albumine bovine (20-60 microgrammes/ml) et de glycérol (environ 0,5 % poids/volume) .11. Method according to any one of claims 1 to 10, characterized in that the marking by "ick Translation" is carried out, during the third step of the process, by incubation of the recovered DNA, with 2 to 50 peak moles of one or more labeled deoxynucleotide-triphosphates, optionally approximately 80-120 picomoles of unlabeled deoxyn cleotide-triphosphates, approximately 0.25 Unit of DNA polymerase I and approximately 5 picograms of deoxyribonuclease-I, in the presence of a buffer such as Tris-hydroxy-aminomethane (5-12 mM), magnesium chloride (2-5 mM), β-mercapto-ethanol (7-15 mM), bovine albumin (20-60 micrograms/ml) and glycerol (approximately 0.5% w/v).
12. Procédé selon la revendication 11, carac- térisé en ce que l'incubation est réalisée à une tempé¬ rature comprise entre 15 et 37°C environ, pendant une durée de 1 à 3 heures.12. Method according to claim 11, characterized in that the incubation is carried out at a temperature between approximately 15 and 37°C, for a period of 1 to 3 hours.
13. Procédé selon l'une quelconque des reven¬ dications 1 à 12 caractérisée en ce qu'au cours de la quatrième étape du procédé, le filtre sur lequel est dé¬ posé l'ADN est lavé, de préférence sous agitation, par une solution de forte molarité permettant d'éliminer les nucléotides marqués non-incorporés à l'ADN tout en conservant sur le filtre la totalité de l'ADN marqué.13. Method according to any one of claims 1 to 12 characterized in that during the fourth step of the process, the filter on which the DNA is deposited is washed, preferably with stirring, by a high molarity solution allowing the elimination of labeled nucleotides not incorporated into the DNA while retaining all of the labeled DNA on the filter.
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Inventor name: BOUCHE, JEAN-PIERRE

Inventor name: CONTE, JEAN

Inventor name: TAMINH, MARTINE

Inventor name: FOURNIE, GILBERT