KR102143071B1 - Primer set for detecting hantaan virus and uses thereof - Google Patents
Primer set for detecting hantaan virus and uses thereof Download PDFInfo
- Publication number
- KR102143071B1 KR102143071B1 KR1020180139995A KR20180139995A KR102143071B1 KR 102143071 B1 KR102143071 B1 KR 102143071B1 KR 1020180139995 A KR1020180139995 A KR 1020180139995A KR 20180139995 A KR20180139995 A KR 20180139995A KR 102143071 B1 KR102143071 B1 KR 102143071B1
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- hantan virus
- seq
- quencher
- primer
- nucleotide sequence
- Prior art date
Links
- 241000150562 Hantaan orthohantavirus Species 0.000 title description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims abstract description 73
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims abstract description 58
- 229920001850 Nucleic acid sequence Polymers 0.000 claims abstract description 39
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims abstract description 28
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 18
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 20
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 claims description 16
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 7
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 6
- COCMHKNAGZHBDZ-UHFFFAOYSA-N 4-carboxy-3-[3-(dimethylamino)-6-dimethylazaniumylidenexanthen-9-yl]benzoate Chemical compound C=12C=CC(=[N+](C)C)C=C2OC2=CC(N(C)C)=CC=C2C=1C1=CC(C([O-])=O)=CC=C1C(O)=O COCMHKNAGZHBDZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- BZTDTCNHAFUJOG-UHFFFAOYSA-N 6-carboxyfluorescein Chemical compound C12=CC=C(O)C=C2OC2=CC(O)=CC=C2C11OC(=O)C2=CC=C(C(=O)O)C=C21 BZTDTCNHAFUJOG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N Rhodamine B Chemical compound [Cl-].C=12C=CC(=[N+](CC)CC)C=C2OC2=CC(N(CC)CC)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C(O)=O PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- ABZLKHKQJHEPAX-UHFFFAOYSA-N tetramethylrhodamine Chemical compound C=12C=CC(N(C)C)=CC2=[O+]C2=CC(N(C)C)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C([O-])=O ABZLKHKQJHEPAX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- MPLHNVLQVRSVEE-UHFFFAOYSA-N Texas Red Chemical compound [O-]S(=O)(=O)C1=CC(S(Cl)(=O)=O)=CC=C1C(C1=CC=2CCCN3CCCC(C=23)=C1O1)=C2C1=C(CCC1)C3=[N+]1CCCC3=C2 MPLHNVLQVRSVEE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- QCPFFGGFHNZBEP-UHFFFAOYSA-N 4,5,6,7-tetrachloro-3',6'-dihydroxyspiro[2-benzofuran-3,9'-xanthene]-1-one Chemical compound O1C(=O)C(C(=C(Cl)C(Cl)=C2Cl)Cl)=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 QCPFFGGFHNZBEP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- WCKQPPQRFNHPRJ-UHFFFAOYSA-N 4-[[4-(dimethylamino)phenyl]diazenyl]benzoic acid Chemical compound C1=CC(N(C)C)=CC=C1N=NC1=CC=C(C(O)=O)C=C1 WCKQPPQRFNHPRJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- IDLISIVVYLGCKO-UHFFFAOYSA-N 6-carboxy-4',5'-dichloro-2',7'-dimethoxyfluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=C(C(O)=O)C=C2C21C1=CC(OC)=C(O)C(Cl)=C1OC1=C2C=C(OC)C(O)=C1Cl IDLISIVVYLGCKO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 239000012099 Alexa Fluor family Substances 0.000 claims description 2
- ANRHNWWPFJCPAZ-UHFFFAOYSA-M CHEMBL593252 Chemical compound [Cl-].C1=CC(N)=CC2=[S+]C3=CC(N)=CC=C3N=C21 ANRHNWWPFJCPAZ-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 2
- NULAJYZBOLVQPQ-UHFFFAOYSA-N N-(1-Naphthyl)ethylenediamine Chemical compound C1=CC=C2C(NCCN)=CC=CC2=C1 NULAJYZBOLVQPQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- ZBKFYXZXZJPWNQ-UHFFFAOYSA-N [N-]=C=S Chemical compound [N-]=C=S ZBKFYXZXZJPWNQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 239000000975 dye Substances 0.000 claims description 2
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 claims 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 15
- 230000002452 interceptive Effects 0.000 abstract description 14
- 238000003860 storage Methods 0.000 abstract description 8
- 230000037029 cross reaction Effects 0.000 abstract description 6
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 abstract description 6
- 230000001809 detectable Effects 0.000 abstract description 3
- 229920003013 deoxyribonucleic acid Polymers 0.000 description 10
- 101700062818 NP Proteins 0.000 description 9
- 101710042981 SHMT1 Proteins 0.000 description 9
- 229920000160 (ribonucleotides)n+m Polymers 0.000 description 8
- 230000032683 aging Effects 0.000 description 6
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 6
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 6
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 6
- 150000002739 metals Chemical class 0.000 description 6
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 5
- 229940027941 Immunoglobulin G Drugs 0.000 description 4
- 102000004851 Immunoglobulin G Human genes 0.000 description 4
- 108090001095 Immunoglobulin G Proteins 0.000 description 4
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 4
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 4
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N edta Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 4
- 238000006011 modification reaction Methods 0.000 description 4
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 4
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 4
- 229920002676 Complementary DNA Polymers 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- 206010061192 Haemorrhagic fever Diseases 0.000 description 3
- 102000001554 Hemoglobins Human genes 0.000 description 3
- 108010054147 Hemoglobins Proteins 0.000 description 3
- ZFGMDIBRIDKWMY-PASTXAENSA-N Heparin Chemical compound CC(O)=N[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](COS(O)(=O)=O)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](C(O)=O)O[C@@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](OS(O)(=O)=O)[C@@H](O[C@@H]3[C@@H](OC(O)[C@H](OS(O)(=O)=O)[C@H]3O)C(O)=O)O[C@@H]2O)CS(O)(=O)=O)[C@H](O)[C@H]1O ZFGMDIBRIDKWMY-PASTXAENSA-N 0.000 description 3
- 229960002897 Heparin Drugs 0.000 description 3
- 101700054624 RF1 Proteins 0.000 description 3
- HRXKRNGNAMMEHJ-UHFFFAOYSA-K Trisodium citrate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O HRXKRNGNAMMEHJ-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 3
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 3
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 229920001894 non-coding RNA Polymers 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 230000002285 radioactive Effects 0.000 description 3
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 3
- 239000011778 trisodium citrate Substances 0.000 description 3
- 229940100198 ALKYLATING AGENTS Drugs 0.000 description 2
- DZBUGLKDJFMEHC-UHFFFAOYSA-N Acridine Chemical compound C1=CC=CC2=CC3=CC=CC=C3N=C21 DZBUGLKDJFMEHC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000004369 Blood Anatomy 0.000 description 2
- 108010014303 DNA-Directed DNA Polymerase Proteins 0.000 description 2
- 102000016928 DNA-Directed DNA Polymerase Human genes 0.000 description 2
- 101700011961 DPOM Proteins 0.000 description 2
- 108010092799 EC 2.7.7.49 Proteins 0.000 description 2
- 102000033147 ERVK-25 Human genes 0.000 description 2
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 2
- 101710029649 MDV043 Proteins 0.000 description 2
- 101700080605 NUC1 Proteins 0.000 description 2
- 101700061424 POLB Proteins 0.000 description 2
- LLKYUHGUYSLMPA-UHFFFAOYSA-N Phosphoramidite Chemical compound NP([O-])[O-] LLKYUHGUYSLMPA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 2
- 210000003296 Saliva Anatomy 0.000 description 2
- 231100000765 Toxin Toxicity 0.000 description 2
- 210000002700 Urine Anatomy 0.000 description 2
- 239000002168 alkylating agent Substances 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 102000004965 antibodies Human genes 0.000 description 2
- 108090001123 antibodies Proteins 0.000 description 2
- 239000003124 biologic agent Substances 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 210000004027 cells Anatomy 0.000 description 2
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 description 2
- NAGJZTKCGNOGPW-UHFFFAOYSA-K dioxido-sulfanylidene-sulfido-$l^{5}-phosphane Chemical compound [O-]P([O-])([S-])=S NAGJZTKCGNOGPW-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 229940079593 drugs Drugs 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 238000005538 encapsulation Methods 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 2
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 230000011987 methylation Effects 0.000 description 2
- 238000007069 methylation reaction Methods 0.000 description 2
- YACKEPLHDIMKIO-UHFFFAOYSA-L methylphosphonate(2-) Chemical compound CP([O-])([O-])=O YACKEPLHDIMKIO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 101700006494 nucA Proteins 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 230000001590 oxidative Effects 0.000 description 2
- PTMHPRAIXMAOOB-UHFFFAOYSA-L phosphoramidate Chemical compound NP([O-])([O-])=O PTMHPRAIXMAOOB-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- -1 phosphotriester Chemical compound 0.000 description 2
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 2
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 2
- RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-K thiophosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=S RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 2
- 108020003112 toxins Proteins 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 241001529533 Apodemus agrarius Species 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 206010008111 Cerebral haemorrhage Diseases 0.000 description 1
- 210000001175 Cerebrospinal Fluid Anatomy 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- 210000004544 DC2 Anatomy 0.000 description 1
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 1
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 1
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 1
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 description 1
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-N Deoxycytidine triphosphate Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](CO[P@](O)(=O)O[P@](O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-N 0.000 description 1
- HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N Deoxyguanosine triphosphate Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 1
- 102000016911 Deoxyribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010053770 Deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 241000701867 Enterobacteria phage T7 Species 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 210000003608 Feces Anatomy 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 206010021067 Hypopituitarism Diseases 0.000 description 1
- 208000001953 Hypotension Diseases 0.000 description 1
- 208000009025 Nervous System Disease Diseases 0.000 description 1
- 206010029305 Neurological disorder Diseases 0.000 description 1
- 108020005187 Oligonucleotide Probes Proteins 0.000 description 1
- 206010030302 Oliguria Diseases 0.000 description 1
- 241000150452 Orthohantavirus Species 0.000 description 1
- 241000150350 Peribunyaviridae Species 0.000 description 1
- 210000002381 Plasma Anatomy 0.000 description 1
- 206010036790 Productive cough Diseases 0.000 description 1
- 206010037660 Pyrexia Diseases 0.000 description 1
- 210000002966 Serum Anatomy 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- 210000003802 Sputum Anatomy 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- 108020000999 Viral RNA Proteins 0.000 description 1
- 241000710772 Yellow fever virus Species 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000001396 anti-anti-diuretic Effects 0.000 description 1
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 1
- KXDHJXZQYSOELW-UHFFFAOYSA-M carbamate Chemical compound NC([O-])=O KXDHJXZQYSOELW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 150000004657 carbamic acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 125000003636 chemical group Chemical group 0.000 description 1
- 230000001684 chronic Effects 0.000 description 1
- 238000007374 clinical diagnostic method Methods 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 230000000295 complement Effects 0.000 description 1
- 230000000875 corresponding Effects 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-J dATP(4-) Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-J 0.000 description 1
- NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N dTTP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N 0.000 description 1
- 239000012502 diagnostic product Substances 0.000 description 1
- 230000001882 diuretic Effects 0.000 description 1
- 239000002934 diuretic Substances 0.000 description 1
- 241001493065 dsRNA viruses Species 0.000 description 1
- 125000001153 fluoro group Chemical group F* 0.000 description 1
- 239000004120 green S Substances 0.000 description 1
- 230000036543 hypotension Effects 0.000 description 1
- 230000000984 immunochemical Effects 0.000 description 1
- 238000003317 immunochromatography Methods 0.000 description 1
- 230000002530 ischemic preconditioning Effects 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 1
- JLVVSXFLKOJNIY-UHFFFAOYSA-N magnesium ion Chemical compound [Mg+2] JLVVSXFLKOJNIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 230000001404 mediated Effects 0.000 description 1
- 238000000034 method Methods 0.000 description 1
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic Effects 0.000 description 1
- 244000052769 pathogens Species 0.000 description 1
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 238000007781 pre-processing Methods 0.000 description 1
- 230000005180 public health Effects 0.000 description 1
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory Effects 0.000 description 1
- 210000002345 respiratory system Anatomy 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 239000003161 ribonuclease inhibitor Substances 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing Effects 0.000 description 1
- JGVWCANSWKRBCS-UHFFFAOYSA-N tetramethylrhodamine thiocyanate Chemical compound [Cl-].C=12C=CC(N(C)C)=CC2=[O+]C2=CC(N(C)C)=CC=C2C=1C1=CC=C(SC#N)C=C1C(O)=O JGVWCANSWKRBCS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000001519 tissues Anatomy 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 238000001291 vacuum drying Methods 0.000 description 1
- 238000009777 vacuum freeze-drying Methods 0.000 description 1
- 229940051021 yellow-fever virus Drugs 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
- C12Q1/701—Specific hybridization probes
Abstract
본 발명은 서열번호 1의 염기서열로 기재되는 정방향 프라이머; 서열번호 2의 염기서열로 기재되는 제1 역방향 프라이머; 및 서열번호 3의 염기서열로 기재되는 제2 역방향 프라이머로 이루어진 한탄바이러스 검출용 프라이머 세트에 관한 것으로, 본 발명의 프라이머 세트 및 프로브를 이용하여 PCR 수행 시 현재 보고되어 있는 한탄바이러스를 한 번의 반응으로 검출할 수 있고, 민감도가 우수하고 타 균주와의 교차반응 및 간섭물질과의 간섭반응이 없으며 재현성있는 결과를 나타내고 보관 안정성이 우수하므로, 본 발명의 프라이머 세트 및 프로브는 한탄바이러스를 검출 및 진단하는 데 유용하게 사용될 수 있다. The present invention is a forward primer described in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1; A first reverse primer described by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2; And it relates to a primer set for detection of hantan virus consisting of a second reverse primer described in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3, wherein when performing PCR using the primer set and probe of the present invention, the currently reported Hantan virus is used in one reaction. It is detectable, has excellent sensitivity, does not have cross-reaction with other strains, has no interfering reaction with interfering substances, shows reproducible results, and has excellent storage stability, so the primer set and probe of the present invention detect and diagnose Hantan virus. Can be usefully used.
Description
본 발명은 한탄바이러스 검출용 프라이머 세트 및 이의 용도에 관한 것이다. The present invention relates to a primer set for detecting hantan virus and a use thereof.
한탄바이러스(Hantaan virus)는 한국 전쟁 중 UN 군에서 약 3200명 이상의 신증후군출혈열 환자를 발생시키고 수백명을 사망에 이르게 한 바이러스로, 바이러스가 발견된 한탄강의 이름을 따서 한탄바이러스로 명명되었다. 한탄바이러스는 버냐바이러스(Bunyaviridae)와 한타바이러스(Hantavirus) 속에 속하며, 직경 80~110 nm의 구형의 형태이고 음성 단일가닥 RNA 바이러스이다. 한탄바이러스는 설치류에 만성 감열을 일으키고, 감염된 설치류의 분변, 오줌, 타액 등으로 배출되어 공기 중에 건조된 바이러스가 호흡기를 통해 전파되며, 드물게 매개체를 통해 전파되는 것으로 추정되고 있다. 연구결과에 따르면 국내 신증후군출혈열의 약 70%는 한탄바이러스에 의해 유발되는데 이는 주로 시골지역의 등줄쥐(Apodemus agrarius)에 의해 매개되는 것으로 알려져 있다. 한탄바이러스에 의한 신증후군출혈열 환자는 우리나라를 비롯하여 중국, 러시아 동부에서 주로 발병되며, 이 중 절반이 중국에서 발생한다. 한탄바이러스에 감염되면 무증상부터 사망에 이르기까지 다양한 임상양상을 보이는데, 대체로 발열기, 저혈압기, 핍뇨기, 이뇨기 회복기로 나눠지는 5단계의 임상 양상을 보인다. 대부분 후유증없이 회복하나, 드물게는 뇌하수체 기능저하능, 뇌출혈의 결과로 영구적인 신경학적 장애가 나타나고 심한 경우 사망에 이른다. Hantan virus is a virus that caused more than 3,200 nephrotic hemorrhagic fever patients and killed hundreds of people in the UN military during the Korean War. It was named after the Hantan River where the virus was found. Hantan virus belongs to the genus Bunyaviridae and Hantavirus, has a spherical shape of 80-110 nm in diameter and is a negative single-stranded RNA virus. Hantan virus causes chronic heat in rodents, and the virus that is dried in the air by being discharged through the feces, urine, and saliva of infected rodents is spread through the respiratory tract, and is rarely transmitted through vectors. According to the results of the study, about 70% of domestic nephrotic hemorrhagic fever is caused by hantan virus, which is known to be mediated mainly by Apodemus agrarius in rural areas. Hantan virus-induced nephrotic hemorrhagic fever is mainly in Korea, China, and eastern Russia, half of which occur in China. When infected with Hantan virus, various clinical manifestations are shown, ranging from asymptomatic to death. In general, there are five stages of clinical manifestations that are divided into fever, hypotension, oliguria, and diuretic recovery. Most recover without any sequelae, but in rare cases, permanent neurological disorders appear as a result of pituitary hypofunction and cerebral hemorrhage, leading to death in severe cases.
이러한 고위험 바이러스가 생물테러로 사용될 경우 진단과 치료에 있어 치명적이며, 확산을 방지하기 어려워 국민보건에 심각한 영향을 끼칠 우려가 있으므로 이에 대한 대응책 마련이 시급하다. 그러나 생물테러 사건현장에서 주로 이용되는 면역크로마토그래피 시험법으로는 검출 가능한 생물작용제가 한정되어 있어 검출 가능한 생물작용제의 확대가 요구되고 있다. 또한 면역크로마토그래피 시험법의 경우, 민감도 개선 필요성이 제기됨에 따라 이를 보완할 수 있는 실시간 유전자중폭장비(real-time PCR)기기에서 운용될 수 있는 현장진단법의 도입이 필요한 실정이다. If such a high-risk virus is used as a bioterrorism, it is fatal in diagnosis and treatment, and it is difficult to prevent its spread and may seriously affect public health, so it is urgent to prepare countermeasures for this. However, as the immunochromatographic test method mainly used at the site of a biological terrorist incident, detectable biological agents are limited, and thus, expansion of detectable biological agents is required. In addition, in the case of immunochromatography, as the need to improve sensitivity is raised, it is necessary to introduce a field diagnosis method that can be operated in a real-time PCR device that can compensate.
현장진단(Point of Care Testing, POCT)은 체외진단 중 하나로, 피검자 및 환자와 가까운 위치에서 원심분리 등 샘플 사전가공을 거치지 않고, 신속하게 시행해 진료 및 치료에 활용할 수 있는 임상병리 검사방식을 말한다. 최근까지는 개인의 자가혈당측정 용도로 많이 사용되어 왔지만 수년 전부터 점차 다양한 질환의 진단 목적으로 사용 및 개발되고 있고, 서유럽에서 다른 진단 제품들이 가지고 있는 비용문제, 규제문제를 해결할 수 있는 분야로 각광받고 있으며, 저비용의 장점으로 개발도상국가에서도 수요가 증가하고 있다. Point of Care Testing (POCT) is one of the in vitro diagnostics, and refers to a clinical pathology test method that can be used for treatment and treatment by promptly implementing it without undergoing pre-processing of samples such as centrifugation at a location close to the subject and patient. Until recently, it has been widely used for the purpose of measuring personal blood sugar, but it has been gradually used and developed for the purpose of diagnosing various diseases from several years ago, and is in the spotlight as a field that can solve the cost and regulatory problems of other diagnostic products in Western Europe. However, due to its low cost, demand is also increasing in developing countries.
본 발명의 목적은 한탄바이러스를 검출할 수 있는 프라이머 세트를 제공하는 것이다.An object of the present invention is to provide a primer set capable of detecting hantan virus.
본 발명의 다른 목적은 본 발명의 프라이머 세트를 포함하는 한탄바이러스 검출용 조성물 및 키트를 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a composition and kit for detecting hantan virus comprising the primer set of the present invention.
본 발명의 또 다른 목적은 본 발명의 프라이머 세트를 이용하여 한탄바이러스를 검출하는 방법을 제공하는 것이다. Another object of the present invention is to provide a method for detecting Hantan virus using the primer set of the present invention.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1의 염기서열로 기재되는 정방향 프라이머; 서열번호 2의 염기서열로 기재되는 제1 역방향 프라이머; 및 서열번호 3의 염기서열로 기재되는 제2 역방향 프라이머로 이루어진 한탄바이러스 검출용 프라이머 세트를 제공한다.In order to achieve the above object, the present invention is a forward primer described in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1; A first reverse primer described by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2; And it provides a primer set for detecting hantan virus consisting of a second reverse primer described by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3.
또한, 본 발명은 본 발명의 프라이머 세트를 포함하는 한탄바이러스 검출용 조성물을 제공한다. In addition, the present invention provides a composition for detecting hantan virus comprising the primer set of the present invention.
또한, 본 발명은 본 발명의 조성물을 포함하는 한탄바이러스 검출용 키트를 제공한다. In addition, the present invention provides a kit for detecting hantan virus comprising the composition of the present invention.
또한, 본 발명은 검체로부터 분리된 핵산을 주형으로 본 발명의 프라이머 세트를 이용하여 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)을 수행하는 단계를 포함하는 한탄바이러스를 검출하는 방법을 제공한다. In addition, the present invention provides a method of detecting a Hantan virus comprising the step of performing a polymerase chain reaction (PCR) using the primer set of the present invention using the nucleic acid isolated from the specimen as a template.
본 발명의 프라이머 세트는 60개의 한탄바이러스 균주들의 염기서열을 수집하여 디자인한 것으로, 본 발명의 프라이머 세트 및 프로브를 이용하여 PCR 수행 시 현재 보고되어 있는 한탄바이러스를 한 번의 반응으로 검출할 수 있고, 민감도가 우수하고 타 균주와의 교차반응 및 간섭물질과의 간섭반응이 없으며 재현성있는 결과를 나타내고 보관 안정성이 우수하므로, 본 발명의 프라이머 세트 및 프로브는 한탄바이러스를 검출 및 진단하는 데 유용하게 사용될 수 있다. The primer set of the present invention is designed by collecting the base sequences of 60 Hantan virus strains, and when performing PCR using the primer set and probe of the present invention, the currently reported Hantan virus can be detected in one reaction, Since the sensitivity is excellent, there is no cross-reaction with other strains, no interference reactions with interfering substances, reproducible results, and excellent storage stability, the primer sets and probes of the present invention can be usefully used for detecting and diagnosing hantan virus. have.
도 1은 수집한 60개의 한탄바이러스 균주의 염기서열을 정렬(alignment)한 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 프라이머 및 프로브 세트를 이용하여 PCR 수행 시 검출한계를 확인한 결과이다
(Target: 실험예 1-1의 합성된 타겟 RNA 유전자;
IPC: 내부 양성 대조군(internal positive control);
CV: 평균 대비 표준편차의 비율(coefficient of variation)).
도 3은 본 발명의 프라이머 및 프로브 세트를 이용하여 PCR 수행 시 타균주와의 교차반응의 유무를 확인한 결과이다.
도 4는 본 발명의 프라이머 및 프로브 세트를 이용하여 PCR 수행 시 간섭물질과의 간섭반응의 유무를 확인한 결과이다
(녹색: 내부 양성 대조군(ITC); 빨간색: 간섭물질이 첨가되거나 첨가되지 않은 한탄 바이러스 시료; 파란선: 음성 대조군).
도 5는 본 발명의 프라이머 및 프로브 세트를 이용하여 PCR 수행 시 재현성을 확인한 결과이다
(녹색: 내부 양성 대조군(ITC); 빨간색: 한탄 바이러스 시료; 파란선: 음성 대조군).
도 6은 본 발명의 프라이머 및 프로브 세트의 보관 안정성을 확인한 결과이다
(녹색: 내부 양성 대조군(ITC); 빨간색: 한탄 바이러스 시료; 파란선: 음성 대조군).1 shows the result of alignment of the nucleotide sequences of the collected 60 Hantan virus strains.
2 is a result of confirming the detection limit when performing PCR using the primer and probe set of the present invention.
(Target: the synthesized target RNA gene of Experimental Example 1-1;
IPC: internal positive control;
CV: The coefficient of variation relative to the mean).
3 is a result of confirming the presence or absence of cross-reaction with other strains when performing PCR using the primer and probe set of the present invention.
4 is a result of confirming the presence or absence of an interference reaction with an interfering substance when performing PCR using the primer and probe set of the present invention
(Green: internal positive control (ITC); red: hantan virus sample with or without interfering substances; blue line: negative control).
5 is a result of confirming reproducibility when performing PCR using the primer and probe set of the present invention
(Green: internal positive control (ITC); red: hantan virus sample; blue line: negative control).
6 is a result of confirming the storage stability of the primer and probe set of the present invention
(Green: internal positive control (ITC); red: hantan virus sample; blue line: negative control).
이하, 본 발명을 상세히 설명한다. Hereinafter, the present invention will be described in detail.
본 발명은 서열번호 1의 염기서열로 기재되는 정방향 프라이머; 서열번호 2의 염기서열로 기재되는 제1 역방향 프라이머; 및 서열번호 3의 염기서열로 기재되는 제2 역방향 프라이머로 이루어진 한탄바이러스 검출용 프라이머 세트를 제공한다. The present invention is a forward primer described in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1; A first reverse primer described by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2; And it provides a primer set for detecting hantan virus consisting of a second reverse primer described by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3.
상기 프라이머 세트는 한탄바이러스의 segment S 영역을 증폭하는 것일 수 있다. 또한, 상기 프라이머 세트는 상기 segment S 영역의 유전자에 상보적으로 결합 가능한 10 내지 40개, 구체적으로 15 내지 30개의 염기서열로 이루어진 정방향 또는 역방향 프라이머일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서, 상기 프라이머 세트는 서열번호 1의 염기서열로 기재되는 정방향 프라이머, 서열번호 2의 염기서열로 기재되는 제1 역방향 프라이머 및 서열번호 3의 염기서열로 기재되는 제2 역방향 프라이머로 이루어진 것일 수 있다. The primer set may amplify the segment S region of the Hantan virus. In addition, the primer set may be a forward or reverse primer consisting of 10 to 40, specifically 15 to 30 nucleotide sequences capable of complementarily binding to the gene of the segment S region. In one embodiment of the present invention, the primer set is a forward primer described by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, a first reverse primer described by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2, and a second reverse primer described by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 It may be made of a primer.
상기 프라이머는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성될 수 있다. 이러한 프라이머는 한탄바이러스를 검출할 수 있는 효과를 나타내는 한, 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 예로는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오티드 하나 이상의 동족체로의 치환 및 뉴클레오티드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예를 들어, 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예를 들어, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형을 포함할 수 있다. 핵산은 하나 이상의 부가적인 공유 결합된 잔기, 예를 들면, 단백질(예를 들어, 뉴클레아제, 독소, 항체, 시그널 펩타이드, 폴리-L-리신 등), 삽입제(예를 들어, 아크리딘, 프로랄렌 등), 킬레이트화제(예를 들어, 금속, 방사성 금속, 철, 산화성 금속 등) 및 알킬화제를 함유할 수 있다. 또한, 본 발명의 프라이머는 필요한 경우, 분광학적, 광화학적, 생화학적, 면역화학적 또는 화학적 수단에 의해 직접적으로 또는 간접적으로 검출 가능한 표지를 포함할 수 있다. 표지의 예로는, 효소(예를 들어, 호스래디쉬 퍼옥시다제, 알칼린 포스파타아제), 방사성 동위원소(예를 들어, 32P), 형광성 분자 및 화학그룹(예를 들어, 바이오틴) 등이 있다. The primer can be chemically synthesized using the phosphoramidite solid support method, or other well known methods. These primers can be modified using a number of means known in the art as long as they exhibit an effect capable of detecting the Hantan virus. Examples of such modifications include methylation, encapsulation, substitution of one or more homologs of natural nucleotides and modifications between nucleotides, such as uncharged linkers (e.g., methyl phosphonate, phosphotriester, phosphoroamidate, Carbamates, etc.) or charged linkers (eg, phosphorothioate, phosphorodithioate, etc.). Nucleic acids can include one or more additional covalently attached residues, such as proteins (e.g., nucleases, toxins, antibodies, signal peptides, poly-L-lysine, etc.), inserts (e.g., acridine , Proralene, etc.), chelating agents (eg, metals, radioactive metals, iron, oxidizing metals, etc.) and alkylating agents. In addition, the primers of the present invention, if necessary, may contain a label that can be detected directly or indirectly by spectroscopic, photochemical, biochemical, immunochemical or chemical means. Examples of labels include enzymes (e.g. horseradish peroxidase, alkaline phosphatase), radioactive isotopes (e.g. 32 P), fluorescent molecules and chemical groups (e.g. biotin), etc. There is this.
상기 프라이머 세트는 현장진단(point-of-care testing, POCT)을 위한 것일 수 있다. 상기 프라이머 세트는 현장진단용 기기를 이용하여 황열바이러스를 높은 민감도 및 특이도로 검출할 수 있는 현장진단을 위한 프라이머 세트일 수 있다. The primer set may be for point-of-care testing (POCT). The primer set may be a primer set for on-site diagnosis capable of detecting a yellow fever virus with high sensitivity and specificity using a field diagnosis device.
또한, 본 발명은 서열번호 1의 염기서열로 기재되는 정방향 프라이머; 서열번호 2의 염기서열로 기재되는 제1 역방향 프라이머; 및 서열번호 3의 염기서열로 기재되는 제2 역방향 프라이머로 이루어진 한탄바이러스 검출용 프라이머 세트를 포함하는 한탄바이러스 검출용 조성물을 제공한다. In addition, the present invention is a forward primer described by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1; A first reverse primer described by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2; And it provides a hantan virus detection composition comprising a primer set for hantan virus detection consisting of a second reverse primer described in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3.
상기 프라이머 세트는 상술한 바와 같은 특징을 가질 수 있다. 일례로, 상기 프라이머 세트는 한탄바이러스의 segment S 영역을 증폭하는 것일 수 있다. 또한, 상기 프라이머 세트는 상기 segment S 영역의 유전자에 상보적으로 결합 가능한 10 내지 40개, 구체적으로 15 내지 30개의 염기서열로 이루어진 정방향 또는 역방향 프라이머일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서, 상기 프라이머 세트는 서열번호 1의 염기서열로 기재되는 정방향 프라이머, 서열번호 2의 염기서열로 기재되는 제1 역방향 프라이머 및 서열번호 3의 염기서열로 기재되는 제2 역방향 프라이머로 이루어진 것일 수 있다.The primer set may have the characteristics as described above. For example, the primer set may be to amplify the segment S region of the hantan virus. In addition, the primer set may be a forward or reverse primer consisting of 10 to 40, specifically 15 to 30 nucleotide sequences capable of complementarily binding to the gene of the segment S region. In one embodiment of the present invention, the primer set is a forward primer described by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, a first reverse primer described by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2, and a second reverse primer described by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 It may be made of a primer.
또한, 상기 조성물은 서열번호 4의 염기서열로 기재되는 프로브를 더 포함할 수 있다. In addition, the composition may further include a probe described in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4.
본 명세서에서 사용되는 용어 "프로브"는 DNA 또는 RNA와 특이적으로 결합할 수 있는 수개 내지 수백 개의 염기에 해당하는 핵산 단편을 의미하며, 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide) 프로브, 단쇄 DNA(single stranded DNA) 프로브, 이중쇄 DNA(double stranded DNA) 또는 RNA 등의 형태로 제작될 수 있다. The term "probe" as used herein refers to a nucleic acid fragment corresponding to several to hundreds of bases capable of specifically binding to DNA or RNA, and is an oligonucleotide probe, a single stranded DNA probe. , It can be produced in the form of double stranded DNA or RNA.
상기 프로브는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성될 수 있다. 이러한 프라이머는 한탄바이러스를 검출할 수 있는 효과를 나타내는 한, 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 예로는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오티드 하나 이상의 동족체로의 치환 및 뉴클레오티드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예를 들어, 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예를 들어, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형을 포함할 수 있다. 핵산은 하나 이상의 부가적인 공유 결합된 잔기, 예를 들면, 단백질(예를 들어, 뉴클레아제, 독소, 항체, 시그널 펩타이드, 폴리-L-리신 등), 삽입제(예를 들어, 아크리딘, 프로랄렌 등), 킬레이트화제(예를 들어, 금속, 방사성 금속, 철, 산화성 금속 등) 및 알킬화제를 함유할 수 있다. The probe can be chemically synthesized using the phosphoramidite solid support method, or other well known methods. These primers can be modified using a number of means known in the art as long as they exhibit an effect capable of detecting the Hantan virus. Examples of such modifications include methylation, encapsulation, substitution of one or more homologs of natural nucleotides and modifications between nucleotides, such as uncharged linkers (e.g., methyl phosphonate, phosphotriester, phosphoroamidate, Carbamate, etc.) or to a charged linker (eg, phosphorothioate, phosphorodithioate, etc.). Nucleic acids can include one or more additional covalently attached residues, such as proteins (e.g., nucleases, toxins, antibodies, signal peptides, poly-L-lysine, etc.), inserts (e.g., acridine , Proralene, etc.), chelating agents (eg, metals, radioactive metals, iron, oxidizing metals, etc.) and alkylating agents.
상기 프로브는 이의 5' 말단에 리포터가 추가로 더 접합될 수 있다. 상기 리포터는 FAM(6-carboxyfluorescein), 텍사스 레드(texas red), 플루오레신(fluorescein), HEX(2',4',5',7'-tetrachloro-6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein), 플루오레신 클로로트리아지닐(fluorescein chlorotriazinyl), 로다민 그린(rhodamine green), 로다민 레드(rhodamine red), 테트라메틸로다민(tetramethylrhodamine), FITC(fluorescein isothiocyanate), 오레곤 그린(oregon green), 알렉사 플루오로(alexa fluor), JOE(6-Carboxy-4',5'-Dichloro-2',7'-Dimethoxyfluorescein), ROX(6-Carboxyl-X-Rhodamine), TET(Tetrachloro-Fluorescein), TRITC(tertramethylrodamine isothiocyanate), TAMRA(6-carboxytetramethyl-rhodamine), NED(N-(1-Naphthyl) ethylenediamine), 시아닌(Cyanine) 계열 염료 및 씨아디카르보시아닌(thiadicarbocyanine)으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있으나, 이외에 당업계에서 리포터로 사용될 수 있는 물질이라고 알려진 것이라면 모두 사용할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서, 상기 리포터는 FAM(6-carboxyfluorescein)일 수 있다. The probe may be further bonded to a reporter at its 5'end. The reporter is FAM (6-carboxyfluorescein), Texas red (texas red), fluorescein, HEX (2',4',5',7'-tetrachloro-6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein) , Fluorescein chlorotriazinyl, rhodamine green, rhodamine red, tetramethylrhodamine, FITC (fluorescein isothiocyanate), oregon green, Alexa Fluoro (alexa fluor), JOE (6-Carboxy-4',5'-Dichloro-2',7'-Dimethoxyfluorescein), ROX (6-Carboxyl-X-Rhodamine), TET (Tetrachloro-Fluorescein), TRITC ( tertramethylrodamine isothiocyanate), TAMRA (6-carboxytetramethyl-rhodamine), NED (N-(1-Naphthyl) ethylenediamine), cyanine-based dyes, and thiadicarbocyanine can be any one or more selected from the group consisting of However, any other known material that can be used as a reporter in the art may be used. In one embodiment of the present invention, the reporter may be 6-carboxyfluorescein (FAM).
상기 프로브는 이의 3' 말단에 소광자가 추가로 더 접합될 수 있다. 상기 소광자는 TAMRA(6-carboxytetramethyl-rhodamine), BHQ1(black hole quencher 1), BHQ2(black hole quencher 2), BHQ3(black hole quencher 3), NFQ(nonfluorescent quencher), 답실(dabcyl), Eclipse, DDQ(Deep Dark Quencher), 블랙베리 퀸처(Blackberry Quencher), 아이오와 블랙(Iowa black)으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있으나, 이외에 당업계에서 소광자로 사용될 수 있는 물질이라고 알려진 것이라면 모두 사용할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서, 상기 소광자는 BHQ(black hole quencher) 1일 수 있다.The probe may further be conjugated with a quencher at its 3'end. The quencher is TAMRA (6-carboxytetramethyl-rhodamine), BHQ1 (black hole quencher 1), BHQ2 (black hole quencher 2), BHQ3 (black hole quencher 3), NFQ (nonfluorescent quencher), dabcyl, Eclipse, DDQ (Deep Dark Quencher), Blackberry Quencher (Blackberry Quencher), may be any one or more selected from the group consisting of Iowa black (Iowa black), but in addition to any known material that can be used as a quencher in the art can be used. In an embodiment of the present invention, the quencher may be a black hole quencher (BHQ) 1.
상기 조성물에는 상기 프라이머 세트 및 프로브 이외에 역전사 중합효소, DNA 중합효소, Mg2+와 같은 조인자, dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP가 포함될 수 있다. 역전사된 cDNA를 증폭하기 위하여 다양한 DNA 중합효소가 본 발명의 증폭 단계에 이용될 수 있으며, DNA 중합효소의 예로 E. coli DNA 중합효소 I의 클레나우 단편, 열안정성 DNA 중합효소 또는 박테리오파지 T7 DNA 중합효소가 있다. 중합효소는 박테리아 그 자체로부터 분리하거나 상업적으로 구입하거나 중합효소를 암호화하는 클로닝 유전자의 높은 레벨을 발현하는 세포로부터 수득할 수 있다. The composition may include reverse transcription polymerase, DNA polymerase, cofactors such as Mg2+, dATP, dCTP, dGTP, and dTTP in addition to the primer set and probe. In order to amplify the reverse transcribed cDNA, various DNA polymerases can be used in the amplification step of the present invention. Examples of DNA polymerases include Klenow fragment of E. coli DNA polymerase I, thermostable DNA polymerase or bacteriophage T7 DNA polymerization There are enzymes. The polymerase can be obtained from cells expressing a high level of the cloning gene encoding the polymerase, either from the bacteria itself or commercially purchased.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 서열번호 1의 염기서열로 기재되는 정방향 프라이머, 서열번호 2의 염기서열로 기재되는 제1 역방향 프라이머, 서열번호 3의 염기서열로 기재되는 제2 역방향 프라이머 및 서열번호 4의 염기서열로 기재되는 프로브를 제작하여 현재 보고되어 있는 한탄바이러스를 소형·신속 실시간 유전자 증폭 장치에서 짧은 시간 안에 한 번의 반응으로 한탄바이러스를 검출할 수 있고, 8.41 copies/reaction의 최소검출한계를 나타내어 민감도가 우수하며, 88개의 균주 중에서 한탄바이러스만을 특이적으로 검출할 수 있고, 검체 내 포함되어 검출 결과에 영향을 미칠 수 있는 간섭물질과의 간섭반응이 없으며, 재현성있는 결과를 나타내고, 365일 동안의 보관 안정성을 나타냄을 확인하였다(도 2 내지 도 6 참조).In a specific embodiment of the present invention, the present inventors have a forward primer described with the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, a first reverse primer described with the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2, and a second reverse primer described with the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 And by producing a probe described in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4, the currently reported Hantan virus can be detected in a single reaction in a small and fast real-time gene amplification device in a short time, with a minimum of 8.41 copies/reaction. It has excellent sensitivity due to its detection limit, and can specifically detect only Hantan virus out of 88 strains, there is no interference reaction with interfering substances that may affect the detection result because it is contained in the sample, and shows reproducible results. , It was confirmed that it shows storage stability for 365 days (see FIGS. 2 to 6).
따라서, 본 발명의 프라이머 세트 및 프로브는 한탄바이러스를 검출 및 진단하는 데 유용하게 사용될 수 있다. Therefore, the primer set and probe of the present invention can be usefully used for detecting and diagnosing hantan virus.
또한, 본 발명은 본 발명의 조성물을 포함하는 한탄바이러스 검출용 키트를 제공한다. In addition, the present invention provides a kit for detecting hantan virus comprising the composition of the present invention.
상기 조성물은 상술한 바와 같은 특징을 가질 수 있다. 일례로, 상기 조성물은 서열번호 1의 염기서열로 기재되는 정방향 프라이머; 서열번호 2의 염기서열로 기재되는 제1 역방향 프라이머; 및 서열번호 3의 염기서열로 기재되는 제2 역방향 프라이머로 이루어진 한탄바이러스 검출용 프라이머 세트를 포함하는 것일 수 있다. 또한, 상기 조성물은 서열번호 4의 염기서열로 기재되는 프로브를 더 포함할 수 있다. 상기 프로브는 이의 5' 말단에 리포터가 추가로 더 접합될 수 있다. 또한, 상기 프로브는 이의 3' 말단에 소광자(quencher)가 추가로 더 접합될 수 있다. The composition may have the characteristics as described above. In one example, the composition is a forward primer described in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1; A first reverse primer described by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2; And it may be to include a primer set for detecting hantan virus consisting of a second reverse primer described in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3. In addition, the composition may further include a probe described in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4. The probe may be further bonded to a reporter at its 5'end. In addition, a quencher may be further bonded to the 3'end of the probe.
상기 키트는 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성 성분 조성물, 용액 또는 장치를 더 포함할 수 있다. 상기 키트는 한탄바이러스의 특정 영역에 대한 특이적인 프라이머 세트 이외에도 한탄바이러스 RNA로부터 상보적인 cDNA를 합성하기 위한 역전사 효소, 상보적인 DNA를 증폭하기 위한 DNA 중합효소, 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오티드(dNTPs), hot-start Taq-폴리머라제 및 역전사 효소와 같은 효소, DNase, RNase 억제제, DEPC-물(DEPC-water) 및 멸균수 등을 포함할 수 있다. 한편, 키트에 포함되는 성분들은 액상 형태로 제조될 수도 있고, 포함 성분들의 자유도를 낮추어 제품의 안정성을 제고하기 위해 건조된 형태로 제조될 수도 있다. 이러한 건조된 형태로의 제조를 위해서는 건조 단계의 적용이 필요하고, 이 때 가온건조, 자연건조, 감압건조, 동결건조 또는 이들의 복합 공정이 사용될 수 있다. The kit may further include one or more other component compositions, solutions, or devices suitable for analytical methods. The kit includes reverse transcriptase for synthesizing complementary cDNA from Hantan virus RNA, DNA polymerase for amplifying complementary DNA, tube or other suitable container, reaction buffer (pH And magnesium concentration varies), deoxynucleotides (dNTPs), enzymes such as hot-start Taq-polymerase and reverse transcriptase, DNase, RNase inhibitors, DEPC-water, and sterile water. . Meanwhile, the components included in the kit may be manufactured in a liquid form, or may be manufactured in a dried form in order to improve the stability of the product by lowering the degrees of freedom of the components. In order to manufacture such a dried form, it is necessary to apply a drying step, and in this case, heated drying, natural drying, vacuum drying, freeze drying, or a complex process thereof may be used.
또한, 본 발명은 검체로부터 분리된 핵산을 주형으로 본 발명의 프라이머 세트를 이용하여 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)을 수행하는 단계를 포함하는 한탄바이러스를 검출하는 방법을 제공한다.In addition, the present invention provides a method of detecting a Hantan virus comprising the step of performing a polymerase chain reaction (PCR) using the primer set of the present invention using the nucleic acid isolated from the specimen as a template.
상기 검체는 임상시료 또는 환경시료로부터 수득되는 것일 수 있다. 예를 들어, 임상시료는 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 객담, 뇌척수액 또는 뇨로부터 수득되는 시료일 수 있다. The sample may be obtained from a clinical sample or an environmental sample. For example, the clinical sample can be a sample obtained from tissue, cells, whole blood, serum, plasma, saliva, sputum, cerebrospinal fluid, or urine.
상기 프라이머 세트는 상술한 바와 같은 특징을 가질 수 있다. 일례로, 상기 프라이머 세트는 한탄바이러스의 segment S 영역을 증폭하는 것일 수 있다. 또한, 상기 프라이머 세트는 상기 segment S 영역의 유전자에 상보적으로 결합 가능한 10 내지 40개, 구체적으로 15 내지 30개의 염기서열로 이루어진 정방향 또는 역방향 프라이머일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서, 상기 프라이머 세트는 서열번호 1의 염기서열로 기재되는 정방향 프라이머, 서열번호 2의 염기서열로 기재되는 제1 역방향 프라이머 및 서열번호 3의 염기서열로 기재되는 제2 역방향 프라이머로 이루어진 것일 수 있다. The primer set may have the characteristics as described above. For example, the primer set may be to amplify the segment S region of the hantan virus. In addition, the primer set may be a forward or reverse primer consisting of 10 to 40, specifically 15 to 30 nucleotide sequences capable of complementarily binding to the gene of the segment S region. In one embodiment of the present invention, the primer set is a forward primer described by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, a first reverse primer described by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2, and a second reverse primer described by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 It may be made of a primer.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의해 상세히 설명한다. Hereinafter, the present invention will be described in detail by examples.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명이 이들에 의해 제한되는 것은 아니다.However, the following examples are for illustrative purposes only, and the present invention is not limited thereto.
<< 실시예Example 1> 한탄바이러스를 검출할 수 있는 1> Hantan virus can be detected 프라이머primer 및 And 프로브Probe 제작 making
한탄바이러스를 검출할 수 있는 현장 검출용(Point-Of Care-Testing, POCT) 프라이머 및 프로브 세트와 실험실 검출용 프라이머 및 프로브 세트를 제작하였다. A set of primers and probes for point-of-care-testing (POCT) that can detect Hantan virus and a set of primers and probes for laboratory detection were prepared.
한탄바이러스 균주를 탐색한 후 미국국립생물정보센터(NCBI, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)에서 60개의 한탄바이러스 균주들의 염기서열을 수집하였다(표 1). 수집된 염기서열을 이용하여 유전자를 정렬(alignment)하였고, segment S를 표적 유전자로 하여 한탄바이러스를 검출할 수 있는 프라이머 및 프로브를 제작하였다(도 1 및 표 2). 프로브의 5' 말단에는 리포터 FAM(6-carboxyfluorescein)를 결합시켰으며, 3' 말단에는 소광자 BHQ(black hole quencher) 1를 결합시켰다. After searching for the Hantan virus strain, the base sequences of 60 Hantan virus strains were collected at the National Center for Biological Information (NCBI, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/) (Table 1). Genes were aligned using the collected nucleotide sequences, and primers and probes capable of detecting the Hantan virus were prepared using segment S as a target gene (Fig. 1 and Table 2). The reporter FAM (6-carboxyfluorescein) was bound to the 5'end of the probe, and the quencher BHQ (black hole quencher) 1 was bound to the 3'end.
유전자Target
gene
Primer or probe
프라이머Forward direction
primer
(서열번호 1)CAGAGRGAAATCAATGCCCATGAG
(SEQ ID NO: 1)
프라이머First reverse
primer
(서열번호 2)TCATCWGGRTCCTTTTCATACTGTTT
(SEQ ID NO: 2)
프라이머2nd reverse
primer
(서열번호 3)TCATCTGGATCCTTYTCATATTGTTT
(SEQ ID NO: 3)
(서열번호 4)ATWGCYAGGCAGAAGGTGAGRGATGCAG
(SEQ ID NO: 4)
<< 실험예Experimental Example 1> 1> 프라이머primer 및 And 프로브Probe 세트의 Set of 한탄바이러스의Hantan virus 검출 능력 평가 Evaluation of detection ability
<1-1> 검출한계 평가<1-1> Detection limit evaluation
실시예 1에서 제조한 한탄바이러스의 현장 검출용 프라이머 및 프로브 세트를 이용하여 PCR 수행 시, 프라이머 및 프로브 세트의 최소검출한계(limit of detection, LoD)를 분석하고자 하였다. When performing PCR using the primer and probe set for in-situ detection of the hantan virus prepared in Example 1, it was attempted to analyze the limit of detection (LoD) of the primer and probe set.
구체적으로, 표 1에 기재된 한탄바이러스 균주의 공통 영역을 타겟(target)으로 설정한 후, 정제된 DNA를 이용하여 시험관 내 전사(in vitro transcription(T7))를 진행하여 RNA 유전자를 합성하였다. 300, 100, 33.33, 11.11, 3.70, 및 1.23 copies/reaction 농도의 한탄바이러스의 합성된 RNA 3 ㎕, 2x 마스터 믹스(Master mix) 5 ㎕, 프라이머 프로브 믹스(primer probe mix) 1 ㎕ 및 PCR이 잘 수행되었는지 확인하는 내부 양성 대조군(Internal positive control) 1 ㎕을 혼합한 후, 하기 표 3과 같은 반응 조건으로 실시간 RT-PCR의 반응을 수행하였다(UltraFast LabChip real-time PCR G2-4). 동일한 조건으로 30회 반복실험을 수행하여 Ct(cycle threshold)값 및 검출률을 측정하였고, 95% 양성구간을 통계프로그램(IBM SPSS Statistics, IBM)을 이용하여 프로빗(probit) 회귀모델로 검증하였다. 최소검출한계는 식품의약품안전처의 <체외진단용 의료기기 허가심사 가이드라인>에서 제시한 정의대로 '표준물질을 이용하여 95% 검출률을 보이는 최저 농도'로 계산하였다.Specifically, after setting the common region of the Hantan virus strain described in Table 1 as a target, in vitro transcription (T7) was performed using purified DNA to synthesize an RNA gene. 300, 100, 33.33, 11.11, 3.70, and 1.23 copies/reaction concentration of Hantan virus synthesized
그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, 합성된 타겟 RNA 유전자(Target으로 표기)의 농도가 높을수록 Ct 값은 낮아졌으며, 한탄바이러스 segment S를 타겟으로 하는 프라이머 및 프로브 세트는 8.41 copies/reaction의 최소검출한계를 나타내, 민감도가 우수함을 알 수 있었다(도 2). As a result, as shown in Figure 2, the higher the concentration of the synthesized target RNA gene (denoted as Target), the lower the Ct value, and the primer and probe set targeting the Hantan virus segment S had a minimum of 8.41 copies/reaction. It was found that the detection limit was shown, and the sensitivity was excellent (Fig. 2).
(*기계 상에서 결과값을 읽는 시간까지 포함된 총 소요시간)( * Total time required including reading time on the machine)
<1-2> <1-2> 타균주Other strains 유전자와의 교차반응 시험을 통한 특이도 평가 Specificity evaluation through cross-reaction test with gene
실시예 1에서 제조한 한탄바이러스의 현장 검출용 프라이머 및 프로브 세트를 이용하여 PCR 수행 시, 프라이머 및 프로브 세트의 특이도를 평가하고자 타균주와의 교차반응 시험을 수행하였다. When performing PCR using the primer and probe set for field detection of the Hantan virus prepared in Example 1, a cross-reaction test with other strains was performed to evaluate the specificity of the primer and probe set.
구체적으로, 총 88개의 균주 유전자(도 3에서 '굵게'로 표시) 및 질병관리본부에서 제공받은 전사체(transcript, 도 3에서 '밑줄'로 표시)를 이용한 교차반응 시험을 수행하였다. 사용한 균주들 중 바이러스는 104 copies/㎕의 농도로 적용하였고, 나머지 균주들은 1 ng/㎕의 농도로 적용하였다. 한탄바이러스 RNA 대신 동량의 상기 병원체 유전자 및 전사체를 사용한 것을 제외하고는 상기 실험예 1-1에 기재된 것과 동일한 방법으로 실시간 RT-PCR을 수행하였다.Specifically, a cross-reaction test was performed using a total of 88 strain genes (indicated in'bold' in FIG. 3) and a transcript provided by the Centers for Disease Control and Prevention (indicated by'underlined' in FIG. 3). Among the strains used, the virus was applied at a concentration of 10 4 copies/µl, and the remaining strains were applied at a concentration of 1 ng/µl. Real-time RT-PCR was performed in the same manner as described in Experimental Example 1-1, except that the same amount of the pathogen gene and transcript were used instead of Hantan virus RNA.
그 결과, 실시예 1에서 제조한 프라이머 및 프로브 세트는 88개의 균주의 유전자 중 한탄바이러스만을 검출하였다(도 3).As a result, the primer and probe set prepared in Example 1 detected only Hantan virus among the genes of 88 strains (FIG. 3).
<1-3> 간섭물질과의 간섭반응 시험을 통한 특이도 평가<1-3> Evaluation of specificity through interference reaction test with interfering substances
실시예 1에서 제조한 한탄바이러스의 현장 검출용 프라이머 및 프로브 세트를 이용하여 PCR 수행 시, 프라이머 및 프로브 세트의 특이도를 평가하고자 검체 내 포함되어 실험에 영향을 미칠 수 있는 간섭물질과의 간섭반응을 확인하였다. When performing PCR using the primer and probe set for in-situ detection of the Hantan virus prepared in Example 1, interference with interfering substances that may affect the experiment included in the sample to evaluate the specificity of the primer and probe set Was confirmed.
구체적으로, 간섭물질은 <CLSI 가이드라인>의 'EP7-A2'를 참고하여 헤모글로빈, IgG, 헤파린, EDTA 및 시트르산 나트륨(Na-citrate)으로 선정하였고, 간섭물질을 포함 또는 간섭물질을 포함하지 않은 시료를 이용하여 실험예 1-1에 기재된 것과 동일한 방법으로 실시간 RT-PCR을 수행하였으며, 간섭물질을 포함하지 않은 양성대조군과의 Ct 값 차이(Ct difference)를 산출하였다. 이 때, 한탄바이러스로부터 합성한 RNA는 최소검출한계(8.41 copies/reaction)의 25배 또는 100배의 농도로 첨가하였으며, 각 간섭물질은 1 mg/㎖의 헤모글로빈(hemoglobin), 12.5 ㎍/㎖의 면역글로불린 G(immunoglobulin G, IgG), 0.1 mg/㎖의 헤파린(heparin), 4 mM의 EDTA(ethylenediaminetetraacetic acid) 또는 20 mM의 시트르산나트륨(Na-citrate)의 농도로 첨가하였다. Specifically, the interfering substances were selected as hemoglobin, IgG, heparin, EDTA, and sodium citrate (Na-citrate), referring to'EP7-A2' of the <CLSI Guidelines>, and containing or not containing interfering substances. Real-time RT-PCR was performed using the sample in the same manner as described in Experimental Example 1-1, and the Ct value difference (Ct difference) from the positive control group that did not contain an interfering substance was calculated. At this time, RNA synthesized from Hantan virus was added at a concentration of 25 or 100 times the minimum detection limit (8.41 copies/reaction), and each interfering substance was 1 mg/ml of hemoglobin and 12.5 μg/ml. Immunoglobulin G (IgG), 0.1 mg/ml of heparin, 4 mM of ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) or 20 mM of sodium citrate (Na-citrate) were added.
그 결과, 5종의 간섭물질에 따른 Ct 값의 차이는 미미하므로, 실시예 1에서 제조한 프라이머 및 프로브 세트는 간섭물질로 작용하는 헤모글로빈, IgG, 헤파린, EDTA 또는 시트르산 나트륨(Na-citrate)과 간섭반응이 나타나지 않음을 확인하였다(도 4). As a result, since the difference in Ct values according to the five interfering substances is insignificant, the primer and probe set prepared in Example 1 were hemoglobin, IgG, heparin, EDTA, or sodium citrate (Na-citrate) acting as interfering substances. It was confirmed that no interference reaction appeared (FIG. 4).
<1-4> 재현성 평가<1-4> Reproducibility evaluation
실시예 1에서 제조한 한탄바이러스의 현장 검출용 프라이머 및 프로브 세트를 이용하여 PCR 수행 시, 프라이머 및 프로브 세트의 재현성을 평가하고자 하였다. When performing PCR using the primer and probe set for field detection of the hantan virus prepared in Example 1, it was to evaluate the reproducibility of the primer and probe set.
구체적으로, 한탄바이러스로부터 합성한 RNA를 최소검출한계(8.41 copies/reaction)의 5배, 25배 또는 100배의 농도로 반응시킨 것을 제외하고는 5일 동안 하루에 2회씩 반복하여 실험예 1-1에 기재된 것과 동일한 방법으로 실시간 RT-PCR을 수행하였으며, 측정한 Ct값의 평균, 표준편차 및 CV(coefficient of variation, 평균 대비 표준편차의 비율) 값을 산출하였다. 음성 대조군은 한탄바이러스의 합성 RNA를 포함하지 않은 시료이다.Specifically, except for reacting RNA synthesized from Hantan virus at a concentration of 5, 25 or 100 times the minimum detection limit (8.41 copies/reaction), it was repeated twice a day for 5 days, Experimental Example 1- Real-time RT-PCR was performed in the same manner as described in 1, and the average, standard deviation, and CV (coefficient of variation, ratio of standard deviation to the mean) of the measured Ct values were calculated. The negative control was a sample that did not contain the synthetic RNA of Hantan virus.
그 결과, 10번의 반복실험에 따른 CV 값이 0.01% 이하로 나타나, 실시예 1에서 제조한 프라이머 및 프로브 세트는 재현성있는 결과를 나타냄을 확인하였다(도 5).As a result, it was confirmed that the CV value according to the 10 replicate experiments was 0.01% or less, and the primer and probe set prepared in Example 1 showed reproducible results (FIG. 5).
<1-5> 보관 안정성 평가<1-5> Storage stability evaluation
실시예 1에서 제조한 한탄바이러스의 현장 검출용 프라이머 및 프로브 세트의 보관 안정성을 평가하고자, <식품의약품안전처 고시 제2014-178호>에 제시된 의료기기의 안정성 시험기준에 따른 가속노화실험을 통하여 조사하였다.In order to evaluate the storage stability of the primer and probe set for on-site detection of the Hantan virus prepared in Example 1, the accelerated aging test according to the stability test standard of medical devices presented in <Ministry of Food and Drug Safety Notice No. 2014-178> Investigated.
구체적으로, 하기 계산식 1을 이용하여 가속노화계수(AAF)를 산출하고, 계산식 2를 이용하여 가속노화시간(AAT)을 산출하였다. Specifically, the accelerated aging factor (AAF) was calculated using the following
[계산식 1][Calculation formula 1]
AAF = Q10 ｜( TAA - TRT )/10｜ AAF = Q 10 ｜( TAA - TRT )/10｜
Q10: 온도 10℃ 상승 또는 감소 시 노화계수, 2Q 10 : Aging coefficient when temperature rises or decreases by 10℃, 2
TAA: 가속노화온도, 45℃TAA: Accelerated aging temperature, 45℃
TRT: 제품 보관온도, -20℃TRT: Product storage temperature, -20℃
[계산식 2][Calculation formula 2]
AAT = 설정된 유효기간 / AAFAAT = Set validity period / AAF
설정된 유효기간: 365일Set validity period: 365 days
AAF: 90.51 (계산식 1로부터 도출된 가속노화계수)AAF: 90.51 (accelerated aging coefficient derived from equation 1)
산출된 조건에 따라 4일간 45℃에서 상기 실시예 1에서 제작한 프라이머 및 프로브 세트를 세 가지 농도(최소검출한계 8.41 copies/reaction의 5X, 25X 또는 100X)로 보관하고, 0, 3, 6, 9 또는 12개월째에 상기 실험예 1-1에 기재된 것과 동일한 방법으로 실시간 RT-PCR을 수행하였으며, 0일차의 Ct 값과 비교하여 Ct 값 차이(Ct difference)를 산출하였다. 양성 대조군으로는 한탄바이러스의 특정 서열로 이루어진 플라스미드 DNA를 이용하였고, 음성 대조군으로는 한탄바이러스 서열을 갖는 양성 대조군 또는 바이러스 RNA가 포함되지 않은 시료를 이용하였다. Depending on the calculated conditions, the primer and probe set prepared in Example 1 were stored at 45° C. for 4 days at three concentrations (minimum detection limit of 8.41 copies/reaction of 5X, 25X or 100X), and 0, 3, 6, At 9 or 12 months, real-time RT-PCR was performed in the same manner as described in Experimental Example 1-1, and the Ct value difference (Ct difference) was calculated by comparing with the Ct value on
그 결과, 실시예 1에서 제조한 프라이머 및 프로브 세트는 ±1 이내의 Ct 값을 나타냈으며, 통상적으로 대조군과의 Ct값 차이가 ±2범위 내에 있는 경우 안정한 것으로 판단하므로, 365일 동안의 보관 안정성을 갖는 것으로 확인되었다(도 6).As a result, the primer and probe set prepared in Example 1 showed a Ct value within ±1, and it is generally determined that the Ct value difference from the control group is within the range of ±2, so storage stability for 365 days It was confirmed to have (Fig. 6).
<110> Korea Centers for Disease Control and Prevention MICOBIOMED CO., LTD. <120> Primer set for detecting hantaan virus and uses thereof <130> 2018P-07-008 <160> 4 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hantaan-NF1 <400> 1 cagagrgaaa tcaatgccca tgag 24 <210> 2 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hantaan-NR1 <400> 2 tcatcwggrt ccttttcata ctgttt 26 <210> 3 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hantaan-NR2 <400> 3 tcatctggat ccttytcata ttgttt 26 <210> 4 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hantaan-NP1 <400> 4 atwgcyaggc agaaggtgag rgatgcag 28 <110> Korea Centers for Disease Control and Prevention MICOBIOMED CO., LTD. <120> Primer set for detecting hantaan virus and uses thereof <130> 2018P-07-008 <160> 4 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hantaan-NF1 <400> 1 cagagrgaaa tcaatgccca tgag 24 <210> 2 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hantaan-NR1 <400> 2 tcatcwggrt ccttttcata ctgttt 26 <210> 3 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hantaan-NR2 <400> 3 tcatctggat ccttytcata ttgttt 26 <210> 4 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hantaan-NP1 <400> 4 atwgcyaggc agaaggtgag rgatgcag 28
Claims (9)
서열번호 2의 염기서열로 기재되는 제1 역방향 프라이머;
서열번호 3의 염기서열로 기재되는 제 2 역방향 프라이머; 및
서열번호 4의 염기서열로 기재되는 프로브로 이루어진 한탄 바이러스 검출용 조성물.
A forward primer represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1;
A first reverse primer described by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2;
A second reverse primer described by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3; And
Hantan virus detection composition consisting of a probe described in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4.
The method of claim 1, wherein the probe is a reporter is additionally conjugated to the 5'end, hantan virus detection composition.
The composition of claim 1, wherein the probe is further conjugated to a quencher at the 3'end.
The method of claim 2, wherein the reporter is FAM (6-carboxyfluorescein), Texas red (texas rbed), fluorescein, HEX (2',4',5',7'-tetrachloro-6-carboxy- 4,7-dichlorofluorescein), fluorescein chlorotriazinyl, rhodamine green, rhodamine red, tetramethylrhodamine, fluorescein isothiocyanate (FITC), oregon green (oregon green), alexa fluor, JOE(6-Carboxy-4',5'-Dichloro-2',7'-Dimethoxyfluorescein), ROX(6-Carboxyl-X-Rhodamine), TET(Tetrachloro -Fluorescein), tertramethylrodamine isothiocyanate (TRITC), 6-carboxytetramethyl-rhodamine (TAMRA), NED (N-(1-Naphthyl) ethylenediamine), cyanine-based dyes and thiadicarbocyanine Any one selected, hantan virus detection composition.
The method of claim 3, wherein the quencher is TAMRA (6-carboxytetramethyl-rhodamine), BHQ1 (black hole quencher 1), BHQ2 (black hole quencher 2), BHQ3 (black hole quencher 3), NFQ (nonfluorescent quencher), dapsil ( dabcyl), Eclipse, DDQ (Deep Dark Quencher), Blackberry Quencher (Blackberry Quencher), any one selected from the group consisting of Iowa black (Iowa black), hantan virus detection composition.
Hantan virus detection kit comprising the composition of claim 1.
2) 상기 검체로부터 분리한 핵산을 주형으로 제1항의 조성물을 이용하여 중합 효소 연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)을 수행하여 표적서열을 증폭하는 단계; 및
3) 상기 단계 2)의 증폭산물을 형광측정을 통해 검출하는 단계; 를 포함하는 한탄 바이러스를 검출하는 방법.
1) separating the nucleic acid from the specimen;
2) amplifying a target sequence by performing a polymerase chain reaction (PCR) using the composition of claim 1 using the nucleic acid isolated from the sample as a template; And
3) detecting the amplified product of step 2) through fluorescence measurement; Method for detecting hantan virus comprising a.
The method of claim 7, wherein the specimen is obtained from a clinical sample or an environmental sample.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020180139995A KR102149396B1 (en) | 2018-11-14 | 2018-11-14 | Primer set for detecting hantaan virus and uses thereof |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020180139995A KR102149396B1 (en) | 2018-11-14 | 2018-11-14 | Primer set for detecting hantaan virus and uses thereof |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20200056091A KR20200056091A (en) | 2020-05-22 |
| KR102143071B1 true KR102143071B1 (en) | 2020-08-10 |
| KR102149396B1 KR102149396B1 (en) | 2020-08-31 |
Family
ID=70913879
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020180139995A KR102149396B1 (en) | 2018-11-14 | 2018-11-14 | Primer set for detecting hantaan virus and uses thereof |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR102149396B1 (en) |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR101815105B1 (en) * | 2015-10-16 | 2018-01-05 | 국방과학연구소 | Hantavirus Whole Genome Sequence Identification Methods Using a Multiplex PCR-based Next-Generation Sequencing and Uses Thereof |
| KR101987112B1 (en) * | 2017-03-22 | 2019-06-10 | 국방과학연구소 | Optimized primer set, TaqMan probe, and TaqMan real-time PCR method for detection of Hantaan virus and Seoul virus causing hemorrhagic fever with renal syndrome |
-
2018
- 2018-11-14 KR KR1020180139995A patent/KR102149396B1/en active IP Right Grant
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| KR101939336B1 (en) | Composition for Detecting Virus Relating Respiratory Disease and Kit for Detecting Virus Relating Respiratory Disease Comprising the Same | |
| KR101209312B1 (en) | A method for detecting hbv using real time pcr | |
| KR101857684B1 (en) | Primers and probe for detection of middle east respiratory syndrome coronavirus and detecting method for middle east respiratory syndrome coronavirus using the same | |
| KR102207965B1 (en) | Primers and probes for detection of Hantaan virus and Seoul virus and detecting method for Hantaan virus and Seoul virus using the same | |
| KR102149373B1 (en) | Primer set for detecting rift valley virus and uses thereof | |
| CN106282176A (en) | One is used for identifying AGA926-928the primer combination of the ARMS-qPCR of sudden change and application thereof | |
| KR102143071B1 (en) | Primer set for detecting hantaan virus and uses thereof | |
| KR102149396B1 (en) | Primer set for detecting hantaan virus and uses thereof | |
| KR102189593B1 (en) | Primer set for detecting yellow fever virus and uses thereof | |
| KR102252750B1 (en) | Primer and probe sets for diagnosing african swine fever virus and uses thereof | |
| CN111733227B (en) | Molecular marker circRNA for diagnosing idiopathic optic neuritis, kit and application | |
| KR102076343B1 (en) | Composition for detecting adenovirus type 55 using Real-time LAMP and uses thereof | |
| WO2005030027A2 (en) | Salmonella detection identification | |
| KR20210073220A (en) | Primer and probe sets for simultaneous detecting severe fever with thrombocytopenia syndrome and orientia tsutsugamushi | |
| CN116479116A (en) | Kit and method for detecting SMN1 gene capable of eliminating SMN2 interference | |
| KR102189581B1 (en) | Primers and probes for simultaneous detection of lineage of lassa virus and detecting method for lassa virus using the same | |
| KR102189576B1 (en) | Primers and probes for simultaneous detection of subtypes of Ebola virus and detecting method for ebola virus using the same | |
| KR20060108531A (en) | Kit and method for quantitatively detecting multiple pathogens without gene amplification | |
| KR102189587B1 (en) | Primers and probes for simultaneous detection of subtypes of Marburg virus and detecting method for Marburg virus using the same | |
| KR102284248B1 (en) | Primers and probes for detection of nipah virus and detecting method for nipah virus using the same | |
| KR102284243B1 (en) | Primers and probes for simultaneous detection of nipah and hendra viruses and detecting method for nipah and hendra viruses using the same | |
| KR102572368B1 (en) | Primer set for detection and identification of parainfluenza virus type 1 and type 3 and use thereof | |
| KR102632702B1 (en) | Method for detection and quantification of hepatitis a virus | |
| KR102516022B1 (en) | Detection and Differentiation of African Swine Fever Virus and Classical Swine Fever Virus by One Step Duplex Reverse Transcriptase Quantitative PCR Assay | |
| KR102453357B1 (en) | Primer set for multiplex loop-mediated isothermal amplification reaction for detection and identification of Candida albicans, Candida auris and Candida glabrata using fluorescent probe |