FI97473B - Menetelmä puhdistettujen glykolipidien valmistamiseksi käyttäen membraanierotusmenetelmää - Google Patents

Description

97473

Menetelmä puhdistettujen glykolipidien valmistamiseksi käyttäen membraanierotusmenetelmää

Glykolipidit koostuvat rasvahappo- ja sokeriryhmäs-5 tä. Yksi tunnetuimmista glykolipideistä on trehaloosilipi-di (Suzuki et ai., 1969, Agric. Biol. Chem. 33, 1619 - 1627). Se koostuu disakkaridista trehaloosi ja kahdesta β-hydroksi-a-haaroittuneesta rasvahaposta (korynomikoli-happo), jotka on esteröity sokerin hydroksyyliryhmillä. 10 Glykolipidejä, jotka sisältävät ramnoosia ja β-hydroksi-rasvahappoja, on kuvattu julkaisussa EP 0 153 634. Ensimmäinen ramnolipidi, jonka rakenne määritettiin, koostuu kahdesta molekyylistä L-ramnoosia ja kahdesta molekyylistä β-hydroksidekaanihappoa (Ewards ja Hayashi, 1965, Arch. 15 Biochem. Biophys., 111, 415 - 421).

Tähän asti tunnetuilla glykolipideillä moolimassa on sokeri- ja rasvahappo-osuudesta riippuen välillä 250 -2000. Niitä luovuttavat esimerkiksi bakteerit ympäröivään ravintoväliaineeseen ja ne voivat kasautua useiden eri-20 laisten glykolipidien seoksena (EP 0 153 634; Advances in Appi. Microbiol. 1980, 229 - 259).

Glykolipidejä voidaan käyttää esimerkiksi emulgaat-toreina, biotensideinä tai emulsioiden stabilisaattoreina.

Glykolipidien puhdistusmenetelmät perustuvat uut-.'.j 25 to-, kiteytys- ja kromatografointiprosesseihin (EP

0 282 942; US 4 812 272). Näissä menetelmissä muodostuu « · .·_·. kuitenkin suuria määriä liuottimia. Mulligan ja Gibbs (J.

• ·

Chem. Tech. Biotechnol, 1990, 47, 23-29) kuvaavat ultra- • · · t · · • suodatusmenetelmää biotensidien kuten surfaktiinin ja ram- 30 nolipidien puhdistukseen. Siinä kuvattu membraanin pidä- » t « *.:.* tyskyky vähenee kuitenkin huokoskoon kasvaessa. Tämä joh- ··· · taa membraaneilla, joiden erotusraja on 30 000, glykolipi dien häviöihin, jotka ovat yli 77 %.

Nyt keksittiin yllättävästi, että membraani, jonka 35 erotusraja molekyyleille on moolimassan arvoilla yli 2 97473 30 000, pidättää glykolipidejä happamalla pH-alueella lähes täydellisesti.

Keksintö koskee siten sellaista menetelmää puhdistettujen glykolipidien valmistamiseksi, jolle on tunnus-5 omaista se, että puhdistus suoritetaan membraanierotusme-netelmän avulla happamalla pH-arvolla membraanilla, jonka erotusraja molekyyleille on moolimassan arvoilla yli 30 000.

Keksintöä kuvataan seuraavassa yksityiskohtaisesti 10 erityisesti edullisina suoritusmuotoinaan.

Glykolipidejä voi esiintyä kasveissa tai bakteereissa (Lehninger, Biochemistry, 1977; Syldakt et ai., Z. Naturforschung, 40 c, 1985, 51 - 67). Glykolipidien valmistuksessa kyseeseen tulee edullisesti fermentointi. Sitä 15 varten mikro-organismeja viljellään sinänsä tunnetulla tavalla. Viljelyväliaineeseen erittyneet glykolipidit puhdistetaan esimerkiksi fermentoinnin päätyttyä keksinnön mukaisen membraanierotustekniikan avulla, edullisesti ult-rasuodattamalla. Ultrasuodatus voidaan suorittaa esimer-20 kiksi levy-, putki-, kapillaariputki-, kierremembraani- tai ontelokuitulaitteissa, jotka sisältävät membraaneja, joiden erotusraja on 30 000 - 300 000. Edullisesti käytetään membraaneja, joiden erotusraja on 100 000 - 200 000. Erotusraja koskee pidätettävien molekyylien moolimassaa ja 25 tarkoittaa sitä, että aineet, joiden moolimassa on suurem- • · ....: pi kuin mainittu arvo, pidätetään. Membraanimateriaaleina voidaan käyttää esimerkiksi polysulfoneja, polyamideja tai • · *..1^ selluloosa-asetaatteja. Membraanit pidättävät glykolipidit ' ja glykolipidejä voidaan jatkokäsitellä puhdistuksen jäl- 30 keen.

’···' Keksinnön mukainen membraanierotusmenetelmä toteu- *.* * tetaan happamalla pH-arvolla, edullisesti pH-arvolla 1 - 5, erityisen edullisesti pH-arvolla 2-4. Jos on välttämätöntä, pH-arvoa säädetään hapolla tai emäksellä. Voidaan 35 käyttää esimerkiksi suolahappoa, rikkihappoa, etikkahap- li 3 97473 poa, sitruunahappoa, natriumhydroksidia tai natriumkarbonaattia.

Keksinnön mukaista menetelmää käytetään edullisesti ramnolipidien puhdistukseen. Erityisen edullista on a-L-5 ramnopyranosyyli-p-hydroksidekaanihapon, 2-0-a-L-ramnopy-ranosyyli-a-L-ramnopyranosyyli-p-hydroksidekaanihapon, 2- 0-a-L-ramnopyranosyyli-a-L-ramnopyranosyyli-p-hydroksi-dekanoyyli-p-hydroksidekaanihapon tai a-L-ramnopyranosyy-li-p-hydroksidekanoyyli-p-hydroksidekaanihapon puhdistus.

10 Glykolipidien puhdistus ultrasuodatuslaitteella voidaan suorittaa erinä tai jatkuvatoimisesti. Tällöin suodatusliuoksen lämpötila on välillä 0 °C - 70 °C, edullisesti välillä 18 °C - 40 °C.

Nesteen ylijuoksunopeus membraanin yläpuolella pi-15 detään välillä 2-7 m/s, edullisesti välillä 5-6 m/s. Nesteen paine suodatuslaitteen sisäänmenossa on välillä 3- 6 bar. Painehäviö suodatusmatkalla on välillä 0,5 -3,5 bar.

Keksinnön mukaista membraanierotusmenetelmää ei 20 luonnollisesti voida käyttää vain glykolipidien puhdistukseen vaan myös väkevöintiin.

Esimerkki 1

Pseudomonas-lajia DSM 2874 kasvatettiin DE-patent-tijulkaisun 3 405 664 mukaan aerobisissa olosuhteissa ra-25 vintoliuoksessa, jossa hiililähteenä oli Paraffin S (89 % • · ....: tetradekaania, 9 % pentadekaania). Fermentointi suoritet- tiin pH-arvon ollessa 6,6 - 7,2 sekä lämpötilassa 30 °C ja • · *·;·# ilmastusnopeuden ollessa 0,2 V/V/m. Fermentointi lopetet- • · · tiin 7 päivän kuluttua. Fermentointiliuos sisälsi ramnoo- 30 silipidiseoksen, jonka L-ramnoosiosuus oli 2,5 g/1.

*·:·* Esimerkki 2 • · * • · · *·’ * Esimerkistä 1 saadun fermentointiliuoksen pH sää dettiin rikkihapolla arvoon 3 ja sen jälkeen väkevöitiin putkimoduliultrasuodatuslaitteella (Böttcher, Itävalta). 35 Noudatettiin seuraavia prosessiparametrejä: 4 97473

Sisäänmenopaine: 5 bar

Ulostulopaine: 1,5 bar

Lämpötila: 35 °C

Ylivuotonopeus: 5 m/s 5 Suodatusteho: 200 1/tunti Väkevöintitekij ä: 3,9

Alkutilavuus: 18,6 m3

Lopputilavuus: 4,8 m3 Väkevöinnin jälkeen konsentraatti sisälsi ramnoosi-10 lipidiseosta, jonka L-ramnoosiosuus oli 9,75 g/1. Esimerkki 3

Esimerkissä 2 saadusta väkevöidystä fermentointi-liuoksesta poistettiin suolat käyttäen kaksoissuodatusta pH-arvolla 3 ja vakiotilavuutta vettä. Siihen tarkoituk-15 seen käytettiin putkimoduliultrasuodatuslaitetta (Bött-cher, Itävalta). Polysulfonimembraanilla UF-PS-100, yhtiö Kalle-Albert, Wiesbaden, erotusraja oli 100 000. Noudatettiin seuraavia prosessiparametrejä:

Sisäänmenopaine: 5 bar 20 Ulostulopaine: 1,5 bar

Lämpötila: 35 °C

Ylivirtausnopeus: 5 m/s

Suodatusteho: 59 1/m2· tunti

Liuoksen tilavuus: 4,8 m3 .. 25 Fermentointiliemen johtokyky ennen suolanpoistoa • · oli 24,5 mS cm'1 ja sen jälkeen 2,9 mS cm'1. Permeaatti si- ;·.·. sälsi 0,1 g/1 L-ramnoosia.

• · ··· Esimerkki 4 « * · • « ·

Vertailun vuoksi ramnoosilipidiä sisältävää fermen- . 30 tointiliuosta laitettiin membraaneille, joiden erotuskoko * oli 10 000 ja 100 000: • · · » • · · *·' * Prosessiparametrit:

Ylivirtaus 0,3 m3/tunti

Ulostulopaine 4 bar

35 Lämpötila 32 °C

II

5 97473

Membraanin pinta-ala 0,45 m2 pH 3

Membraanityypit Permeaatti Virtaus 1/m21tunti 5 Polysulfoni 10 000 D kirkas 0,8

Polysulfoni 100 000 D kirkas 50,0

Molemmissa tapauksissa ramnolipidin pidätys oli 99 %.

• · » · « 4 » • » · • 1 · • · · • · · ·«« 1 1 • « # * # ·

Claims (9)

1. 97473
2. 1. Menetelmä puhdistettujen glykolipidien valmistamiseksi, tunnettu siitä, että puhdistus suorite- 5 taan membraanierotusmenetelmän avulla happamalla pH-arvol-la käyttäen membraania, jonka erotusraja on sellaisille molekyyleille, joiden moolimassa on yli 30 000.
3. 2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että puhdistetaan ramnolipidejä.
4. 3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että puhdistetaan a-L-ramnopyrano-syy1i-β-hydroks idekaanihappoa, 2-0-a-L-ramnopyranoyy1i-a-L-ramnopyranosyyli-p-hydroksidekaanihappoa, 2-0-a-L-ram-nopyranoyyli-a-L-ramnopyranosyyli-p-hydroksidekanoyyli-p-15 hydroksidekaanihappoa tai a-L-ramnopyranosyyli-p-hydroksi- dekanoyyli-p-hydroksidekaanihappoa.
5. 4. Yhden tai useamman patenttivaatimuksen 1-3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että membraa-nierotusmenetelmänä toimii ultrasuodatus.
6. 5. Yhden tai useamman patenttivaatimuksen 1-4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että käytetään ultrasuodatusmembraania, jonka erotusraja on 30 000 -300 000.
7. 6. Patenttivaatimuksen 1-5 mukainen menetelmä, 25 tunnettu siitä, että käytetään ultrasuodatusmem- • · braania, jonka erotusraja on 100 000 - 200 000. ·.*. 7. Yhden tai useamman patenttivaatimuksen 1-6 • · *..! mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että menetel- • · · 9 9 • · · * mä toteutetaan pH-arvolla 1-5.
8. 8. Patenttivaatimuksen 7 mukainen menetelmä, t » · tunnettu siitä, että menetelmä toteutetaan pH-ar- »f · V * volla 2-4.
9. 9. Yhden tai useamman patenttivaatimuksen 1-8 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että työsken- 35 nellään lämpötilassa 0 °C - 70 °C. 97473