FI96367C - Biospecifinen määritysmenetelmä - Google Patents

Description

96367 BIOSPESIFINEN MÄÄRITYSMENETELMÄ

Immunomääritys on vakiintunut biospesifinen määritysmenetelmä ja sen eri sovellutuksia käytetään laajalti rutiinidiagnostiikassa ja tutkimustoiminnassa. Toinen biospesifisten määritysten ryhmä, joskin vielä 5 kehityksen alaisena oleva, on DNA- ja RNA-hybridisaatiomääritys. Tavallisimmin nämä menetelmät perustuvat merkkiainetekniikkaan, joka tarkoittaa sitä, että spesifiseen reagenssiin on liitetty leima. Nykyisin käytettyjä leimoja ovat radioisotoopit, entsyymit, 10 luminoivat leimat ja fluoresoivat leimat.

Rutiinidiagnostiikassa on jatkuvasti kasvava moniparametri-sen analytiikan tarve. Valitettavasti nykyiset menetelmät eivät salli useamman kuin kahden tai kolmen samanaikaisesti mitattavan bioaffinitettireagenssien leiman käyttöä, koska 15 näiden eri leimojen antamien signaalien spektrometrinen erottelu ei ole mahdollista riittävällä tarkkuudella. Eri radioisotooppien tai fluoresoivien leimojen emissiokaistat peittävät huomattavasti toisiaan ja sen seurauksena eri analyyttien erottelu samasta näytteestä on huonoa 20 vaaditulla pitoisuusalueella.

Moniparametrinen määritys voidaan tehdä mm. siten, että kutakin analyyttiä vastaavat spesifiset bioaffiniteettireagenssit on kiinnitetty eri mikropartikkeleihin, jotka toimivat kiinteinä 25 reaktioalustoina reaktioliuoksessa, jossa on tarpeelliset reagenssit ja johon lisätään näyte. Mikropartikkelien sisään tai pintaan on liitetty yksi tai useampi fluoresoiva väriaine D2/ D3, ... D*. (jäljempänä D*.) kyseessä olevan mikropartikkelin ja samalla analyytin tunnistamiseksi 30 näiden fluoresoivien väriaineiden antamien signaalien avulla. Jokaisen partikkelin pinnalla tapahtuva biospesifinen reaktio mittaa ko. partikkelille spesifistä analyyttiä ja reagensseihin liitetty fotoluminesenssia antavan leiman F signaalin perusteella määritetään ko.

35 analyytin pitoisuus reaktioliuoksessa. Näissä tunnetuissa 2 96367 menetelmissä käytettävät fluoresoivat väriaineet Dk ja fotoluminoiva leima F on valittu siten, että niiden antamat signaalit voidaan erottaa toisistaan signaalien eriaikaisuuden avulla.

5 Jäljempänä olevassa tekstissä nimitetään mikropartikkelin luokan tunnistamisessa käytettäviä väriaineita Dk fluoresoiviksi väriaineiksi ja biospesifisen reaktion leimana käytettävää ainetta F fotoluminoivaksi leimaksi, ja viimeksi mainittu voi olla joko fluoresoiva, fosforoiva tai 10 kerni- tai bioluminesenssia synnyttävä leima.

Edellä kuvatussa menetelmässä mikropartikkeleiden luokan määritys voi perustua mikropartikkelin sisältämän yhden lyhytikäisen väriaineen pitoisuuden mittaamiseen siten, että kyseessä olevan väriaineen pitoisuus vaihtelee eri 15 luokkiin kuuluvissa mikropartikkeleissa esim. 1, 2, 4, 8, jne. Edellisen lisäksi mikropartikkelin luokan määritys voi tapahtuu kahden tai useamman väriaineen kombinaation perusteella. Bioaffinitettireaktion mittaamista varten näissä menetelmissä voidaan käyttää fotoluminoivana leimana 20 fluoresoivaa lantanidikelaattia (US-pat. no 5,028,545), bio- tai kerniluminoivaa yhdistettä (FI-pat. no. 89837) tai fosforoivaa yhdistettä (FI-pat. no. 90695).

Muissa edellä mainituissa patenttijulkaisuissa kuvatut menetelmät perustuvat sellaisten fluoresoivien ja 25 fotoluminoivien leimojen samanaikaiseen käyttöön, joilla on eri pituiset emission purkautumisajät. Nämä menetelmät perustuvat erityisesti siihen, että fotoluminoivan leiman F signaali voidaan mitata laajalla dynamiikka-alueella ilman, että fluoresoivien leimojen Dk signaalit häiritsevät 30 signaalia F, koska emissiot tapahtuvat oleellisesti eri aikoina. Käytännössä tämä tarkoittaa sitä, että mittaus suoritetaan aikaerotteisella mittausmenetelmällä, joka erottaa tehokkaasti lyhytikäisen fluoresenssiemission pitkäikäisestä emissiosta. Väriaineiden Dk ja leiman F

3 963 67 viritys tapahtuu valopulssilla ja väriaineiden Dk purkautumisaika on yleensä ainakin kaksi kertalukua lyhyempi kuin leiman F. Jos fotoluminoivana leimana käytetään leimaa, jonka emission purkautunisaika on 10-1000 5 mikrosekuntia (esim. lantanidikelaatteja tai metalloporfyriinejä), voivat väriaineet Dk voivat olla tavanomaisia fluoresoivia väriaineita, joiden fluoresenssin purkautumisaika on lyhyempi kuin 10 ns. Jos fotoluminoivana leimana käytetään bio- tai kemiluminoivaa leimaa, jonka 10 emission purkautumisaika on vähintään useita sekunteja ja lisäksi kemiallisella aktivaattorilla Hipaistavissa, voivat väriaineet Dk olla paitsi tavanomaisia fluoresoivia väriaineita myös esimerkiksi lantanidikelaatteja tai metalloporfyriinejä tai muita fluoresoivia tai fosforoivia 15 yhdisteitä, joiden emission purkautumisaika on yleensä vähintäin 10 mikrosekunnin ja enintään 10 millisekunnin pituinen.

On selvää, että tässä menetelmässä tarvittava mittauslaite tulee yksinkertaisemmaksi, jos kaikkien fluoresoivien 20 väriaineiden Dk viritysaallonpituus on sama ja emissioaallonpituudet eroavat toisistaan niin paljon, että ne voidaan yksinkertaisin spektrometrisin menetelmin erottaa toisistaan.

Esimerkkinä tällaisista fluoresoivista väriaineista voidaan 25 mainita esim. kaupallisesti saatavat ja yleisesti käytössä olevat fluoresoivat väriaineet fluoreskeiini, RBE (rhodamiini), RBE + Texas Red ja RBE + CY, joista kaksi viimeksi mainittua on ns. "tandem"-väriaineita eli kahden värin konjugaatteja. Tandem-väriaineissa tapahtuu tehokas 30 energiasiirto väriaineelta toiselle ja viritys tehdään ensimmäisen väriaineen viritysaaltopituudella ja emissio saadaan toisen väriaineen emissioaaltopituudella. Näiden neljän väriaineen yhdistelmää voidaan virittää yhdellä ja samalla aaltopituudella 488 nm ja emissiot tapahtuvat 520, 35 560, 613 ja 680 nm:n aaltopituuksilla. Vastaavia usean 4 96367 väriaineen ja tandemväriaineen yhdistelmiä tunnetaan muitakin.

Toinen esimerkki väriaineiksi D* sopivasta yhdistelmästä ovat lantanidi-ionien Tb, Dy, Eu ja Sm fluoresoivat 5 kelaatit (FI-pat. hak. no. 931198). Koska näiden kaikkien kelaattien ligandeilla on absorptio 300-360 nm alueella, voidaan niiden fluoresenssi virittää yhdellä ja samalla aaltopituudella. Näiden kelaattien emissioaaltopituudet ovat vastaavasti 545, 575, 613 ja 643 nm.

10 Kolmas esimerkki väriaineiksi Dk sopivasta yhdistelmästä ovat epäorgaaniset yttriumoksidisulfidin ja sinkkisulfidin yms. mikrokiteet, joita käytetään yleisesti värillisinä loisteaineina esim. televisioputkissa. Näissä aineissa käytetään fluoresenssin aktivaattorina esim lantanideja tai 15 muita metalleja jotka määräävät kiteen fluoresenssin emissioaallonpituuden.

Tämä keksintö liittyy edellä kuvatuissa moniparametrisissä biospesifisissä määritysmenetelmissä kyseeseen tulevien fluoresoivien väriaineiden Ι\ valintaan. Näiltä aineilta 20 tulee vaatia seuraavia ominaisuuksia: 1) Niillä tulee olla yhteinen fluoresenssin viritysallonpituus ja mielellään bioaffiniteettileiman virityskaistalla, 2) niillä tulee olla erilliset kapeat toisistaan helposti spektrometrisesti erotettavat fluoresenssin emissiokaistat, 3) niiden 25 fluoresoivien viritystilojen purkautumisaijän tulee olla fotolumivoivan leiman emission purkautumisaikaan nähden lyhyt eli nanosekuntiluokkaa, jos fotoluminoivana leiman käytetään esim. lantanidikelaatteja tai metalloporfyriinejä. Lisäksi keksinnön toimivuudelle on 30 edullista, jos 5) niillä ei ole pienessäkään määrässä pitkäikäisiä fluoresoivia tai fosforoivia viritystiloja ja jos 6) nämä yhdisteet ovat kemiallisesti stabiileja ja voimakkaasti fluoresoivia mikropartikkelien polymeerissä ja jos niiden viritysallonpituuksien ja 5 96367 emissioaallonpituuksien erotus on suuri.

Keksinnön tunnusmerkit ilmenevät patenttivaatimuksessa 1. Keksinnölle on tunnusomaista, että fluoresoiviksi väriaineiksi Dk on valittu yksi tai useampi seuraavien 5 tetrapyrroli-yhdisteluokkien johdannaisista: porfyriinit, kloriinit, bakteriokloriinit, klorofyllit, purpuriinit, feoforbidit, ftalosyaniinit ja naftalosyaniinit, jolloin valituilla väriaineilla Ι\ on - yhteinen fluoresenssin viritysaallonpituus, ja 10 - erilliset kapeat toisistaan helposti spektrometrisesti erottuvat fluoresenssin emissiokaistat, ja - niiden fluoresenssin viritystilojen purkautumisaika on lyhyt verrattuna fotoluminoivan leiman F emission purkautumisaikaan.

15 Koska tämän keksinnön tarkoittamassa sovelluksessa kyseeseen tulevien fluoresoivien tai fosforoivien bioaffinitettileimojen virityskaistat ovat 300nm-420nm alueella, eivät ylempänä mainitut väriaineet (fluoreskeiini, RBE, RBE + Texas Red ja RBE + CY) 20 samoinkuin monet muutkaan yleisesti käytössä olevat tavanomaiset fluoresoivat väriaineet tai tandem-väriaineet, joita on käytetty mikropartikkelien värjäämiseen, täytä edellä mainittua ehtoa 1. Näiden aineiden emissiospektrit ovat suhteellisen leveitä, eivätkä sen vuoksi myöskään 25 täytä edellä mainittua ehtoa 2 riittävän hyvin. FI-pat. hakemuksessa no. 931198 kuvatussa menetelmässä käytetyt lantanidikelaatit eivät täytä ehtoa 4 ja 5. Sama koskee myös fluoresoivien mikrokiteiden käyttöä.

Tämä keksintö liittyy mikropartikkelien tunnistamisessa 30 käyttävien väriaineiden valintaan ja keksinnön sisältö on erityisesti siinä, että edellä mainittuja ehtoja 1-6 täyttäviä yhdisteitä löytyy seuraavien tetrapyrroliyhdisteiden joukosta: porfyriinit, kloriinit, bakteriokloriinit, klorofyllit, purpuriinit, feoforbidit, 96367 6 ftalosyaniinit ja naftalosyaniinit. Näillä yhdisteillä on yleensä leveät toisensä peittävät absorptiokaistat lähiultraviolettialueella (320nm-450nm) ja kapeat erilliset fluoresenssin emissiokaistat punaisella ja 5 lähi-infrapuna-alueella (600nm-800nm). Näitä yhdisteitä voidaan tuottaa synteettisesti tai mikrobiologisesti (Porphyrins, D. Dolphin, Ed., Elsevier,

Amsterdam-N.-Y.-London, 1980, V.l-3) ja niitä on käytetty erilaisissa analyyttisissä sovelluksissa (D.B. Papkovsky, 10 Appi. Fluor. Technology 3 (1991) 16-23; EP 0127797; EP 0071991; Russian patent SU 1,659,477).

Esimerkkeinä tetrapyrroliyhdisteistä esitetään seuraavat:

1) deuteroporfyriini IX 15 2) mesoporfyriini IX

3) protoporfyriinin (IX) dimetyyliesteri 4) oktaetyyliporfiini 5) tetrafenyyliporfiini 6) tetra-(2-metoksi)-fenyyliporfiini 20 7) koproporfyriinin dimetyyliesterin kloriini 8) koproporfyriinin dimetyyliesterin bakteriokloriini 9) alumiiniftalosyaniini 10) sinkkiftalosyaniini.

Taulukossa 1 on esitetty näiden tetrapyrroliyhdisteiden 25 1-10 viritysaallonpituudet (Xexc) ja emissioaallonpituudet ( Aem). Kuvissa 3a-3j on esitetty näiden yhdisteiden viritys ja emissiospektrit. Voidaan todeta, että mitattujen yhdisteiden spektrit täyttävät ehdot 1-3.

Näitä tetrapyrroliyhdisteitä voidaan moniparametrisessa 30 määritysmenetelmässä täydentää muilla tunnetuilla orgaanisilla fluoresoivilla yhdisteillä, joilla on sama viritysaallonpituus ja joiden emissiokaista on tetrapyrroliyhdisteiden emissioalueen lyhyemmällä puolella. Esimerkkinä tällaisesta yhdisteestä taulukossa 1 on 35 esitetty kumariini 120.

:s «n i >i m i 96367 7

Kuvassa 1 on esitetty käyriä, jotka kuvaavat näiden tetrapyrroliyhdisteiden 1-10 emissioiden purkautumis-nopeuksia. Käyrästön logaritminen pystyakseli ilmaisee signaalin voimakkuuden ja vaaka-akseli ilmaisee 5 aikaa millisekunteina. Mittausta varten yhdisteet oli sekoitettu kiinteään polymeerimatriisiin (Merckoglas) ja käyrät mitattiin aikaerotteisella fluorometrillä. Käyrä 11 on puhtaalla matriisilla saatu tulos, jonka emission purkautumisajän tiedetään olevan lyhyt. Käyrä 12 on 10 tyhjästä kyvetistä saatu tulos. Tuloksista voidaan päätellä, että ko. yhdisteiden 1-10 emission purkautumisaika on lyhyt ja ne täyttävät ehdon 4.

Kuvassa 2 on esitty näiden samojen näytteiden pitkäikäisen emission voimakkuudet aikaikkunassa, joka alkaa 100 15 mikrosekuntia ja loppuu 1000 mikrosekuntia virityspulssin jälkeen. Tuloksista voidaan todeta, että signaalivoimakkuudet eivät eroa merkittävästi kumariinin (11), puhtaan matriisin (12) ja tyhjän kyvetin (13) antamista signaalivoimakkuuksista yhdistettä 4 20 lukuunottamatta, jonka pitkäikäinen emissiokomponentti on kaksi kertaa voimakkaampi kuin muiden yhdisteiden. Kaksinkertainen ero ei kuitenkaan ole merkittävä tässä sovelluksessa. Tuloksista voidaan päätellä, että ko. yhdisteillä ei esiinny pitkäikäisiä fluoresoivia tai 25 fosforoivia viritystiloja ja ne täyttävät ehdon 5.

Kuvissa 3a, 3b,....3j on esitetty tetrapyrroli-yhdisteiden 1-10 ja kuvassa 3k kumariinin viritys- ja emissiospektrit. Näistä spektreistä voidaan helposti todeta, että niiden joukosta on helppo valita aikakin kolme eri yhdistettä, 30 joiden emissiospektrit erottuvat selvästi toisistaan.

Esimerkkinä on kuvassa 4b esitetty kolmen yhdisteen 1,6 ja 10 emissiospektrit yhdessä kumariinin emissiospektrin kanssa. Kunkin yhdisteen emissio voidaan mitata vähintään yhden kertaluvun dynamiikka-aluella ilman toisesta 35 yhdisteestä aiheutuvaa interferenssiä, kun toisten yhdisteiden pitoisuudet vaihtelevat yhden vastaavassa 8 96367 määrässä. Samojen yhdisteiden viritysspektrit on esitetty kuvassa 4a. Kaikki yhdisteet virittyvät 350-400 nm aallonpituuskaistalla. Yhdisteet olivat kiinteässä matriisissa (Merckoglas). Yhtenäinen viiva esittää 5 viritysspektriä ja katkoviiva emissiospektriä.

Mikropartikkeleita, joiden sisällä, pintakerroksessa tai pinnassa on fluoresoivia väriaineita kuten tetrapyrroliyhdisteitä, voidaan valmistaa monilla eri tunnetuilla tavoilla. Väriaineet voidaan liittää 10 partikkeleiden pintaan kovalenttisesti, jos partikkelien pinnassa on kemiallisesti aktiivisia ryhmiä (Molday, R.S. et ai., J.Cell.Biol., 1975, 64, 75-88). Väriaineita voidaan imeyttää mikropartikkelien pintakerrokseen siten, että mikropartikkelit turvotetaan ensin orgaanisessa 15 liuottimessa ja väriaineen imeyttämisen jälkeen orgaaninen liuotin pestään ja haihdutetaan pois. Nämä menetelmät on kuvattu mm. seuraavissa mikropartikkelien valmistajien julkaisuissa: Dyeing Large Particles, julkaisija The Dow Chemical Co.,1972 ja Uniform Latex Particles, julkaisija 20 Seragen Diagnostics Inc. Luonnollisesti väriaineet voidaan lisätä mikropartikkelien valmistuksen yhteydessä ennen polymerisaatiota.

Alan ammattimiehelle on selvää, että keksinnön erilaiset 25 sovellutusmuodot voivat vaihdella jäljempänä esitettävien patenttivaatimusten puitteissa.

9 96367

”1 CM I I CD 1 CD I I I I I I I

t~ CO <J> σΐ cnT σΓ

CO O CO

CO h- CO

“ “ To" ~ — ~ o O O O in O « 04 σ_

ET-* T-' r-’ CO fsT o’ CO

moo-tni— 04 04 w 0 0 0 (O s s r·*- r- ~ “ “ σΓ “ oT “ o" co" oo" In' 0 (O O) CO O t 0 N N r- r- 04* 'tt co’ co’ co’ o’ co’ σ> o>* co’ f\jo4(OOjminin^Noo(>4 000000000(0^ ““ """" """" ““ “ ™“ """"""""" o’

CO

— — — — — ~ 75"~~ ““ o m o’ co’

O CO

m co m co" ▼— ~ ~ “ To" m co in o* co r** coe 04^ o» σ>* crT co’ h-~ co’ f^·* -r-’ 04’ cocoo-cooo^·^ inminminininin 0 x___________

Sooco^-^-mooTfin cococomn^—inin O-" *»-* CO* Is-* CO* 04* 04* CO* CO* 04* 04C0C004^tin0>OC0i“ unininininm^Tfcoco 0“ “ ~ "in" ~ Τ7Γ “ co" "ο" σΓ Τ7Γ Οϊ0τ-σ)0Ο)ι-Ν000 co* co’ co’ co’ 04’ co’ oi co’ o·’ 00’ co’

OOOO^— O CO O CO O

^Tfin^ininTfTi-coinco “ ~ “ σΓ "o" “ “ “ o" “ “ rr o w 0 n 0 q n 0 q o-Γ co’ 04 CO* CO* "T- h-’ o’ 10’ O-" Tf O)O)OO)r(\jSN^^0 coco^-co^t^tcococococo e ' “ o o := ® O ro S ^

<7> .E .E

J :§ s £ > t w ai

>» o D CD

1 -5- ^ .E »> >> >>

τι 2* qj "S

X 5? .lii 1

“ X 8- .E ^ 10 13 e C

.E c .E to tz c co ·= 'E ‘c c t o o Ξ !E w <o o t— t t c 0. = tu E. >, = <λ <- _ οί>«2·>ρίί5 o..

0 S-Oo^c'oo-m.E

S a äig ö a a.E e -c

3 ^ 2 2 aa|^ E

3 -gE§.-g2255-i-|j ro ----------— “ f— Ύ— 04 CO ^ in CO O- CO O) T— T—

Claims (2)

96367

1. Biospesifinen moniparametrinen määritysmenetelmä, jossa käytetään ennakolta valmistettuja, eri luokkiin jaettuja ja eri analyyttejä edustavia mikropartikkeleita kiinteänä kantajana, jossa eri luokkiin kuuluvat mikropartikkelit on 5 päällystetty eri analyyttejä sitovilla biospesifisillä reagensseilla, jossa mikropartikkeleihin on liitetty niiden tunnistamista varten yksi tai useampia fluoresoivia väriaineita Dk yhtenä tai useampana pitoisuutena partikkeliluokasta riippuen, jossa menetelmässä 10 - sekoitetaan eri luokkiin kuuluvat mikropartikkelit ja lisätään analysoitava näyte seokseen ja lisätään seokseen fotoluminesenssia antavalla leimalla F leimatut biospesifiset reagenssit, ja - aktivoidaan fluoresoivat väriaineet Dk ja 15 fotoluminesenssia antavat leimat F, ja - mitataan aikaerotteisella fluorometrillä mikropartikkelien väriaineen D*. fluoresenssin voimakkuus mikropartikkeliluokan tunnistamiseksi ja leiman F fotoluminesenssin voimakkuus eri analyyttimäärien 20 määrittämiseksi, tunnettu siitä, että fluoresoiviksi väriaineiksi on valittu yksi tai useampi seuraavien tetrapyrroli-yhdisteluokkien johdannaisista: porfyriinit, kloriinit, bakteriokloriinit, klorofyllit, purpuriinit, 25 feoforbidit, ftalosyaniinit ja naftalosyaniinit, jolloin valituilla väriaineilla Dk on - yhteinen fluoresenssin viritysaallonpituus, ja - erilliset kapeat toisistaan helposti spektrometrisesti erottuvat fluoresenssin emissiokaistat, ja 30. niiden fluoresenssin viritystilojen purkautumisaika on lyhyt verrattuna fotoluminoivan leiman F emission purkautumisaikaan.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, jossa fluoresoivina yhdisteinä käytetään yhtä tai useampaa 96367 seuraavista tetrapyrroliyhdisteiden johdannaisista: 1) deuteroporfyriini IX, 2) mesoporfyriini IX, 3) protoporfyriinin (IX) dimetyyliesteri, 4) oktaetyyliporfiini, 5) tetrafenyyliporfiini, 6) 5 tetra-(2-metoksi)-fenyyliporfiini, 7) koproporfyriinin dimetyyliesterin kloriini 8) koproporfyriinin dimetyyliesterin bakteriokloriini, 9) alumiiniftalosyaniini, 10) sinkkiftalosyaniini. 96367