FI94421B - Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisten peptidien valmistamiseksi - Google Patents

Description

, 94421

Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisten peptidien valmistamiseksi Tämä keksintö koskee menetelmää terapeuttisesti 5 aktiivisten peptidien valmistamiseksi, joilla on kaava (I) : Y-Ser-R2-Glu-Pro-Pro-Ile-Ser-Leu-Asp-Leu-Thr-Phe-His-Leu-Leu-Arg-Glu-Val-Leu-His-Rjj-RH-R^-Ala-R^-Gln-Leu-Ala-Gln-Gln-Ala-His-Ser-Asn-Arg-Lys-Leu-R^-Rjg-lle-RH-NH^ jossa Y on vety tai asetyyli, R2 on Glu tai Gin, R21 on Met tai 10 Nle, R22 on Ala tai Thr, R23 on Arg tai Lys, R25 on Glu tai

Asp, R38 on Met tai Leu, R39 on Glu tai Asp, R^ on Ile tai

Ala, kuitenkin edellyttäen, että N-päätteen 3 aminohappoa voidaan poistaa, tai näiden peptidien ei-myrkyllisten ad-ditiosuolojen valmistamiseksi. Keksintö koskee siten mene-15 telmää hentetrakontapeptidin CRF analogien valmistamiseksi. Kuvataan myös näitä CRF-analogeja sisältäviä farmaseuttisia koostumuksia sekä menetelmiä nisäkkäiden hoitamiseksi näitä CRF-analogeja käyttäen.

Keksinnön tausta 20 Kokeelliset ja kliiniset havainnot ovat tukeneet sitä käsitystä, että alanäkökukkula esittää keskeistä osaa aivolisäkkeen etulohkon kortikotropiinia erittävien solujen eritysfunktioiden säätelyssä. Yli 25 vuotta sitten Guillemin, Rosenberg ja Saffran ja Schally osoittivat toi-25 · sistaan riippumatta tekijöiden läsnäolon alanäkökukkulas-sa, jotka lisäsivät aivolisäkkeen ACTH-erityksen nopeutta inkuboituina ia vitro tai elinviljelmässä pidettyinä. Mikään karakterisoiduista eritystä lisäävistä tekijöistä ei täyttänyt fysiologiselle kortikotropiinia vapauttavalle 30 tekijälle (CRF:lie) asetettuja kriteereitä, kunnes lampaan CRF (oCRF) karakterisoitiin v. 1981 ja, kuten on julkistettu US-patenttijulkaisussa 4,415,558, sen kaava todettiin seuraavaksi: H-Ser-Gln-Glu-Pro-Pro-Ile-Ser-Leu-Asp-

Leu-Thr-Phe-His-Leu-Leu-Arg-Glu-Val-Leu-Glu-Met-Thr-Lys-35 Ala-Asp-Gln-Leu-Ala-Gln-Gln-Ala-His-Ser-Asn-Arg-Lys-Leu-

Leu-Asp-Ile-Ala-NH2.

2 94421

Sauvagiini on 40 jäännöstä käsittävä, amidoitu yleensä ottaen samankaltainen peptidi, joka eristettiin eteläamerikkalaisen sammakon Phvllomedusa sauvaaei ihosta.

Sitä karakterisoivat Erspamer et ai.. ja sitä kuvattiin 5 artikkelissa Regulatory Peptides 2 (1981) 1-13. Sauvagii-nin kaava on seuraava: pGlu-Gly-Pro-Pro-Ile-Ser-Ile-Asp-Leu-Ser-Leu-Glu-Leu-Leu-Arg-Lys-Met-Ile-Glu-Ile-Glu-Lys-Gln-Glu-Lys-Glu-Lys-Gln-Gln-Ala-Ala-Asn-Asn-Arg-Leu-Leu-Leu-Asp-Thr-Ile-NH2. Sauvagiinin ja oCRF:n on ilmoitettu 10 omaavan biologista aktiivisuutta niiden alentaessa nisäkkäiden verenpainetta ja stimuloidessa ACTH:n ja beta-en-dorfiinin eritystä.

Rotan CRF (rCRF) on eristetty, puhdistettu ja karakterisoitu hentetrakontapeptidiksi, jonka kaava on: H-15 Ser-Glu-Glu-Pro-Pro-Ile-Ser-Leu-Asp-Leu-Thr-Phe-His-Leu-

Leu-Arg-Glu-Val-Leu-Glu-Met-Ala-Arg-Ala-Glu-Gln-Leu-Ala-Gln-Gln-Ala-His-Ser-Asn-Arg-Lys-Leu-Met-Glu-Ile-Ile-NHj.

Sitä voidaan vaihtoehtoisesti kutsua rotan amuniiniksi.

Ihmisen CRF:n kaava on nyt määritetty samaksi kuin rCRF:n.

20 Synteettiset rCRF ja oCRF stimuloivat ACTH- ja beta-endor- fiiniaktiivisuuksia in vitro sekä in vivo ja alentavat huomattavasti verenpainetta pitkäksi aikajaksoksi.

Keksinnön mukaisesti saatavat CRF-agonistit, joiden . . asemassa 20 on His, omaavat yllättävästi paljon suuremman 25 ' aktiivisuuden kuin vastaavat tunnetut yhdisteet. Myöhemmin selostettavissa kokeissa testatulla yhdisteellä on siten paljon suurempi teho kuin US-patentissa 4,594,329 kuvatuilla yhdisteillä. EP-patentissa 67,608 esitetään lampaan CRF, jota käytettiin vakiona edellä mainituissa kokeissa.

30 EP-patentti 122,798 kuvaa rotan/ihmisen CRF, joka on pe-’ rustana tässä julkaisussa kuvatuille His20-substituution sisältäville yhdisteille ja joka aktiivisuudeltaan vastaa edellä mainittua kokeissa vakiona käytettyä yhdistettä. US-patentti 4,605,642 taas kohdistuu CRF-antagonisteihin, 35 joilla on vastakkainen biologinen aktiivisuus kuin esillä 3 94421 olevassa julkaisussa kuvatuilla yhdisteillä, jotka ovat CRF-agonisteja. CRF-antagonistit yksinkertaisesti sitoutuvat CRF-reseptoriin mutta eivät mitenkään aktivoi sitä biologisesti ja näin ollen ne inhiboivat CRF:n biologisen 5 aktiivisuuden eläimissä. US-patentti 4,605,642 ei siten ole relevantti tämän keksinnön kannalta.

Keksinnön yhteenveto Tämä keksintö koskee siis menetelmää näiden 41 jäännöstä käsittävien CRF-peptidien analogien valmistami- 10 seksi, joiden kaava on seuraava ja jotka omaavat ainakin oleellisesti saman biologisen aktiivisuuden edeltävissä suhteissa kuin natiivit peptidit: Y-Ser-R2-Glu-Pro-Pro-Ile-

Ser-Leu-Asp-Leu-Thr-Phe-His-Leu-Leu-Arg-Glu-Val-Leu-His- R2i~R22”R23"Ala-R25~Gln_I,eu”Ala-Gln-Gln-Ala-His-Ser-Asn-Arg- 15 Lys-Leu-R3g-R39-Ile-R4,-NH2, jossa Y on vety tai asetyyli, R2 on Glu tai Gin, R21 on Met tai Nle, R22 on Ala tai Thr, R^ on Arg tai Lys, R25 on Glu tai Asp, R38 on Met tai Leu, R39 on Glu tai Asp, R^ on Ile tai Ala, kuitenkin edellyttäen, että N-päätteen 3 aminohappoa voidaan poistaa.

20 Kuvataan myös farmaseuttisia koostumuksia, jotka sisältävät tällaisia CRF-analogeja tai niiden ei-myrkylli- siä additiosuoloja dispergoituneina farmaseuttisesti tai eläinlääketieteellisesti hyväksyttävään nestemäiseen tai . kiinteään kantajaan. Näitä peptidejä tai niiden farmaseut-• < 25 · tisesti tai eläinlääketieteellisesti hyväksyttäviä additiosuoloja voidaan antaa nisäkkäille, erityisesti ihmisille, ACTH:n, beta-endorfiinin, beta-lipotropiinin, muiden pro-opiomelanokortiinigeenituotte.iden ja kortikosteronin erityksen säätelemiseksi ja/tai verenpaineen alentamiseksi 30 ja/tai mielialaan, käyttäytymisfunktioihin ja mahalaukun ja suolen alueen funktioihin ja autonomisen hermoston aktiivisuuksiin vaikuttamiseksi. Lisäksi CRF-analogeja voidaan käyttää aivolisäke-, sydänverisuonisto-, maha-suolisto -alueen tai keskushermostofunktioiden tilan arvioimi-35 seksi.

4 94421

Yksityiskohtainen kuvaus edullisista suoritusmuodoista

Peptidien määrittelemiseksi käytetty nimistö on Schroderin ja Lubken kirjassa "The Peptides", Academic 5 Press, 1965, määrittämä, jolloin tavanomaisen esitystavan mukaisesti aminoryhmä on vasemmalla ja karboksyyliryhmä oikealla. Alfa-aminohappojäännöksien identifioimiseksi käytetään tavanomaisia kolmikirjainlyhenteitä ja jos aminohappo jäännöksellä on isomeerisiä muotoja, esitetty on 10 aminohapon L-muoto, ellei toisin vartavasten ole mainittu, esim. Ser = L-seriini, Nle * L-norleusiini, Nva = norva-liini, Har homoarginiini, Orn = ornitiini jne. Lisäksi käytetään seuraavia lyhenteitä: leu = joko L-leusiini tai C CH3-L-leusiini (CML) ja ala = joko L-alaniini tai C CH3-15 L-alaniini (CMA).

Keksinnön mukaisesti saadaan siis CRF-analogeja, joiden kaava on (I): Y-Ser-R2-Glu-Pro-Pro-Ile-Ser-Leu-Asp-Leu-Thr-Phe-His-Leu-Leu-Arg-Glu-Val-Leu-His-R21-R22-R23-Ala-R25-Gln-Leu-Ala-Gln-Gln-Ala-His-Ser-Asn-Arg-Lys-Leu-R38-R39-20 Ile-R41-NH2, jossa Y on vety tai asetyyli, R2 on Glu tai

Gin, R21 on Met tai Nle, R22 on Ala tai Thr, R23 on Arg tai

Lys, R25 on Glu tai Asp, R38 on Met tai Leu, R39 on Glu tai

Asp, R41 on Ile tai Ala, kuitenkin edellyttäen, että N-. päätteen 3 aminohappoa voidaan poistaa, sekä näiden pepti-25 dien ei-myrkyllisiä additiosuoloja.

Näitä analogeja pidetään ainakin yhtä tehokkaina kuin natiivi CRF. Nämä analogit voivat käsittää korkean alfa-heeliksimuodostuskyvyn omaavia jäännöksiä kuten: R3 on Ser, R2 on Gin tai Glu, R3 on Glu, R4 ja R5 ovat kumpikin 30 Pro, Re on Leu, Ru on Thr, R12 on Phe, R13 on His, Rn on Glu, R21 on Met tai Nle, R19 ja R37 ovat kumpikin Leu, R22 ja R41 on kumpikin Ala, R23 on Lys, R24 ja R28 ovat kumpikin Ala, R25 ja R39 ovat kumpikin Glu, R26 on Gin, R27 on Leu, R32 on His, R33 on Ser, R38 on Leu ja R40 on Ile.

94421

Kyseiset peptidit syntetisoidaan jollain sopivalla menetelmällä, kuten yksinomaan kiinteäfaasitekniikoilla, osittaisilla kiinteäfaasitekniikoilla, fragmenttikonden-saatiota käyttäen tai perinteistä lisäystä liuoksessa 5 käyttäen. Tiettyjä CRF-analogeja, jotka eivät sisällä D-isomeeri jäännöksiä tai ei-luontaisia aminohappo jäännöksiä, voidaan syntetisoida myös viimeaikoina kehitettyjä yhdis-telmä-DNA-tekniikoita käyttäen.

Synteesin yhdistelmä-DNA-tekniikoita käyttämällä 10 tulisi tämän patenttijulkaisun tarkoitusperiä silmälläpitäen ymmärtää tarkoittavan CRF-analogin haluttua muotoa koodaavan rakennegeenin sopivaa käyttämistä. Tällainen synteettinen CRF-peptidi voidaan saada transformoimalla mikro-organismi käyttäen ilmaisuvektoria, joka sisältää 15 promoottorin ja operaattorin ohella tällaisen rakennegeenin, ja indusoimalla tällainen transformoitu mikro-organismi ilmaisemaan CRF-peptidianalogi. Myös muuta eläin-edustajaa kuin ihmistä voidaan käyttää CRF-analogipeptidin tuottamiseksi geeniviljelyllä, jonka yleistekniikat ovat 20 alan ammattilaisille tuttuja. Esimerkiksi voidaan käyttää mikroruiskutusta alkioihin kuten on kuvattu patenttijulkaisuissa W083/01783, joka julkaistiin 26. toukokuuta 1983, ja W082/04443, joka julkaistiin 23. joulukuuta 1982. Synteettinen CRF-analogipeptidi otetaan sitten sopivalla 25: tavalla talteen eläimestä seerumista uuttamalla tai muulla vastaavalla tavalla.

Yhteistä peptidien kemiallisille synteeseille on eri aminohappo-osuuksien labiilien sivuketjuryhmien suojaaminen sopivilla suojaryhmillä, jotka estävät jonkin ke-30 miallisen reaktion tapahtumasta tuossa keskuksessa, kunnes kyseinen ryhmä sittemmin poistetaan. Tavallisesti yhteistä on myös aminohapon tai fragmentin alfa-aminoryhmän suojaus tuon ryhmittymän karboksyyliryhmän reagoidessa, minkä jälkeen alfa-aminon suojaryhmä poistetaan selektiivisesti, 35 jotta seuraava reaktio voi tapahtua tuossa keskuksessa.

6 94421 Täten tavanomaista on, että yhtenä vaiheena synteesiä valmistuu väliyhdiste, joka käsittää kunkin aminohappojäännöksen sijoitettuna toivomusten mukaiseen asemaansa pepti-diketjun sekvenssissä siten, että osa näistä jäännöksistä 5 käsittää sivuketjun suojaryhmiä.

Keksinnön mukaiselle menetelmälle peptidien valmistamiseksi on tunnusomaista, että (a) yksittäiset aminohapot tai lyhyitä peptidejä kytketään välituotteeksi, joka käsittää ainakin yhden suojaryhmän ja jolla on kaava (II) 10 tai on kaavan (II) mukaisen yhdisteen N-päätteestä lyhennetty versio, X'-Ser (X2) -R2(X5) -Glu(X5) -Pro-Pro-Ile-Ser (X2) -Leu-Asp(X5) -Leu-Thr (X2) -Phe-His(X) -Leu-Leu-Arg(X3) -Glu(X5) -Val-Leu-His(X)-R21-R22(5i2)-R23(X3 tai X6)-Ala-R^ (X5)-Gin (X4) -Leu-Ala-Gin (X4) -Gin (X4) -Ala-His (X) -Ser (X2) -Asn (X4) -Arg(X3) -15 Lys(X6) -Leu-R3g-R39(X5) -Ile-R^-X7, jossa R-ryhmät ovat kuten edellä on määritelty, X, X1, X2, X3, X4, X5 ja X6 kukin on joko vety tai suojaryhmä ja X7 on ankkuroiva sidos hartsi-kantajaan, (b) lohkaistaan suojaryhmä tai -ryhmät ja ankkuroiva sidos kaavan (II) mukaisesta välituotteesta, ja 20 (c) haluttaessa saatu peptidi muutetaan ei-myrkylliseksi additiosuoIäkseen.

X1 on siis joko vety tai alfa-aminon suojaryhmä.

X‘:n piiriin kuuluvat alfa-aminon suojaryhmät ovat alalla polypeptidien askel kerrallaan etenevässä synteesissä 25- käyttökelpoisiksi tiedetyt. X‘:n piiriin kuuluvia alfa-aminon suojaryhmäluokkia ovat (1) asyylityypin suojaryhmät, kuten formyyli, akrylyyli (Acr), bentsoyyli (Bz) ja ase-tyyli (Ac), joita käytetään edullisesti vain N-päädyssä, (2) aromaattiset uretaanityypin suojaryhmät, kuten bent-30 syylioksikarbonyyli (Z) ja substituoitu Z, kuten p-kloori-bentsyylioksikarbonyyli, p-nitrobentsyylioksikarbonyyli, p-bromibentsyylioksikarbonyyli,p-metoksibentsyylioksikar-bonyyli, (3) alifaattiset uretaanityypin suojaryhmät, kuten t-butyylioksikarbonyyli (BOC), di-isopropyylimetoksi-35 karbonyyli, isopropyylioksikarbonyyli, etoksikarbonyyli, 7 94421 allyylioksikarbonyyli, (4) sykloalkyyliuretaanityypin suo-jaryhmät, kuten fluorenyylimetyylioksikarbonyyli (FMOC), syklopentyylioksikarbonyyli, adamantyylioksikarbonyyli ja sykloheksyylioksikarbonyyli ja (5) tiouretaanityypin suo-5 jaryhmät kuten fenyylitiokarbonyyli. Edullinen alfa-aminon suojaryhmä on BOC.

X2 on Thr:n ja Ser:n hydroksyyliryhmän suojaryhmä ja se valitaan edullisesti seuraavista koostuvasta ryhmästä: asetyyli (Ac), bentsoyyli (Bz), tert-butyyli, trifenyyli-10 metyyli (trityyli), tetrahydropyranyyli, bentsyylieetteri (Bzl) ja 2,6-diklooribentsyyli (DCB). Edullisin suojaryhmä on Bzl. X2 voi olla vety, joka merkitsee suojaryhmän puuttumista hydroksyyliryhmästä.

X3 on Arg:n guanidinoryhmän suojaryhmä, joka vali-15 taan edullisesti seuraavista: nitro, p-tolueenisulfonyyli (Tos), Z, adamantyylioksikarbonyyli ja BOC, tai se on vety. Edullisin on Tos.

X4 on vety tai Asn:n tai Gin:n amidoryhmän suojaryhmä, edullisesti ksantyyli (Xan).

20 X5 on vety tai Asp:n tai Glu:n beta- tai gamma-kar- boksyyliryhmän esterin muodostava suojaryhmä, joka valitaan edullisesti seuraavista: bentsyyli-, 2,6-dikloori- bentsyyli-, metyyli-, etyyli- ja t-butyyliesteri. Edulli-, sin on OBzl.

25 X6 on vety tai Lys:n sivuketjuaminosubstituentin suojaryhmä. Sopivia sivuketjuaminon suojaryhmiä ovat esimerkiksi Z, 2-klooribentsyylioksikarbonyyli (2-C1-Z), Tos, t-amyylioksikarbonyyli (Aoc), BOC ja aromaattiset tai ali-faattiset uretaanityypin suojaryhmät edellä määritellyn 30 mukaisesti.

* Kun His on läsnä, X on vety tai imidatsolitypen suojaryhmä kuten Tos tai 2,4-dinitrofenyyli (DNP), ja kun läsnä on Tyr, X on vety tai hydroksyyliryhmän suojaryhmä kuten DCB. Kun läsnä on Met, rikki voi haluttaessa olla 35 suojattu hapella.

8 94421

Sivuketjuaminon suojaryhmän valinta ei ole kriittistä paitsi, että suojaryhmän tulisi olla sellainen, ettei se poistu poistettaessa alfa-aminojen suojaryhmiä synteesin aikana. Täten alfa-aminon suojaryhmä ja sivuketju-5 aminon suojaryhmä eivät voi olla identtiset.

X7 on ankkuroimissidos, jota käytetään kiinteäfaa-sisynteesissä ketjun kytkemiseksi kiinteään hartsikanta-jaan, edullisesti seuraavien kaavojen mukaiseen: -NH- bentshydryyliamiini-(BHA) -hartsikantaja ja -NH-parametyy-10 libentshydryyliamiini-(MBHA) -hartsikantaja. Irtilohkaisu BHA- tai MBHA-hartsista tuottaa suoraan CRF-analogiamidin. Käyttämällä tällaisen hartsin metyylijohdannaista voidaan muodostaa metyylisubstituoitu amidi, jota pidetään ei-sub-stituoituun amidiin nähden samanarvoisena.

15 Väliyhdisteen kaavassa ainakin yksi X, X1, X2, X3, X4, X5 tai X6 on suojaryhmä. Kulloiseksikin R-ryhmäksi valitusta nimenomaisesta aminohaposta riippuu, onko läsnä myös edellä spesifioidun mukaisesti ja alalla yleisesti tunnetun mukaisesti kiinnitetty suojaryhmä. Valittaessa 20 tiettyä nimenomaista sivuketjun suojaryhmää kyseisten pep tidien synteesissä käytettäväksi noudatetaan seuraavia sääntöjä: (a) suojaryhmän tulisi olla stabiili reagenssin suhteen sekä synteesin kussakin vaiheessa alfa-aminon suojaryhmän poistamiseksi valituissa reaktio-olosuhteissa, 25 (b) suojaryhmän tulisi säilyttää suojaavat ominaisuutensa eikä lohjeta pois kytkemisolosuhteissa, ja (c) sivuketjun suojaryhmän tulee olla poistettavissa, sitten kun halutun aminohapposekvenssin käsittävä synteesi on valmis, reaktio-olosuhteissa, jotka eivät muuta (saatua) peptidiket-30 jua.

Y:n edustamaksi ryhmäksi N-päätteessä edullinen on asetyyli. 1-10 aminohapon peptidissä, joka voidaan valinnaisesti sisällyttää mukaan vaikuttamatta tehoon kielteisesti, voidaan käyttää mitä tahansa aminohappoja, mutta 35 normaalisti käytettäisiin luontaisesti esiintyvien amino- , 94421 happojen L- tai D-muotoja. Lisäksi kuten edellä mainittu N-päätettä voidaan hieman lyhentää vaikuttamatta merkittävästi biologiseen tehokkuuteen.

Valmistettaessa kyseiset peptidit kemiallisella 5 synteesillä ne valmistetaan edullisesti käyttäen kiinteä-faasisynteesiä, kuten esimerkiksi Merrifieldin, J. Am. Chem. Soc. 85 (1964) 2149, kuvaamaa, vaikka muitakin samanarvoisia alalla tunnettuja kemiallisia synteesejä voidaan käyttää kuten aiemmin mainittu. Kiinteäfaasisynteesi 10 aloitetaan tavallisesti peptidin C-päätteestä kytkemällä suojattu alfa-aminohappo sopivaan hartsiin kuten yleisesti on esitetty US-patenttijulkaisussa 4,244,946, joka myönnettiin 21. tammikuuta 1981 Rivierille et ai. . ja joka julkaisu sisällytetään tähän viitteeksi. Tällainen lähtö-15 materiaali rCRF-analogeille voidaan valmistaa kiinnittämällä suojatun alfa-aminon käsittävä Ile BHA-hartsiin.

BOCrllä suojattu Ile kytketään BHA-hartsiin käyttäen metyleenikloridia ja dimetyyliformamidia (DMF). Kun BOC-Ile on kytketty hartsikantajaan, alfa-aminon suojaryh-20 mä poistetaan, kuten esim. käyttämällä trifluorietikkahap-poa (TFA) metyleenikloridissä, pelkkää TFA:ta tai HCl:n kerällä dioksaanissa. Edullisesti käytetään liuosta, jossa on -50 til.-% TFA:ta ja 0 - 5 paino-% 1,2-etaaniditiolia metyleenikloridissä. Suojaryhmä poistetaan lämpötilassa 25 noin 0 °C:sta huoneen lämpötilaan. Muitakin tavanomaisia pilkkomisreagensseja ja -olosuhteita spesifisten alfa-aminon suojaryhmien poistamiseksi voidaan käyttää, kuten on kuvattu teoksessa Schroder ja Lubke, "The Peptides", osa 1, Academic Press, 1965, ss. 72-75.

30 Kun Ile:stä on poistettu alfa-aminon suojaryhmä, - loput suojatun alfa-aminon ja sivuketjun käsittävät aminohapot kytketään vaihe kerrallaan halutussa järjestyksessä edellä määritellyn väliyhdisteen saamiseksi. Vaihtoehtona sille, että kukin aminohappo lisätään synteesissä 35 erikseen, joitakin niistä voidaan kytkeä toisiinsa ennen - 94421 10 lisäämistä kiinteäfaasireaktoriin. Tarkoituksenmukaisen kytkemisreagenssin valinta kuuluu alan taitamukseen. Erityisen soveliaita kytkemisreagensseja ovat N,N'-disyklo-heksyylikarbodi-imidi (DCCI) ja N,N'-di-isopropyylikarbo-5 di-imidi (DICI).

Kyseisten peptidien kiinteäfaasisynteesissä käytetyt aktivoivat reagenssit ovat peptidikemian alalla hyvin tunnettuja. Esimerkkejä sopivista aktivoivista reagens-seista ovat karbodi-imidit, kuten Ν,Ν'-di-isopropyylikar-10 bodi-imidi ja N-etyyli-N'-(3-dimetyyliaminopropyyli)kar- bodi-imidi. Muita aktivoimisreagensseja ja niiden käyttöä peptidien kytkemisessä kuvaavat Schroder ja Lubke, supra. luvussa III, sekä Kapoor, J. Pharm. Sei. 59 (1970) 1-27.

Kutakin suojattua aminohappoa tai aminohapposek-15 venssiä mitataan kiinteäfaasireaktoriin noin nelinkertai sena ylimääränä ja kytkeminen suoritetaan käyttäen väliaineena dimetyyliformamidi (DMF)/metyleenikloridia (1:1) tai DMF:ää tai metyleenikloridia pelkästään. Silloin kun kytkeminen suoritetaan manuaalisesti, kytkemisreaktion 20 onnistumista synteesin kussakin vaiheessa tarkkaillaan ninhydriinireaktion avulla, kuten ovat kuvanneet E. Kaiser et ai.. Anal. Biochem. 34 (1970) 595. Tapauksissa, joissa esiintyy epätäydellistä kytkeytymistä, kytkemismenettely toistetaan ennen alfa-aminon suojaryhmän poistamista ennen 25 seuraavan aminohapon kytkemistä. Kytkemisreaktiot voidaan suorittaa automaattisesti, kuten käyttäen automaattista Beckman 990 -syntetisaattoria ja esimerkiksi lähteessä Rivier et ai. . Biopolvmers 17 (1978) 1927-1938, kuvattua ohjelmaa.

30 Kun haluttu aminohapposekvenssi on saatu valmiiksi, välipeptidi poistetaan hartsikantajasta käsittelemällä jollain reagenssilla kuten nestemäisellä fluorivedyllä, joka ei ainoastaan irrota peptidiä hartsista vaan pilkkoo myös kaikki jäljellä olevat sivuketjun suojaryhmät X, X2, 35 X3, X4, X5 ja X6 ja alfa-aminon suojaryhmän X1 (paitsi jos se 11 94421 on asyyliryhmä, jonka on tarkoitus esiintyä lopullisessa peptidissä), peptidin saamiseksi. Käytettäessä pilkkomisessa fluorivetyä reaktioastiaan lisätään anisolia tai kresolia ja metyylietyylisulfidia sieppaajiksi. Kun sek-5 venssissä esiintyy Met, BOC-suojaryhmä voidaan pilkkoa trif luorietikkahappo (TFA) /etaaniditiolilla ennen peptidin irrottamista hartsista mahdollisen S-alkyloitumisen estämiseksi .

Keksinnön mukaisesti saadulla CRF-analogilla, jonka 10 asemassa 20 on His, on lähes kuusikertainen biologinen teho verrattuna vastaavaan luonnossa esiintyvään yhdisteeseen, kuten alla esitettävistä koetuloksista ilmenee. Näiden koetulosten perusteella on selvää, että ainakin rotan/ ihmisen ja lampaan CRF-analogien, joiden asemissa 20 on 15 His, biologinen teho on merkittävästi parempi kuin vastaavien luonnollisten yhdisteiden. Kokeissa mitattiin yhdisteen kykyä stimuloida ACTH-eritys esimerkissä 3 kuvatulla tavalla käyttäen standardina EP-patenttijulkaisussa 67,608 esitettyä oCRF:ää. Tulokset on esitetty seuraavassa taulu-20 kossa.

ACTH pitoisuus/ koodi käsittely (mg/ml) annostus___ 2,87 - A kontrolli oCRF(l-41)NH2 3,22 10X 80 pM B 0,0008 nM (177-58-20) 2$ ; 4,67 50 l C 0,004 5,54 10 2 nM D 0,02 7,28 60 4 E 0,1 9,13 10 50 pM F 0,5 8,41 50 i G 2,5 ^ 2.77 30 10 pM *H 0,0003 [AcPro\HisM,Nle21,Leu3']rCRF(4-4l) 4.83 10 100 pM I 0,001 (206-44-16) -0 5,85 30 l J 0,003 5,6829 (2,959-11,091) 7,16 10 1 nM K 0,01 7.77 30 l L 0,03 8.62 10 10 nM M 0,1 8.84 30 1 N 0,3 8.62 lOV 100 nM O 1 V τ 2,19 - *P kontrolli 35 - 94421 12

Seuraavat esimerkit esittelevät edullista menetelmää CRF-analogien syntetisoimiseksi kiinteäfaasitekniikal-la.

Esimerkki 1 5 [His1]-rCRF:n, jonka kaava on: H-Ser-Glu-Glu-Pro-

Pro-Ile-Ser-Leu-Asp-Leu-Thr-Phe-His-Leu-Leu-Arg-Glu-Val-Leu-His-Met-Ala-Arg-Ala-Glu-Gln-Leu-Ala-Gln-Gln-Ala-His-Ser-Asn-Arg-Lys-Leu-Met-Glu-Ile-Ile-NH2/ synteesi suoritetaan vaiheittain etenevällä tavalla MBHA-hydrokloridihart-10 sissa, jota on saatavana esimerkiksi valmistajalta Bachem,

Inc., ja jonka substituutioaste on noin 0,1 - 0,5 mmol/ grammaa hartsia. Synteesissä käytetään automaattista Beckman 990B -peptidisyntetisaattoria ja sopivaa ohjelmaa, edullisesti seuraavasti: 15

Vaihe Reagenssit ja suoritukset Sekoitusaika, min 1 CH2Cl2-pesu, 80 ml (2x) 3 2 Metanoli-pesu, 30 ml (2x) 3 3 CH2Cl2-pesu, 80 ml (3x) 3 20 4 50 % TFA + 5 % 1,2-etaani- ditioli/ CH2C12, 70 ml (2x) 12 5 Isopropanoli-pesu, 80 ml (2x) 3 6 TEA, 12,5 %/ CH2C12, 70 ml (2x) 5 7 Metanoli-pesu, 40 ml (2x) 2 2*5 8 CH2Cl2-pesu, 80 ml (3x) 3 9 BOC-aminohappo (10 mmol)/30 ml joko DMF tai CH2C12, riippuen kys. nimenomaisen suojatun aminohapon liukoisuudesta, (lx) + DCCI (10 mmol)/ CH2C12 30 - 300 BOC-Ile-kytkennän tuloksena saadaan substituutioksi noin 0,35 mmol Ile/grammaa hartsia. Kaikista käytettävistä liuottimista poistetaan huolellisesti kaasut, edullisesti johtamalla niihin inerttiä kaasua, esim. heliumia tai typ-3c peä, hapen puuttumisen varmistamiseksi, joka happi saattaisi epätoivottavasti hapettaa rikin Met-jäännöksessä.

13 94421

Suojaryhmän poiston ja neutraloinnin jälkeen pep-tidiketjua rakennetaan vaihe kerrallaan hartsiin. Yleensä käytetään 1-2 nunol BOC:llä suojattua aminohappoa mety-leenikloridissa kohden grammaa hartsia, sekä yksi ekviva-5 lentti 2 M DCCI-liuosta metyleenikloridissa, kahden tunnin reaktioajalla. Jos kytkettävänä on BOC-Arg(Tos), käytetään 50 %:sen DMF/metyleenikloridin seosta. Ser:n ja Thr:n si-vuketjuhydroksyylin suojaryhmänä käytetään Bzlrää. Asn:n tai Gin:n karboksyylipäätteen aktivoimiseksi käytetään p-10 nitrofenyyliesteriä (ONp), ja esimerkiksi BOC-Asn(ONp) kytketään yön yli kestävässä reaktiossa käyttäen yksi ekvivalentti H0Bt:tä 50 % DMF/metyleenikloridi seoksessa. Asn:n tai Gin:n amidoryhmä suojataan Xan:llä käytettäessä DCCI-kytkemistä aktivoitu esteri -menetelmän asemesta. 2-15 Cl-Z:aa käytetään suojaryhmänä Lys-sivuketjulle. Tos:ia käytetään Arg:n guanidinoryhmän ja His:n imidatsoliryhmän suojaamiseksi ja Glu:n tai Asp:n sivuketjukarboksyyliryhmä suojataan 0Bzl:llä. Synteesin päättyessä on saatu seuraava koostumus: B0C-Ser(Bzl)-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Pro-Pro-Ile- 20 Ser(Bzl)-Leu-Asp(OBzl)-Leu-Thr(Bzl)-Phe-His(Tos)-Leu-Leu-

Arg(Tos)-Glu(OBzl)-Val-Leu-His(Tos)-Met-Ala-Arg(Tos)-Ala-Glu( OBzl )-Gln( Xan) -Leu-Ala-Gln( Xan) -Gln( Xan) -Ala-His (Tos) -Ser(Bzl)-Asn(Xan)-Arg(Tos)-Lys(2-C1-Z)-Leu-Met-Glu(OBzl)-Ile-Ile-hartsikantaja. Xan on voinut poistua osittain tai > 25- täysin alfa-aminon suojaryhmän poistamiseksi käytetyssä TFA-käsittelyssä.

Saadun suojatun peptidi-hartsin irrottamiseksi ja suojaryhmien poistamiseksi sitä käsitellään liuoksella, jossa on grammaa peptidi-hartsia kohden 1,5 ml anisolia, 30 0,5 ml metyylietyylisulfidia ja 15 ml fluorivetyä (HF), ensin -20 eC:ssa 20 minuutin ajan ja sitten 0 °C:ssa . tunnin ajan. Kun HF on poistettu tehokkaassa tyhjössä, hartsi-peptidiä pestään vuorotellen kuivalla dietyylieet-terillä ja kloroformilla, minkä jälkeen peptidejä uutetaan 35 etikkahapon 2 N vesiliuoksella, josta on kaasut poistettu, ja ne hartsista suodattamalla erotetaan.

14 94421

Peptidiä puhdistetaan geelipermeaatioteknisesti, ja sen jälkeen puolipreparatiivisella HPLC:llä kuten on kuvattu julkaisuissa Rivier et ai. . ""Peptides: Structure and Biological Function", 1979, ss. 125-128, ja Rivier et 5 al.. J. Chromatoar. (1983). Kromatografiafraktioita tarkkaillaan huolellisesti HPLCrllä, ja vain huomattavan puhtaat fraktiot yhdistetään.

Sen tutkimiseksi, päästiinkö täsmällisesti kyseiseen sekvenssiin, rCRF-analogi hydrolysoitiin suljetuissa, 10 ilmasta tyhjäksi imetyissä koeputkissa, jotka sisälsivät vakiolämpötilassa kiehuvaa HCl:ää, 3 mikrolitraa tioglyko-lia/ml ja 1 nmol Nle:tä (sisäisenä standardina), 9 tunnin ajan 140 °C:ssa. Hydrolysaattien aminohappoanalyyseissä Beckman 121 MB -aminohappoanalysaattorilla saatiin seuraa-15 vat aminohapposuhteet: Asx (1,8), Thr (0,9), Ser (3,1),

Glx (7,9), Pro (2,2), Ala (3,9), Vai (0,9), Met (1,8), Ile (2.8) , Leu (6,9), Phe (0,8), Lys (1,0), His (2,9) ja Arg (2.9) , mikä varmistaa, että oli saatu kyseinen 41 jäännöksen peptidirakenne.

20 Esimerkki 2 (ei keksinnnön mukainen)

Synteettinen peptidi, jonka kaava on: H-Ser-Gln-Glu-Pro-Pro-Ile-Ser-Leu-Asp-Leu-Thr-Phe-His-Leu-Leu-Arg-Glu-Met-Leu-His-Met-Ala-Lys-Ala-Glu-Gln-Glu-Ala-Glu-Gln-Ala-Ala-Leu-Asn-Arg-Leu-Leu-Leu-Glu-Glu-Ala-NH2, synteti-^5 soitiin käyttäen yleensä ottaen esimerkissä 1 esitellyn mukaista menettelyä.

Peptidiä puhdistettiin esimerkissä 1 esitetyllä tavalla. Aminohappoanalyysissa todettiin odotusten mukaiset aminohapposuhteet.

30 Esimerkki 3 • .1.1 lii -

Tutkitaan esimerkin 1 mukaisesti valmistetun synteettisen peptidin ja synteettisen oCRF:n vaikutuksia ACTH- ja beta-endorfiini-eritykseen in vitro ja myös in vivo. Synteettisen oCRF:n tehoa stimuloida viljeltyjen 35 rotan aivolisäkesolujen ACTH-ja beta-endorfiinieritystä 15 944 21 mitataan käyttäen menettelyä, joka on yleisesti esitelty julkaisussa Endocrinology 91 (1972) 562. Puolimaksimaali-sia vasteita todetaan peptidin pitoisuuksissa, jotka ovat hyvin huomattavasti alhaisempia kuin ne synteettisen oCRF-5 :n pitoisuudet noin 250 pM, jotka tarvitaan tähän vasteeseen pääsemiseksi. In vivo -testaus suoritetaan käyttäen julkaisussa C. Rivier et ai.. Science 218 (1982) 377, esitettyä yleismenettelyä, ja varmistutaan biologisesta tehosta .

10 Esimerkki 4 (ei keksinnön mukainen)

Syntetisoitiin peptidi [des-Ser^Glu2, Ile33, Asn36]-rCRF, jonka kaava on: H-Glu-Pro-Pro-Ile-Ser-Leu-Asp-Leu-Thr-Phe-His-Leu-Leu-Arg-Glu-Val-Leu-Glu-Met-Ala-Arg-Ala-Glu-Gln-Leu-Ala-Gln-Gln-Ala-His-Ile-Asn-Arg-Asn-Leu-Met-15 Glu-Glu-Ile-NH2. Testaus esimerkissä 3 esitetyn yleismenet-telyn mukaan osoittaa, että sekin stimuloi ACTH- ja beta-END-LI-eritystä ja aiheuttaa verenpaineessa hyvin huomattavan laskun.

Esimerkki 5 (ei keksinnön mukainen) 20 Syntetisoitiin peptidi [His20, Gly26]-rCRF, jonka kaava on: H-Ser-Glu-Glu-Pro-Pro-Ile-Ser-Leu-Asp-Leu-Thr-

Phe-His-Leu-Leu-Arg-Glu-Val-Leu-His-Met-Ala-Arg-Ala-Glu-Gly-Leu-Ala-Gln-Gln-Ala-His-Ser-Asn-Arg-Lys-Leu-Met-Glu-Ile-Ile-NH2. Testaus esimerkissä 3 esitetyn yleismenettelyn 25 mukaan osoittaa, että sekin stimuloi ACTH- ja beta-END-LI-eritystä ja aiheuttaa verenpaineessa hyvin huomattavan laskun.

Esimerkki 6 (ei keksinnön mukainen)

Syntetisoitiin peptidi [Asetyyli-Gly1, Ile33, Glu40]-30 rCRF, jonka kaava on: Ac-Gly-Glu-Glu-Pro-Pro-Ile-Ser-Leu-Asp-Leu-Thr-Phe-His-Leu-Leu-Arg-Glu-Val-Leu-Glu-Met-Ala-Arg-Ala-Glu-Gln-Leu-Ala-Gln-Gln-Ala-His-Ile-Asn-Arg-Lys-Leu-Met-Glu-Glu-Ile-NH2. Testaus esimerkissä 3 esitetyn yleismenettelyn mukaan osoittaa, että sekin stimuloi ACTH-35 ja beta-END-LI-eritystä ja aiheuttaa verenpaineessa hyvin huomattavan laskun.

94421 16

Esimerkki 7 (ei keksinnön mukainen)

Syntetisoitiin peptidi [Met14,24, Arg21]-rCRF, jonka kaava on: H-Ser-Glu-Glu-Pro-Pro-lle-Ser-Leu-Asp-Leu-Thr-

Phe-His-Met-Leu-Arg-Glu-Val-Leu-Glu-Arg-Ala-Arg-Met-Glu-5 Gln-Leu-Ala-Gln-Gln-Ala-His-Ser-Asn-Arg-Lys-Leu-Met-Glu-

Ile-Ile-NH2. Testaus esimerkissä 3 esitetyn yleismenettelyn mukaan osoittaa, että sekin stimuloi ACTH- ja beta-END-LI-eritystä ja aiheuttaa verenpaineessa hyvin huomattavan laskun.

10 Esimerkki 8 (ei keksinnön mukainen)

Syntetisoitiin peptidi [Akrylyyli-Val1, Ser2, Arg21]-rCRF, jonka kaava on: Acr-Val-Ser-Glu-Pro-Pro-Ile-Ser-Leu-Asp-Leu-Thr-Phe-His-Leu-Leu-Arg-Glu-Val-Leu-Glu-Arg-Ala-Arg-Ala-Glu-Gln-Leu-Ala-Gln-Gln-Ala-His-Ser-Asn-Arg-Lys-15 Leu-Met-Glu-lle-Ile-NH2. Testaus esimerkissä 3 esitetyn yleismenettelyn mukaan osoittaa, että sekin stimuloi ACTH-ja beta-END-LI-eritystä ja aiheuttaa verenpaineessa hyvin huomattavan laskun.

Esimerkki 9 (ei keksinnön mukainen) 20 Syntetisoitiin peptidi [Glu9, His20, Nle21, Glu29,

Ile33]-rCRF, jonka kaava on: H-Ser-Glu-Glu-Pro-Pro-Ile-Ser-Leu-Glu-Leu-Thr-Phe-His-Leu-Leu-Arg-Glu-Val-Leu-His-Nle-Ala-Arg-Ala-Glu-Gln-Leu-Ala-Glu-Gln-Ala-His-Ile-Asn-Arg-Lys-Leu-Met-Glu-Ile-Ile-NH2. Testaus esimerkissä 3 esitetyn 25 yleismenettelyn mukaan osoittaa, että sekin stimuloi ACTH- ja beta-END-LI-eritystä ja aiheuttaa verenpaineessa hyvin huomattavan laskun suuremmassa määrin kuin rCRF.

Esimerkki 10 (ei keksinnön mukainen)

Syntetisoitiin peptidi [Bentsoyyli-Gly1, Nle12, His20, 30 Arg36]-rCRF, jonka kaava on: Bz-Gly-Glu-Glu-Pro-Pro-Ile-

Ser-Leu-Asp-Leu-Thr-Nle-His-Leu-Leu-Arg-Glu-Val-Leu-His-Met-Ala-Arg-Ala-Glu-Gln-Leu-Ala-Gln-Gln-Ala-His-Ser-Asn-Arg-Arg-Leu-Met-Glu-Ile-Ile-NH2. Testaus esimerkissä 3 esitetyn yleismenettelyn mukaan osoittaa, että sekin stimuloi 35 ACTH- ja beta-END-LI-eritystä ja aiheuttaa verenpaineessa hyvin huomattavan laskun.

- 94421 17

Esimerkki 11 (ei keksinnön mukainen)

Syntetisoitiin peptidi [Nle®, Ser11, Gly26, Leu32, Glu40]-rCRF, jonka kaava on: H-Ser-Glu-Glu-Pro-Pro-Ile-Ser-Nle-Asp-Leu-Ser-Phe-His-Leu-Leu-Arg-Glu-Val-Leu-Glu-Met-5 Ala-Arg-Ala-Glu-Gly-Leu-Ala-Gln-Gln-Ala-Leu-Ser-Asn-Arg-

Lys-Leu-Met-Glu-Glu-Ile-NH2. Testaus esimerkissä 3 esitetyn yleismenettelyn mukaan osoittaa, että sekin stimuloi ACTH-ja beta-END-LI-eritystä ja aiheuttaa verenpaineessa hyvin huomattavan laskun.

10 Esimerkki 12 (ei keksinnön mukainen)

Syntetisoitiin peptidi [Nle21, Har23, Asn36, Glu40, Nle41J-rCRF, jonka kaava on: H-Ser-Glu-Glu-Pro-Pro-Ile-Ser-Leu-Asp-Leu-Thr-Phe-His-Leu-Leu-Arg-Glu-Val-Leu-Glu-Nle-Ala-Har-Ala-Glu-Gln-Leu-Ala-Gln-Gln-Ala-His-Ser-Asn-Arg-15 Asn-Leu-Met-Glu-Glu-Nle-NH2. Testaus esimerkissä 3 esitetyn yleismenettelyn mukaan osoittaa, että sekin stimuloi ACTH-ja beta-END-LI-eritystä ja aiheuttaa verenpaineessa hyvin huomattavan laskun.

Esimerkki 13 (ei keksinnön mukainen) 20 Syntetisoitiin peptidi [Asetyyli-Pro4, His20, Glu29,40,

Asn36]-rCRF(4-41) , jonka kaava on: Ac-Pro-Pro-Ile-Ser-Leu-Asp-Leu-Thr-Phe-His-Leu-Leu-Arg-Glu-Val-Leu-His-Met-Ala-Arg-Ala-Glu-Gln-Leu-Ala-Glu-Gln-Ala-His-Ser-Asn-Arg-Asn-.> Leu-Met-Glu-Glu-Ile-NH2. Testaus esimerkissä 3 esitetyn 25 yleismenettelyn mukaan osoittaa, että sekin stimuloi ACTH- ja beta-END-LI-eritystä ja aiheuttaa verenpaineessa hyvin huomattavan laskun suuremmassa määrin kuin rCRF.

Esimerkki 14 (ei keksinnön mukainen)

Syntetisoitiin peptidi [Gin2, Orn23, Gly26, Glu29, -30 Leu38]-rCRF, jonka kaava on: H-Ser-Gln-Glu-Pro-Pro-lle-Ser-Leu-Asp-Leu-Thr-Phe-His-Leu-Leu-Arg-Glu-Val-Leu-Glu-Met-Ala-Orn-Ala-Glu-Gly-Leu-Ala-Glu-Gln-Ala-His-Ser-Asn-Arg-Lys-Leu-Leu-Glu-Ile-Ile-NH2. Testaus esimerkissä 3 esitetyn yleismenettelyn mukaan osoittaa, että sekin stimuloi ACTH-25 ja beta-END-LI-eritystä ja aiheuttaa verenpaineessa hyvin huomattavan laskun.

94421 18

Esimerkki 15 (ei keksinnön mukainen)

Syntetisoitiin peptidi [His20, Nle21, Leu32, Ile33, Glu40]-rCRF, jonka kaava on: H-Ser-Glu-Glu-Pro-Pro-Ile-Ser-Leu-Asp-Leu-Thr-Phe-His-Leu-Leu-Arg-Glu-Val-Leu-His-Nle-5 Ala-Arg-Ala-Glu-Gln-Leu-Ala-Gln-Gln-Ala-Leu-Ile-Asn-Arg-

Lys-Leu-Met-Glu-Glu-Ile-NH2. Testaus esimerkissä 3 esitetyn yleismenettelyn mukaan osoittaa, että sekin stimuloi ACTH-ja beta-END-LI-eritystä ja aiheuttaa verenpaineessa hyvin huomattavan laskun suuremmassa määrin kuin rCRF.

10 Esimerkki 16 (ei keksinnön mukainen)

Syntetisoitiin peptidi [His20, Arg21, Leu32, Ile33]-rCRF, jonka kaava on: H-Ser-Glu-Glu-Pro-Pro-Ile-Ser-Leu-Asp-Leu-Thr-Phe-His-Leu-Leu-Arg-Glu-Val-Leu-His-Arg-Ala-Arg-Ala-Glu-Gln-Leu-Ala-Gln-Gln-Ala-Leu-Ile-Asn-Arg-Lys-15 Leu-Met-Glu-Ile-Ile-NH2. Testaus esimerkissä 3 esitetyn yleismenettelyn mukaan osoittaa, että sekin stimuloi ACTH-ja beta-END-LI-eritystä ja aiheuttaa verenpaineessa hyvin huomattavan laskun suuremmassa määrin kuin rCRF.

Esimerkki 17 (ei keksinnön mukainen) 20 Syntetisoitiin peptidi [His19, Ala20, Arg21, Glu28,

Ile39]-sauvagiini, jonka kaava on: pGlu-Gly-Pro-Pro-Ile-

Ser-Ile-Asp-Leu-Ser-Leu-Glu-Leu-Leu-Arg-Lys-Met-Ile-His-Ala-Arg-Lys-Gln-Glu-Lys-Glu-Lys-Glu-Gln-Ala-Ala-Asn-Asn-. Arg-Leu-Leu-Leu-Asp-Ile-Ile-NH2. Testaus esimerkissä 3 esi- 25 tetyn yleismenettelyn mukaan osoittaa, että sekin stimuloi ACTH- ja beta-END-LI-eritystä ja aiheuttaa verenpaineessa hyvin huomattavan laskun.

Esimerkki 18 (ei keksinnön mukainen)

Syntetisoitiin synteettinen peptidi, jonka kaava 30 on: H-Ser-Gln-Glu-Pro-Pro-Ile-Ser-Leu-Asp-Leu-Thr-Phe-His-

Leu-Leu-Arg-Glu-Met-Leu-His-Arg-Ala-Lys-Ala-Glu-Gly-Glu-Ala-Glu-Gln-Ala-Ala-Leu-Asn-Arg-Leu-Leu-Leu-Glu-Glu-Ala-NH2, käyttäen yleensä ottaen esimerkissä 1 esitettyä menettelyä. Testaus esimerkissä 3 esitetyn yleismenettelyn mu-33 kaan osoittaa, että sekin stimuloi ACTH- ja beta-END-LI- 94421 19 eritystä ja aiheuttaa verenpaineessa hyvin huomattavan laskun.

Esimerkki 19 (ei keksinnön mukainen)

Syntetisoitiin peptidi, jonka kaava on: H-Ser-Gln-5 Glu-Pro-Pro-Ile-Ser-Leu-Glu-Leu-Thr-Phe-His-Leu-Leu-Arg-

Glu-Nle-Leu-His-Arg-Ala-Lys-Ala-Glu-Gln-Glu-Ala-Glu-Gln-Ala-Ala-Leu-Asn-Arg-Leu-Leu-Leu-Glu-Glu-Ala-NH2. Testaus esimerkissä 3 esitetyn yleismenettelyn mukaan osoittaa, että sekin stimuloi ACTH- ja beta-END-LI-eritystä ja ai-10 heuttaa verenpaineessa hyvin huomattavan laskun.

Esimerkki 20 (ei keksinnön mukainen)

Syntetisoitiin peptidi, jonka kaava on: H-Ser-Gln-Glu-Pro-Pro-Ile-Ser-Leu-Asp-Leu-Thr-Phe-His-Leu-Leu-Arg-Glu-Nle-Leu-His-Nle-Ala-Lys-Ala-Glu-Gln-Glu-Ala-Glu-Gln-15 Ala-Ala-Leu-Asn-Arg-Leu-Leu-Leu-Glu-Glu-Ala-NH2. Testaus esimerkissä 3 esitetyn yleismenettelyn mukaan osoittaa, että sekin stimuloi ACTH- ja beta-END-LI-eritystä ja aiheuttaa verenpaineessa hyvin huomattavan laskun.

Esimerkki 21 (ei keksinnön mukainen) 20 Syntetisoitiin peptidi, jonka kaava on: H-Ser-Gln-

Glu-D-Pro-Pro-Ile-Ser-Leu-Asp-Leu-Thr-Phe-His-Leu-Leu-Arg-Glu-Nle-Leu-Glu-Nle-Ala-Lys-Ala-Glu-Gln-Glu-Ala-Glu-Gln-Ala-Ala-Ile-Asn-Arg-Asn-Leu-Leu-Glu-Glu-Ala-NH2. Testaus esimerkissä 3 esitetyn yleismenettelyn mukaan osoittaa, *25 että sekin stimuloi ACTH- ja beta-END-LI-eritystä ja ai heuttaa verenpaineessa hyvin huomattavan laskun.

Esimerkki 22 (ei keksinnön mukainen)

Syntetisoitiin peptidi, jonka kaava on: H-Ser-Gln-D-Tyr-Pro-Pro-Ile-Ser-Leu-Asp-Leu-Thr-Phe-His-Leu-Leu-Arg-βΟ Glu-Nle-Leu-His-Nle-Ala-Lys-Ala-Gly-Gln-Glu-Ala-Glu-Gln-

Ala-Ala-Leu-Asn-Arg-Leu-Leu-Leu-Glu-Glu-Ala-NH2. Testaus esimerkissä 3 esitetyn yleismenettelyn mukaan osoittaa, että sekin stimuloi ACTH- ja beta-END-LI-eritystä ja aiheuttaa verenpaineessa hyvin huomattavan laskun.

94421 20

Esimerkki 23 (ei keksinnön mukainen)

Syntetisoitiin peptidi, jonka kaava on: H-Ser-Glu-Glu-Pro-Pro-Ile-Ser-Leu-Asp-Leu-Thr-Leu-Glu-Met-Leu-Arg-Glu-Met-Leu-Glu-Met-Glu-Orn-Met-Glu-Lys-Glu-Ala-Glu-Gln-5 Ala-Ala-Leu-Asn-Arg-Leu-Leu-Leu-Glu-Glu-Ala-NH2. Testaus esimerkissä 3 esitetyn yleismenettelyn mukaan osoittaa, että sekin stimuloi ACTH- ja beta-END-LI-eritystä ja aiheuttaa verenpaineessa hyvin huomattavan laskun.

Esimerkki 24 (ei keksinnön mukainen) 10 Syntetisoitiin synteettinen peptidi, jonka kaava on: H-Ser-Gln-Glu-Pro-Pro-Ile-Ser-Leu-Asp-Leu-Thr-Phe-His-Met-Leu-Arg-Glu-Met-Leu-His-Arg-Ala-Lys-Met-Glu-Gly-Glu-Ala-Glu-Gln-Ala-Leu-Ile-Asn-Arg-Asn-Leu-Leu-Glu-Glu-Ala-NH2. Testaus esimerkissä 3 esitetyn yleismenettelyn mukaan 15 osoittaa, että sekin stimuloi ACTH- ja beta-END-LI-eritys tä ja aiheuttaa verenpaineessa hyvin huomattavan laskun.

Esimerkki 25 (ei keksinnön mukainen)

Syntetisoitiin peptidi, jonka kaava on: H-Ser-Gln-Glu-Pro-Pro-Ile-Ser-Leu-Asp-Leu-Thr-Leu-Glu-Leu-Leu-Arg-2 0 Glu-Met-Leu-Glu-Arg-Ala-Lys-Ala-Glu-Gln-Glu-Ala-Glu-Gln-

Ala-Ala-Leu-Asn-Arg-Asn-Tyr-Leu-Glu-Glu-Ala-NH2. Testaus esimerkissä 3 esitetyn yleismenettelyn mukaan osoittaa, että sekin stimuloi ACTH- ja beta-END-LI-eritystä ja aiheuttaa verenpaineessa hyvin huomattavan laskun.

• < ^5 Esimerkki 26 (ei keksinnön mukainen)

Syntetisoitiin peptidi, jonka kaava on: H-Ser-Gln-Glu-Pro-Pro-Ile-Ser-Leu-Asp-CML-Thr-Phe-His-CML-Leu-Arg-Glu-Met-CML-Glu-Met-Ala-Lys-Ala-Glu-Gln-CML-Ala-Glu-Gln-Ala-Ala-CML-Asn-Arg-Asn-Leu-CML-Glu-Glu-Ala-NH2. Testaus J3p esimerkissä 3 esitetyn yleismenettelyn mukaan osoittaa, ‘ että sekin stimuloi ACTH- ja beta-END-LI-eritystä ja ai heuttaa verenpaineessa hyvin huomattavan laskun.

Esimerkki 27 (ei keksinnön mukainen)

Syntetisoitiin peptidi, jonka kaava on: H-Ser-Gln-25 Glu-Pro-Pro-Ile-Ser-Leu-Asp-CML-Thr-Phe-His-Leu-CML-Arg- 94421 21

Glu-Met-Leu-His-Met-CMA-Lys-Ala-Glu-Gln-CML-Ala-Glu-Gln-Ala-CMA-Leu-Asn-Arg-Leu-CML-Leu-Glu-Glu-CMA-NH2. Testaus esimerkissä 3 esitetyn yleismenettelyn mukaan osoittaa, että sekin stimuloi ACTH- ja beta-END-LI-eritystä ja ai-5 heuttaa verenpaineessa hyvin huomattavan laskun.

Esimerkki 28 (ei keksinnön mukainen)

Syntetisoitiin peptidi, jonka kaava on: H-D-Tyr-D-Pro-Pro-Ile-Ser-Leu-Asp-Leu-Thr-Phe-His-Leu-Leu-Arg-Glu-Nle-Leu-Glu-Arg-Ala-Lys-Ala-Glu-Gln-Glu-Ala-Glu-Gln-Ala-10 Ala-Leu-Asn-Arg-Leu-Leu-Leu-Glu-Glu-Ala-NH2. Testaus esimerkissä 3 esitetyn yleismenettelyn mukaan osoittaa, että se stimuloi ACTH- ja beta-END-LI-eritystä ja aiheuttaa samoin verenpaineessa hyvin huomattavan laskun.

Esimerkki 29 (ei keksinnön mukainen) 15 Syntetisoitiin peptidi, jonka kaava on: H-D-Pro-

Pro-Ile-Ser-Leu-Asp-Leu-Thr-Phe-His-Leu-Leu-Arg-Glu-Nle-Leu-His-Nle-Ala-Lys-Ala-Glu-Gln-Glu-Ala-Glu-Gln-Ala-Ala-Ile-Asn-Arg-Leu-Leu-Leu-Glu-Glu-Ala-NH2. Testaus esimerkissä 3 esitetyn yleismenettelyn mukaan osoittaa, että se 20 stimuloi ACTH- ja beta-END-LI-eritystä määrässä, joka vas taa noin 160 % oCRF:ää, ja aiheuttaa samoin verenpaineessa hyvin huomattavan laskun.

Esimerkki 30 (ei keksinnön mukainen)

Syntetisoitiin peptidi, jonka kaava on: H-Pro-Pro-*5 Ile-Ser-Leu-Asp-Leu-Thr-Leu-His-Leu-Leu-Arg-Glu-Met-Leu-

Glu-Met-Glu-Orn-Ala-Glu-Gln-Glu-Ala-Glu-Gln-Ala-Ala-Leu-Asn-Arg-Asn-Leu-Leu-Glu-Glu-Ala-NH2. Testaus esimerkissä 3 esitetyn yleismenettelyn mukaan osoittaa, että sekin stimuloi ACTH- ja beta-END-LI-eritystä ja aiheuttaa verenpaine neessa hyvin huomattavan laskun.

Esimerkki 31 (ei keksinnön mukainen)

Syntetisoitiin peptidi [His20, Asn36]-oCRF, jonka kaava on: H-Ser-Gln-Glu-Pro-Pro-Ile-Ser-Leu-Asp-Leu-Thr-Phe-His-Leu-Leu-Arg-Glu-Val-Leu-His-Met-Thr-Lys-Ala-Asp-3 5 Gln-Leu-Ala-Gln-Gln-Ala-His-Ser-Asn-Arg-Asn-Leu-Leu-Asp- 94421 22

Ile-Ala-NH2. Testaus esimerkissä 3 esitetyn yleismenettelyn mukaan osoittaa, että se stimuloi ACTH- ja beta-END-LI-eritystä ja aiheuttaa samoin verenpaineessa hyvin huomattavan laskun.

5 Esimerkki 32

Syntetisoitiin peptidi [His20, Nle2I]-oCRF, jonka kaava on: H-Ser-Gln-Glu-Pro-Pro-Ile-Ser-Leu-Asp-Leu-Thr-

Phe.-His-Leu-Leu-Arg-Glu-Val-Leu-His-Nle-Thr-Lys-Ala-Asp-Gln-Leu-Ala-Gln-Gln-Ala-His-Ser-Asn-Arg-Lys-Leu-Leu-Asp-10 Ile-Ala-NH2. Testaus esimerkissä 3 esitetyn yleismenettelyn mukaan osoittaa, että sekin stimuloi ACTH- ja beta-END-LI-eritystä ja aiheuttaa verenpaineessa hyvin huomattavan laskun.

Esimerkki 33 (ei keksinnön mukainen) 15 Syntetisoitiin peptidi [Nle18,21, Asn36]-oCRF, jonka kaava on: H-Ser-Gln-Glu-Pro-Pro-Ile-Ser-Leu-Asp-Leu-Thr-

Phe-His-Leu-Leu-Arg-Glu-Nle-Leu-Glu-Nle-Thr-Lys-Ala-Asp-Gln-Leu-Ala-Gln-Gln-Ala-His-Ser-Asn-Arg-Asn-Leu-Leu-Asp-Ile-Ala-NH2. Testaus esimerkissä 3 esitetyn yleismenettelyn 20 mukaan osoittaa, että sekin stimuloi ACTH- ja beta-END-LI-eritystä ja aiheuttaa verenpaineessa hyvin huomattavan laskun.

Esimerkki 34 . Syntetisoitiin peptidi [D-Pro4, His20]-oCRF(4-41) , *2b jonka kaava on: H-D-Pro-Ile-Ser-Leu-Asp-Leu-Thr-Phe-His-

Leu-Leu-Arg-Glu-Val-Leu-His-Met-Thr-Lys-Ala-Asp-Gln-Leu-Ala-Gln-Gln-Ala-His-Ser-Asn-Arg-Lys-Leu-Leu-Asp-Ile-Ala-NH2. Testaus esimerkissä 3 esitetyn yleismenettelyn mukaan osoittaa, että sekin stimuloi ACTH- ja beta-END-LI-eritys-30 tä ja aiheuttaa verenpaineessa hyvin huomattavan laskun.

‘ Esimerkki 35 (ei keksinnön mukainen)

Syntetisoitiin peptidi [Met14,24, CML33]-oCRF(3-41), jonka kaava on: H-Glu-Tyr-Pro-Pro-Ile-Ser-Leu-Asp-Leu-Thr-Phe-His-Met-Leu-Arg-Glu-Val-Leu-Glu-Met-Thr-Lys-Met-Asp-35 Gln-Leu-Ala-Gln-Gln-Ala-His-CML-Asn-Arg-Lys-Leu-Leu-Asp- 94421 23

Ile-Ala-NH2. Testaus esimerkissä 3 esitetyn yleismenettelyn mukaan osoittaa, että sekin stimuloi ACTH- ja beta-END-LI-eritystä ja aiheuttaa verenpaineessa hyvin huomattavan laskun.

5 Esimerkki 36 (ei keksinnön mukainen)

Syntetisoitiin peptidi [Nle18, Gly26, Asn36, Glu40]-oC-RF(2-41), jonka kaava on: H-Gln-Glu-Pro-Pro-Ile-Ser-Leu-Asp-Leu-Thr-Phe-His-Leu-Leu-Arg-Glu-Nle-Leu-Glu-Met-Thr-Lys-Ala-Asp-Gly-Leu-Ala-Gln-Gln-Ala-His-Ser-Asn-Arg-Asn-10 Leu-Leu-Asp-Glu-Ala-NH2. Testaus esimerkissä 3 esitetyn yleismenettelyn mukaan osoittaa, että sekin stimuloi ACTH-ja beta-END-LI-eritystä ja aiheuttaa verenpaineessa hyvin huomattavan laskun.

Esimerkki 37 (ei keksinnön mukainen) 15 Syntetisoitiin [ Arg21 ]-r CRF, jonka kaava on: H-Ser-

Glu-Glu-Pro-Pro-Ile-Ser-Leu-Asp-Leu-Thr-Phe-His-Leu-Leu-Arg-Glu-Val-Leu-Glu-Arg-Ala-Arg-Ala-Glu-Gln-Leu-Ala-Gln-Gln-Ala-His-Ser-Asn-Arg-Lys-Leu-Met-Glu-Ile-lle-NH2. Testaus esimerkissä 3 esitetyn yleismenettelyn mukaan osoit-20 taa, että sekin stimuloi ACTH- ja beta-END-LI-eritystä ja aiheuttaa verenpaineessa hyvin huomattavan laskun. Esimerkki 38 (ei keksinnön mukainen)

Syntetisoitiin [Asn^J-rCRF, jonka kaava on: H-Ser-Glu-Glu-Pro-Pro-Ile-Ser-Leu-Asp-Leu-Thr-Phe-His-Leu-Leu-25 Arg-Glu-Val-Leu-Glu-Met-Ala-Arg-Ala-Glu-Gln-Leu-Ala-Gln-

Gln-Ala-His-Ser-Asn-Arg-Asn-Leu-Met-Glu-Ile-Ile-NH2. Testaus esimerkissä 3 esitetyn yleismenettelyn mukaan osoittaa, että sekin stimuloi ACTH- ja beta-END-LI-eritystä ja aiheuttaa verenpaineessa hyvin huomattavan laskun.

.30 Esimerkki 39 (ei keksinnön mukainen) 4

Syntetisoitiin peptidi [Gly26]-rCRF, jonka kaava on: H-Ser-Glu-Glu-Pro-Pro-Ile-Ser-Leu-Asp-Leu-Thr-Phe-His-Leu-Leu-Arg-Glu-Val-Leu-Glu-Met-Ala-Arg-Ala-Glu-Gly-Leu-Ala-Gln-Gln-Ala-His-Ser-Asn-Arg-Lys-Leu-Met-Glu-Ile-Ile-NH2. 35 Testaus esimerkissä 3 esitetyn yleismenettelyn mukaan • 94421 osoittaa, että sekin stimuloi ACTH- ja beta-END-LI-eritystä ja aiheuttaa verenpaineessa hyvin huomattavan laskun.

Esimerkki 40 (ei keksinnön mukainen)

Syntetisoitiin [Leu32]-rCRF, jonka kaava on: H-Ser-5 Glu-Glu-Pro-Pro-Ile-Ser-Leu-Asp-Leu-Thr-Phe-His-Leu-Leu-

Arg-Glu-Val-Leu-Glu-Met-Ala-Arg-Ala-Glu-Gln-Leu-Ala-Gln-Gln-Ala-Leu-Ser-Asn-Arg-Lys-Leu-Met-Glu-Ile-Ile-NH2. Testaus esimerkissä 3 esitetyn yleismenettelyn mukaan osoittaa, että sekin stimuloi ACTH- ja beta-END-LI-eritystä ja 10 aiheuttaa verenpaineessa hyvin huomattavan laskun.

Esimerkki 41 (ei keksinnön mukainen)

Syntetisoitiin peptidi [Ile33]-rCRF, jonka kaava on: H-Ser-Glu-Glu-Pro-Pro-Ile-Ser-Leu-Asp-Leu-Thr-Phe-His-Leu-Leu-Arg-Glu-Val-Leu-Glu-Met-Ala-Arg-Ala-Glu-Gln-Leu-Ala-15 Gln-Gln-Ala-His-Ile-Asn-Arg-Lys-Leu-Met-Glu-Ile-Ile-NH2.

Testaus esimerkissä 3 esitetyn yleismenettelyn mukaan osoittaa, että sekin stimuloi ACTH- ja beta-END-LI-eritystä ja aiheuttaa verenpaineessa hyvin huomattavan laskun.

Esimerkki 42 (ei keksinnön mukainen) 20 Syntetisoitiin [Met24]-rCRF, jonka kaava on: H-Ser-

Glu-Glu-Pro-Pro-Ile-Ser-Leu-Asp-Leu-Thr-Phe-His-Leu-Leu-Arg-Glu-Val-Leu-Glu-Met-Ala-Arg-Met-Glu-Gln-Leu-Ala-Gln-Gln-Ala-His-Ser-Asn-Arg-Lys-Leu-Met-Glu-Ile-Ile-NH2. Testaus esimerkissä 3 esitetyn yleismenettelyn mukaan osoit-2*5 taa, että sekin stimuloi ACTH- ja beta-END-LI-eritystä ja aiheuttaa verenpaineessa hyvin huomattavan laskun.

Esimerkki 43 (ei keksinnön mukainen)

Syntetisoitiin [Met14]-rCRF, jonka kaava on: H-Ser-Glu-Glu-Pro-Pro-Ile-Ser-Leu-Asp-Leu-Thr-Phe-His-Met-Leu- 3.0 Arg-Glu-Val-Leu-Glu-Met-Ala-Arg-Ala-Glu-Gln-Leu-Ala-Gln-

Gln-Ala-His-Ser-Asn-Arg-Lys-Leu-Met-Glu-Ile-Ile-NH2. Testaus esimerkissä 3 esitetyn yleismenettelyn mukaan osoittaa, että sekin stimuloi ACTH- ja beta-END-LI-eritystä ja aiheuttaa verenpaineessa hyvin huomattavan laskun.

94421 25

Esimerkki 44 (ei keksinnön mukainen)

Syntetisoitiin peptidi, jonka kaava on: H-D-Tyr-Pro-Pro-Ile-Ser-Leu-Asp-Leu-Thr-Phe-His-Leu-Leu-Arg-Glu-Nle-Leu-His-Nle-Ala-Lys-Ala-Glu-Gly-Glu-Ala-Glu-Gln-Ala-5 Leu-Leu-Asn-Arg-Asn-Leu-Leu-Glu-Glu-Ala-NH2. Testaus esimerkissä 3 esitetyn yleismenettelyn mukaan osoittaa, että sekin stimuloi ACTH- ja beta-END-LI-eritystä ja aiheuttaa verenpaineessa hyvin huomattavan laskun.

Esimerkki 45 (ei keksinnön mukainen) 10 Syntetisoitiin peptidi, jonka kaava on: H-Pro-Pro-

Ile-Ser-Leu-Asp-Leu-Thr-Phe-His-Leu-Leu-Arg-Glu-Nle-Leu-His-Nle-Ala-Arg-Ala-Glu-Gln-Glu-Ala-Glu-Gln-Ala-Leu-Leu-Asn-Arg-Asn-Leu-Leu-Glu-Glu-Ala-NH2. Testaus esimerkissä 3 esitetyn yleismenettelyn mukaan osoittaa, että sekin sti-15 muloi ACTH- ja beta-END-LI-eritystä ja aiheuttaa verenpaineessa hyvin huomattavan laskun.

Esimerkki 46 (ei keksinnön mukainen)

Syntetisoitiin synteettinen peptidi, jonka kaava on: H-Ser-Gln-Glu-Pro-Pro-Ile-Ser-Leu-Asp-Leu-Thr-Phe-His-20 Met-Leu-Arg-Glu-Met-Leu-His-Met-Ala-Lys-Met-Glu-Gln-Glu-

Ala-Glu-Gln-Ala-Ala-Leu-Asn-Arg-Leu-Leu-Leu-Glu-Glu-Ala-NH2. Testaus esimerkissä 3 esitetyn yleismenettelyn mukaan osoittaa, että sekin stimuloi ACTH- ja beta-END-LI-eritys-. tä ja aiheuttaa verenpaineessa hyvin huomattavan laskun.

*2S Esimerkki 47 (ei keksinnön mukainen)

Syntetisoitiin synteettinen peptidi, jonka kaava on: H-Ser-Gln-Glu-Pro-Pro-Ile-Ser-Leu-Asp-Leu-Thr-Phe-His-Leu-Leu-Arg-Glu-Met-Leu-His-Arg-Ala-Lys-Ala-Glu-Gln-Glu-Ala-Glu-Gln-Ala-Ala-Ile-Asn-Arg-Leu-Leu-Leu-Glu-Glu-Ala-,30 NH2. Testaus esimerkissä 3 esitetyn yleismenettelyn mukaan osoittaa, että sekin stimuloi ACTH- ja beta-END-LI-eritys-tä ja aiheuttaa verenpaineessa hyvin huomattavan laskun.

CRF-analogit osoittavat sen laatuista verenpaineen alentamista, että ne mahdollisesti ovat erityisen arvok-35 kaita korkeaa verenpainetta käsittävien tilojen hoitami- 26 - 94421 seksi sekä myös tietyn tyyppisten kirurgisten toimenpiteiden kohteeksi joutuvien potilaiden hoitamiseksi.

CRF stimuloi perustavaa laatua olevalla tavalla aivolisäke-lisämunuaisen kuorikerros -akselia, ja CRF-ana-5 logit ovat oletettavasti hyödyllisiä tämän akselin funktioiden stimuloimiseksi joissain potilastyypeissä, joiden endogeeninen glukokortikoidituotanto on alhainen. Esimerkiksi CRF olisi arvatenkin hyödyllinen aivolisäke-lisämu-nuaisfunktion palauttamiseksi potilaissa, jotka ovat saa-10 neet eksogeenistä glukokortikoiditerapiaa ja joiden aivolisäke-lisämunuaisen kuorikerros -funktiot ovat jääneet alhaiselle tasolle.

Useimmilla muilla säätöpeptideillä on todettu olevan vaikutuksia keskushermostoon sekä maha-suolisto -15 alueeseen. Koska ACTH- ja beta-END-eritys on nisäkkään stressivasteen "sine qua non", ei ole yllättävää, että CRF:llä on merkittäviä vaikutuksia aivoihin elimistön stressivasteen välittäjänä. Täten CRF:lie tulisi niinikään löytyä käyttöä sekä normaalien yksilöiden että mieleltään 20 häiriintyneiden yksilöiden mielialan, oppimisen ja käyttäytymisen modifioinnissa. Koska CRF-analogit kohottavat ACTH-, beta-END-, beta-lipotropiinitasoja, muiden pro-opiomelanokortiinigeenituotteiden ja kortikosteronin tasoja, sen antoa voidaan käyttää niiden vaikutuksien indusoi- 4 25 miseksi aivoissa ja aivojen äärialueilla, jolloin tällä tavalla pyritään vaikuttamaan muistiin, mielialaan, kivun-tuntoon jne., ja spesifisemmin valppauteen, masennukseen ja/tai ahdistukseen. Esimerkiksi aivokammioihin annettuna CRF nostaa aktiviteettia ja parantaa oppimissuoritusta 30 rotissa ja saattaa siten toimia luontaisena stimulanttina.

CRF-analogeilla olisi oletettavasti käyttöä myös verenvirtauksen lisäämiseksi nisäkkäiden maha-suolisto -alueella, erityisesti ihmisissä ja muissa nisäkkäissä.

Kaikkien CRF-sukuisten peptidien on osoitettu laajentavan 35 suoliliepeen verisuonipetiä. Samoin oCRF inhiboi mahanes- 94421 27 teen tuotantoa ja niinikään CRF-analogien odotetaan olevan tehokkaita maha- ja pohjukaissuolihaavojen hoidossa niiden alentaessa mahanesteen tuotantoa ja/tai estäessä mahalaukun ja suolen alueen funktioita nisäkkäässä.

5 CRF-analogeja tai niiden ei-myrkyllisiä additiosuo- loja, yhdistettyinä farmaseuttisesti tai eläinlääketie-teellisesti hyväksyttävään kantajaan farmaseuttisen koostumuksen muodostamiseksi, voidaan antaa nisäkkäille, mukaanlukien ihmisille, joko laskimonsisäisesti, ihonalai-10 sesti, lihaksen sisäisesti, ihon kautta, esim. nenän sisäisesti, selkäytimen sisäisesti tai suun kautta. Peptidien puhtausasteen tulisi olla ainakin noin 90 % ja edullisesti niiden puhtausasteen tulisi olla ainakin noin 98 %; kuitenkin alhaisemmankin puhtauden omaavat yhdisteet 15 ovat tehokkaita, ja niitä voidaan aivan hyvin käyttää muilla nisäkkäillä kuin ihminen. Tämä puhtausaste tarkoittaa, että kohdepeptidi muodostaa mainitun paino-%-osuuden kaikista läsnäolevista samankaltaisista peptideistä ja peptidifragmenteista. Lääkäri voi antaa näitä peptidejä 20 ihmisille verenpaineen alentamiseksi tai endogeenisen glu-kokortikoidituotannon stimuloimiseksi. Tarvittava annostus vaihtelee hoidettavan nimenomaisen sairaustilan, sairaustilan vakavuuden ja halutun hoidon keston mukaan.

Näitä peptidejä voidaan käyttää myös alanäkökukku-25 la-aivolisäke-lisämunuaisfunktion arvioimiseksi nisäkkäis sä, joiden epäillään kärsivän sisäeritys- tai keskushermostosairaudesta, jolloin niitä annetaan sopivalla tavalla, minkä jälkeen tarkkaillaan elimistön toimintoja. Esimerkiksi näiden peptidien antamista voidaan käyttää diag-30 nostisena työkaluna Cushingin sairauden ja tunneperäisten häiriöiden, kuten masennuksen, arvioimiseksi.

Näitä peptidejä annetaan usein farmaseuttisesti tai eläinlääketieteellisesti hyväksyttävien ei-myrkyllisten suolojen muodossa, kuten happoadditiosuoloina tai metalli-35 komplekseina, esim. sinkin, raudan, kalsiumin, bariumin, 94421 28 magnesiumin, aluminiumin ja vastaavien (joita tämän patenttijulkaisun tarkoituksiin pidetään additiosuoloina) kanssa. Esimerkkejä tällaisista happoadditiosuoloista ovat hydrokloridi, hydrobromidi, sulfaatti, fosfaatti, tannaat-5 ti, oksalaatti, fumaraatti, glukonaatti, alginaatti, male-aatti, asetaatti, sitraatti, bentsoaatti, sukkinaatti, malaatti, askorbaatti, tartraatti ja vastaavat. Jos vaikuttava ainesosa on määrä antaa tablettina, tabletti voi sisältää sideaineen, kuten traganttikumi, maissitärkkelys 10 tai gelatiini, hajottavan aineen, kuten alginiinihappo, ja voiteluaineen, kuten magnesiumstearaatti. Jos lääke halutaan antaa nesteen muodossa, voidaan käyttää makeutus-ja/tai aromiaineita ja antaa lääke laskimonsisäisesti iso-tooninen suolaliuos-, fosfaattipuskuriliuoksissa tai vas-15 taavissa.

Kyseisiä peptidejä tulisi antaa lääkärin valvonnassa ja farmaseuttiset koostumukset sisältävät tavallisesti peptidin yhdistettynä tavanomaiseen, farmaseuttisesti tai eläinlääketieteellisesti hyväksyttävään kantajaan. Taval-20 lisesti annostus on noin 1 - noin 200 mikrogrammaa peptidiä kilogrammaa isäntäeläimen ruumiinpainoa kohden. Joissain tapauksissa kohteiden hoito näillä peptideillä voidaan suorittaa ACTH:n tai kortikosteroidien antamisen ase-. mesta, näissä tapauksissa voidaan käyttää niinkin alhaista 25 annostusta kuin noin 10 ng per kg ruumiinpainoa. Tässä käytettynä kaikki lämpötilat ovat °C ja kaikki suhteet ovat tilavuussuhteita. Prosenttiosuudet nestemäisiä materiaaleja on samoin laskettu tilavuudesta.

Vaikka keksintöä on kuvattu sen edullisten suori- 3.0 tusmuotojen valossa, jotka muodostavat kyseisten keksijöiden tämänhetkisen tietämyksen mukaisen parhaan muodon, tulee ymmärtää, että erilaisia, tämän alan keskimääräiselle taitajalle ilmeisiä muutoksia ja muunnoksia voidaan tehdä poikkeamatta keksinnön kattamasta alueesta, joka 35 esitetään oheisissa patenttivaatimuksissa. Esimerkiksi 29 944,21 substituutioita ja modifikaatioita muissa asemissa CRF-peptidiketjua voidaan tehdä nykyisten tai tulevien kehityksien mukaisesti vähentämättä kyseisten analogien tehoa. Vaikuttaa tärkeältä, että synteettisessä peptidissä esiin-5 tyy aminohapposekvenssi noin asemat 6-41 tai samanarvoinen tuon pituinen sekvenssi, kun puolestaan molekyylin N-päädyn loppuosa ei vaikuta niin kriittiseltä. Lisäksi C-päätteessä yksinkertaisen amidin asemesta voidaan mukaan ottaa alemmalla alkyylillä substituoidun amidi, esim. me-10 tyyliamidi, etyyliamidi jne., ja tällaiset substituoidut amidit katsotaan samanarvoisiksi kuin ei-substituoitu amidi. Samoin N-päätteeseen voidaan sisällyttää 1-10 ylimääräistä aminohappojäännöstä, ilman että tällä on sanottavaa kielteistä vaikutusta biologiseen tehoon. Tällaiset 15 peptidit katsotaan keksinnön piiriin kuuluviksi samanarvoisiksi muodoiksi.

Keksinnön eri ominaispiirteitä korostetaan seuraa-vissa patenttivaatimuksissa.

« • «

Claims (3)

94421 30

1. Analoginen menetelmä terapeuttisesti aktiivisten peptidien valmistamiseksi, joilla on kaava (I): Y-Ser-R2-

5 Glu-Pro-Pro-Ile-Ser-Leu-Asp-Leu-Thr-Phe-His-Leu-Leu-Arg- Glu-Val-Leu-His-R2i-R22**R23“Ala”R25“Gln-Ijeu“Ala“Gln"Gln"Ala" His-Ser-Asn-Arg-Lys-Leu-R3g-R39-Ile-R4,-NH2, jossa Y on vety tai asetyyli, R2 on Glu tai Gin, R2i on Met tai Nle, R22 on Ala tai Thr, R23 on Arg tai Lys, Rjj on Glu tai Asp, R3g on 10 Met tai Leu, R39 on Glu tai Asp, R^ on Ile tai Ala, kuitenkin edellyttäen, että N-päätteen 3 aminohappoa voidaan poistaa, tai näiden peptidien ei-myrkyllisten additiosuo-lojen valmistamiseksi, tunnettu siitä, että (a) yksittäiset aminohapot tai lyhyitä peptidejä kytketään 15 välituotteeksi, joka käsittää ainakin yhden suojaryhmän ja jolla on kaava (II) tai on kaavan (II) mukaisen yhdisteen N-päätteestä lyhennetty versio, x‘-Ser (X2)-R2(X5)-Glu(X5) -Pro-Pro-Ile-Ser (X2) -Leu-Asp (X5) -Leu-Thr (X2) -Phe-His (X) -Leu-Leu-Arg(X3)-Glu(X5)-Val-Leu-His(X)-R2i-R22(X2)-R23(X3 tai X6)-20 Ala-R2j(X5) -Gin (X4) -Leu-Ala-Gin(X4) -Gin (X4) -Ala-His (X) -Ser-(X2) -AsnfX4) -Arg(X3) -Lys(X6) -Leu-R3g-R39(X5) -Ile-R^-X7, jossa R-ryhmät ovat kuten edellä on määritelty, X, X1, X2, X3, X4, Xs ja X6 kukin on joko vety tai suojaryhmä ja X7 on ankkuroiva sidos hartsikantajaan, (b) lohkaistaan suojaryhmä 3^ tai -ryhmät ja ankkuroiva sidos kaavan (II) mukaisesta välituotteesta, ja (c) haluttaessa saatu peptidi muutetaan ei-myrkylliseksi additiosuolakseen.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että peptidi on [His20]-rCRF.

3»U 3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, • 9 <·· tunnettu siitä, että peptidi on [His20]-oCRF. 31 94421