FI92877C - Menetelmä polarisoitujen fluoresenssiemissioiden mittaamiseksi - Google Patents

Description

92877

Menetelmä polarisoitujen fluoresenssiemissioiden mittaamiseksi

Keksinnön ala 5 Tämä keksintö koskee menetelmää polarisoitujen fluoresenssiemissioiden mittaamiseksi ja tarkemmin määriteltynä tällaisen menetelmän käyttöä polarisaatioarvojen määrittämiseksi elinkykyisistä lymfosyyteistä ihmis- ja eläinelimistöissä esiintyvien sairauksien detektoimiseksi.

10 Keksinnön tausta

Monia ihmisissä ja eläimissä esiintyviä sairauksia voidaan detektoida sen avulla, että veressä esiintyy vieraita aineita tai antigeenejä, joita muodostuu tuloksena elimistön puolustautumisesta sairautta vastaan. Näiden an-15 tigeenien detektointi on osoittautunut diagnostiseksi ja hoitokeinoksi, joka soveltuu erityisesti antigeeniä tuottavan nimenomaisen sairauden tai tilan varhaiseen toteamiseen ja hoitoon. Tällaisen menetelmän tulee kuitenkin olla luotettava, toistettavissa oleva ja herkkä, ja henkilöi-20 den, joilla on tavanomainen taito ja koulutus laboratorio-tieteiden ja -menetelmien alalla, tulisi pystyä toteuttamaan tällainen menetelmä. Tällaisten menetelmien tulisi edullisesti olla toteutettavissa laitteiden avulla ja automaattisesti.

25 Olemme kehittäneet ja kuvanneet erään menetelmän syövän varhaistoteamiseksi, joka perustuu siihen, että mitataan muutokset elävien lymfosyyttien sytoplasmamatrii-sin strukturoituneisuudessa niiden joutuessa alttiiksi syöpäantigeeneille (L. Cercek, B. Cercek, C.I.V. Franklin, 30 "Biophysical Differentiation between Lymphocytes from Healthy Donors, Patients With Malignant Diseases and Other Disorders", Brit. J. Cancer 29 (1974) 345; L. Cercek, B. Cercek, "Application of the Phenomena of Changes in the Structuredness of Cytoplasmic Matrix (SCM) in the Diag-35 nosis of Malignant Disorders; A Review", Europ. J. Cancer 2 92877 13 (1977) 903 - 915. Menetelmämme mukaisesti erotetaan SCM-reagoivien lymfosyyttien alapopulaatio verinäytteestä ja inkuboidaan näitä lymfosyyttejä antigeenin kanssa, joka on eristetty erilaisten pahanlaatuisten kudosten yleisestä 5 yhdistelmästä, tai antigeenin kanssa, joka on eristetty tietyntyyppisen pahanlaatuisen kasvaimen sisältävästä kudoksesta. Jos verinäytteen luovuttajalla on pahanlaatuinen kasvain, lymfosyyteissä esiintyy karakteristinen SCM-vas-te, kun niitä on inkuboitu syöpään liittyvän antigeenin 10 kanssa, ja tämä reaktio on erotettavissa luovuttajien, joilla ei ole pahanlaatuista kasvainta, lymfosyyttien SCM-vaste. Vastaavasti, jos luovuttajalla on samantyyppinen pahanlaatuinen kasvain kuin se, josta spesifinen kudosan-tigeeni on eristetty, tapahtuu karakteristinen SCM-vaste, 15 joka on erilainen kuin luovuttajista, joilla ei ole tämäntyyppistä pahanlaatuista kasvainta, saatujen lymfosyyttien SCM-vaste. Niinpä SCM-testimenetelmää voidaan käyttää sekä syövän seulontatestinä että spesifisenä syövän diagnostisena testinä.

20 Näiden tulosten laajennukseksi olemme havainneet, että SCM-syöpätestiä voidaan soveltaa vastaavin tuloksin muuntyyppisiin, antigeenejä tuottaviin sairauksiin, kuten esimerkiksi virus- ja bakteeri-infektioihin, allergisten reaktioiden määrittämiseen, kudostyypitykseen ja allo-25 transplantaattien hylkimisen seuraamiseen. Muiden antigee-i nejä tuottavien sairauksien ja elimistön tilojen läsnäolo ei häiritse, ja itse asiassa potilaasta, jolla on useampia kuin yhdentyyppinen antigeenejä tuottava sairaus, voidaan testata useita tällaisia sairauksia yksinkertai-30 sesti tekemällä erillisiä testejä käyttäen kuhunkin testiin testattavista sairauksista tai tiloista peräisin olevaa antigeeniä.

Lymfosyyttien SCM-vaste mitataan kätevimmin fluo-rimetrisellä menetelmälläja tarkemmin määriteltynä mittaa-35 maila lymfosyyttien intrasellulaarisen fluoreseiinin fluo- 3 928 77 resenssin polarisaatio. Tämä tehdään viemällä soluun fluo-reseiiniä ja mittaamalla emittoituneen fluoresenssin, jonka saa aikaan solun virittäminen energialähteellä, kuten sinisellä valolla, vaakasuorat ja pystysuorat komponentit.

5 Lymfosyyteillä, jotka reagoivat positiivisesti antigeeniin, esiintyy merkittävä fluoresenssisäteilyn pola-risaatioarvon aleneminen verrattuna stimuloimattomiin verta i lu lymfosyytte ihin , jos luovuttajalla on sairaus tai tila, joka tuottaa antigeeniä, jota vastaan lymfosyytit 10 testattiin, tai liittyy tähän antigeeniin. Luovuttajien, joilla ei ole antigeeniä tuottavaa sairautta tai tilaa, lymfosyyteillä ei toisaalta esiinny merkittävää polarisaa-tioarvon alenemista niiden jouduttua kosketukseen mainitun antigeenin kanssa, mikä on osoituksena negatiivisesta SCM-15 vasteesta.

Fluoreseiinimolekyylejä viedään tutkittaviin lym-fosyytteihin muodostamalla tutkittavien lymfosyyttien suspensio substraattiliuoksessa, joka sisältää fluorogeenistä ainetta, kuten fluoreseiinidiasetaattia (FDA) steriilissä, 20 täydellisessä, fosfaattipuskuroidussa fysiologisessa suo laliuoksessa. FDA läpäisee solukalvon ja muuttuu fluorese-iinimolekyyleiksi entsymaattisen hydrolyysin kautta. Fluo-resenssimittaukset tehdään suspensiosta, joka sitten suodatetaan, ja mitataan fluoresenssi suodoksesta. Suodoksen 25 emissiot vähennetään taustafluoresenssinä suspension koko- naisemissioista, jolloin saadaan lymfosyyttien emissioin-tiintensiteetti. Suspension emission rekisteröinnin ja suodatusvaiheen toteuttamisen välinen aika täytyy kuitenkin pitää mahdollisimman lyhyenä väärien tulosten välttä-30 miseksi. Testin tekijän taitoon joudutaan luottamaan huomattavassa määrin siinä suhteessa, että suodatusvaihe tulee varmasti suoritetuksi asianmukaiseksi.

Yhteenveto keksinnöstä Tämä keksintö, jota kuvataan solususpensioiden flu-35 roesenssiemissiomittausten yhteydessä mutta joka on käyt- 4 92877 tökelpoinen mille tahansa fluoresoivalle materiaalille, jonka yhteydessä taustafluoresenssi on ongelma, tarjoaa parannetun menetemän fluoresenssiemissioiden pysty- ja vaakasuorien komponenttien mittaamiaeksi ja rekisteröimi-5 seksi, johon sisältyy taustafluoresenssin kompensointi erottamatta fysikaalisesti fluoresoivaa ainetta tausta-fluoresenssin aiheuttavasta substraatista. Taustafluoresenssi, jota saattaa aiheuttaa fluorogeenisen aineen, kuten fluoreseiinin, karkaaminen lymfosyyteistä substraat-10 tiin, johon ne on suspendoitu, kompensoidaan yhdessä mittauksessa. Suodatusvaiheen välttämättömyys taustaemission mittaamiseksi eliminoituu. Virheet, jotka johtuvat mittausten välisistä ajanjaksoista ja suspension monista käsittelyistä, poistuvat. Mittausmenetelmä on helppo automa-15 tisoida, mikä tekee menettelystähelppokäyttöisemmän ja luotettavamman.

Siten tämä keksintö antaa käyttöön menetelmän luovuttajan verinäytteen testaamiseksi tilan tai sairauden läsnäolon toteamiseksi luovuttajan elimistössä, menetelmän 20 perustuessa luovuttajan verinäytteestä erotettujen lym fosyyttien vasteeseen, kun ne joutuvat kosketukseen aineen kanssa, joka on tutkittavaan tilaan tai sairauteen liittyvä mitogeeni tai antigeeni, jolloin sairauden tai tilan läsnäolon luovuttajassa seurauksena aineelle herkistynei-25 den lymfosyyttien sytoplasmamatriisin strukturoituneisuu- dessa (SCM) esiintyvät muutokset osoittavat lymfosyytti-vasteen, ja muutos SCM:ssä mitataan lymfosyyttien polarisoidun intrasellulaarisen fluoresenssin avulla, jolloin menetelmälle on tunnusomaista, että 30 mitataan vaakasuoraan ensimmäisellä aallonpituudel- : la ja toisella aallonpituudella ja mitataan pystysuoraan mainitulla ensimmäisellä aallonpituudella ja mainitulla toisella aallonpituudella polarisoituneet fluoresenssi-emissiot lymfosyyttisuspensiosta substraatissa, jolloin 35 mittaukset ensimmäisellä aallonpituudella ja toisella aal- , 92877 5 lonpituudella tehdään aallonpitoisuusalueella, jonka määrää fluoresenssiemissioiden batokrominen siirtymä, saadaan siitä suspension kokonaisfluoresenssiemis-sio kummallakin aallonpituudella, 5 määritetään tekijä, joka edustaa ekstrasellulaari- sesta fluoresenssista johtuvaa fluoresenssiemission koko-naisintensiteetin osaa, johdetaan siitä ekstrasellulaarisen fluoresenssin vaaka- ja pystysuoraan polarisoidun emission intensi-10 teetit, vähennetään ekstrasellulaariset intensiteetit ensimmäisellä aallonpituudella mitatuista vaaka- ja pystysuoraan polarisoidun emission intensiteeteistä, jolloin saadaan intrasellulaarisesta fluoresenssista johtuvat pys-15 ty- ja vaakasuoraan polarisoidun emission intensiteetit, ja tämän jälkeen sovelletaan intrasellulaarisen f luoresenssiemission intensiteettejä suspensiossa olevien lymfosyyttien pola-risaatioarvon laskemiseksi.

20 Tämän keksinnön mukaisesti mitataan pystysuoraan ja vaakasuoraan polarisoidut fluoresenssiemissiot ensimmäisellä aallonpituudella ja toisella aallonpituudella. Toisen aallonpituuden määrää taustafluoresenssiemissioi-denemissiospektrien batokrominen siirtymä. Kullakin aal-25 lonpituudella mitattu kokonaisfluoresenssiemissio pelkis tetään tekijäksi, joka edustaa taustafluoresenssin aihe-utta-maa osaa fluoresenssiemissioiden kokonaisintensitee-tistäensimmäisellä aallonpituudella. Käyttämällä hyväksi tätätekijää johdetaan taustafluoresenssin aiheuttamat pys-3 0 ty-suoraan ja vaakasuoraan polarisoidut emissiointensitee- titensimmäisellä aallonpituudella ja vähennetään ne polarisoiduista kokonaisfluoresenssiemissiointensiteeteistä, jolloin saadaan pystysuoraan ja vaakasuoraan polarisoidut, solunsiääiset fluoresenssiemissiointensiteetit, joita käy-3 5 tetään emittoidun fluoresenssin polarisaatioarvon laskemi- . seen.

6 92877

Fluoresenssimittaukset tehdään edullisesti fluo-resenssispektrofotometrillä, joka on varustettu polarisaa-tiosuodattimella eksitaatioenergian polarisoimiseksi ja toisella polarisaatiosuodattimella, joka on käännettävissä 5 pystysuoran ja vaakasuoran asennon välillä ja tarkoitettu emissioiden polarisointiin ja joka päästää emittoidun fluoresenssin pystysuorat ja vaakasuorat fotodetektoin-tijärjestelmään. Vaikka spektrofotometri voi olla varustettu yhdellä fotodetektorilla ja välineillä emissioiden 10 mittaamiseksi peräkkäin kahdella eri aallonpituudella, on spektrofotometri edullisesti varustettu vähintään kahdella valomonistimella, niin että voidaan samanaikaisesti mitata emissiot kahdella aallonpituudella.

Käyttämällä tämän keksinnön mukaista menetelmää 15 voidaan solun ulkopuolisen fluoresenssin aiheuttama taus-tafluoresenssi kompensoida automaattisesti ja jättää siten pois erillinen suodatusvaihe. Käyttämällä keksinnön mukaista menetelmää kokemus, taito ja tekniikka, joita tarvitaan lymfosyyttisuspension vaakasuorien ja pystysuorien 20 f luoresenssiemissiointensiteettien asianmukaiseen johtami seen, vähenevät ja yksinkertaistuvat oleellisesti ja nämä tehtävät voidaan suorittaa itse spektrofotometrissä, mikä tekee edellä kuvatusta SCM-testimenetelmästä käyttökelpoisen rutiinikäyttöön kliinisissä laboratorioissa.

25 Esillä oleva keksintä koskee myös menetelmää pola risoitujen fluoresenssiemissioiden mittaamiseksi fluoresoivasta materiaalista, joka on taustafluoresenssia aiheuttavassa ympäristössä, erottamatta fluoresoivaa materiaalia ympäristöstä, jolloin menetelmälle on tunnusomaista, 30 että a. mitataan vaaka- ja pystysuoraan polarisoidut fluoresenssiemissiot ympäristössä olevasta materiaalista, jolloin mittaukset tehdään ensimmäisellä aallonpituudella ja toisella aallonpituudella, jotka ovat aallonpituus-35 alueella, jonka määrää taustafluoresenssiemissioista joh- 92877 7 tuvien fluoresenssiemissioiden batokrominen siirtymä, ja saadaan niistä ympäristössä olevan fluoresoivan materiaalin kokonaisfluoresenssiemissio kummallakin aallon pituudella seuraavan yhtälön mukaisesti: 5 i|coic ~ + 2(Ih X G) jossa Iv ja IH ovat pysty- ja vaakasuoraan polarisoidut fluoresenssiemissiointensiteetit ja G on korjaustekijä 10 vaaka- ja pystysuoraan polarisoitujen fluoresenssiemissioiden epäyhtenäiselle kululle fluoresenssin mittauslaitteen optisen järjestelmän läpi, b. määritetään tekijä F, joka edustaa taustafluore-senssista johtuvaa osaa fluoresenssiemission kokonaisin- 15 tensiteetistä, jolloin tekijä F määritetään yhtälöstä:

Kb - Q

F -----------

Kb - K, 20 jossa K, on keskiarvo vain taustafluoresenssin fluoresenssi-intensiteetin todellisista mittauksista toisella aallonpituudella jaettuna vain mainitun fluoresenssin ensimmäisellä aallonpituudella mitatulla fluoresenssi-intensi-25 teetillä, Kb on fluoresoivan materiaalin fluoresenssi-intensiteetin keskiarvo taustafluoresenssin puuttuessa toisella aallonpituudella jaettuna fluoresoivan materiaalin fluoresenssi-intensiteetillä taustaf luoresenssin puuttuessa ensimmäisellä aallonpituudella, jolloin K, ja Kb ovat 30 kulloinkin käytettävälle laitteistolle ominaisia vakioita, ·· ja Q on kokonaisintensiteetti toisella aallonpituudella jaettuna kokonaisintensiteetillä ensimmäisellä aallonpituudella, c. johdetaan tekijästä taustafluoresenssin pysty-35 ja vaakasuoraan polarisoidut emissiointensiteetit seuraa- vien yhtälöiden mukaisesti: 92877 δ

^kok(M) Χ F

1 V(X1) = 1 + 2[ (1 - Pk/ 1 + Pk) ] 5 ja

Itot(M) x F

!h(Xd = A + p, \

10 2 + I---------I x G

\1 - Pk / jossa IV(xi) on pystysuoraan polarisoitu fluoresenssiemissio ensimmäisellä aallonpituudella, IH(M) on vaakasuoraan pola-15 risoitu taustatluoresenssi-intensiteetti ensimmäisellä aallonpituudella, Itot(M) on f luoresenssiemissioiden koko-naisintensiteetti ensimmäisellä aallonpituudella, F on tekijä, joka edustaa taustatluoresenssista johtuvaa osaa fluoresenssiemission kokonaisintensiteetistä, ja Pk on va-20 kio, joka saadaan yhtälöstä: ivjuodos G X I Hsuodos pk =----------------------- A 1 Vsuodos "t" G X 1 Hsuodos 25 jossa 1 vsuodos on ympäristön, josta fluoresoiva materiaali on erotettu, pystysuoraan polarisoitu fluoresenssiemissioin-tensiteetti, IHsuodos on ympäristön, josta fluoresoiva materiaali on erotettu, vaakasuoraan polarisoitu fluoresenssi-30 emissiointensiteetti ja G on korjaustekijä pysty- ja vaa- t kasuoraan polarisoitujen fluoresenssiemissioiden epäyhtenäiselle kululle fluoresenssin mittauslaitteen optisen järjestelmän läpi, ja d. vähennetään taustafluoresenssi-intensiteetit en-35 simmäisellä aallonpituudella mitatuista pysty- ja vaaka- • « 9 92877 suoraan polaroiduista emissiointensiteeteistä, jolloin saadaan fluoresoivan materiaalin fluoresenssista johtuvat vaaka- ja pystysuoraan polarisoidut emissiointensiteetit taustafluoresenssin puuttuessa, ja tämän jälkeen sovel-5 letaan fluoresoivan materiaalin fluoresenssiemissiointen-siteettejä taustafluoresenssin puuttuessa ympäristön fluoresoivan materiaalin polarisaatioarvon (P) laskemiseen.

Tämän keksinnön muut puolet ja edut käyvät ilmi seuraavasta yksityiskohtaisesta kuvauksesta tarkasteltuna 10 yhdessä piirrosten kanssa.

Piirrosten lyhyt kuvaus

Kuvio 1 on SCM-testimenettelyn juoksukaavio; ja Kuvio 2 on kaaviokuva fluoresenssispektrofotometri-järjestelystä, jota käytetään lymfosyyttisuspension SCM-15 vasteen mittaamiseen.

Keksinnön yksityiskohtainen kuvaus SCM-testi syövän ja muiden antigeenejä tuottavien sairauksien ja elimistön tilojen detektoimiseksi perustuu siihen, että mitataan muutokset elävien solujen sytoplas-20 mamatriksirakenteen fysikaalisessa tilassa, kun soluja on inkuboitu tutkittavan sairauden tai elimistön tilan tuottaman antigeenin kanssa. Termiä "sytoplasmamatriisin strukturoituneisuus" eli SCM käytetään kuvaamaan sytoplas-mamatriisirakenteen fysikaalista tilaa molekyylitasolla.

25 SCM-muutosten mekanismeja koskevat tutkimukset ovat osoit taneet, että kun on tehty eksitaatio aallonpituudella 470nm tai 442 nm, intrasellulaarisen fluoreseiinin fluoresenssin polarisaatio aallonpituudella 510 nm ja vastaavasti 527 nm heijastaa "mitokondrioissa tapahtuvia raken-30 nemuutoksia (SCM)" ja osoittaa niiden siirtymiset normaalista lepomuodosta aktiiviseen, ATP:ta muodostavaan, tiivistyneeseen muotoon ja päin vastoin. [L. Cercek ja B. Cercek, Biophysics. J. 28 (1979) 403 - 412]. Tällaiset SCM-muutokset ovat mitattavissa ääreisveressä esiintyvien 35 lymfosyyttien tietystä alapopulaatiosta. Kuten Cercekit 10 92877 (Europ. J. Cancer, supra) raportoivat, syöpää sairastavista luovuttajista saatavat ihmisen ja eläinten reagoivat lymfosyytit antavat erilaisia SCM-vasteita fytohemagglu-tiniiniin ja spesifisistä syöpäkudostyypeistä saatuihin 5 syöpäperusproteiineihin ja antigeeneihin kuin SCM-reagoi-vat lymfosyytit, jotka ovat peräisin potilaista, joilla ei ole pahanlaatuisia kasvaimia. Testi on raporttien mukaan käyttökelpoinen sekä seulontatestinä että spesifisenä diagnostisena välineenä. Käyttämällä samoja raportoituja 10 menettelyjä SCM-testiä on laajennettu muihin antigeenejä tuottaviin sairauksiin ja elimistön tiloihin, kuten erilaisten aineiden aiheuttamien allergisten reaktioiden määrittämiseen, virus- ja bakteeri-infektioiden detektointiin ja määrittämiseen tms. SCM-testin yhteydessä käytettynä 15 termiä "antigeeni" käytetään laajimmassa merkityksessään mistä tahansa vieraasta, sairauteen tai tilaan liittyvästä aineesta, joka herättää SCM-vasteen SCM-reagoivissa lymfosyyteissä.

Kuviossa 1 esitetyn testimenetelmän mukaisesti ote-20 taan luovuttajasta ääreisverinäyte ja kerätään se heparii-nia sisältävään putkeen. Ääreisveri käsitellään talteenoton jälkeen rautajauheella tai karbonyylirautajauheella ja sijoitetaan sitten magneetille fagosyyttisolujen erottami- . seksi yhdessä rautajauheen kanssa verinäytteestä. Osa ve- »« 25 rinäytteestä siirretään sitten useita tiheyagradientteja sisältävään liuokseen ja sentrifugoidaan, jolloin SCM-rea-goivat lymfosyytit erottuvat veren muista komponenteista tiheytensä perusteella monigradienttiliuoksessa. Erotuksen ja pesun jälkeen osa SCM-reagoivista lymfosyyteistä jäte-30 tään vertailunäytteeksi ja muut osat stimuloidaan inkuboi-maila niitä testattavasta sairaudesta tai tilasta peräisin olevien tai niihin liittyvien antigeenien kanssa.

Lymfosyyttien SCM-reaktio määritetään mittaamalla lymfosyyttien fluoresenssin polarisaatio, kun niihin on 35 sekoitettu sopivaa fluorogeenistä ainetta esimerkiksi muo- » • » 11 92877 11 dostamalla lymfosyyttien suspensio liuoksessa, joka sisältää fluoreseiinidiasetaattia (FDA) fosfaattipuskuroidussa fysiologisessa suolaliuoksessa, jolloin fluorogeeninen aine tunkeutuu lymfosyytteihin. Edullisen fluorogeenisen 5 aineen, FDA:n, ollessa kyseessä FDA-molekyylit muuttuvat fluoreseiinimolekyyleiksi solussa entsymaattisen hydrolyy-sin kautta. Fluoreseiinimolekyylit fluoresoivat, kun niihin suunnataan eksitaatioenergiaa pystysuoran polarisoidun valon muodossa. SCM-vasteen osoittaa SCM-reagoivien lym-10 fosyyttien intrasellulaarisen fluoreseiinin polarisaatio-arvon muutostaso antigeenistimuloinnin jälkeen verrattuna lymfosyyttivertailususpension polarisaatioarvoon.

SCM-testimenetelmän mukaisesti lymfosyyttisuspen-sion polarisaatioarvo (P) saadaan eksitoimalla suspensio 15 valolla, joka on polarisoitu pystysuorassa tasossa. Myös suspensiosta tulevat fluoresenssiemissiot polarisoidaan, ja fluoresenssiemissiot mitataan pystysuorassa tasossa ja vaakasuorassa tasossa kohtisuoraan pystytasoa vastaan. Näitä intensiteettejä, joista käytetään tästedes lyhentei-20 tä Iv pystysuorasta fluoresenssikomponentista ja IH vaakasuorasta fluoresenssikomponentista, käytetään suspension polarisaatioarvon (P) laskemiseen seuraavan kaavan mukaisesti : 25 (1) P = (Iv- G X IH)/(IV + G X I„) jossa Iv ja IH ovat polarisoidut fluoresenssi-intensiteetit pysty- ja vastaavasti vaakatasossa ja G on korjaustekijä polarisoidun energian vaaka- ja pystykomponenttien epäyh-30 tenäiselle kululle käytetyn laitteen optisen järjestelmän läpi.

G:n arvo määritetään jakamalla pystysuora fluoresenssi-intensiteetti vaakasuoralla fluoresenssi-intensiteetillä, jotka emittoituvat suodosliuoksesta, tai 10'7 M 35 fluoreseiiniliuoksesta fosfaattipuskuroidussa fysiologi- 12 92877 sessa suolaliuoksessa, joka on eksitoitu vaakasuoraan po-laroidulla valolla, jonka aallonpituus on sama kuin pystysuoraan polaroidun eksitoivan valon.

Stimuloivan lymfosyyttisuspension P-arvoa verrataan 5 sitten stimuloimattoman vertailususpension, joka sisältää saman luovuttajan lymfosyyttejä, P-arvoon ja stimuloitujen ja stimuloimattomien lymfosyyttien välinen prosentuaalinen muutos on osoitus SCM-vasteesta antigeeniin.

Jotta taattaisiin tulosten toistettavuus käytettä-10 essä FDA:ta fluoresoivana aineena, tulisi FDA-substraat-tiliuoksen pH pitää arvossa 7,4 tai hieman sen yläpuolella ja liuoksen osmolaalisuus saisi poiketa korkeintaan ± 1 % isotonisesta arvosta 0,330 osm/kg. Eksitaatio- ja emissio-aallonpituuksien valinta riippuu lymfosyyttien/ fluoro-15 geenisen aineen suspension spektreistä. SCM-vasteen muutokset havaitaan tietyillä eksitaatio- ja emissioaallonpi-tuuksien yhdistelmillä, jotka riippuvat käytettävästä fluorogeenisestä aineesta. Käytettäessä esimerkiksi FDArta fluorogeenisenä aineena lymfosyyttisuspension SCM-vaste 20 havaitaan emissioaallonpituudella 510 nm ja eksitaatioaal-lonpituudella 470 nm tai emissioaallonpituudella 527 nm ja eksitaatioaallonpituudella 442 nm.

Tärkein ongelma, joka liittyy fluoresenssin pola-risaatiomenetelmän käyttöön lymfosyyttien SCM-vasteen mit-25 taamiseen, on solun ulkopuolisen fluoresenssin aiheuttama tausta, joka voi heikentää testituloksia, ellei sitä kompensoida. Niinpä vaikka FDA:n ollessa fluorogeenisenä aineena oleellinen osa entsymaattisen hydrolyysin seurauksena muodostuvista fluoreseiinimolekyyleistä pysyy elävissä 30 soluissa, karkaa joitakin fluoreseiinimolekyylejä soluista substraattiliuokseen ja ne voimistavat oleellisesti subst-raattiliuoksen taustafluoresenssiä, mistä on seurauksena herkkyyden väheneminen ja virheellisiä tuloksia. Ennen tätä keksintöä käytössä olleen SCM-testimenetelmän mukai-35 sesti lymfosyyttisuspensio suodatettiin noin 4-7 minuu- tl 92877 13 tin kuluttua solususpensioiden fluoresenssiemissioiden pysty- ja vaakakomponenttien rekisteröinnistä ja rekisteröitiin suodoksen fluoresenssiemissioiden pysty- ja vaaka-komponentit samoin kuin suodatusvaiheen kesto. Fluoresens-5 simittaustulokset ekstrapoloitiin sitten suodatusvaiheen puoliaikaan ja vähennettiin suspension pysty- ja vaakasuorista fluoresenssi-intensiteeteistä, jolloin saatiin itse lymfosyyttien pysty- ja vaakatasoon polarisoidut fluoresenssi-intensiteetit.

10 Suodatusvaihe saattaa aiheuttaa virheitä SCM-testin tuloksiin. Suodatusvaiheen tekemisen asiaton viivästyminen saattaa esimerkiksi vaikuttaa haitallisesti lukemiin, sillä intensiteettitasot riippuvat FDA:n hydrolyysin kestosta. Lisäksi suspension ylimääräinen käsittely ja itse suo-15 datusvaihe, ellei sitä toteuteta asianmukaisesti, saattavat johtaa lymfosyyttien kalvojen vaurioitumiseen. Tämä saattaa johtaa siihen, että suodokseen vapautuu epänormaaleja määriä intrasellulaarista fluoreseiiniä, jolloin seurauksena on normaalia suurempia taustalukemia ja testin 20 herkkyyden heikkeneminen ja/tai virheellisiä tuloksia. Suodatusvaihe vaatii lisäksi fluoresenssi-intensiteettien saamiseksi kineettistä ekstrapolointia, joka saattaa johtaa poikkeamaan tai virheeseen SCM-testituloksissa, ellei sitä tehdä asianmukaisesti.

25 Intrasellulaarisen fluoreseiinifluoresenssin, ts.

solun sisältä tulevan fluoresenssin, spektrin ja tausta-ja solun ulkopuolisen fluoreseiinin fluoresenssispektrin välillä on batokrominen siirtymä. Niinpä tausta- ja intrasellulaarisen fluoresenssiemission voidaan katsoa olevan 30 peräisin eri fluoroforeista. Tämän perusteella ja keksinnön mukaisesti on kehitetty menetelmä vaaka- ja pystyta-sossa polarisoitujen fluoreseiinifluoresenssiemissioiden mittaamiseksi kahdella aallonpituudella; ensimmäisellä aallonpituudella, joka valitaan intrasellulaaristen 35 fluoresenssiemissioiden mittaamiseen, ja toisella aallon- 14 92877 pituudella, joka on batokromisen siirtymän määräämällä aallonpituudella. Taustan fluoresenssi-intensiteetti määritetään tarvitsematta erillistä suodatusvaihetta. Tämän keksinnön mukainen menetelmä, jota voidaan analysoida ja 5 ilmaista matemaattisesti, soveltuu siten automaattisiin menetelmiin lymfosyyttisuspension taustafluoresenssiemis-sioiden määrittämiseksi. Jäljempänä käytetään termejä "tausta" ja "ekstrasellulaarinen" toistensa vastineina viitattaessa fluoresenssiemissioihin.

10 Keksinnön mukaisessa menetelmässä mitataan ja re kisteröidään SCM-reagoivien lymfosyyttien, jotka on käsitelty fluorogeenisellä aineella ja joihin on suunnattu ek-sitaatioenergia, suspensiosta tulevien fluoresenssiemis-sioiden vaaka- ja pystykomponentit ensimmäisellä ja toi-15 sella aallonpituudella. Tämä tehdään edullisesti samanaikaisesti käyttämällä useampaa kuin yhtä valomonistinta, kuten kuvataan yksityiskohtaisemmin kuvion 2 yhteydessä. Intensiteetit voidaan myös mitata ja rekisteröidä vuorotellen näillä kahdella aallonpituudella. Mitä ensimmäiseen 20 ja toiseen allonpituuteen tulee, olemme havainneet, että fluoreseiinin fluoresenssin ollessa kyseessä toinen aallonpituus on noin 5 - 10 nm suurempi kuin ensimmäinen aallonpituus.

Fluoresenssiemissioiden kokonaisintensiteetti en-25 simmäisellä ja toisella aallonpituudella määritetään vaakatasossa ja pystytasossa polarisoitujen fluoresenssimis-sioiden summana sekä ensimmäisellä että toisella aallonpituudella seuraavan yhtälön mukaisesti: 30 (2) Ikok = Iv + 2(I„ x G) jossa Iv ja IH ovat vaaka- ja pystytasossa polarisoidut fluoresenssiemissiointensiteetit ja G on korjaustekijä polaroidun valon vaaka- ja pystykomponenttien epäyhtenäi-35 selle kululle käytettävän laitteen optisen järjestelmän läpi.

ti 92877 15

Tekijä, joka edustaa ekstrasellulaarisen fluoresenssin aiheuttamaa osaa mainitun fluoresenssiemission kokonaisintensiteetistä, määritetään sitten yhtälöstä:

5 Kb - Q

(3) F = ----------

Kb - K.

jossa Kb on 1,135, Ka on 1,048 ja Q on kokonaisintensi-10 teetti toisella aallonpituudella jaettuna kokonaisinten-siteetillä ensimmäisellä aallonpituudella.

Ka on laitevakio ja keskiarvo tuloksista, joita saadaan tehtäessä laitteella todellisia fluoresenssi-intensi-teettimittauksia ensimmäisellä ja toisella aallonpituudel-15 la lymfosyyttisuspensioiden suodoksista. Kb, joka myös on laitevakio, on toisella aallonpituudella mitatun intrasel-lulaarisen fluoresenssi-intensiteetin ja ensimmäisellä aallonpituudella mitatun intrasellulaarisen fluoresenssi-intensiteetin suhteen keskiarvo. Nämä arvot määritetään 20 kullekin fluoresenssispektrofotometrille ja testimenetelmässä käytettävälle kullekin aallonpituusparille.

Esimerkeissä esitetyssä keksinnön suoritusmuodossa ensimmäinen aallonpituus (1,) on 510 nm. Batokromiseksi siirtymäksi valitaan 5 nm, niin että toinen aallonpituus 25 (12) on 515 nm. Ekstrasellulaarinen fluoresenssi-intensi teetti pysty- ja vaakatasossa johdetaan sitten seuraavista yhtälöistä:

^kok(Xl) x K

3 0 Ιγ(λΐ) = 1 + 2[(1 - Pk/ 1 + Pk)] 16 92877 ja

^-kok(Xl) X F

^(Xl) = Λ+ ΡΛ

5 2+1---------lx G

\1 - Pk / joissa ΐ(νλΙ) ja I^m, ovat ekstrasellulaariset intensiteetit ensimmäisellä aallonpituudella (λ,) , Ikok(X1) suspension koko-10 naisintensiteetti aallonpituudella (1,), F on edellä olevasta kaavasta (2) saatava tekijä, G on korjaustekijä polarisoidun valon vaaka- ja pystykomponenttien epäyhtenäiselle kululle kyseisen laitteen optisen järjestelmän läpi ja Pk on ekstrasellulaarisen fluoresenssin polarisaatioar-15 vovakio, joka saadaan yhtälöstä: ^Vsuodos ^ ^ ^Hsuodoi pk =----------------------- ^Vsuodos t G X Ilisuodos 20 Käytettäessä fluorogeenisenä aineena fluoreseiiniä on Pk:n arvon määritetty kokeellisesti olevan 0,0254 lämpötilassa 27 °C lymfosyyttisuspensioiden ollessa kyseessä.

Ekstrasellulaariset pysty- ja vaakasuorat fluore-25 senssi-intensiteetit IV(xi> ja IH(xi) vähennetään pysty- ja vaakasuoristafluoresenssiemissiokokonaisintensiteeteistä, jolloin saadaan intrasellulaaristen fluoresenssiemissioi-den pysty- ja vaakasuorat intensiteetit, joita käytetään edellä olevassa yhtälössä (1) P:n laskemiseen. Kuten edel-30 lä mainittiin, matemaattinen analyysi soveltuu automati-sointiin, niin että koko analyysi voidaan tehdä fluore-senssispektrofotometrissä tai sen apulaitteissa ja tehdä korjaukset lopulliseen ulos tulevaan signaaliin.

Viitataksemme kuvioon 2, se on kaavamainen esitys 35 spektrofotometrijärjestelystä, jota käytetään SCM-solusus-

It 92877 17 pensioiden mittaamiseen tämän keksinnön mukaisesti ja jossa eksitaatiolähde 10 on soveltuva valonlähde, kuten ksen-onlamppu. Sopiva väline, kuten optinen suodatin tai, kuten kuviossa, eksitaatiomonokromaattori 12, sijoitetaan eksi-5 taatiovalon reitille valon, jolla on valittu eksitaatio-aallonpituus, päästämiseksi paikallaan olevaan polarisaa-tiosuodattimeen 14, joka päästää vain pystytasossa polarisoitua valoa näytelymfosyytti-/fluoreseiinisuspensioon 16. Kun fluoreseiinimolekyyleihin on suunnattu pystytasos-10 sa polarisoitu eksitaatiovalo, ne fluoresoivat, ja fluor-esenssiemissio johdetaan toisen polarisaatiosuodattimen 18 läpi, joka on varustettu automaattisella suodattimen asennon muuttajalla.polarisaatioakselin suunnan kääntämiseksi pysty- ja vaakatason välillä. Pysty- ja vaakakomponenttei-15 hin siten jaettu fluoresenssiemissio kulkee sitten aallonpituuden valitsemisvälineen, kuten optisten suodattimien tai, kuten kuviossa, kahden emissiomonokromaattorin 20 ja 22 läpi, joista toinen on valittu läpäisemään vain valoa, jolla on ensimmäinen aallonpituus (1,) ja toinen läpäise-20 mään valoa, jolla on toinen aallonpituus (12). Fotodetek-toripari 24 ja 26 sijoitetaan emissiomonokromaattoreista 20 ja vastaavasti 22 tulevan valon kulkureitille ja foto-detektoreista tuleva signaali syötetään vahvistimeen 28. Vahvistimesta 28 tuleva signaali syötetään mikroprosesso-25 rin 30 kautta, joka on tarkoitettu tekemään tarpeelliset matemaattiset toiminnot ekstrasellulaarisen fluoresenssin huomioon ottamiseksi edellä kuvatulla tavalla, ja siitä tuleva signaali lähetetään kirjoittimelle 32 laskettujen intrasellulaarisen fluoreseiinin fluoresenssin polarisaa-30 tioarvojen rekisteröimiseksi.

SCM-mittauksiin käytettävän spektrofotometrin tulisi olla herkkyydeltään ja stabiiliudeltaan hyvä ja sen tulisi kyetä kompensoimaan eksitaatiovalon intensiteetin huojunta, sillä polarisoidun fluoresenssin intensiteetti 35 rekisteröidään ajan funktiona ja fluoreseiinin kokonais- 92877 18 konsentraatio on SCM-mittauksissa suuruusluokaltaan ainoastaan 109 - 10'1 mol/1. Leveävyöhykesuodatinlaitteita (ΙΟ'10) ei voida myöskään käyttää SCM-mittauksissa, sillä lymfosyyttien eksitaatio- ja emissiopolarisaatiospektrit osoit-5 tavat, että SCM-muutoksia voidaan detektoida vain kapealla aallonpituusalueella. Spektrofotometrin tulee olla varustettu myös termostaatilla ohjatulla kyvetinpitimellä, sillä fluoreseiinin polarisaatioarvot riippuvat voimakkaasti lämpötilasta (ts. noin 3 %/ °C) , ja tulosten toistettavuu-10 den takaamiseksi näytteen lämpötila tulisi säätää tarkasti, ts. ± 0,2 °C:n tarkkuudella.

Kuten kuviosta 2 ilmenee, fluoresenssispektrofoto-metri jär jestely on varustettu fotodetektoriparilla (24 ja 26) fluoresenssi-intensiteetin pysty- ja vaakakomponent-15 tien mittaamiseksi ensimmäisellä ja toisella aallonpituudet. Haluttaessa voidaan kuitenkin käyttää neljääkin fo-todetektoria, niin että fluoresenssi-intensiteetin vaaka-ja pystytasossa polaroiduille komponenteille on erillinen fotodetektori kummallakin käytettävällä aallonpituudella.

20 Vaihtoehtoisesti voidaan käyttää yhtä fotodetektoria fluoresenssin vaaka- ja pystytasossa polarisoitujen komponenttien mittaamiseen. Voidaan myös käyttää yhtä välinettä, kuten suodatinta, joka on suunniteltu läpäisemään vuorotellen fluoresenssi ensimmäisellä ja toisella aallonpituu-25 della, kahden suodattimen tai monokromaattorin tilalla.

Esimerkki SCM-reagoivat lymfosyytit erotettiin luovuttajien ääreisverinäytteistä menetelmällä, jota kuvataan julkaisussamme (Europ. J. Cancer, supra), asettamalla verinäyte, 30 josta oli poistettu fagosyytit, kerrokseksi Ficoll-Trio-sil-tiheysgradienttiliuokselle, jonka tiheys lämpötilassa 25 °C oli 1,081 g/cm3 ja osmolaalisuus 0,320 osm/kg, minkä jälkeen sentrifugoitiin kiihtyvyydellä 550 gAV lämpötilassa 2 0 °C. SCM-syöpätestimenetelmän mukaisesti käsiteltiin osa 35 lymfosyyteistä fytohemagglutiniinilla (PHA) ja toinen erä 19 92877 samasta näytteestä peräisin olevia lymfosyyttejä uutteella, joka sisälsi erilaisista pahanlaatuisista kudoksista saatujen proteiinien yhdistelmän, jota kutsutaan syöpäpe-rusproteiiniksi (CaBP). Testimenetelmämme mukaan CaBPtn 5 kanssa inkuboidun lymfosyyttierän polarisaatioarvon suhde PHA:n kanssa inkuboidun, samasta luovuttajasta peräisin olevan lymfosyyttierän polarisaatioarvoon osoittaa syövän läsnä- tai poissaolon luovuttajassa. Tämän suhteen, jota kutsutaan tässä SCM-reaktiosuhteeksi (RR), on havaittu 10 olevan keskimäärin noin 1,1 - 1,8 terveillä luovuttajilla, kun taas pahanlaatuisia sairauksia sairastavilla potilailla RR on noin 0,5 - 0,95.

Kun lymfosyyttisuspensioita oli inkuboitu CaBP-an-tigeenin kanssa ja muodostettu lymfosyytti-FDA-suspensio 15 menetelmällämme, jota kuvataan lehdessä Europ. J. Cancer, johon edellä viitattiin, määritettiin suspensioiden pola-risaatioarvot Perkin Elmer -fluoresenssispektrofotometril-lä (malli MPF-4) kuvatulla menetelmällämme, jossa lymfo-syyttisuspension polarisoidut fluoresenssiemissiokokonai-20 sintensiteetit mitattiin vaaka- ja pystytasossa, minkä jälkeen tehtiin suodatus, ja mitattiin suodoksen polarisoidut fluoresenssiemissiointensiteetit vaaka- ja pysty-tasossa ekstrasellulaarisen fluoresenssin kompensoimiseksi. Eksitaatioaallonpituus oli 470 nm ja ensimmäinen emis-25 sioaallonpituus 510 nm.

Ennen suodatusvaihetta mitattiin kuitenkin kustakin näytteestä fluoresenssiemissiot samalla laitteella toisella emissioaallonpituudella 515 nm. Käyttämällä tämän keksinnön mukaista menetelmää taustafluoresenssin kompensoi-30 miseksi laskettiin polarisaatioarvot (P) ja SCM-vastesuh-teet. Näitä tuloksia verrataan samojen suspensioiden pola-risaatioarvoihin ja vastesuhteisiin, jotka saatiin tavanomaisella menetelmällä, seuraavassa taulukossa, jossa keksinnön mukaisella menetelmällä saadut polarisaatioarvot ja 35 SCM-vastesuhteet esitetään sarakkeessa, jonka otsikkona on 20 92877 "BSM-menetelmä" ja tavanomaisella menetelmällä saadut tulokset sarakkeessa, jonka otsikkona on "tavanomainen menetelmä" .

5 Taulukko

Tavanomaiset menetelmät BSM -menetelmät

Nro Antigeeni P RR P rr 1 PHA 0,154 0,128

CaBP 0,210 1,36 0,180 1,41 10 2 PHA 0,137 0,122

CaBP 0,195 1,42 0,189 1,55 3 PHA 0,140 0,133 15 CaBP 0,195 1,39 0,189 1,35 4 PHA 0,163 0,161

CaBP 0,208 1,28 0,183 1,14 20 5 PHA 0,145 0,170

CaBP 0,202 1,39 0,215 1;27 6 PHA 0,201 0,215

CaBP 0;152 0,76 0,160 0,74 25 7 -PHA 0,202 0,208

CaBP 0,158 0,78 0,164 0,79 1 ti • · PHA 0,202 0,196

CaBP 0,161 0,80 0,164 0,84 30

Tavanomaisilla menetelmillä, johon liittyy suoda-tusvaihe, ja keksinnön mukaisella menetelmällä, josta suodatus on jätetty pois, saadut polarisaatioarvot ja SCM-vastesuhteet sopivat yhteen virheanalyysillä ennustettujen 35 tarkkuusrajojen puitteissa. Havaittaneen, että näytteiden 92877 21 1-5 SCM-reaktiosuhteet ovat suuruusluokkaa vähintään 1,15, mikä osoittaa syövän poissaolon luovuttajasta. Näytteissä 6-8 SCM-reaktiosuhteet ovat selvästi pienempiä kuin 1,0, mikä osoittaa, että luovuttajalla on syöpä. Var-5 sinaiset diagnoosit vahvistavat nämä tulokset.

Käyttämällä hyväksi tämän keksinnön mukaista menetelmää olemme saaneet aikaan fluoresenssimittausmenetel-män, joka antaa vähintään yhtä hyviä tuloksia kuin tavanomainen menetelmä, jota on käytetty ennen tätä keksintöä 10 solujen SCM-reaktioiden määrittämiseen, ja olemme poistaneet erillisen suodatusvaiheen tarpeen ekstrasellulaarisen fluoresenssin kompensoimiseksi sekä siihen liittyvät ongelmat.

Vaikka keksinnön mukaista menetelmää on kuvattu 15 SCM-testin yhteydessä, ymmärrettäneen, että sitä voidaan soveltaa mihin tahansa menetelmään, johon liittyy polaroi-tujen fluoresenssiemissioiden mittaaminen materiaalista, joka on taustafluoresenssia aiheuttavassa substraatissa, jossa taustafluoresenssiemissioiden ja mitattavien emissi-20 oiden välillä on batokrominen siirtymä.

Vaikka tätä keksintöä on tässä kuvattu ja valaistu viitaten sen tiettyihin suoritusmuotoihin, ymmärrettäneen, että sillä voi olla muita liitteenä olevien patenttivaatimusten piiriin sisältyviä suoritusmuotoja.

Claims (20)

1. 22 92877
2. 1. Menetelmä luovuttajan verinäytteen testaamiseksi tilan tai sairauden läsnäolon toteamiseksi luovuttajan 5 elimistössä, menetelmän perustuessa luovuttajan verinäytteestä erotettujen lymfosyyttien vasteeseen, kun ne joutuvat kosketukseen aineen kanssa, joka on tutkittavaan tilaan tai sairauteen liittyvä mitogeeni tai antigeeni, jolloin sairauden tai tilan läsnäolon luovuttajassa seurauk-10 sena aineelle herkistyneiden lymfosyyttien sytoplasmamat-riisin strukturoituneisuudessa (SCM) esiintyvät muutokset osoittavat lymfosyyttivasteen, ja muutos SCM:ssä mitataan lymfosyyttien polarisoidun intrasellulaarisen fluoresenssin avulla, tunnettu siitä, että 15 mitataan vaakasuoraan ensimmäisellä aallonpituudel la ja toisella aallonpituudella ja mitataan pystysuoraan mainitulla ensimmäisellä aallonpituudella ja mainitulla toisella aallonpituudella polarisoituneet fluoresenssi-emissiot lymfosyyttisuspensiosta substraatissa, jolloin 20 mittaukset ensimmäisellä aallonpituudella ja toisella aallonpituudella tehdään aallonpitoisuusalueella, jonka määrää fluoresenssiemissioiden batokrominen siirtymä, saadaan siitä suspension kokonaisfluoresenssiemis-sio kummallakin aallonpituudella, 25 määritetään tekijä, joka edustaa ekstrasellulaari- sesta fluoresenssista johtuvaa fluoresenssiemission koko-naisintensiteetin osaa, johdetaan siitä ekstrasellulaarisen fluoresenssin vaaka- ja pystysuoraan polarisoidun emission intensitee-30 tit, « · * vähennetään ekstrasellulaariset intensiteetit en simmäisellä aallonpituudella mitatuista vaaka- ja pystysuoraan polarisoidun emission intensiteeteistä, jolloin saadaan intrasellulaarisesta fluoresenssista johtuvat pys-35 ty- ja vaakasuoraan polarisoidun emission intensiteetit, ja tämän jälkeen II 23 92877 sovelletaan intrasellulaarisen fluoresenssiemission intensiteettejä suspensiossa olevien lymfosyyttien pola-risaatioarvon (P) laskemiseksi.
3. 2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, 5 tunnettu siitä, että fluoresenssiemissioiden koko- naisintensiteetin ensimmäisellä aallonpituudella ja toisella aallonpituudella määrää sekä ensimmäisellä että toisella aallonpituudella pysty- ja vaakasuoraan polarisoitujen fluoresenssiemissioiden summa seuraavan yhtälön mu-10 kaisesti: ikok = iv + 2(Ih x G) jossa Iv ja IH ovat pysty- ja vaakasuoraan polarisoidut 15 fluoresenssiemissiointensiteetit ja G on korjaustekijä vaaka- ja pystysuoraan polarisoitujen fluoresenssiemissioiden epäyhtenäiselle kululle fluoresenssin mittauslaitteen optisen järjestelmän läpi.
4. 3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, 20 tunnettu siitä, että tekijä F, joka edustaa ekst- rasellulaarisesta fluoresenssista johtuvaa osaa fluore-senssiemission kokonaisintensiteetissä, määrätään suhteesta . 25 Kb - Q F ----------- Kb - K. jossa K, on keskiarvo fluoresenssi-intensiteetin todelli-30 sista mittauksista toisella aallonpituudella jaettuna ensimmäisellä aallonpituudella mitatulla fluoresenssi-intensiteetillä lymfosyyttisuspensioiden suodoksille, Kb on intrasellulaarisen fluoresenssi-intensiteetin keskiarvo toisella aallonpituudella jaettuna ensimmäisellä aallonpituu-35 della mitatulla intrasellulaarisella fluoresenssi-intensi- • · 24 92877 teetillä, jolloin K„ ja Kb ovat kulloinkin käytettävälle laitteistolle ominaisia vakioita, ja Q on kokonaisintensi-teetti toisella aallonpituudella jaettuna kokonaisintensi-teetillä ensimmäisellä aallonpituudella.
5. 4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että ekstrasellulaarisen fluoresenssin pystysuuntaan polarisoitu emissiointensiteetti johdetaan seuraavasta yhtälöstä: l|cok(M) x F IV(X1) = 1 + 2[ (1 - Pk/ 1 + Pk) ] jossa lV(M) on pystysuoraan polarisoitu ekstrasellulaarinen 15 intensiteetti ensimmäisellä aallonpituudella, Ikok(X1) on f luoresenssiemissioiden kokonaisintensiteetti ensimmäisellä aallonpituudella, F on tekijä, joka edustaa ekstrasel-lulaarisesta fluoresenssista johtuvaa osaa fluoresenssi-emission kokonaisintensiteetistä, ja Pk on vakio, joka saa-20 daan yhtälöstä: ! V suodos G X I Hsuodoa pk ------------------------
6. 1 Vsuodos t G X Insuodoa jossa IvmkxJoj on f luorogeenisen substraatin, josta lymfosyytit on suodatettu, pystysuoraan polarisoitu fluore-senssiemissiointensiteetti, 1^.^ on fluorogeenisen substraatin, josta lymfosyytit on suodatettu, vaakasuoraan po-30 larisoitu fluoresenssiemissiointensiteetti ja G on kor- jaustekijä pysty- ja vaakasuoraan polarisoitujen fluore-senssiemissioiden epäyhtenäiselle kululle fluoresenssin mittauslaitteen optisen järjestelmän läpi.
7. 5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, 35 tunnettu siitä, että ekstrasellulaarisen fluore- tl 25 9 2 8 7 7 senssin vaakasuoraan polarisoitu emissiointensiteetti johdetaan yhtälöstä: ikok(M) x F 5 χΗ(λΐ) = - A + P. \ 2 + (---------I X G \1 - Pk / 10 jossa IH(M) on vaakasuoraan polarisoitu ekstrasellulaarinen intensiteetti ensimmäisellä aallonpituudella, Ikok(M) on f luoresenssiemissioiden kokonaisintensiteetti ensimmäisellä aallonpituudella, F on tekijä, joka edustaa ekstrasel-lulaarisesta fluoresenssista johtuvaa osaa fluoresenssie-15 mission kokonaisintensiteetistä ja Pk on vakio, joka saadaan yhtälöstä
8. 1 Vsuodos — G X 1 Hsuodos pk =----------------------- 2 0 1 Vsuodos + G X 1 Hsuodos jossa Ivsuodos on f luorogeenisen substraatin, josta lymfosyytit on suodatettu, pystysuoraan polarisoitu fluore-senssiemissiointensiteetti, IH$Uodo. on f luorogeenisen subst-25 raatin, josta lymfosyytit on suodatettu, vaakasuoraan polarisoitu fluoresenssiemissiointensiteetti ja G on kor-jaustekijä pysty- ja vaakasuoraan polarisoitujen fluo re-senssiemissioiden epäyhtenäiselle kululle fluoresenssin mittauslaitteen optisen järjestelmän läpi.
9. 6. Patenttivaatimuksen 4 tai 5 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että Pk on 0,0254 lämpötilassa 27 °C.
10. 7. Jonkin patenttivaatimuksen 1-6 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että fluorogeeninen sub-35 straatti on fluoreseiinidiasetaatti. * » 26 92877
11. 8. Patenttivaatimuksen 7 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että ekstrasellulaarisista fluore-senssiemissioista johtuvan fluoresenssiemissiospektrin ja intrasellulaaristen fluoresenssiemissioiden välillä on 5 batokrominen siirtymä noin 5-10 nm.
12. 9. Patenttivaatimuksen 7 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että ensimmäinen aallonpituus on 510 nm ja toinen aallonpituus on 515 - 520 nm.
13. 10. Patenttivaatimuksen 9 mukainen menetelmä, 10 tunnettu siitä, että toinen aallonpituus on 515 nm.
14. 11. Patenttivaatimuksen 7 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että ensimmäinen aallonpituus on 527 nm ja toinen aallonpituus on 532 - 537 nm.
15. 12. Patenttivaatimuksen 11 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että toinen aallonpituus on 532 nm.
16. 13. Menetelmä polarisoitujen fluoresenssiemissioiden mittaamiseksi suspensiosta, joka sisältää fluoresoivia 20 soluja substraatissa, joka aiheuttaa taustafluoresenssia, erottamatta fluoresoivia soluja substraatista, tunnettu siitä, että a. mitataan suspensiosta tulevat vaakasuoraan ja pystysuoraan polarisoidut fluoresenssiemissiot, jolloin 25 mittaukset tehdään ensimmäisellä aallonpituudella ja toisella aallonpituudella, jotka ovat aallonpituusalueella, jonka määrää ekstrasellulaarisista fluoresenssiemissioista johtuvien fluoresenssiemissioiden batokrominen siirtymä, ja saadaan niistä suspension kokonaisfluoresenssiemissio 30 kummallakin aallonpituudella seuraavan yhtälön mukaisesti: • · f Ijcok = ly + 2(Ih X G) jossa Iv ja IH ovat pysty- ja vaakasuoraan polarisoidut 35 fluoresenssiemissiointensiteetit ja G on korjaustekijä 11 27 92877 vaaka- ja pystysuoraan polarisoitujen fluoresenssiemis-sioiden epäyhtenäiselle kululle fluoresenssin mittauslaitteen optisen järjestelmän läpi, b. määritetään tekijä F, joka edustaa ekstrasellu-5 laarisesta fluoresenssista johtuvaa osaa fluoresenssiemis- sion kokonaisintensiteetistä, jolloin tekijä F määritetään yhtälöstä: Kb - Q
17. 10 F ----------- Kb - K, jossa K, on keskiarvo fluoresenssi-intensiteetin todellisista mittauksista toisella aallonpituudella jaettuna en-15 simmäisellä aallonpituudella mitatulla fluoresenssi-intensiteetillä lymfofosyyttisuspensioiden suodoksille, K„ on intrasellulaarisen fluoresenssi-intensiteetin keskiarvo toisella aallonpituudella jaettuna intrasellulaarisella fluoresenssi-intensiteetillä ensimmäisellä aallonpituudel-20 la, jolloin Ka ja Kb ovat kulloinkin käytettävälle laitteistolle ominaisia vakioita, ja Q on kokonaisintensi-teetti toisella aallonpituudella jaettuna kokonaisintensi-teetillä ensimmäisellä aallonpituudella, c. johdetaan tekijästä ekstrasellulaarisen fluore-25 senssin pysty- ja vaakasuoraan polarisoidut emissiointen- siteetit seuraavien yhtälöiden mukaisesti: ikok(XI) x F !v(xi) = 30 1 + 2 [ (1 - Pk/ 1 + Pk) ] • < • · 28 92877 ja ^kok(Xl) X F ΪΗίλΙ) = “ 5 /l + Pk \ 2. f---------] X G v - ρ* / joissa IV(xi) on pystysuoraan polarisoitu fluoresenssiemis-10 siointensiteetti ensimmäisellä aallonpituudella, ΙΗ(λ1) on vaakasuoraan polarisoitu ekstrasellulaarinen intensiteetti ensimmäisellä aallonpituudella, Ikok(X1) on fluoresenssiemis-sioiden kokonaisintensiteetti ensimmäisellä aallonpituudella, F on tekijä, joka edustaa ekstrasellulaarisesta 15 fluoresenssista johtuvaa osaa fluoresenssiemission koko-naisintensiteetistä, ja Pk on vakio, joka saadaan yhtälöstä: i Vsuodos “ G X I Hsuodos
18. 20 Pk =----------------------- iysuodos ** G X I Hjuodos jossa Ivsuodoi on substraatin, josta lymfosyytit on suodatettu, pystysuoraan polarisoitu fluoresenssiemissiointensi-25 teetti, IHsuodos on substraatin, josta lymfosyytit on suodatettu, vaakasuoraan polarisoitu fluoresenssiemissiointen-siteetti ja G on korjaustekijä pysty- ja vaakasuoraan polarisoitujen fluoresenssiemissioiden epäyhtenäiselle kululle fluoresenssin mittauslaitteen optisen järjestelmän . 30 läpi, ja d. vähennetään ekstrasellulaariset intensiteetit ensimmäisellä aallonpituudella mitatuista pysty- ja vaakasuoraan polaroiduista emissiointensiteeteistä, jolloin saadaan intrasellulaarisesta fluoresenssista johtuvat vaa-35 ka- ja pystysuoraan polarisoidut emissiointensiteetit, ja II 92877 29 tämän jälkeen sovelletaan intrasellulaarisia fluoresenss-iemissiointensiteettejä suspensiossa olevien solujen pola-risaatioarvon (P) laskemiseen.
19. 14. Menetelmä polarisoitujen fluoresenssiemissioi-5 den mittaamiseksi fluoresoivasta materiaalista, joka on taustafluoresenssia aiheuttavassa ympäristössä, erottamatta fluoresoivaa materiaalia ympäristöstä, tunnettu siitä, että a. mitataan vaaka- ja pystysuoraan polarisoidut 10 fluoresenssiemissiot ympäristössä olevasta materiaalista, jolloin mittaukset tehdään ensimmäisellä aallonpituudella ja toisella aallonpituudella, jotka ovat aallonpituusalueella, jonka määrää taustafluoresenssiemissioista johtuvien fluoresenssiemissioiden batokrominen siirtymä, ja saa-15 daan niistä ympäristössä olevan fluoresoivan materiaalin kokonaisfluoresenssiemissio kummallakin aallonpituudella seuraavan yhtälön mukaisesti: i|colc = ly + 2 (IH X G) 20 jossa Iv ja IH ovat pysty- ja vaakasuoraan polarisoidut fluoresenssiemissiointensiteetit ja G on korjaustekijä vaaka- ja pystysuoraan polarisoitujen fluoresenssiemissioiden epäyhtenäiselle kululle fluoresenssin mittauslait-25 teen optisen järjestelmän läpi, b. määritetään tekijä F, joka edustaa taustafluore-senssista johtuvaa osaa fluoresenssiemission kokonaisin-tensiteetistä, jolloin tekijä F määritetään yhtälöstä:
20. 30 Kb - Q - F ----------- Kb - K. jossa K, on keskiarvo vain taustafluoresenssin fluoresens-35 si-intensiteetin todellisista mittauksista toisella aal- 30 92877 lonpituudella jaettuna vain mainitun fluoresenssin ensimmäisellä aallonpituudella mitatulla fluoresenssi-intensiteetillä, Kb on fluoresoivan materiaalin fluoresenssi-intensiteetin keskiarvo taustafluoresenssin puuttuessa toi-5 sella aallonpituudella jaettuna fluoresoivan materiaalin fluoresenssi-intensiteetillä taustaf luoresenssin puuttuessa ensimmäisellä aallonpituudella, jolloin K, ja Kb ovat kulloinkin käytettävälle laitteistolle ominaisia vakioita, ja Q on kokonaisintensiteetti toisella aallonpituudella 10 jaettuna kokonaisintensiteetillä ensimmäisellä aallonpituudella, c. johdetaan tekijästä taustafluoresenssin pystyjä vaakasuoraan polarisoidut emissiointensiteetit seuraa-vien yhtälöiden mukaisesti: 15 Ikok(Xl) X F Wl) = 1 + 2 [(1 - PJ 1 + Pk)] ja 20 ^IOC<Xl) X f = Λ+ ρΛ 2 +(--------) X G 25 \1 - Pk / ' jossa IV(x,) on pystysuoraan polarisoitu fluoresenssiemissio ensimmäisellä aallonpituudella, ΙΗ(λΙ) on vaakasuoraan polarisoitu taustafluoresenssi-intensiteetti ensimmäisellä 3 0 aallonpituudella, Iux<m) on fluoresenssiemissioiden kokonaisintensiteetti ensimmäisellä aallonpituudella, F on tekijä, joka edustaa taustafluoresenssista johtuvaa osaa fluoresenssiemission kokonaisintensiteetistä, ja Pk on vakio, joka saadaan yhtälöstä: II 92877 31 ^Vsuodos ^ ^ ^Hsuodos pk =-----------------------