FI91084B - Menetelmä salinomysiini-antibiootin valmistamiseksi - Google Patents

Description

91084

Menetelmä salinomysiini-antibiootin valmistamiseksi Tämä keksintö koskee parannettua menetelmää salinomysiini-5 antibiootin valmistamiseksi fermentoimalla mikro-organismi-lajia Streptomyces albus, joka on talletettu mikro-organis-mikokoelmaan American Type Culture Collection, Rockville, USA, nro ATCC 21838 ja mikro-organismikokoelmaan Fermentation Research Institute, Chibe, FERM-P nro 419, Japani.

10

On hyvin tunnettua, että salinomysiiniä valmistetaan mikro-organismin Streptomyces albus eri lajien avulla aerobisissa kasvuolosuhteissa ravintovällaineissa, jotka sisältävät orgaanista hiililähdettä, kuten tärkkelystä, soijaöljyä, glu-15 koosia, typpilähdettä, kuten ammoniumsulfaattia, ammonium-kloridia ja mineraalisuoloja, kuten CaC03:a, Kl^PO^a,

NaCl:a ja MgS04:a.

Salinomysiiniantibiootin pienet määrät fermentointiliemessä 20 ja ravintoväliainekoostumuksen suuret kustannukset kannustavat jatkuvasti parempien ratkaisujen etsintään, joilla saavutetaan suurempi saanto ja halvempi tuotanto.

Salinomysiinimolekyyli on erittäin monimutkainen ja kuuluu 25 niin kutsuttuihin syklisiin polyeetterirakenteisiin, joissa on suurehko määrä metyyli- ja etyylisivuradikaaleja.

Kemiallisesti polyeetteriantibiootit ovat haaraketjuisten polyhydroksirasvahappojen johdannaisia. Salinomysiinin bio-30 synteesi alkaa todennäköisesti asetaatti-, propionaatti- ja butyraattiprekursoreista polyketidireittiä. Muita vastaavia reittejä ei ole luonnollisestikaan poissuljettu. Näin ollen erilaiset öljyt ovat ravintovällaineiden perustana mainittua mikro-organismia viljeltäessä. Johtuen öljyjen suuresta mää-35 rästä ravintovällaineessa tarvitaan voimakasta ilmastusta ja sekoitusta, mikä aiheuttaa voimakasta vaahtoamista, jota voidaan vähentää vain erikoisella silikonityyppisellä vaah-donestoaineella.

2

Salinomysiiniantibiootti ja mikro-organismi ATCC 21838, joka tuottaa sanottua antibioottia, saatiin ensimmäistä kertaa vuonna 1972 japanilaisessa yhtiössä Raken Chemical Co. (JP-patentti 21553). Muunnoksia ensimmäisestä menetelmästä on 5 myös patentoitu. Saannot ovat kuitenkin hyvin pieniä, vain 100-500 μg/ml.

Myöhemmin patentoitiin uusi, edistyksellinen monivaihepro-sessi uusine muunnelmineen, joiden saannot olivat jopa 10 60 000 pig/ml. Ravintovällaineet sisälsivät jopa 25 % öljyä, mikä on hyvin epätavallista kaikille tunnetuille fermentoin-neille (EP-patentti 0 000 037). Sanotussa prosessissa käytettiin erikoista silikonityyppistä vaahdonestoainetta KM-68-2F (Shinetsu Chemical Industry Co. Ltd).

15

Nyt kyseessä olevassa tutkimuksessa on havaittu, että osa metyylisivuketjuista on peräisin metioniini-aminohaposta. Mikro-organismit saavat aikaan sanottua happoa yleisissä ravintovällaineissa soijapapujauhon hydrolyysin avulla. Tämä 20 tutkimus on osoittanut, että salinomysiinin biosynteesejä voidaan voimakkaasti stimuloida metioniinilla. Stimulointi on paljon voimakkaampi vitamiinien läsnäollessa, jotka ovat välttämättömiä transmetyloiville ja karboksyloiville entsyy-mireaktioille. Sanottuja vitamiineja ovat edullisesti vita-25 miini D-biotiini ja pyridoksiini (vitamiini Bg).

Edellä mainitun keksinnön pohjalta valmistettiin fermentoin-tialustakoostumus, joka sisälsi hiililähteen (soijapapuöl-jyä, melassia, tärkkelystä), typpilähteen (soijapapujauhoa, 30 (NH4)2SO4:a), epäorgaanisia suoloja (KCl:a, NaCl:a, CaC03:a, KH2P04:a), DL-metioniiniaminohappoa ja mahdollisesti joko H-vitamiinia, ts. D-biotiinia, tai Bg-vitamiinia. Tällaisella ravintoväliaineen koostumuksella saadaan suuremmat saannot, jopa 100 %:n saannot samassa ajassa ja samoissa olosuhteissa 35 samalla, kun vaahtoamista voidaan vähentää halvempien vaah-donestoaineiden avulla.

Il 3 91084

On mielenkiintoista, että molempien vitamiinien samanaikaisella läsnäololla ravintovällaineessa on ehkäisevä vaikutus salinomysiinin biosynteesiin.

5 Menetelmälle antibioottisen salinomysiinin valistamiseksi fermentoimalla mikro-organismia Streptomyces albus ATCC 21838 on luonteenomaista, että sanottua mikro-organismia submerssiviljellään aerobisissa olosuhteissa pH:ssa 5,5-6,5 ja 26-29°C:n lämpötilassa ensin kasvuvaiheessa ja sen jäl-10 keen fermentointivaiheessa ravintovällaineessa, joka koostuu hiililähteestä, typpilähteestä, mineraalisuoloista, DL-metioniiniaminohaposta, jota on 0,01-0,15 %, ja mahdollisesti joko D-biotiinivitamiinista, jota on 10-20 μg/ml, tai Bg-vitamiinista, jota on 5-10 μg/ml. D-biotiinivitamiinia ja 15 Bg-vitamiinia ei saa olla samanaikaisesti läsnä ravintoväli-aineessa.

Kasvuvaiheessa sitä kasvatetaan esim. 40-60 tuntia ja fermentointivaiheessa esim. 110-210 tuntia.

20

Seuraava taulukko esittää salinomysiinin saantoja laboratoriomittakaavassa .

Ravintoväliaine Saanto: μg/ml/200 h 25 ------------------------------------------------------------

Standardi väliaine 1 3000

Standardi väliaine + 0,01 % metioniinia 4000

Standardi väliaine + 0,01 % metioniinia + 20 μg/ml D-biotiinia 6000 30 Standardi väliaine + 0,01 % metioniinia + 10 μg/ml Bg-vitamiinia 4500

Standardi väliaine + 0,01 % metioniinia + 20 μg/Inl D-biotiinia + 10 μg/ml Bg-vitamiinia 1700 35 väliaineen koostumus, kuten esimerkissä 1.

4

Fermentointiväliaineen voimakkaamman vaahtoamisen tapauksessa käytetään eri vaahdonestoaineita, kuten kasviöljyä, sili-konityyppisiä vaahdonestoaineita, jne.

5 Antibiootti eristetään fermentoidusta liemestä standardi-menetelmällä .

Kuten edellä mainittiin, patentti- ja muussa teknillisessä kirjallisuudessa neuvotaan, että vaahto voidaan menestykselle) lisesti tuhota vain erikoisella silikonityyppisellä vaahdon-estoaineella (KM-68-2P, Shinetsu Chemical Industry, Japani).

Tässä menetelmässä väliaineen koostumus on sellainen, ettei voimakasta vaahtoamista tapahdu; jos vaahtoamista kuitenkin 15 ilmenee, se voidaan tuhota muilla, halvemmilla vaahdonesto-aineilla.

Salinomysiini-antibiootin pitoisuus viljelyalustassa määritetään biotestimenetelmällä mikro-organismin S. cereus avul-20 la.

Tätä keksintöä kuvataan seuraavien esimerkkien avulla eikä se rajoitu millään lailla niihin.

25 Esimerkki 1

Mikro-organismia Streptomyces albus 80614 (ATCC 21838) viljellään vinoagarilla viljelyväliaineessa, jolla on seuraava koostumus: 30 lihauutetta 10 g hiivauutetta 4 g glukoosia 4 g agaria 20 g vettä 1000 ml:aan asti pH = 5,8-6,0; steriloinnin jälkeen 6,2-6,4.

II

35 5 91084

Ravintovällainetta on edeltä käsin steriloitu 120°C:ssa 20 minuutin ajan. Näin valmistettuun ravintovällaineeseen lisätään Streptomyces albus -itiöiden suspensio ja sanottua suspensiota inkuboidaan 28°C:ssa 8-10 päivää. Itiöitä muodostanut myseeli, 5 joka kasvaa vinoagarilla, suspendoidaan uudelleen 0,l-%:iseen Tween 80 -liuokseen (10 ml). Näin valmistettu suspensio lisätään kasvuravintovällaineeseen, jolla on seuraava koostumus: glukoosia 4 % 10 soijapapujauhoa 1 % hiivauutetta 0,5 % jauhettua CaCC>3:a 0,2 % vettä 100 %:iin asti 15 Ravintoväliaineen pH steriloinnin jälkeen on 6,6-7,0.

Mikro-organismin kasvatuksen kasvuvaihe kestää aina 48 tuntiin asti 28°C:n lämpötilassa kierrosnopeudella 220 rpm ja sitä käytetään siirrosteena; siirrosteen pH on 6,4-6,8.

20

Fermentoinnin ravintovällaineeseen siirrostetaan 5-6 til.-% kasvuviljelmää. Fermentointialustalla on seuraava koostumus: soijapapuöljyä 10 % 25 soijapapujauhoa 1 % maissitärkkelystä 0,5 % (NH4)2S04 0,3 % KC1 0,2 %

NaCl 0,2 % 30 KH2P04 0,02 %

CaC03 0,5 %

MgS04 0,01 % DL-metioniinia 0,01 % vettä 100 %:iin asti

Fermentointialustaa steriloidaan 120°C:ssa 30 minuuttia ja pH steriloinnin jälkeen on 7,5. Fermentoinnin päätyttyä, ts. 200-210 tunnin kuluttua 28°C:ssa salinomysiinipitoisuus viljely- 35 6 alustassa on 400 pg/ml. Fermentoinnin aikana öljyn pitoisuutta ravintovällaineessa pidetään jatkuvasti välillä 3-4 % ja pH arvossa 5,8 10-%:isella ammoniakkiliuoksella. Vaahto tuhotaan silikonityyppisellä vaahdonestoaineella 1510 Dow Corning.

5

Esimerkki 2

Menetellään, kuten esimerkissä 1 paitsi, että fermentointi-ravintoväliaine sisältää lisäksi D-biotiinivitamiinia 20 μ9/ιη1:η pitoisuuden. Fermentoinnin päätyttyä 200 tunnissa 10 salinomysiinin saanto on 6000 jzg/ml.

Esimerkki 3

Menetellään, kuten esimerkissä 1 paitsi, että fermentointi-ravintoväliaine sisältää lisäksi Bg-vitamiinia 10 μg/ml:n 15 pitoisuuden. Fermentoinnin päätyttyä 200 tunnissa salinomysiinin saanto on 6000 μg/ml.

Esimerkki 4

Menetellään, kuten esimerkissä 2 paitsi, että fermentointi-20 avintoväliaineen koostumus on seuraava: soijapapuöljyä 10 % s o i j apapu jauhoa l % maissin liuotusnestettä 1 % 25 melassia 1 % DL-metioniinia 0,01 % D-biotiinia 0,002 % NH4C1 0,11 %

CaC03 0,5% 30 NaCl 0,2 % KC1 0,2 % KH2P04 0,02 %

MgS04 0,01 % vettä 100 %:iin asti

Fermentoinnin päätyttyä 190 tunnissa salinomysiinin saanto on 8000 μg/ml.

II

35

Claims (4)

91084

1. Menetelmä saiinomysiini-antibiootin valmistamiseksi fermentoimalla mikro-organismia Streptomyces albus ATCC 21838, jota mikro-organismia submerssiviljellään aerobisissa 5 olosuhteissa pH-arvossa 5,5-6,5 ja 26-29°C:n lämpötilassa ensin kasvuvaiheessa ja sen jälkeen fermentointivaiheessa ravintovällaineessa, joka koostuu hiililähteestä, typpiläh-teestä ja mineraalisuoloista, tunnettu siitä, että ravinto-väliaineeseen lisätään DL-metioniiniaminohappoa, jota on 10 0,01-0,15 %, ja mahdollisesti joko D-biotiinivitamiinia, jota on 10-20 μg/ml, tai Bg-vitamiinia, jota on 5-10 μg/ml.

2. Patenttivaatimuksen l mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että hiililähteenä käytetään tärkkelystä, kasviöljyjä 15 ja/tai melassia.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että typpilähteenä käytetään soijapapujauhoa, (NH4)2S04:a, maissiliotusnestettä ja Nl^Clra. 20

4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mineraalisuoloina käytetään natriumin, kaliumin, kalsiumin ja/tai magnesiumin sulfaatteja, fosfaatteja, klorideja ja/tai karbonaatteja. 25