FI89362B

FI89362B - Foerfarande Foer framstaellning av nya therapeutiskt tinkande i methylylinkvaeve acylerade staurosporinderivat

Info

Publication number: FI89362B
Application number: FI882808A
Authority: FI
Inventors: Giorgio Caravatti; Andreas Fredenhagen
Original assignee: Ciba Geigy Ag
Priority date: 1987-06-15
Filing date: 1988-06-13
Publication date: 1993-06-15
Also published as: CA1337763C; PT87719A; JPS6434989A; HUT47587A; NZ225018A; ATE134375T1; DK324888D0; YU115488A; IE881787L; NO882613D0; KR890000494A; DK175507B1; GR3019064T3; DE3855015D1; NO882613L; FI882808A; NO170634B; ES2083956T3; FI89362C; FI882808A0

Abstract

N-Substituted derivatives of staurosporin of the formula [Stau]-N(CH3)-R (I> in which [Stau] represents the radical of the sub-formula <IMAGE> in which R represents a hydrocarbyl R<0> or an acyl Ac, which preferably have at most 30 C atoms, and salts of compounds of the formula I having salt-forming properties, are distinguished as selective inhibitors of protein kinase C. They are prepared by conventional alkylation or acylation of staurosporin.

Description

8936289362

Menetelmä uusien terapeuttisesti vaikuttavien, metyyliaminotypessä asyloitujen staurosporiini-johdannaisten valmistamiseksiProcess for the preparation of new therapeutically active staurosporine derivatives acylated in methylamino nitrogen

Tämän keksinnön kohteena on menetelmä uusien terapeuttisesti vaikuttavien staurosporiinin N-substituoitujen johdannaisten valmistamiseksi, joilla on yleinen kaava IThe present invention relates to a process for the preparation of new therapeutically active N-substituted derivatives of staurosporine of general formula I

o HN N't)o HN N't)

^V"^ ^ CH3 N^ V "^ ^ CH3 N

R ^h3 jossa kaavassa R merkitsee kaavan -C(=0)RA mukaista ryhmää, jossa RA on alempialkyyli, trifluorimetyyli, karbok-sialempialkyyli, fenyyli, joka on substituoimaton tai substituoitu halogeenilla, nitrolla, alempialkoksilla, alempialkoksikarbonyyIillä tai karboksilla, alempialkok-si, fenoksi, fenyyliamino, alempialkoksikarbonyyliamino-alempialkyyli tai aminoalempialkyyli, tai jossa R merkitsee kaavan -C(=S)RB mukaista ryhmää, jossa RB on alempial-kyyliamino, alempialkenyylillä, jossa vapaa valenssi lähtee eri hiiliatomista kuin kaksoissidos, substituoitu amino tai fenyyli, sekä suolanmuodostavia ominaisuuksia omaavien kaavan I mukaisten yhdisteiden suolojen valmistamiseksi, jossa menetelmässä a) kaavan I mukaisten yhdisteiden valmistamiseksi, joissa R on kaavan -C(=0)RA mukainen ryhmä, jossa RA tarkoittaa samaa kuin edellä lukuunottamatta karboksifenyyliä, aminoalempialkyyliä ja fenyyliaminoa, kaavan II mukainen 2 89362 staurosporiiniWherein R is a group of the formula -C (= O) RA wherein RA is lower alkyl, trifluoromethyl, carboxy-lower alkyl, phenyl which is unsubstituted or substituted by halogen, nitro, lower alkoxy, lower alkoxycarbonyl or carboxy, lower alkoxy, phenoxy, phenylamino, lower alkoxycarbonylamino-lower alkyl or amino-lower alkyl, or wherein R represents a group of formula -C (= S) RB wherein RB is lower alkylamino, lower alkenyl in which the free valence is derived from a different carbon atom than a double or double bond, substituted for the preparation of salts of compounds of formula I, wherein in process a) for the preparation of compounds of formula I wherein R is a group of formula -C (= O) RA wherein RA is as defined above except for carboxyphenyl, amino lower alkyl and phenylamino, 89362 staurosporine

HNHN

0¾^) y°Y.....ch30¾ ^) y ° Y ..... ch3

NOF

H CH3H CH3

tai sen happoadditiosuola saatetaan reagoimaan kaavan IIIor an acid addition salt thereof is reacted with a compound of formula III

Ra*(C=0)-Y (III) mukaisen reaktiokykyisen karboksyylihappojohdannaisen kanssa, jossa tähteellä RA* on edellä RA:lle esitetyt merkitykset lukuunottamatta karboksifenyyliä, aminoalem-pialkyyliä ja fenyyliaminoa ja Y merkitsee aktivoitua hydroksyyliryhmää, tai b) kaavan I mukaisten yhdisteiden valmistamiseksi, joissa R merkitsee fenyyliaminokarbonyyliä, alempialkyyliamino-tiokarbonyyliä tai alempialkenyylillä, jossa vapaa va-lenssi lähtee eri hiiliatomista kuin kaksoissidos, subs-tituoitu aminotiokarbonyyli, kaavan II mukainen staurosporiini saatetaan reagoimaan kaavan RA'-N=C=0 mukaisen reagenssin kanssa, jossa RA' tarkoittaa fenyyliä, tai kaavan RD'-N=C=S mukaisen reagenssin kanssa, jossa RB1 tarkoittaa alempialkyyliä tai alempialkenyyliä, joka on sitoutunut hiiliatomista, josta ei lähde kaksoissidosta, li 3 89362 ja haluttaessa 1) saadusta suojatusta kaavan I mukaisesta yhdisteestä, jossa R tarkoittaa alempialkoksikarbonyyli-fenyylikar-bonyyliryhmää, lohkaistaan alempialkoksisuojaryhmä, jolloin saadaan kaavan I mukainen yhdiste, jossa R tarkoittaa karboksifenyylikarbonyyliä, tai 2) saadusta suojatusta kaavan I mukaisesta yhdisteestä, jossa R tarkoittaa alempialkoksikarbonyyliamino-alempial-kyylikarbonyyliryhmää, lohkaistaan alempialkoksikarbonyy-lisuojaryhmä, jolloin saadaan kaavan I mukainen yhdiste, jossa R tarkoittaa aminoalempialkyylikarbonyyliryhmää, tai 3) kaavan I mukaisessa yhdisteessä, jossa R tarkoittaa fenyylikarbonyyliä, karbonyyliryhmä muutetaan tiokar-bonyyliryhmäksi reagenssilla, joka vaihtaa hapen rikiksi, jolloin saadaan kaavan I mukainen yhdiste, jossa R tarkoittaa fenyylitiokarbonyyliä, ja/tai 4) muunnetaan vapaassa muodossa saatu kaavan I mukainen yhdiste suolakseen, ja/tai 5) muunnetaan suolana saatu kaavan I mukainen yhdiste sen vapaaseen muotoon tai joksikin toiseksi suolaksi.Ra * (C = O) -Y (III) with a reactive carboxylic acid derivative wherein RA * has the meanings given above for RA except carboxyphenyl, aminoalkylalkyl and phenylamino and Y represents an activated hydroxyl group, or b) for the preparation of compounds of formula I in which R represents phenylaminocarbonyl, lower alkylaminothiocarbonyl or, with lower alkenyl in which the free valence starts from a carbon atom other than a double bond, substituted aminothiocarbonyl, a staurosporine of formula II is reacted with RA of the formula RA '-N = C = O means phenyl, or with a reagent of formula RD'-N = C = S, wherein RB1 represents lower alkyl or lower alkenyl bonded from a carbon atom not having a double bond, li 3 89362 and, if desired 1) obtained from a protected compound of formula I wherein R means a lower alkoxycarbonyl-phenylcarbonyl group, cleaved below an alkoxy protecting group to give a compound of formula I wherein R represents carboxyphenylcarbonyl, or 2) a protected compound of formula I wherein R represents a lower alkoxycarbonylamino-lower alkylcarbonyl group to give a lower alkoxycarbonyl protecting group, wherein or 3) in a compound of formula I wherein R represents phenylcarbonyl, the carbonyl group is converted to a thiocarbonyl group by a reagent which converts oxygen to sulfur to give a compound of formula I wherein R represents phenylthiocarbonyl, and / or 4) a free form of a compound of formula I to a salt thereof, and / or 5) converting the compound of formula I obtained as a salt into its free form or into another salt.

Kaavan (II) mukainen staurosporiini, joka on keksinnön mukaisten yhdisteiden perusaine, eristettiin jo vuonna 1977 Streptomvces staurosporeus-vilielmistä AWAYA, TA-KASHI and OMURA. sp. nov. Am. 2282, vrt. Omura, S., Iwai, Y., Hirano, A., Nakagawa, A., Awaya, J., Tsuchiya, H., Takahashi, Y. ja Masuma, R.: J. Antibiot. 30, 275 - 281 (1977), ja tarkastettiin antimikrobisen vaikutuksen suhteen. Tällöin havaittiin myös, että yhdiste vaikuttaa hiivamaisia mikro-organismeja ja sieniä vastaan (MIC n. 3 - 25 mcg/ml) , jolloin sen LDS0-arvo on hydrokloridina 6,6 mg/kg (hiiri, intraperitoneaalisesti). Viime aikoina on laajassa seulonnassa todettu, vrt. Tamaoki, T., Nomoto, H., Takahashi, I, Kato, Y, Morimoto, M. ja Tomita, F.: .**·. Biochem. and Biophys. Research Commun. 135 (No. 2), 397 - 4 S9362 402 (1986), että yhdisteellä on voimakas inhiboiva vaikutus proteiinikinaasi C:hen (rotan aivoista).The staurosporine of formula (II), which is the basic substance of the compounds of the invention, was isolated as early as 1977 from the cultures of Streptomyces staurosporeus AWAYA, TA-KASHI and OMURA. mp. nov. Am. 2282, cf. Omura, S., Iwai, Y., Hirano, A., Nakagawa, A., Awaya, J., Tsuchiya, H., Takahashi, Y., and Masuma, R., J. Antibiot. 30, 275-281 (1977), and tested for antimicrobial activity. In this case, the compound was also found to be active against yeast-like microorganisms and fungi (MIC approx. 3 to 25 mcg / ml), giving an LDS0 value of 6.6 mg / kg as hydrochloride (mouse, intraperitoneally). Recently, extensive screening has found, cf. Tamaoki, T., Nomoto, H., Takahashi, I, Kato, Y, Morimoto, M., and Tomita, F .:. ** ·. Biochem. and Biophys. Research Commun. 135 (No. 2), 397-4 S9362 402 (1986) that the compound has a potent inhibitory effect on protein kinase C (from rat brain).

Fosfolipideistä ja kalsiumista riippuvainen proteiinikinaasi C esiintyy solussa useissa muodoissa ja osallistuu erilaisiin perustapahtumiin, kuten signaalinsiirtoon, solujen jakautumiseen ja erilaistumiseen sekä myös hormonien ja neurotransmittereiden tuotantoon. Näiden entsyymien aktivointi tapahtuu tunnetulla tavalla joko reseptorien kautta välitetyllä solukalvon fosfolipidien hydro-lyysillä tai määrättyjen tuumoria edistävien vaikuttavien aineiden suoralla vuorovaikutuksella. Solun herkkyyteen reseptorivälitteisen signaalinsiirron suhteen voidaan vaikuttaa olennaisesti muuntamalla proteiinikinaasi C:n aktiivisuutta (signaalinsiirtimenä). Yhdisteitä, jotka pystyvät muuntamaan selektiivisesti proteiinikinaasi C:n aktiivisuutta, voidaan käyttää tuumoria estävinä, tulehdusta estävinä, immunomoduloivina ja antibakteerisina vaikuttavina aineina ja ne voivat olla mielenkiintoisia aineita jopa arterioskleroosin ja kardiovaskulaarisen järjestelmän ja keskushermoston sairauksien hoitamiseksi.Phospholipid- and calcium-dependent protein kinase C is present in the cell in several forms and is involved in various basic events such as signal transduction, cell division and differentiation, as well as the production of hormones and neurotransmitters. Activation of these enzymes takes place in a known manner, either by receptor-mediated hydrolysis of cell membrane phospholipids or by direct interaction of certain tumor-promoting active substances. The sensitivity of a cell to receptor-mediated signaling can be substantially affected by modifying the activity of protein kinase C (as a signal transducer). Compounds capable of selectively modulating protein kinase C activity can be used as antitumor, anti-inflammatory, immunomodulatory and antibacterial agents and may be of interest even in the treatment of arteriosclerosis and diseases of the cardiovascular system and central nervous system.

Vaikkakin staurosporiinilla on voimakas estovaikutus proteiinikinaasi C:n suhteen (ks. yllä), se estää yhtä voimakkaasti myös muita proteiinikinaaseja ja sillä ei ole tästä syystä sitä selektiivisyyttä, joka tarvittaisiin terapeuttiseen käyttöön. - Yllättävästi nyt on osoittautunut, että vedyn poistaminen staurosporiinin metyyliami-noryhmässä substituutiolla saa aikaan sen, että näin N-substituoidut johdannaiset säilyttävät tosin selektiivisesti staurosporiinin estoaktiivisuuden proteiinikinaasi C:n suhteen, mutta ovat muiden proteiinikinaasien suhteen olennaisesti vähemmän vaikuttavia. Tämän merkittävästi parantuneen selektiivisyyden johdosta keksinnön mukaiset yhdisteet täyttävät siten myös tärkeän edellytyksen terapeuttista käyttöä varten yllä mainituilla indikaatio- li 5 89362 alueilla, ensisijassa solujen jakautumisen aktivoimiseksi.Although staurosporine has a strong inhibitory effect on protein kinase C (see above), it inhibits other protein kinases just as strongly and therefore does not have the selectivity required for therapeutic use. Surprisingly, it has now been shown that the removal of hydrogen in the methylamino group of staurosporine by substitution results in the N-substituted derivatives thus selectively retaining the inhibitory activity of staurosporine on protein kinase C, but being substantially less effective on other protein kinases. Due to this significantly improved selectivity, the compounds according to the invention thus also fulfill an important condition for therapeutic use in the above-mentioned indication regions, primarily for activating cell division.

Proteiinikinaasi C:n estovaikutuksen määrittämiseksi otettiin ensin proteiinikinaasi C talteen sian aivoista ja puhdistettiin T. Uchidan ja C. R. Filburnin julkaisussa J. Biol. Chem. 259. 12311-4 (1984) esittämän menetelmän mukaisesti. Kaavan I mukaisten yhdisteiden pro-teiinikinaasin estovaikutuksen määrittämiseksi käytettiin perustana metodiikkaa, jonka ovat esittäneet D. Fabro et ai. julkaisussa Arch. Biochem. Biophys. 239. 102 - 111 (1985). Merkittävä proteiinikinaasi C:n esto tapahtui jo n. 0,01 μΜ/1:η konsentraatiosta alkaen. Menetelmä ja saadut tulokset esitetään tarkemmin seuraavassa koeselos-tuksessa, josta käy selkeästi ilmi keksinnön mukaisten asyyli-staurosporiiniyhdisteiden olennaisesti parempi selektiivisyys proteiinikinaasi C:n inhibitiossa verrattuna staurosporiinin aikaansaamaan inhibitioon.To determine the inhibitory effect of protein kinase C, protein kinase C was first recovered from porcine brain and purified by T. Uchida and C. R. Filburn in J. Biol. Chem. 259. 12311-4 (1984). To determine the protein kinase inhibitory activity of the compounds of formula I, the methodology presented by D. Fabro et al. in Arch. Biochem. Biophys. 239. 102 - 111 (1985). Significant inhibition of protein kinase C occurred as early as about 0.01 μΜ / 1: η. The method and the results obtained are presented in more detail in the following experimental description, which clearly shows the substantially better selectivity of the acyl-staurosporine compounds of the invention for the inhibition of protein kinase C compared to the inhibition provided by staurosporine.

Koeselostus 1. MateriaaliTest report 1. Material

Yhdisteet liuotettiin DMSOrhon (10 mM) ja säilytettiin -20 °C:ssa. Laimennokset tehtiin juuri ennen käyttöä DMSO/vesi-seokseen suhteessa 1:1 ja lopullinen DMSO-kon-sentraatio entsyymimäärityksessä oli < 0,5 %. Kaikki käytetyt reagenssit on kuvattu julkaisussa Meyer et ai.,Compounds were dissolved in DMSO (10 mM) and stored at -20 ° C. Dilutions were made just before use in a 1: 1 DMSO / water mixture and the final DMSO concentration in the enzyme assay was <0.5%. All reagents used are described in Meyer et al.,

Int. J. Cancer, 43, 851-856 (1989).Int. J. Cancer, 43, 851-856 (1989).

2. Menetelmät PKC:n puhdistus ja määritys: PKC puhdistettiin sian aivoista käyttäen DEAE-selluloosa-kromatografiaa ja sen jälkeen affiniteettikromatografiaa polyakryyliamidilla immobilisoidulla fosfatidyyliserii- 6 89362 nillä siten kuin Uchida ja Filburn ovat kuvanneet (J.2. Methods Purification and assay of PKC: PKC was purified from porcine brain using DEAE-cellulose chromatography followed by affinity chromatography with polyacrylamide-immobilized phosphatidylserine as described by Uchida and Filburn (J.

Biol. chem., 259. 12311-12314, (1984)) Borner et al.:n esittämin muunnoksin (Int. J. Cancer, 40, 344-348, (1987)). Entsyymin spesifinen aktiivisuus oli 5000 U/mg. Yksi yksikkö PKC-aktiivisuutta määritettiin sellaiseksi entsyymimääräksi, joka siirtää yhden nanomoolin 32P:tä y-[32P]-ATP: stä histoniksi Hl yhdessä minuutissa yhtä mg proteiinia kohti.Biol. chem., 259. 12311-12314, (1984)) as modified by Borner et al. (Int. J. Cancer, 40, 344-348, (1987)). The specific activity of the enzyme was 5000 U / mg. One unit of PKC activity was defined as the amount of enzyme that converts one nanomolar of 32 P from γ- [32P] -ATP to histone H1 per minute per mg of protein.

PKC-aktiivisuus määritettiin olennaisesti siten kuin Fab-bro et ai. ovat kuvanneet (Arch. Biochem. Biophys., 239, 102-111, (1985)) ja suoritettiin reaktioseoksessa, joka sisälsi lopullisessa tilavuudessa 100 μΐ 20 mM TRIS-HC1 pH 7,4, 200 Mg/ml histonia Hl, 300 μΜ CaCl2, 10 mH Mg(N03)2, 10 μg/xαl fosfatidyyliseriiniä, 1 μg/ml dioleii-nia, 24 μΜ ATPrtä (0,25 μΟΐ y- [32P] -ATP) , 2,5 U puhdistettua entsyymiä ja eri konsentraatio inhibiittoreita. 50 μ1:η erät analysoitiin substraatin fosforylaation suhteen siten kuin Witt ja Roskoski ovat kuvanneet (Anal. Biochem., 66, 253-258 (1975)) käyttäen P81-kromatogra-fiapaperia. Entsyymi-inhibitiomääritykset suoritettiin vähintään kahtena itsenäisenä kokeena. Kunkin määrityksen arvo on saatu kolmesta rinnakkaismäärityksestä, joiden standardipoikkeama oli < 10 %.PKC activity was determined essentially as described by Fab-bro et al. have described (Arch. Biochem. Biophys., 239, 102-111, (1985)) and performed in a reaction mixture containing a final volume of 100 μΐ 20 mM TRIS-HCl pH 7.4, 200 Mg / ml histone H1, 300 μΜ CaCl2 , 10 mH Mg (NO 3) 2, 10 μg / xαl phosphatidylserine, 1 μg / ml diolein, 24 μΜ ATP (0.25 μΟΐ γ- [32 P] -ATP), 2.5 U purified enzyme and various concentrations of inhibitors . 50 μl aliquots were analyzed for substrate phosphorylation as described by Witt and Roskoski (Anal. Biochem., 66, 253-258 (1975)) using P81 chromatography paper. Enzyme inhibition assays were performed in at least two independent experiments. The value of each assay is obtained from three replicate assays with a standard deviation of <10%.

cAMP:stä riippuvaisen proteiinikinaasin määritys:Assay for cAMP-dependent protein kinase:

Tri B. Hemmings, F. Miescher Institute, Basel, Sveitsi, suoritti cAMP:stä riippuvaisen proteiinikinaasin eristämisen ja puhdistuksen, ja valmiste saatiin laimennoksena 400 U/ml. cAPM:stä riippuvaisen proteiinikinaasin aktiivisuus määritettiin 100 μ1:η reaktioseoksessa siten kuin Reimann ja Beham ovat kuvanneet (Meth. Enzymol., 99, 51-63 (1983)). Se sisälsi lopullisina konsentraatioina 70 mM MES-NaOH pH 6,9, 75 mM NaCl, 0,5 mM EDTA, 2,5 mM Mg-ase-taattia, 1,2 mg/ml naudan seerumialbumiinia, 0,1 mg/ml kemptidiä, 0,01 U puhdistettua entsyymiä ja eri konsent- 7 89362 raatiot yhdisteitä. Seosta esi-inkuboitiin 2 min. ajan 32 °C:ssa ja reaktio aloitettiin lisäämällä esilämmitettyä 1 mM ATP:tä (0,5 μΟχ γ-[32Ρ]-ΑΤΡ) . 50 μ1:η erät analysoitiin substraatin fosforylaation suhteen käyttäen P81-kromato-grafiapaperia keräysmateriaalina.Isolation and purification of cAMP-dependent protein kinase was performed by Dr. B. Hemmings, F. Miescher Institute, Basel, Switzerland, and the preparation was obtained at a dilution of 400 U / ml. cAPM-dependent protein kinase activity was determined in 100 μl of the reaction mixture as described by Reimann and Beham (Meth. Enzymol., 99, 51-63 (1983)). It contained final concentrations of 70 mM MES-NaOH pH 6.9, 75 mM NaCl, 0.5 mM EDTA, 2.5 mM Mg acetate, 1.2 mg / ml bovine serum albumin, 0.1 mg / ml camptide. , 0.01 U of purified enzyme and various concentrations of compounds. The mixture was preincubated for 2 min. at 32 ° C and the reaction was started by adding preheated 1 mM ATP (0.5 μΟχ γ- [32Ρ] -ΑΤΡ). 50 μl aliquots were analyzed for substrate phosphorylation using P81 chromatography paper as collection material.

Epidermaalisen kasvutekijäreseptorin (EGF-reseptori) tyros iin i spesifisen fosforylaation määritys: EGF-reseptori eristettiin A431-soluista ja entsymaattinen aktiivisuus määritettiin siten kuin House et ai. ovat kuvanneet (Europ. J. Biochem., 140. 363-367 (1984)) pienin muutoksin käyttäen angiotensiini II:ta substraattina. Reaktioseos (50 μΐ) sisälsi 5 μΐ A431-membraanivalmistet-ta (noin 50 μg proteiinia), 10 mM HEPES pH 7,4, 10 mM MgCl2> 1 mM Na3-ortovanadaattia, 0,1 % Triton X-100, 13,5 μΜ 7~[32P]-ATP, 1 μΜ epidermaalista kasvutekijää, 50 μg angiotensiini II:ta ja eri konsentraatiot yhdisteitä. Membraaneja esi-inkuboitiin EGF:n läsnäollessa tai ilman sitä 10 min. jään päällä. Reaktio aloitettiin lisäämällä 7~[32P]-ATP, ja inkubointia jatkettiin 5 min. 37 °C:ssa. Reaktio lopetettiin lisäämällä 100 μΐ 10%:ista trikloo-rietikkahappoa ja jätettiin 30 minuutiksi jään päälle. 5 minuutin sentrifugoinnin jälkeen 1500 gtssä erät superna-tanttia pantiin täpliksi P81-kromatografiapaperille ja suodatinpaperit pestiin 5 kertaa 6%:isella etikkahapolla. Suodatinpaperit kuivattiin ja radioaktiivisuus mitattiin nestetuikelaskurilla.Assay for epidermal growth factor receptor (EGF receptor) tyrosine-specific phosphorylation: The EGF receptor was isolated from A431 cells and enzymatic activity was determined as described by House et al. have described (Europ. J. Biochem., 140. 363-367 (1984)) with minor modifications using angiotensin II as a substrate. The reaction mixture (50 μΐ) contained 5 μΐ of A431 membrane preparations (approximately 50 μg of protein), 10 mM HEPES pH 7.4, 10 mM MgCl 2> 1 mM Na 3 orthovanadate, 0.1% Triton X-100, 13.5 μΜ 7 ~ [32P] -ATP, 1 μΜ epidermal growth factor, 50 μg angiotensin II and various concentrations of compounds. Membranes were preincubated in the presence or absence of EGF for 10 min. on ice. The reaction was started by the addition of 7 - [32 P] -ATP, and the incubation was continued for 5 min. At 37 ° C. The reaction was quenched by the addition of 100 μΐ of 10% trichloroacetic acid and left on ice for 30 minutes. After centrifugation for 5 minutes at 1500 g, aliquots of the supernatant were spotted onto P81 chromatography paper and the filter papers were washed 5 times with 6% acetic acid. The filter papers were dried and the radioactivity was measured with a liquid scintillation counter.

3. Tulokset3. Results

Tulokset on kerätty Taulukkoon 1. Staurosporiini samoin kuin keksinnön mukaiset yhdisteet saivat aikaan konsent-raatiosta riippuvaisen proteiinikinaasi C:n inhibition. Lineaarisella regressioanalyysillä määritetyt IC50-arvot olivat 6 nM ja vastaavasti 32 - 570 nM. Toisin kuin stau-rosporiini, keksinnön mukaiset yhdisteet osoittivat voi- β 89362 makasta selektiivisyyttä, kun suoritettiin cAMP:stä riippuvaisen proteiinikinaasin määritys ja EGF-reseptorin ty-rosiinikinaasiaktiivisuusmääritys. Kuten Taulukossa 1 on esitetty, keksinnön mukaisilla yhdisteillä saadut ICJ0-arvot olivat 12 - yli 800 kertaa suuremmat cAMP:stä riippuvaisen proteiinikinaasin tapauksessa [f=PKA:PKC] ja 10-800 kertaa suuremmat EGF-reseptorin tyrosiinikinaasiak-tiivisuuden ollessa kyseessä [f=TPK:PKC].The results are summarized in Table 1. Staurosporine as well as the compounds of the invention produced a concentration-dependent inhibition of protein kinase C. IC50 values determined by linear regression analysis ranged from 6 nM to 32-570 nM, respectively. In contrast to staurosporine, the compounds of the invention showed potent β 89362 selectivity when performing a cAMP-dependent protein kinase assay and an EGF receptor tyrosine kinase activity assay. As shown in Table 1, the ICJ0 values obtained with the compounds of the invention were 12- to 800-fold higher for cAMP-dependent protein kinase [f = PKA: PKC] and 10-800-fold higher for EGF receptor tyrosine kinase activity [f = TPK: PKC].

9 893629 89362

Taulukko 1table 1

Vaikutukset proteiinikinaasiaktiivisuuksiin in vitro Yhdiste esimerkistä in vitro-entsyymi-inhibitio (IC50, μΜ) PKC PKA [f=PKA:PKC] TPK [f=TPK:PKC] 40 0,014 0,4 29 0,5 36 18 0,050 2,4 48 3,0 60 24 0,150 6,6 44 20 133 23 1,041 1,6 39 6,5 159 13 0,075 1,5 20 5,0 67 14 0,032 2,3 72 0,85 27 26 0,57 6,8 12 6,0 10 36 0,35 28 80 46 131 28 0,063 2,5 40 1,4 22 38 0,125 >100 >800 >100 >800 39 0,064 2,3 36 7,5 117 **/ 0,006 0,015 3 0,025 4 **/ StaurosporiiniEffects on protein kinase activities in vitro Compound from the example in vitro enzyme inhibition (IC50, μΜ) PKC PKA [f = PKA: PKC] TPK [f = TPK: PKC] 40 0.014 0.4 29 0.5 36 18 0.050 2.4 48 3.0 60 24 0.150 6.6 44 20 133 23 1.041 1.6 39 6.5 159 13 0.075 1.5 20 5.0 67 14 0.032 2.3 72 0.85 27 26 0.57 6.8 12 6.0 10 36 0.35 28 80 46 131 28 0.063 2.5 40 1.4 22 38 0.125> 100> 800> 100> 800 39 0.064 2.3 36 7.5 117 ** / 0.006 0.015 3 0.025 4 ** / Staurosporine

PKC: Proteiinikinaasi CPKC: Protein Kinase C

PKA: cAMPistä riippuvainen proteiinikinaasi TPK: Epidermaalisen kasvutekijäreseptorin tyrosiinis- pesifinen proteiinikinaasi f: tekijä, joka osoittaa PKC-inhibition selektiivi- syyttä; selektiivisyysmäärityksen ΙΟ50(μΚ) : IC50 PKC(mM) 10 89362PKA: cAMP-dependent protein kinase TPK: Epidermal growth factor receptor tyrosine-specific protein kinase f: factor showing selectivity for PKC inhibition; selectivity assay ΙΟ50 (μΚ): IC50 PKC (mM) 10 89362

Siten kaavan I mukaisia yhdisteitä ja niiden farmaseuttisesti käyttökelpoisia suoloja voidaan käyttää esim. lääkeaineina, etenkin tuumoria estävinä, tulehdusta estävinä, immunomoduloivina, antibakteerisina aineina, edelleen aineina arterioskleroosin, kardiovaskulaarisen järjestelmän ja keskushermoston sairauksien hoitamiseksi. Tämän keksinnön eräänä kohteena on keksinnön mukaisten yhdisteiden käyttö lääkeaineiden valmistamiseksi, esim. edellä mainittuja käyttötarkoituksia varten, ihmisen ja myös eläinten hoitamiseksi terapeuttisesti ja profylakti-sesti. Tällöin mukaan luetaan myös ammattimainen valmistus.Thus, the compounds of the formula I and their pharmaceutically usable salts can be used, for example, as medicaments, in particular as antitumor, anti-inflammatory, immunomodulatory, antibacterial agents, further as agents for the treatment of arteriosclerosis, diseases of the cardiovascular system and the central nervous system. It is an object of the present invention to provide the use of the compounds according to the invention for the preparation of medicaments, e.g. for the above-mentioned uses, for the therapeutic and prophylactic treatment of humans and also of animals. In this case, professional manufacturing is also included.

Mikäli toisin ei ole esitetty, tässä julkaisussa käsitteellä "alempi" nimetyt orgaaniset tähteet sisältävät korkeintaan 7, etenkin korkeintaan 4 hiiliatomia.Unless otherwise indicated, organic residues referred to as "lower" in this publication contain at most 7, in particular at most 4, carbon atoms.

Alempialkyyli on esim. metyyli, etyyli, n-propyyli, isopropyyli, n-butyyli, isobutyyli, sek-butyyli tai tert-butyyli, edelleen myös n-pentyyli, isopentyyli, n-heksyy-li, isoheksyyli ja n-heptyyli. Alempialkenyyli on esim. allyyli, propenyyli, iso-propenyyli, 2- tai 3-metallyyli ja 2- tai 3-butenyyli. Vastaavissa tyydyttymättömissä tähteissä kaksoissidos sijaitsee korkeammassa kuin α-asemassa vapaan valenssin suhteen.Lower alkyl is, for example, methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl, n-butyl, isobutyl, sec-butyl or tert-butyl, further also n-pentyl, isopentyl, n-hexyl, isohexyl and n-heptyl. Lower alkenyl is, for example, allyl, propenyl, iso-propenyl, 2- or 3-methallyl and 2- or 3-butenyl. In the corresponding unsaturated residues, the double bond is located higher than the α position with respect to the free valence.

Esimerkkinä alempialkoksikarbonyylistä mainittakoon etenkin metoksi-, etoksi-, tert-butoksi- ja bentsyyliok-sikarbonyyliryhmä.Examples of lower alkoxycarbonyl are, in particular, methoxy, ethoxy, tert-butoxy and benzyloxycarbonyl.

Alempialkoksikarbonyyli on esimerkiksi metoksikarbonyy-li, etoksikarbonyyli tai tert-butoksikarbonyyli.Lower alkoxycarbonyl is, for example, methoxycarbonyl, ethoxycarbonyl or tert-butoxycarbonyl.

Halogeeniatomeja ovat etenkin kloori tai fluori, alem-pialkoksi on etenkin C,-C4-alkoksi, kuten metoksi.Halogen atoms are especially chlorine or fluorine, Lower alkoxy is especially C 1 -C 4 alkoxy such as methoxy.

Alempialkaanikarboksyylihappotähteet on johdettu etenkin li li 8 9 362 propioni-, voi-, isovoi-, valeriaana-, isovaleriaana-, kaproni-, trimetyylietikka-, enantyyli- tai dietyylietik-kahaposta ja ennen kaikkea etikkahaposta, edelleen kysymykseen tulevat trifluori- tai trikloorietikkahapon tähteet.Lower alkanecarboxylic acid residues are derived, in particular, from propionic, butyric, isobutyric, valeric, isovaleric, caproic, trimethylacetic, enantyl or diethyl acetic acid and, above all, acetic acid, further suitable trifluoroacetic or trichloroacetic acid residues.

Erityisesti kysymykseen tulevat myös luonnossa esiintyvien L-ryhmän α-aminohappojen glysiini, alaniini, leusiini tai väliini, tähteet, edelleen myös dikarboksyylihappo-jen, kuten oksaalihapon, malonihapon, meripihkahapon, glutaarihapon, adipiinihapon tai maleiinihapon tähteet. Toinen karboksyyliryhmä ei voi olla ainoastaan vapaa, vaan myös esiintyä esim. suolana, mieluummin fysiologisesti yhteensopivana suolana suolan muodostavan emäksisen komponentin kanssa. Kysymykseen tulevat ensisijassa metalli- tai ammoniumsuolat, kuten alkalimetalli- ja maa-alkalimetalli-, esim. natrium-, kalium-, magnesium- tai kalsiumsuolat, tai vast, ammoniumsuolat, jotka on muodostettu ammoniakin tai sopivien orgaanisten amiinien kanssa .In particular, residues of the naturally occurring L-group α-amino acids glycine, alanine, leucine or valine are also suitable, and also residues of dicarboxylic acids, such as oxalic acid, malonic acid, succinic acid, glutaric acid, adipic acid or maleic acid. The second carboxyl group may not only be free, but also exist, e.g., as a salt, preferably as a physiologically compatible salt with the basic salt-forming component. Suitable primarily are metal or ammonium salts, such as alkali metal and alkaline earth metal salts, e.g. sodium, potassium, magnesium or calcium salts, or, respectively, ammonium salts formed with ammonia or suitable organic amines.

Luonteensa mukaisesti keksinnön mukaiset yhdisteet, mikäli ne sisältävät suolan muodostavia ryhmiä, voivat esiintyä myös suolojen, etenkin farmaseuttisesti käyttökelpoisten, s.o. fysiologisesti yhteensopivien suolojen muodossa. Eristämiseen ja puhdistamiseen voidaan käyttää myös farmaseuttisesti sopimattomia suoloja. Terapeuttiseen käyttöön tulevat ainoastaan farmaseuttisesti käyttökelpoiset suolat, jotka ovat etusijalla.By their nature, the compounds of the invention, insofar as they contain salt-forming groups, may also be present in the form of salts, especially pharmaceutically acceptable ones, i. in the form of physiologically compatible salts. Pharmaceutically unsuitable salts can also be used for isolation and purification. Only pharmaceutically acceptable salts are preferred for therapeutic use.

Siten esim. vapaita happoryhmiä, kuten esimerkiksi vapaan sulfo-, fosforyyli- tai karboksyyliryhmän, sisältävät yhdisteet voivat esiintyä suolana, etenkin fysiologisesti yhteensopivana suolana suolan muodostavan emäksisen komponentin kanssa. Ensisijassa kysymykseen tulevat metalli- tai ammoniumsuolat, kuten alkalimetalli- ja maa-alkalimetalli-, esim. natrium-, kalium-, magnesium- tai 12 89362 kalsiumsuolat tai vast, anunoniumsuolat, jotka on muodostettu ammoniakin tai sopivien orgaanisten amiinien, etenkin tertiaaristen monoamiinien ja heterosyklisten emästen, esim. trietyyliamiinin, tri-(2-hydroksietyyli)-amiinin, N-etyylipiperidiinin tai N,N'-dimetyylipiperat-siinin kanssa.Thus, for example, compounds containing free acid groups, such as a free sulfo, phosphoryl or carboxyl group, may exist as a salt, especially as a physiologically compatible salt with the basic salt-forming component. Preferably, metal or ammonium salts, such as alkali metal and alkaline earth metal salts, e.g. sodium, potassium, magnesium or 12 89362 calcium salts or the like, anunonium salts formed with ammonia or suitable organic amines, in particular tertiary monoamines and heterocyclic with bases, e.g. triethylamine, tri- (2-hydroxyethyl) amine, N-ethylpiperidine or N, N'-dimethylpiperazine.

Erittäin edullisia kaavan I mukaisia yhdisteitä ovat esimerkeissä esitetyt.Highly preferred compounds of formula I are those shown in the examples.

Staurosporiinin keksinnön mukainen reaktio tyypin a), s.o. kaavan III mukaisen reagenssin kanssa tapahtuu tunnetuissa menetelmäolosuhteissa, jotka ovat tavanomaisia orgaanisessa kemiassa yleensä amiinien substituoimi-seksi, tavanomaisesti reaktioseoksen jäätymispisteen ja kiehumispisteen välisissä lämpötiloissa, kuten n. -10° -n. +160°C:ssa, etenkin n. +20° - n. +50°C:ssa, atmosfäärisessä tai korotetussa paineessa, heterogeenisessä faasissa (kuten suspensiona) sekoittaen tai ravistaen, tai edullisesti homogeenisessa nestemäisessä faasissa, kuten nestemäisen reagenssin ylimäärässä tai etenkin liuottimien, etenkin orgaanisten liuottimien läsnäollessa ja mahdollisesti happoa sitovien epäorgaanisten tai orgaanisten aineiden läsnäollessa. Sopivia liuottimia ovat esimerkiksi aproottiset orgaaniset alhaisemman polariteetin omaavat liuottimet, kuten alifaattiset ja aromaattiset hiilivedyt, kuten pentaani, heksaani, hep-taani ja sykloheksaani tai vast, bentseeni, tolueeni ja ksyleenit, sekä halogenoidut, etenkin klooratut alifaattiset hiilivedyt, kuten kloroformi ja dikloorimetaani, ja etenkin polaariset aproottiset liuottimet, kuten alifaattiset ja sykliset eetterit, esim. dietyylieetteri, 1,2-dimetoksietaani ja di-isopropyylieetteri tai vast, diok-saani ja tetrahydrofuraani, alempialifaattiset esterit ja amidit, kuten etyyliasetaatti tai vast, formamidi, aseta-midi, N,N-dimetyyliasetamidi ja dimetyyliformamidi, sekä asetonitriili, dimetyylisulfoksidi ja heksametyylifosfo- 13 89362 ritriamidi. Määrätyissä olosuhteissa liuottimena on edullista käyttää myös vettä tai proottista orgaanista liuotinta, kuten alempialkanolia, esim. metanolia, etanolia, isopropyylialkoholia ja tert-butyylialkoholia. sekä glykoli- tai diglykolimonoeetteriä, esim. 2-metok-sietanolia. Tässä tapauksessa on usein edullista edistää reaktionopeutta korotetulla paineella, esim. työskentelemällä suljetuissa astioissa, kiehumis- ja reaktioläm-pötilan korottamiseksi. Liuottimia voidaan käyttää myös tarkoituksenmukaisina yhdistelminä, esim. komponenttien liukenevuuden parantamiseksi.The reaction of sturosporine according to the invention of type a), i.e. with the reagent of formula III takes place under known process conditions which are customary in organic chemistry, generally for the substitution of amines, conventionally at temperatures between the freezing point and the boiling point of the reaction mixture, such as about -10 °. At + 160 ° C, especially at about + 20 ° to about + 50 ° C, at atmospheric or elevated pressure, in a heterogeneous phase (such as a suspension) with stirring or shaking, or preferably in a homogeneous liquid phase, such as an excess of liquid reagent or especially in the presence of solvents, in particular organic solvents and possibly in the presence of acid-binding inorganic or organic substances. Suitable solvents are, for example, aprotic organic solvents of lower polarity, such as aliphatic and aromatic hydrocarbons, such as pentane, hexane, heptane and cyclohexane or, e.g., benzene, toluene and xylenes, as well as halogenated, especially chlorinated, aliphatic hydrocarbons, such as especially polar aprotic solvents such as aliphatic and cyclic ethers, e.g. diethyl ether, 1,2-dimethoxyethane and diisopropyl ether or vast, dioxane and tetrahydrofuran, lower aliphatic esters and amides such as ethyl acetate or vast, formamide, acetamide, , N-dimethylacetamide and dimethylformamide, as well as acetonitrile, dimethylsulfoxide and hexamethylphosphophosphate. Under certain conditions, it is also preferred to use water or a protic organic solvent such as a lower alkanol, e.g. methanol, ethanol, isopropyl alcohol and tert-butyl alcohol. and a glycol or diglycol monoether, e.g. 2-methoxyethanol. In this case, it is often advantageous to promote the reaction rate at elevated pressure, e.g. by working in closed vessels, to increase the boiling and reaction temperature. Solvents can also be used in appropriate combinations, e.g. to improve the solubility of the components.

Happoa sitovina aineina voidaan käyttää periaatteessa mielivaltaisia emäksisiä yhdisteitä, kuten toisaalta orgaanisia typpipitoisia emäksiä, esim. tertiaarisia amiineja, kuten trietyyliamiinia, etyylidi-isopropyy-liamiinia, Ν,Ν-dimetyylianiliinia, N-etyylipiperidiiniä tai N,N1-dimetyylipiperatsiinia, tai aromaattisia hete-rosyklisiä emäksiä, kuten pyridiiniä, kollidiiniä, kino-liiniä tai 4-dimetyyliaminopyridiiniä, toisaalta emäksi-sesti reagoivia epäorgaanisia yhdisteitä, etenkin alka-limetallihydroksideja, -karbonaatteja ja -vetykarbonaat-teja sekä karboksyylihappojen suoloja, kuten natrium- tai kaliumasetaattia.In principle, arbitrary basic compounds can be used as acid-binding agents, such as, on the other hand, organic nitrogen-containing bases, e.g. tertiary amines, such as triethylamine, ethyldiisopropylamine, N, N-dimethylaniline, N-ethylpiperidine or N, rycyclic bases such as pyridine, collidine, quinoline or 4-dimethylaminopyridine, on the other hand, base-reactive inorganic compounds, in particular alkali metal hydroxides, carbonates and bicarbonates, and salts of carboxylic acids or sodium hydroxides, such as sodium.

Lopuksi tähän tarkoitukseen voidaan käyttää myös neutraalisti reagoivia typpipitoisia yhdisteitä, jotka ovat samalla usein myös edullisia liuottimia, esim. karboksyyli-happoamideja, etenkin alempialifaattisia karboksyylihap-poamideja, kuten yllä mainittuja, ja syklisiä amideja, .. . kuten N-metyylipyrrolidonia, sekä hiilihapon amidojohdan naisia, kuten uretaaneja ja virtsa-ainetta.Finally, neutrally reactive nitrogen-containing compounds can also be used for this purpose, which are often also preferred solvents, e.g. carboxylic acid amides, in particular lower aliphatic carboxylic acid amides, as mentioned above, and cyclic amides, ... such as N-methylpyrrolidone, as well as women of the carbonic amido derivative such as urethanes and urea.

Vaikkakin vaihtoreaktion perustana on aina sama periaate ja reaktio tapahtuu yhtenäisen peruskaavion mukaisesti, optimaalista tulosta varten on tarpeen ottaa huomioon käytännön toteutuksessa reaktiokomponenttien, ensisijassa 14 39362 kulloinkin kyseessä olevan kaavan III mukaisen reak-tiokomponentin ominaisuudet.Although the exchange reaction is always based on the same principle and the reaction takes place according to a uniform basic scheme, for optimal results it is necessary to take into account in practice the properties of the reaction components, in particular the reaction component of the formula III in question.

Kaavan III mukaisissa asylointiaineissa, Y merkitsee reaktiokykyiseksi aktivoitua hydroksyyliryhmää. Tällainen esiintyy jo karboksyylihapon vapaassa karboksyyliryhmäs-sä, kun sillä on riittävä reaktiivisuus rakenteen erikoisuuksien ansiosta, kuten trifluorietikkahapossa ja ennen kaikkea muurahaishapossa, mutta etenkin silloin, kun se on aktivoitu tilapäisesti aktivointireagenssien, esim. karbodi-imidien, kuten etenkin disykloheksyylikarbodi-imidin tai di-(2-imidatsolyyli)-karbodi-imidin ja muiden analogisten yhdisteiden vaikutuksella ja mahdollisesti aktiiviesterin muodostavien apuaineiden, kuten substitu-oitujen fenolien ja etenkin N-hydroksiamino-yhdisteiden, kuten 1-hydroksibentsotriatsolin, N-hydroksiftaali-imidin ja N-hydroksimaleiini-imidin tai -sukkinimidin läsnäollessa .In the acylating agents of the formula III, Y denotes a reactivated hydroxyl group. This is already present in the free carboxyl group of the carboxylic acid when it has sufficient reactivity due to structural features such as trifluoroacetic acid and especially formic acid, but especially when it is temporarily activated with activating reagents, e.g. carbodiimides such as dicyclohexylcarbodiimide. (2-imidazolyl) -carbodiimide and other analogous compounds and optionally active ester-forming excipients such as substituted phenols and in particular N-hydroxyamino compounds such as 1-hydroxybenzotriazole, N-hydroxyphthalimide and N-hydroxymaleimine imide or in the presence of succinimide.

Edullinen aktivoitu hydroksyyliryhmä on reaktiokykyinen, vahvoilla hapoilla esteröity hydroksyyliryhmä, joka muodostaa asyylitähteen kanssa happoseka-anhydridin. Näistä on korostettava etenkin halogeenivetyhappojen, etenkin bromivetyhapon ja ennen kaikkea kloorivetyhapon kanssa muodostettuja seka-anhydridejä, s.o. happobromide-ja tai vast, happoklorideja.The preferred activated hydroxyl group is a reactive hydroxyl group esterified with strong acids which forms an acid mixed anhydride with the acyl residue. Of these, special emphasis should be placed on mixed anhydrides formed with hydrohalic acids, in particular hydrobromic acid and, above all, hydrochloric acid, i.e. acid bromides and, or, acid chlorides.

Reaktiokykyinen esteröity hydroksyyliryhmä voi olla esteröity myös joko jonkin toisen karboksyylihapon, kuten muurahaishapon, kloorietikkahapon ja etenkin trif-luorietikkahapon tähteellä ja se voi olla seka-anhydridin perustana, tai se voi olla esteröity samalla asyylitäh-teellä ja muodostaa symmetrisen karboksyy1ihappo-anhydri-din.The reactive esterified hydroxyl group may also be esterified with either a residue of another carboxylic acid, such as formic acid, chloroacetic acid and especially trifluoroacetic acid, and may be based on a mixed anhydride, or may be esterified with the same acyl residue to form a symmetric carboxylic acid.

Asyloitaessa yllä esitetyillä asylointiaineilla työskennellään mieluummin happoa sitovan aineen, kuten jonkin is 39362 yllä mainitun aineen läsnäollessa, jota käytetään edullisesti ekvivalenttisena määränä tai pienenä ylimääränä (joka ei ylitä normaalisti 2 ekvivalenttia).When acylating with the above acylating agents, it is preferable to work in the presence of an acid-binding agent, such as one of the above-mentioned agents, which is preferably used in an equivalent amount or in a small excess (which normally does not exceed 2 equivalents).

Keksinnön mukaisesti haluttaessa saatu kaavan I mukainen yhdiste voidaan muuntaa joksikin toiseksi kaavan I mukaiseksi yhdisteeksi. Alempialkoksikarbonyylin muunto vapaaksi karboksyyliryhmäksi voidaan suorittaa yleensä tavanomaisella hydrolyysillä, ennen kaikkea emästen (kuten etenkin alkalimetalli-hydroksidien, -karbonaattien tai -vetykarbonaattien) vaikutuksessa, tai sopivien estereiden, kuten tertiaaristen alkoholien (esim. tert-butyylialkoholin) estereiden ollessa kyseessä asidolyy-sillä, esim. fluorivedyn tai trifluorietikkahapon avulla.If desired, the compound of formula I obtained according to the invention can be converted into another compound of formula I. The conversion of a lower alkoxycarbonyl to a free carboxyl group can generally be carried out by conventional hydrolysis, in particular under the action of bases (such as especially alkali metal hydroxides, carbonates or bicarbonates), or esters of suitable esters such as tertiary alcohols (e.g. tert-butyl alcohol). with hydrogen fluoride or trifluoroacetic acid.

Kaavan I mukaisten yhdisteiden perusmuotojen haluttaessa suoritettava suolan muodostus ja vapauttaminen niiden suoloista tapahtuu sinänsä yleisesti tunnetulla, tavanomaisella tavalla. Siten kaavan I mukaiset karboksyy-lin sisältävät yhdisteet muunnetaan vastaaviksi suoloiksi emäksillä, ennen kaikkea alkalimetallisuoloiksi käsittelemällä vastaavalla emäksellä, etenkin alkalisesti reagoivalla yhdisteellä, kuten hydroksidilla, karbonaatilla tai bikarbonaatilla. Suolat voidaan muuntaa vapaiksi karboksyyliyhdisteiksi tekemällä happamaksi esim. epäorgaanisilla hapoilla, kuten etenkin halogeenivetyhapoilla. Kaavan I mukaiset emäksisesti reagoivat lopputuotteet, esim. tertiaariset ja kvaternaariset amiinit voidaan muuntaa suoloiksi hapoilla, esim. käsittelemällä suolan muodostukseen sopivalla hapolla, kuten jollakin yllä mainitulla. Kaavan I mukaisen tertiaarisen amiinin emäksinen perusmuoto vapautetaan puolestaan käsittelemällä emäksisesti reagoivilla aineilla, kuten epäorgaanisilla hydroksideilla, karbonaateilla ja bikarbonaateilla, tai orgaanisilla emäksillä ja ioninvaihtimilla.If desired, the salt formation and liberation from the salts of the basic forms of the compounds of the formula I take place in a manner generally known per se. Thus, the carboxyl-containing compounds of the formula I are converted into the corresponding salts with bases, in particular alkali metal salts, by treatment with a corresponding base, in particular an alkali-reactive compound such as hydroxide, carbonate or bicarbonate. The salts can be converted to the free carboxylic compounds by acidification with e.g. inorganic acids, such as especially hydrohalic acids. The basic reactive end products of formula I, e.g. tertiary and quaternary amines, can be converted into salts with acids, e.g. by treatment with an acid suitable for salt formation, as mentioned above. The basic basic form of the tertiary amine of formula I is in turn liberated by treatment with basic reactants such as inorganic hydroxides, carbonates and bicarbonates, or with organic bases and ion exchangers.

Sopivat tämän keksinnön mukaiset yhdisteet voivat muodos- 16 89 362 taa myös sisäisiä suoloja, esim. titraamalla tavanomaisesti hapan-emäksisesti neutraalipisteeseen tai vast, isoelektriseen pisteeseen.Suitable compounds of this invention may also form internal salts, e.g., by conventional acid-base titration to the neutral point or isoelectric point, respectively.

Näitä ja muita uusien yhdisteiden suoloja, kuten esim. pikraatteja voidaan käyttää myös saatujen yhdisteiden puhdistukseen siten, että vapaat yhdisteet muunnetaan suoloiksi, nämä erotetaan ja suoloista otetaan talteen puolestaan vapaat yhdisteet. Johtuen uusien vapaassa muodossa ja suolojen muodossa esiintyvien yhdisteiden läheisestä suhteesta tarkoitetaan edellä ja seuraavassa vapailla yhdisteillä merkityksen- ja tarkoituksenmukaisesti mahdollisesti myös vastaavia suoloja.These and other salts of the novel compounds, such as picrates, can also be used to purify the resulting compounds by converting the free compounds to salts, separating these, and recovering the free compounds from the salts. Due to the close relationship between the new compounds in free form and in the form of salts, the above and the following free compounds mean, meaningfully and expediently, possibly also the corresponding salts.

Sopiva reagenssi joka saa aikaan O-atomin vaihdon S-atomiksi, on esim. Lawesson-reagenssi.A suitable reagent which causes the conversion of an O atom to an S atom is, for example, Lawesson's reagent.

Tämän keksinnön mukaisissa menetelmissä käytetään tunnettuja tai tunnettujen menetelmien mukaisesti saatavia lähtöaineita .The starting materials used in the processes of this invention are known or can be obtained according to known processes.

Mitä tulee uusien kaavan I mukaisten yhdisteiden yllä esitettyihin farmakologisiin ominaisuuksiin, keksinnön mukaisesti valmistettuja vaikuttavia aineita voidaan käyttää yksinään, mahdollisesti apuaineiden kanssa, tai yhdistettynä muiden vaikuttavien aineiden, esim. antibioottien tai kemoterapeuttisten aineiden kanssa, aineina sairauksien hoitamiseksi, joissa, kuten yllä esitettiin, solukasvulla on merkitystä, nimittäin sekä profylaktises-ti että kuratiivisesti. Käytettäessä lääkeaineena keksinnön mukaisesti valmistetut vaikuttavat aineet annetaan profylaktisesti tai vast, kuratiivisesti tehokkaina määrinä, mieluummin farmaseuttisten koostumusten muodossa, jotka on valmistettu yhdessä tavanomaisten farmaseuttisten kantoaineiden tai apuaineiden kanssa. Tällöin annetaan esim. n. 70 kg painavalle lämminveriselle riippuen lajista, painosta, iästä ja yksilöllisestä tilasta li 17 89362 sekä antotavasta ja etenkin myös kulloinkin kyseessä olevasta taudin kuvasta päivittäisinä annoksina n. 1 -1000 mg, joka voidaan vielä ylittää akuuteissa tapauksissa.With respect to the above pharmacological properties of the novel compounds of formula I, the active compounds according to the invention can be used alone, optionally with excipients, or in combination with other active substances, e.g. antibiotics or chemotherapeutic agents, for the treatment of diseases with cell growth. is relevant, namely both prophylactically and curatively. When used as a medicament, the active ingredients according to the invention are administered in prophylactically or curatively effective amounts, preferably in the form of pharmaceutical compositions prepared together with customary pharmaceutical carriers or excipients. In this case, for example, depending on the species, weight, age and individual condition, li 17 89362 and the method of administration, and especially also the image of the disease in question, are administered in a daily dose of about 1-1000 mg, which can still be exceeded in acute cases.

Seuraavat esimerkit havainnollistavat yllä selitettyä keksintöä, mutta ne eivät kuitenkaan rajoita sen laajuutta millään tavoin. Lämpötilat on esitetty celsiusasteina .The following examples illustrate the invention described above, but do not limit its scope in any way. Temperatures are shown in degrees Celsius.

Tuotteiden nimistö johdetaan staurosporiinin täydellisestä runkorakenteestaThe product nomenclature is derived from the complete body structure of staurosporine

HB

\/\ .A___^___A.\ / \ .A ___ ^ ___ A.

Vw wv ( 'Vw wv ('

YjXYJX

S0CH 3S0CH 3

HB

LM 3 jolloin symbolilla N- merkitty substituentti on metyyli-aminoryhmän typpiatomissa.LM 3 wherein the substituent N is on the nitrogen atom of the methylamino group.

Esimerkki 1: N-asetyyli-staurosporiiniExample 1: N-acetyl-staurosporine

Liuokseen, jossa on 116,5 mg (0,25 mmoolia) staurosporii-nia ja 0,065 ml (0,38 mmoolia) N,N-di-isopropyyli-etyyli-amiinia 2 ml:ssa kloroformia, lisätään huoneen lämpötilassa 0,03 ml (0,3 mmoolia) etikkahappoanhydridiä ja - - sekoitetaan suljetussa kolvissa 2 tunnin ajan. Reak- tioseos laimennetaan kloroformilla, pestään natriumbi-karbonaattiliuoksella, kuivatetaan magnesiumsulfaatin päällä ja haihdutetaan. Tuote kiteytetään uudelleen kloroformi/metanolista, sp. 240°.To a solution of 116.5 mg (0.25 mmol) of staurosporine and 0.065 mL (0.38 mmol) of N, N-diisopropylethylamine in 2 mL of chloroform is added 0.03 mL at room temperature. (0.3 mmol) of acetic anhydride and - - stir in a closed flask for 2 hours. The reaction mixture is diluted with chloroform, washed with sodium bicarbonate solution, dried over magnesium sulfate and evaporated. The product is recrystallized from chloroform / methanol, m.p. 240 °.

ie 8936289362 BC

Esimerkki 2; N-(3-karboksipropionyyli)-staurosporiiniExample 2; N- (3-carboxypropionyl) -staurosporiini

Liuokseen, jossa on 116,5 mg (0,25 mmoolia) staurosporii-nia ja 0,065 ml (0,38 mmoolia) N,N-di-isopropyyli-etyyli-amiinia 2 ml:ssa kloroformia, lisätään huoneen lämpötilassa 40 mg (0,4 mmoolia) meripihkahappoanhydridiä ja sekoitetaan suljetussa kolvissa 28 tunnin ajan. Reak-tioseos laimennetaan kloroformilla, pestään 0,1N suola-happoliuoksella, kuivatetaan magnesiumsulfaatin päällä ja haihdutetaan. Raakatuote kromatografoidaan piihappogee-lissä (eluointiaine: metyleenikloridi/etanoli 9:1), sp. 140°. Esimerkki 3: N-bentsoyyli-staurosporiiniTo a solution of 116.5 mg (0.25 mmol) of staurosporine and 0.065 mL (0.38 mmol) of N, N-diisopropylethylamine in 2 mL of chloroform is added at room temperature 40 mg (0 .4 mmol) succinic anhydride and stir in a sealed flask for 28 hours. The reaction mixture is diluted with chloroform, washed with 0.1N hydrochloric acid solution, dried over magnesium sulfate and evaporated. The crude product is chromatographed on silica gel (eluent: methylene chloride / ethanol 9: 1), m.p. 140 °. Example 3: N-benzoyl-staurosporine

Liuokseen, jossa on 116,5 mg (0,25 mmoolia) staurosporii-nia ja 0,065 ml (0,38 mmoolia) N,N-di-isopropyyli-etyyli-amiinia 2 ml:ssa kloroformia, lisätään huoneen lämpötilassa 0,035 ml (0,3 mmoolia) bentsoyylikloridia ja sekoitetaan 10 minuutin ajan. Reaktioseos laimennetaan kloroformilla, pestään natriumbikarbonaattiliuoksella, kuivatetaan magnesiumsulfaatin päällä ja haihdutetaan. Raaka-tuote kromatografoidaan piihappogeelissä (eluointiaine: metyleenikloridi/etanoli 30:1), sp. 235° - 247° värjäytyen ruskeaksi.To a solution of 116.5 mg (0.25 mmol) of staurosporine and 0.065 mL (0.38 mmol) of N, N-diisopropylethylamine in 2 mL of chloroform is added 0.035 mL (0 .3 mmol) benzoyl chloride and stirred for 10 minutes. The reaction mixture is diluted with chloroform, washed with sodium bicarbonate solution, dried over magnesium sulfate and evaporated. The crude product is chromatographed on silica gel (eluent: methylene chloride / ethanol 30: 1), m.p. 235 ° to 247 °, turning brown.

Esimerkki 4: N-trifluoriasetyyli-staurosporiiniExample 4: N-trifluoroacetyl-staurosporine

Liuokseen, jossa on 233 mg (0,5 mmoolia) staurosporiinia ja 0,13 ml (0,6 mmoolia) N,N-di-isopropyyli-etyyliamiinia 2 ml:ssa kloroformia, lisätään huoneen lämpötilassa 0,5 ml (3,57 mmoolia) trifluorietikkahappoanhydridiä ja sekoitetaan 15 minuutin ajan. Reaktioseos laimennetaan kloroformilla, pestään natriumbikarbonaattiliuoksella, kuivatetaan magnesiumsulfaatin päällä ja haihdutetaan. Raakatuote kromatografoidaan piihappogeelissä (eluointiaine: metyleenikloridi/etanoli 20:1), sp. >220°.To a solution of 233 mg (0.5 mmol) of staurosporine and 0.13 mL (0.6 mmol) of N, N-diisopropylethylamine in 2 mL of chloroform is added 0.5 mL (3.57 mL) of mmol) of trifluoroacetic anhydride and stirred for 15 minutes. The reaction mixture is diluted with chloroform, washed with sodium bicarbonate solution, dried over magnesium sulfate and evaporated. The crude product is chromatographed on silica gel (eluent: methylene chloride / ethanol 20: 1), m.p. > 220 °.

α9 89362α9 89362

Esimerkki 5: N-fenoksikarbonyy1i-staurosporiiniExample 5: N-phenoxycarbonyl-staurosporine

Liuokseen, jossa on 116,5 mg (0,25 mmoolia) staurosporii-nia ja 0,065 ml (0,38 mmoolia) N,N-di-isopropyyli-etyyli-amiinia 2 ml:ssa kloroformia, lisätään huoneen lämpötilassa 0,035 ml (0,28 mmoolia) kloorimuurahaishappo-fenyy-liesteriä ja sekoitetaan 30 minuutin ajan suljetussa kolvissa. Reaktioseos laimennetaan kloroformilla, pestään natriumkarbonaattiliuoksella, kuivatetaan magnesiumsulfaatin päällä ja haihdutetaan. Jäännöstä hierotaan kuumalla metanolilla ja jäähtymisen jälkeen se suodatetaan ja kuivatetaan, sp. >210° (haj.).To a solution of 116.5 mg (0.25 mmol) of staurosporine and 0.065 mL (0.38 mmol) of N, N-diisopropylethylamine in 2 mL of chloroform is added 0.035 mL (0 , 28 mmol) chloroformic acid phenyl ester and stir for 30 minutes in a sealed flask. The reaction mixture is diluted with chloroform, washed with sodium carbonate solution, dried over magnesium sulfate and evaporated. The residue is triturated with hot methanol and, after cooling, filtered and dried, m.p. > 210 ° (dec.).

Esimerkki 6: N-metoksikarbonyyli-staurosporiiniExample 6: N-methoxycarbonyl-staurosporine

Liuokseen, jossa on 116,5 mg (0,25 mmoolia) staurosporii-nia ja 0,065 ml (0,38 mmoolia) N,N-di-isopropyyli-etyyli-amiinia 2 ml:ssa kloroformia, lisätään huoneen lämpötilassa 0,025 ml (0,32 mmoolia) kloorimuurahaishappo-metyy-liesteriä ja sekoitetaan tunnin ajan suljetussa kolvissa. Reaktioseos laimennetaan kloroformilla, pestään natrium-bikarbonaattiliuoksella, kuivatetaan magnesiumsulfaatin päällä ja haihdutetaan. Raakatuote kiteytetään uudelleen metanolista, sp. >220° (haj.).To a solution of 116.5 mg (0.25 mmol) of staurosporine and 0.065 mL (0.38 mmol) of N, N-diisopropylethylamine in 2 mL of chloroform is added at room temperature 0.025 mL (0 , 32 mmol) chloroformic acid methyl ester and stir for one hour in a sealed flask. The reaction mixture is diluted with chloroform, washed with sodium bicarbonate solution, dried over magnesium sulfate and evaporated. The crude product is recrystallized from methanol, m.p. > 220 ° (dec.).

Esimerkki 7: N-allyyliaminotiokarbonyyli-staurosporiini (N-allyylitiokarbamoyyli-staurosporiini)Example 7: N-allylaminothiocarbonyl-staurosporine (N-allylthiocarbamoyl-staurosporine)

Liuokseen, jossa on 116,5 mg (0,25 mmoolia) staurosporii-nia 2,5 ml:ssa kloroformia, lisätään 0,029 ml (0,3 mmoolia) allyyli-isotiosyanaattia ja sekoitetaan 12 tunnin ajan suljetussa kolvissa huoneen lämpötilassa. Reaktioseos haihdutetaan ja raakatuote kiteytetään uudelleen kloroformi/metanolista, sp. 220°.To a solution of 116.5 mg (0.25 mmol) of staurosporine in 2.5 mL of chloroform is added 0.029 mL (0.3 mmol) of allyl isothiocyanate and stirred for 12 hours in a sealed flask at room temperature. The reaction mixture is evaporated and the crude product is recrystallized from chloroform / methanol, m.p. 220 °.

Esimerkki 8; N-metyyliaminotiokarbonyyli-staurosporiini (N-metyy1itiokarbamoyy1i-staurosporiini) 20 89362Example 8; N-methylaminothiocarbonyl-staurosporine (N-methylthiocarbamoyl-staurosporine) 20 89362

Liuokseen, jossa on 116,5 mg (0,25 mmoolia) staurosporii-nia 2,5 ml:ssa kloroformia, lisätään 0,022 mg (0,3 mmoolia) metyyli-isotiosyanaattia ja sekoitetaan suljetussa kolvissa 12 tunnin ajan huoneen lämpötilassa. Reaktioseos haihdutetaan ja raakatuote kiteytetään uudelleen kloro-formi/metanolista, sp. 235° - 238°.To a solution of 116.5 mg (0.25 mmol) of staurosporine in 2.5 mL of chloroform is added 0.022 mg (0.3 mmol) of methyl isothiocyanate and stirred in a sealed flask for 12 hours at room temperature. The reaction mixture is evaporated and the crude product is recrystallized from chloroform / methanol, m.p. 235 ° - 238 °.

Esimerkki 9: N-fenyylikarbamoyyli-staurosporiiniExample 9: N-phenylcarbamoyl-staurosporine

Liuokseen, jossa on 116,5 mg (0,25 mmoolia) staurosporii-nia 2,5 mlrssa kloroformia, lisätään 0,033 ml (0,3 mmoolia) fenyyli-isosyanaattia ja sekoitetaan huoneen lämpötilassa 15 minuutin ajan. Reaktioseos haihdutetaan ja raakatuote kiteytetään uudelleen kloroformi/metanolista, sp. 225° - 229° (värjäytyy ruskeaksi).To a solution of 116.5 mg (0.25 mmol) of staurosporine in 2.5 mL of chloroform is added 0.033 mL (0.3 mmol) of phenyl isocyanate and stirred at room temperature for 15 minutes. The reaction mixture is evaporated and the crude product is recrystallized from chloroform / methanol, m.p. 225 ° to 229 ° (turns brown).

Esimerkki 10: N-triklooriasetyyli-staurosporiiniExample 10: N-trichloroacetyl-staurosporine

Liuokseen, jossa on 116,5 mg (0,25 mmoolia) staurosporii-nia ja 0,1 ml (0,58 mmoolia) N,N-di-isopropyyli-etyyli-amiinia 1 mlrssa kloroformia, lisätään huoneen lämpötilassa 0,04 ml (0,35 mmoolia) triklooriasetyylikloridia ja sekoitetaan tunnin ajan. Reaktioseos laimennetaan mety-leenikloridilla ja pestään natriumbikarbonaattiliuoksel-la, kuivatetaan magnesiumsulfaatin päällä ja haihdutetaan. Raakatuote kromatografoidaan piihappogeelissä (eluointiaine: etyyliasetaatti), IR: 1682 (vahva), FAB-MS: 611.To a solution of 116.5 mg (0.25 mmol) of staurosporine and 0.1 mL (0.58 mmol) of N, N-diisopropylethylamine in 1 mL of chloroform is added 0.04 mL at room temperature. (0.35 mmol) trichloroacetyl chloride and stirred for 1 hour. The reaction mixture is diluted with methylene chloride and washed with sodium bicarbonate solution, dried over magnesium sulfate and evaporated. The crude product is chromatographed on silica gel (eluent: ethyl acetate), IR: 1682 (strong), FAB-MS: 611.

Esimerkki 11; N-(3-klooribentsoyyli)-staurosporiiniExample 11; N- (3-chlorobenzoyl) -staurosporiini

Liuokseen, jossa on 116,5 mg (0,25 mmoolia) staurosporii-nia ja 0,065 ml (0,38 mmoolia) N,N-di-isopropyyli-etyyli-amiinia 2 mlrssa kloroformia, lisätään huoneen lämpötilassa 0,038 ml (0,38 mmoolia) 3-klooribentsoyylikloridia ja sekoitetaan tunnin ajan. Reaktioseos laimennetaan kloroformilla, pestään natriumbikarbonaattiliuoksella, INTo a solution of 116.5 mg (0.25 mmol) of staurosporine and 0.065 mL (0.38 mmol) of N, N-diisopropylethylamine in 2 mL of chloroform is added 0.038 mL (0.38 mmol) of mmol) of 3-chlorobenzoyl chloride and stirred for 1 hour. The reaction mixture is diluted with chloroform, washed with sodium bicarbonate solution, 1N

I: 2i 89362 suolahapolla ja kyllästetyllä natriumkloridiliuoksella; kuivatetaan magnesiumsulfaatin päällä ja haihdutetaan. Raakatuote kromatografoidaan piihappogeelissä (eluointi-aine: metyleenikloridi/etanoli 95:5), sp. 240° (haj.).I: 2i 89362 with hydrochloric acid and saturated sodium chloride solution; dried over magnesium sulphate and evaporated. The crude product is chromatographed on silica gel (eluent: methylene chloride / ethanol 95: 5), m.p. 240 ° (dec.).

Esimerkki 12: N-(2-klooribentsoyyli)-staurosporiiniExample 12: N- (2-chlorobenzoyl) -staurosporine

Liuokseen, jossa on 116,5 mg (0,25 mmoolia) staurosporii-nia ja 0,065 ml (0,38 mmoolia) N,N-di-isopropyyli-etyyli-amiinia 2 ml:ssa kloroformia, lisätään huoneen lämpötilassa 0,038 ml (0,38 mmoolia) 2-klooribentsoyylikloridia ja sekoitetaan tunnin ajan. Reaktioseos laimennetaan kloroformilla, pestään natriumbikarbonaattiliuoksella, 1 normaalisella suolahapolla ja kyllästetyllä natriumklo-ridiliuoksella, kuivatetaan magnesiumsulfaatin päällä ja haihdutetaan. Raakatuote kromatografoidaan piihappogeelissä (eluointiaine: metyleenikloridi/etanoli 95:5), sp. 255° (haj.).To a solution of 116.5 mg (0.25 mmol) of staurosporine and 0.065 mL (0.38 mmol) of N, N-diisopropylethylamine in 2 mL of chloroform is added at room temperature 0.038 mL (0 .38 mmol) of 2-chlorobenzoyl chloride and stirred for 1 hour. The reaction mixture is diluted with chloroform, washed with sodium bicarbonate solution, 1N hydrochloric acid and saturated sodium chloride solution, dried over magnesium sulfate and evaporated. The crude product is chromatographed on silica gel (eluent: methylene chloride / ethanol 95: 5), m.p. 255 ° (dec.).

Esimerkki 13: N-(3-nitrobentsoyyli)-staurosporiiniExample 13: N- (3-nitrobenzoyl) -staurosporine

Liuokseen, jossa on 116,5 mg (0,25 mmoolia) staurosporii-nia ja 0,065 ml (0,38 mmoolia) N,N-di-isopropyyli-etyyli-amiinia 2 ml:ssa kloroformia, lisätään huoneen lämpötilassa 55,5 mg (0,30 moolia) 3-nitrobentsoyylikloridia ja sekoitetaan tunnin ajan. Reaktioseos laimennetaan kloroformilla, pestään natriumbikarbonaattiliuoksella, 1 normaalisella suolahapolla ja kyllästetyllä natriumklo-ridiliuoksella, kuivatetaan magnesiumsulfaatin päällä ja haihdutetaan. Raakatuote kromatografoidaan piihappogeelissä (eluointiaine: metyleenikloridi/etanoli 95:5), sp. 230°.To a solution of 116.5 mg (0.25 mmol) of staurosporine and 0.065 mL (0.38 mmol) of N, N-diisopropylethylamine in 2 mL of chloroform is added 55.5 mg at room temperature. (0.30 mol) of 3-nitrobenzoyl chloride and stirred for one hour. The reaction mixture is diluted with chloroform, washed with sodium bicarbonate solution, 1N hydrochloric acid and saturated sodium chloride solution, dried over magnesium sulfate and evaporated. The crude product is chromatographed on silica gel (eluent: methylene chloride / ethanol 95: 5), m.p. 230 °.

Esimerkki 14: N-(4-metoksibentsoyyli)-staurosporiiniExample 14: N- (4-methoxybenzoyl) -staurosporine

Liuokseen, jossa on 116,5 mg (0,25 mmoolia) staurosporii-nia ja 0,065 ml (0,38 mmoolia) N,N-di-isopropyyli-etyyli- 22 89362 amiinia 2 ml:ssa kloroformia, lisätään huoneen lämpötilassa 0,083 ml (0,38 mmoolia) 58-%:ista 4-metoksibent-soyylikloridiliuosta tolueenissa ja sekoitetaan tunnin ajan. Reaktioseos laimennetaan kloroformilla, pestään natriumbikarbonaattiliuoksella, 1 normaalisella suolahapolla ja kyllästetyllä natriumkloridiliuoksella, kuivatetaan magnesiumsulfaatin päällä ja haihdutetaan. Raaka-tuote kromatografoidaan piihappogeelissä (eluointiaine: metyleenikloridi/etanoli 95:5), sp. 220°.To a solution of 116.5 mg (0.25 mmol) of staurosporine and 0.065 mL (0.38 mmol) of N, N-diisopropylethyl-ethyl-89,8362 amine in 2 mL of chloroform is added 0.083 mL at room temperature. (0.38 mmol) of a 58% solution of 4-methoxybenzoyl chloride in toluene and stirred for 1 hour. The reaction mixture is diluted with chloroform, washed with sodium bicarbonate solution, 1N hydrochloric acid and saturated sodium chloride solution, dried over magnesium sulfate and evaporated. The crude product is chromatographed on silica gel (eluent: methylene chloride / ethanol 95: 5), m.p. 220 °.

Esimerkki 15: N-(4-fluoribentsoyyli)-staurosporiiniExample 15: N- (4-fluorobenzoyl) -staurosporine

Liuokseen, jossa on 116,5 mg (0,25 mmoolia) staurosporii-nia ja 0,065 ml (0,38 mmoolia) N,N-di-isopropyyli-etyyli-amiinia 2 ml:ssa kloroformia, lisätään huoneen lämpötilassa 0,036 ml (0,30 mmoolia) 4-fluoribentsoyylikloridia ja sekoitetaan tunnin ajan. Reaktioseos laimennetaan kloroformilla, pestään natriumbikarbonaattiliuoksella, 1 normaalisella suolahapolla ja kyllästetyllä natriumkloridiliuoksella, kuivatetaan magnesiumsulfaatin päällä ja haihdutetaan. Raakatuote kromatografoidaan piihappogeelissä (eluointiaine: metyleenikloridi-etanoli 95:5), sp. 225° (haj.).To a solution of 116.5 mg (0.25 mmol) of staurosporine and 0.065 mL (0.38 mmol) of N, N-diisopropylethylamine in 2 mL of chloroform is added 0.036 mL (0 , 30 mmol) of 4-fluorobenzoyl chloride and stirred for 1 hour. The reaction mixture is diluted with chloroform, washed with sodium bicarbonate solution, 1N hydrochloric acid and saturated sodium chloride solution, dried over magnesium sulfate and evaporated. The crude product is chromatographed on silica gel (eluent: methylene chloride-ethanol 95: 5), m.p. 225 ° (dec.).

Esimerkki 16: N-(4-klooribentsoyyli)-staurosporiiniExample 16: N- (4-chlorobenzoyl) -staurosporine

Liuokseen, jossa on 233 mg (0,5 mmoolia) staurosporiinia ja 0,13 ml (0,76 mmoolia) N,N-di-isopropyyli-etyyliamii-nia 4 mlrssa kloroformia, lisätään huoneen lämpötilassa 0,077 ml (0,6 mmoolia) 4-klooribentsoyylikloridia ja sekoitetaan tunnin ajan. Reaktioseos laimennetaan kloroformilla, pestään natriumbikarbonaattiliuoksella, 1 normaalisella suolahapolla ja kyllästetyllä natriumkloridiliuoksella, kuivatetaan magnesiumsulfaatin päällä ja haihdutetaan. Raakatuote kromatografoidaan piihappogeelissä (eluointiaine: metyleenikloridi-etanoli 95:5), sp. 220° (haj.).To a solution of 233 mg (0.5 mmol) of staurosporine and 0.13 mL (0.76 mmol) of N, N-diisopropylethylamine in 4 mL of chloroform is added 0.077 mL (0.6 mmol) at room temperature. 4-chlorobenzoyl chloride and stirred for one hour. The reaction mixture is diluted with chloroform, washed with sodium bicarbonate solution, 1N hydrochloric acid and saturated sodium chloride solution, dried over magnesium sulfate and evaporated. The crude product is chromatographed on silica gel (eluent: methylene chloride-ethanol 95: 5), m.p. 220 ° (dec.).

Il 23 89 362Il 23 89 362

Esimerkki 17: N-(3-fluoribentsoyyli)-staurosporiiniExample 17: N- (3-fluorobenzoyl) -staurosporine

Liuokseen, jossa on 233 mg (0,5 mmoolia) staurosporiinia ja 0,13 ml (0,76 mmoolia) N,N-di-isopropyyli-etyyliamii-nia 4 ml:ssa kloroformia, lisätään huoneen lämpötilassa 0,072 ml (0,6 mmoolia) 3-fluoribentsoyylikloridia ja sekoitetaan tunnin ajan. Reaktioseos laimennetaan kloroformilla, pestään natriumbikarbonaattiliuoksella, 1 normaalisella suolahapolla ja kyllästetyllä natriumklo-ridiliuoksella, kuivatetaan magnesiumsulfaatin päällä ja haihdutetaan. Raakatuote kromatografoidaan piihappogee-lissä (eluointiaine: metyleenikloridi-etanoli 95:5), sp. 240° (haj.).To a solution of 233 mg (0.5 mmol) of staurosporine and 0.13 mL (0.76 mmol) of N, N-diisopropylethylamine in 4 mL of chloroform is added 0.072 mL (0.6 mmol) of mmol) of 3-fluorobenzoyl chloride and stirred for one hour. The reaction mixture is diluted with chloroform, washed with sodium bicarbonate solution, 1N hydrochloric acid and saturated sodium chloride solution, dried over magnesium sulfate and evaporated. The crude product is chromatographed on silica gel (eluent: methylene chloride-ethanol 95: 5), m.p. 240 ° (dec.).

Esimerkki 18: N-(4-nitrobentsoyyli)-staurosporiiniExample 18: N- (4-nitrobenzoyl) -staurosporine

Liuokseen, jossa on 233 mg (0,5 mmoolia) staurosporiinia ja 0,13 ml (0,76 mmoolia) N,N-di-isopropyyli-etyyliamii-nia 4 ml:ssa kloroformia, lisätään huoneen lämpötilassa 0,11 ml (0,6 mmoolia) 4-nitrobentsoyylikloridia ja sekoitetaan tunnin ajan. Reaktioseos laimennetaan kloroformilla, pestään natriumbikarbonaattiliuoksella, 1 normaalisella suolahapolla ja kyllästetyllä natriumkloridiliuoksella, kuivatetaan magnesiumsulfaatin päällä ja haihdutetaan. Raakatuote kromatografoidaan piihappogeelissä (eluointiaine: metyleenikloridi/etanoli 95:5), sp. 255°.To a solution of 233 mg (0.5 mmol) of staurosporine and 0.13 mL (0.76 mmol) of N, N-diisopropylethylamine in 4 mL of chloroform is added 0.11 mL (0 mmol) of room temperature. , 6 mmol) of 4-nitrobenzoyl chloride and stirred for 1 hour. The reaction mixture is diluted with chloroform, washed with sodium bicarbonate solution, 1N hydrochloric acid and saturated sodium chloride solution, dried over magnesium sulfate and evaporated. The crude product is chromatographed on silica gel (eluent: methylene chloride / ethanol 95: 5), m.p. 255 °.

Esimerkki 19: N-(4-metoksikarbonyylibentsoyyli)-staurosporiiniExample 19: N- (4-methoxycarbonylbenzoyl) -staurosporine

Liuokseen, jossa on 466 mg (1 mmoolia) staurosporiinia ja 0,26 ml (1,52 mmoolia) N,N-di-isopropyyli-etyyliamiinia 8 ml:ssa kloroformia, lisätään huoneen lämpötilassa 237 mg (1,2 mmoolia) 4-metoksikarbonyylibentsoyylikloridia ja sekoitetaan huoneen lämpötilassa tunnin ajan. Reaktioseos laimennetaan kloroformilla, pestään natriumbikarbonaattiliuoksella, 1 normaalisella suolahapolla ja kyllästetyllä 24 89362 natriumkloridiliuoksella, kuivatetaan magnesiumsulfaatin päällä ja haihdutetaan. Raakatuote kromatografoidaan pii-happogeelissä (eluointiaine: metyleenikloridi-etanoli 95:5), sp. 240° (haj.).To a solution of 466 mg (1 mmol) of staurosporine and 0.26 mL (1.52 mmol) of N, N-diisopropylethylamine in 8 mL of chloroform is added 237 mg (1.2 mmol) of 4- methoxycarbonylbenzoyl chloride and stirred at room temperature for one hour. The reaction mixture is diluted with chloroform, washed with sodium bicarbonate solution, 1N hydrochloric acid and saturated sodium chloride solution, dried over magnesium sulfate and evaporated. The crude product is chromatographed on silica gel (eluent: methylene chloride-ethanol 95: 5), m.p. 240 ° (dec.).

Esimerkki 20: N-tiobentsoyyli-staurosporiiniExample 20: N-thiobenzoyl-staurosporine

Seosta, jossa on 180 mg (0,31 mmoolia) N-bentsoyyli-stau-rosporiinia (esimerkki 3) ja 132 mg (0,326 mmoolia) La-wesson-reagenssia (Fluka AG) 2 ml:ssa tolueenia, sekoitetaan 48 tunnin ajan huoneen lämpötilassa. Loppuvaiheiden suorittamiseksi laimennetaan metyleenikloridilla, pestään kyllästetyllä natriumbikarbonaattiliuoksella ja kyllästetyllä natriumkloridiliuoksella, kuivatetaan magnesiumsulfaatin päällä ja haihdutetaan. Raakatuote kromatografoidaan piihappogeelissä (eluointiaine: etikkahappo-etyy-liesteri) , FD-MS: 586, H-NMR (300 MHz CDC13:ssa): 2,99 s (3H), 2,62 s (3H), 2,56 s (3H).A mixture of 180 mg (0.31 mmol) of N-benzoyl-staurosporine (Example 3) and 132 mg (0.326 mmol) of La-wesson's reagent (Fluka AG) in 2 ml of toluene is stirred for 48 hours at room temperature. temperature. To carry out the final steps, dilute with methylene chloride, wash with saturated sodium bicarbonate solution and saturated sodium chloride solution, dry over magnesium sulfate and evaporate. The crude product is chromatographed on silica gel (eluent: acetic acid-ethyl ester), FD-MS: 586, 1 H-NMR (300 MHz in CDCl 3): 2.99 s (3H), 2.62 s (3H), 2.56 s (3 H).

Esimerkki 21: N-tert-butoksikarbonyyli-staurosporiiniExample 21: N-tert-butoxycarbonyl-staurosporine

Liuokseen, jossa on 116,5 mg (0,25 mmoolia) staurosporii-nia 2 ml:ssa tetrahydrofuraania, lisätään huoneen lämpötilassa liuos, jossa on 65 mg (0,297 mmoolia) di-tert-butyyli-dikarbonaattia 1 ml:ssa tetrahydrofuraania, ja sekoitetaan 9 tunnin ajan. Reaktioseos haihdutetaan ja kromatografoidaan piihappogeelissä (eluointiaine: mety-leenikloridi/etanoli 95:5), sp. n. 160°.To a solution of 116.5 mg (0.25 mmol) of staurosporine in 2 mL of tetrahydrofuran is added a solution of 65 mg (0.297 mmol) of di-tert-butyl dicarbonate in 1 mL of tetrahydrofuran at room temperature, and stirred for 9 hours. The reaction mixture is evaporated and chromatographed on silica gel (eluent: methylene chloride / ethanol 95: 5), m.p. about 160 °.

Esimerkki 22: N-(4-karboksibentsoyyli)-staurosporiini-natriumsuolaExample 22: N- (4-carboxybenzoyl) -staurosporine sodium salt

Seosta, jossa on 314 mg (0,5 mmoolia) N-(4-metoksikarbo-nyylibentsoyyli)-staurosporiinia (esimerkki 34), 10 ml metanolia ja 0,3 ml 2 normaalista natriumhydroksidia, kuumennetaan 24 tunnin ajan palautusjäähdyttäen. Jäähtymisen jälkeen suodatetaan, laimennetaan 10 ml:11a vettä 25 89362 ja neutraloidaan 0,1 ml:11a etikkahappoa. Tällöin otsik-koyhdiste saostuu suolana (sp. 275°). Natriumsuolan valmistamiseksi happo suspendoidaan 10 ml:aan metanolia ja siihen lisätään 1 ekvivalentti (5 ml) 0,1 normaalista natriumhydroksidia. Saatava liuos haihdutetaan ja jäännös kiteytetään uudelleen metanoli/eetteristä. FAB-MS: 637 (M+M)+: 659 (M+Na)+.A mixture of 314 mg (0.5 mmol) of N- (4-methoxycarbonylbenzoyl) -staurosporine (Example 34), 10 ml of methanol and 0.3 ml of 2N sodium hydroxide is heated under reflux for 24 hours. After cooling, filter, dilute with 10 ml of water 89362 and neutralize with 0.1 ml of acetic acid. The title compound then precipitates as a salt (m.p. 275 °). To prepare the sodium salt, the acid is suspended in 10 ml of methanol and 1 equivalent (5 ml) of 0.1 N sodium hydroxide is added. The resulting solution is evaporated and the residue is recrystallized from methanol / ether. FAB-MS: 637 (M + M) < + >: 659 (M + Na) < + >.

Esimerkki 23: N-(3,5-dinitrobentsoyyli)-staurosporiiniExample 23: N- (3,5-dinitrobenzoyl) -staurosporine

Liuokseen, jossa on 233 mg (0,5 mmoolia) staurosporiinia ja 0,13 ml (0,76 mmoolia) N,N-di-isopropyyli-etyyliamii-nia 4 ml:ssa kloroformia, lisätään huoneen lämpötilassa 138 mg (0,6 mmoolia) 3,5-dinitrobentsoyylikloridia ja sekoitetaan tunnin ajan. Reaktioseos laimennetaan kloroformilla, pestään natriumbikarbonaattiliuoksella, 1 normaalisella suolahapolla ja kyllästetyllä natriumklo-ridiliuoksella, kuivatetaan magnesiumsulfaatin päällä ja haihdutetaan. Raakatuote kromatografoidaan piihappogee-lissä (eluointiaine: metyleenikloridi/etanoli 95:5), sp. n. 250° (haj.).To a solution of 233 mg (0.5 mmol) of staurosporine and 0.13 mL (0.76 mmol) of N, N-diisopropylethylamine in 4 mL of chloroform is added 138 mg (0.6 mmol) of mmol) of 3,5-dinitrobenzoyl chloride and stirred for 1 hour. The reaction mixture is diluted with chloroform, washed with sodium bicarbonate solution, 1N hydrochloric acid and saturated sodium chloride solution, dried over magnesium sulfate and evaporated. The crude product is chromatographed on silica gel (eluent: methylene chloride / ethanol 95: 5), m.p. about 250 ° (dec.).

Esimerkki 24: N-[(tert-butoksikarbonyyliamino)-asetvvlil-staurosporiini 699 mg:aan (1,5 mmoolia) staurosporiinia 40 ml:ssa kuivaa kloroformia lisätään 264 mg (1,5 mmoolia) BOC-glyserolia (Fluka AG) ja 340 mg (1,65 mmoolia) disykloheksyylikarbo-di-imidiä ja sekoitetaan 1,5 tunnin ajan huoneen lämpötilassa. Tämän jälkeen reaktioseos laimennetaan kloroformilla, pestään natriumbikarbonaattiliuoksella ja kyllästetyllä natriumkloridiliuoksella, kuivatetaan magnesium-sulfaatin päällä ja haihdutetaan. Jäännös lietetään pieneen määrään metyleenikloridia ja suodatetaan (disy-kloheksyylivirtsa-aineen poistaminen). Suodos haihdutetaan ja kuivatetaan, sp. 190°.Example 24: N - [(tert-butoxycarbonylamino) acetyl-staurosporine To 699 mg (1.5 mmol) of staurosporine in 40 ml of dry chloroform are added 264 mg (1.5 mmol) of BOC-glycerol (Fluka AG) and 340 mg (1.65 mmol) of dicyclohexylcarbodiimide and stirred for 1.5 hours at room temperature. The reaction mixture is then diluted with chloroform, washed with sodium bicarbonate solution and saturated sodium chloride solution, dried over magnesium sulfate and evaporated. The residue is slurried in a small amount of methylene chloride and filtered (removal of dicyclohexyl urea). The filtrate is evaporated and dried, m.p. 190 °.

26 3936226 39362

Esimerkki 25: N-(2-aminoasetyyli)-staurosporiiniExample 25: N- (2-aminoacetyl) -staurosporine

Liuokseen, jossa on 187 mg (0,3 mmoolia) N-Γ(tert-butok-sikarbonyyliamino)-asetyyli]-staurosporiinia (esimerkki 39) 1 ml:ssa etikkahappo-etyyliesteriä, lisätään huoneen lämpötilassa 1 ml suolahapon kyllästettyä liuosta etik-kahappoetyyliesterissä. Tällöin muodostuu heti sakka. Suspensiota sekoitetaan vielä 10 tunnin ajan ja tuote suodatetaan ja pestään etikkahappo-etyyliesterillä, sp. 280° (haj.).To a solution of 187 mg (0.3 mmol) of N-β- (tert-butoxycarbonylamino) acetyl] -staurosporine (Example 39) in 1 ml of acetic acid ethyl ester is added at room temperature 1 ml of a saturated solution of hydrochloric acid in ethyl acetate. . In this case, a precipitate forms immediately. The suspension is stirred for a further 10 hours and the product is filtered and washed with ethyl acetate, m.p. 280 ° (dec.).

lili

Claims

27 89362

A process for the preparation of novel therapeutically active N-substituted derivatives of stauro-sporin of the general formula I HN Os / \ W CH (I) ...... * »» ch3 NR CHg in which R represents -C (= 0) A group according to RA, wherein Ra is lower alkyl, trifluoromethyl, carboxy-lower alkyl, phenyl which is unsubstituted or substituted by halogen, nitro, lower alkoxy, lower alkoxycarbonyl or carboxy, lower alkoxy, phenoxy, phenylamino, lower alkyloxy or lower alkoxycarboxy; R represents a group of the formula -C (= S) R ", in which RB is lower alkylamino, lower alkenyl in which the free valence starts from a carbon atom other than a double bond, substituted amino or phenyl, and salts for the preparation of salts of compounds of formula I, characterized in that a) for the preparation of compounds of formula I wherein R is a group of formula -C (= O) RA, where RA has the same meaning as above, except for carboxyphenyl, amino - lower alkyl and phenylamino, staurosporine of formula II 2 »39362 o t ·. QTMZ> Y Y ..... CH3 (II) YY ^ OCHa N ΝΧ0Η3 or an acid addition salt thereof is reacted with a reactive carboxylic acid derivative of formula III Ra * (C = O) -Y (III) wherein RA * is RA above: with the exception of carboxyphenyl, aminoalkylalkyl and phenylamino and Y represents an activated hydroxyl group, or b) for the preparation of compounds of formula I in which R represents phenylaminocarbonyl, lower alkylamino-thiocarbonyl, substituted aminothiocarbonyl, a staurosporine of formula II is reacted with a reagent of formula RA'-N = C = O where RA 'is phenyl or a reagent of formula RD'-N = C = S where R' 'is lower alkyl or lower alkenyl bonded from a carbon atom from which no double bond originates and, if desired, 29 89 362 1. the protected compound of formula I obtained a lower alkoxy protecting group is cleaved to give a compound of formula I wherein R is carboxyphenylcarbonyl, or a protected group of a compound of formula I wherein R is lower alkyloxy , to give a compound of formula I wherein R represents an amino-lower alkylcarbonyl group, or 3. in a compound of formula I wherein R represents phenylcarbonyl, the carbonyl group is converted to a thiocarbonyl group by a reagent which converts oxygen to sulfur to give a compound of formula I wherein R represents phenylthiocarbonyl, and / or 4. converting a compound of formula I obtained in free form into a salt, and / or 5. converting a compound of formula I obtained as a salt into its free form or another salt.

Process for the preparation of N- (3-chlorobenzoyl) -staurosporin according to Claim 1, characterized in that correspondingly substituted starting materials are used.

Process for the preparation of N-benzoyl-staurosporine according to Claim 1, characterized in that correspondingly substituted starting materials are used.

Process for the preparation of N - [(tert-butoxycarbonylamino) acetyl] -staurosporin according to Claim 1, characterized in that correspondingly substituted starting materials are used.

Process for the preparation of N-phenylcarbamoyl-staurosporine according to Claim 1, characterized in that correspondingly substituted starting materials are used.

Process for the preparation of N- (3,5-dinitrobenzoyl) -staurosporin according to Claim 1, characterized in that correspondingly substituted starting materials are used.

Process for the preparation of N- (tert-butoxycarbonyl) -staurosporin according to Claim 1, characterized in that correspondingly substituted starting materials are used.

Process for the preparation of N- (3-carboxypropionyl) -staurosporin according to Claim 1, characterized in that correspondingly substituted starting materials are used.

Process for the preparation of N- (methylaminothiocarbonyl) -staurosporin according to Claim 1, characterized in that correspondingly substituted starting materials are used.

Process for the preparation of N-acetyl-staurosporine according to Claim 1, characterized in that correspondingly substituted starting materials are used. 31 09362