FI88545B - Bestaemningsmetod - Google Patents

Description

1 88545 Määritysmenetelmä 1. Keksinnön aihe

Keksintö koskee kiinteällä faasilla suoritettavaa bioaffini-teettireaktiota, joka on esitetty patenttivaatimuksen 1 5 johdanto-osassa. Bioaffiniteettireaktio sisältää seuraavia määrityksiä: immunomääritykset, nukleiinihappo-hybridisaa- tiot, ligandi-lektiini-määritykset. Menetelmä hyödyntää aikaerotteista fluorometriaa bioaffiniteettireaktion yhteydessä, jossa reaktioon osallistuva vastapuoli on leimattu 10 kovalenttisesti lantanidikelaatilla. Kun bioaffiniteettireaktio on viety loppuun, lantanidikelaatti mitataan aikaerottei-sella fluorometriällä.

Keksintö kattaa erityyppiset biospesifiset ja bioaffiniteet-tiin perustuvat reagoivat vastapuolet, vaikka kaikkein ylei-15 s in onkin immunotyyppinen reaktio. Keksintö kuvataan pääasiassa immunokemialliseksi määritykseksi. Termi viittaa sekä kilpaileviin että ei-kilpaileviin määritysperiaatteisiin (R. Ekins et ai. Pure & Appi. Chem. 57 (1985) s. 473-482), joissa yksi reagoivista vastapuolista on leimattu mitattavissa ole-20 valla ryhmällä. Esimerkkejä immunokemiallisista vastapuolista, joita voidaan leimata mitattavissa olevilla ryhmillä ovat vasta-aineet, antigeenit ja hapteenit.

2. Aikaisemmat keksintöön liittyvät menetelmät

Lantanidikelaatit ovat tulleet viimeisten kymmenen vuoden 25 aikana yleisesti hyväksytyiksi merkkiaineiksi aikaerotteisen fluorometrian yhteydessä esim. immunokemiallisissa menetelmissä (Lövgren et ai.: Luminescence Immunoassays and Molecular Applications, Ed. van Dyke, CRC-Press, 1990, s. 233-253) . Spektroskooppisista ja kvanttikemiallisista tiedoista on 30 voitu vetää se johtopäätös, että lantanidi-ionien joukossa Dy3+, Sm3+, Tb3+ ja Eu3+ ovat sopivimmat, koska ne emittoivat viivästynyttä fluoresenssia. Ennustettavissa olevat käytännön edut huomioon ottaen on yleisesti toivottu, että käytetyt 2 88545 lantanidikelaatit osoittaisivat viivästynyttä fluoresenssia, jonka elinikä on pidempi kuin 10 με. Lisäksi käytetyillä lantanidikelaateilla pitäisi olla tarpeeksi korkea pysyvyys-vakio, jotta ne voisivat sitoa lantanidi-ionin tehokkaasti 5 immunokemiallisen tai jonkin muun bioaffiniteettireaktion aikana (Lövgren, Alternative Immunoassays (1985) s. 203-217) menettämättä kelaatin hyvää viritysenergian absorptiota ja voisivat kuljettaa viritysenergiaa kelatoituun lantanidi-ioniin. Ongelman välttämiseksi on kehitetty useita eri vaih-10 toehtoja, koska tähän mennessä ei ole ollut saatavissa ke-laatteja, joilla on sekä hyvä kelatointikyky että hyvät energian absorptio- ja fluoresenssi-ominaisuudet.

Laajimmin käytetty heterogeeninen aikaerotteinen fluoroim-munomääritys, DELFIAR-määritys (Wallac Oy, Turku) on ratkais-15 sut pysyvyysongelman käyttämällä kovalenttisesti sidottua ei-fluoresoivaa lantanidikelaattia immunoreaktioon osallistuvan vastapuolen (hapteeni, antigeeni, vasta-aine) leimaukseen. DELFIAR-menetelmässä lantanidi-ioni dissosioidaan liuokseen immunoreaktion päätyttyä kelaattiligandista käyttäen pH-arvoa 20 4. Ioni irtautuu ligandista, joka on kovalenttisesti kytketty kiinteään faasiin sidottuun immunokemialliseen vastapuoleen.

Lantanidi-ioni on saatu fluoresoimaan vesiliuoksessa nk. kehitysliuoksessa, joka sisältää a) pinta-aktiivisen aineen b) kelaattiyhdisteen, jonka kanssa lantanidi-ioni tuottaa 25 fluoresenssia ja c) synergistisen yhdisteen. Fluoresenssin voimakkuus ja puoliintumisaika ei riipu ainoastaan lantani-dista, mutta lisäksi myös pH:sta, pinta-aktiivisesta aineesta, synergistisestä yhdisteestä ja kelaatti- yhdisteestä (Halvarson et ai., J. Chem. Phys. 41 (1964) s. 157 ja 2752, 30 ja Hemmilä et ai., Anal. Biochem. (1984) s. 335-343).

Tämän lisäksi on kehitetty vain yksi kaupallinen aikaerotteinen fluoresenssia ja lantanidikelaatteja käyttävä immuno-määritysjärjestelmä (Cyberfluor), joka käyttää 1.10 - fenant-roliini - 2,9 - dikarboksyylihappoa ja muutamia sen uusia 3 88545 johdannaisia (Khosvari et ai., elin. Chem. 33 (1988) s. 1994-1999) . Nämä rakenteet voidaan liittää kovalenttisesti proteiineihin ja ne muodostavat fluoresoivia kelaatteja lantanidi-suolojen läsnäollessa. Kuitenkin näiden kelaattien pysyvyys 5 on suhteellisen alhainen niin, että ylimääräistä lan-tanidisuolaa on oltäva mukana ennen aikaerotteisen fluoresenssin mittaamista kiinteältä faasilta. Lisäksi mittausjärjestelmä on vähemmän herkkä DELFlAANR verrattuna.

Wieder on patentoinut jossakin määrin samanlaisen järjes-10 telmän (U.S. Patent 4.058.732), vaikka mitään todisteita tai tuloksia järjestelmän suorituskyvystä ei ole julkaistu. Kohteena oleva yhdiste immunomäärityksen reaktiopari on leimattu harvinaisen maametallikompleksin f luoresenssiluotai-milla, kuten bensoyylitrifluoriasetonilla ja leimattu yhdiste 15 on viritetty kiinteällä faasilla ja aikäerotteinen fluoresenssi mitattu tietyn viiveajan kuluttua (U.S. Patent 4.058.732, Kuva l). Myös tässä tapauksessa lantanidikelaatin pysyvyys on huomattava ongelma käytännön sovellutuksissa.

Useilla myöhemmin tehdyillä vaihtoehtoisilla lantanidikelaa-20 teillä on hyvät fluoresenssiominaisuudet ja riittävän korkea pysyvyysvakio lantanidi-ionin kelatoimiseen ja pysyvyyden säilyttämiseen useimmissa bioaffiniteettimääritysolosuhteis-sa. Kaikki nämä kelaatit tai yhdisteet voidaan sitoa kovalenttisesti yhteen bioaffiniteetti-määritykseen osallistuvaan 25 yhdisteeseen. Esim. kiinteällä faasilla tapahtuvassa, kilpailevassa tai ei-kilpailevassa immunomäärityksessä, aikaerotteinen fluoresenssi mitataan immunomäärityksen päätyttyä suoraan immobilisoidusta leimatusta reaktioparista. Voidaan kehittää vaihtoehtoisesti erilaisia homogeenisia (ei erotus-30 ta) määrityksiä, joilla mitataan aikaerotteisella fluoresenssilla joko muutosta leimatun reaktioparin liuospitoi-suudessa (U.S. Patent 4.920.195 ja European Patent 0203047) tai käytetyn lantanidikelaatin fluoresenssi-intensiteetin ja/tai viiveajan muutosta, johon vaikuttaa leimattujen ja 4 88545 leimaamattomien reaktioparien välinen bioaffiniteettireaktio (U.S. Patent 4.587.223; European Patent Application 88850314.1).

Erotusvaihe voidaan välttää mittaamalla selektiivisesti 5 kiinteään faasiin sitoutuneen leimatun yhdisteen määrä (European Patent Application 86300588.0).

Useimmissa kuvatuissa menetelmissä aikaerotteinen fluoresenssi mitataan joko suoraan leimatusta yhdisteestä kiinteällä faasilla tai sitten käyttämällä dissosiaation avustamaa 10 lantanidifluoroimmunomääritysperiaatetta (DELFIAR). Tässä menetelmässä lantanidi-ioni sellaisenaan dissosioidaan nopeasti alhaisessa pH:ssa, jolloin muodostuu nk. kehitysliuok-sen ainekomponenttien kanssa uusi, voimakkaasti fluoresoiva kelaatti. Molemmat vaihtoehdot toimivat, vaikka niissä on 15 tiettyjä huonoja puolia.

Jos aikaerotteinen fluoresenssi mitataan suoraan kiinteällä faasilla olevasta leimatusta bioaffiniteettiyhdisteestä, tarvitaan voimakkaasti fluoresoiva pysyvä lantanidikelaatti. Mittalaitteen optiset vaatimukset ovat korkeat, sillä viri-20 tysvalo täytyy kohdistaa rajatulle, määrityksessä kiinteänä faasina käytettävälle pinnalle. Lisäksi monet kiinteät pinnat lähettävät suoraan viritettäessä huomattavaa tausta-fluoresenssia, jolla on määrityksen herkkyyttä rajoittava pitkä puo1i intumi sa ikä.

25 DELFIAR-teknologiassa ei ole e.m. rajoituksia, sillä lan-tanidi mitataan liuoksesta, jossa se on muodostanut uuden voimakkaasti fluoresoivan kelaatin. Mutta lantanidi-ionin dissosiaatio kiinteältä faasilta, leimatusta yhdisteestä ja sitä välittömästi seuraava uuden kelaatin muodostuminen 30 liuoksessa tekee kehitysvaiheesta hyvin herkän ulkoisille lantanidikontaminaatioille. Seurauksena on "tausta"-fluo 5 88545 resenssin välitön kasvu (Diamandis, Clin. Biochem. 21 (1988) s. 139-150). Kontaminaatiomahdollisuus on poissuljettu käytettäessä lantanidikelaatteja, jotka ovat sekä pysyviä että fluoresoivia.

5 Lisäksi kansainvälisen patenttihakemuksen julkaisussa W0 87/04523 on esitetty, miten lantanidikelaatti voidaan vapauttaa kiinteältä faasilta siten, että immobilisoitu vasta-aine-antigeeni-vasta-aine-fluoroforikompleksieluoidaan pois happamassa liuoksessa ennen fluoresenssin mittausta.

10 3. Keksintö

Keksintö koskee aikaerotteista fluorometriaa ja fluoresenssin mittausta lantanidikelaattileimasta kiinteällä faasilla tapahtuneen bioaffiniteettireaktion jälkeen. Bioaffiniteet-tireaktio sisältää seuraavia menetelmiä: immunomäärityksiä, 15 nukleiinihappo-hybridisaatioitä, ligandi-lektiini -määrityksiä ja ligandi-reseptori -määrityksiä. Bioaffiniteettireaktion tapahduttua kiinteällä faasilla lantanidikelaatti vapautetaan kiinteään faasiin Sidotusta bioaffiniteettikom-pleksista liuokseen ja se voidaan mitata suoraan liuoksesta 20 aikaerotteisella fluorometriällä. Lantanidikelaatti vapautetaan kiinteältä faasilta rikkomalla kiinteällä faasilla oleva bioaffiniteettiyhdisteiden välinen sidos esimerkiksi yhden tai useamman seuraavan tekijän vaikutuksesta: pH, lämpötila, detergentti, kaotrooppinen suola, orgaaninen liuotin ja ' : 25 ionivahvuus.

4. Keksinnön yksityiskohtainen kuvaus

Keksintöä voidaan soveltaa moniin erityyppisiin biospesifi-siin affiniteettireaktioihin, vaikkakin kaikkein yleisin on immunokemiallinen reaktio. Tästä syystä keksintö kuvataan 30 ensisijassa immunokemialliseksi määritykseksi. Kysymykseen tulevat erilaiset biospesifiset affiniteettireaktiot on kuvattu kuvissa 1-5. Kilpailevat (kompetitiiviset) reaktio-vaihtoehdot 1-3 on kuvattu kuvissa 1-3 ja ei-kilpailevat « 88545 (non-kompetitiiviset) reaktiovaihtoehdot 1-2 kuvissa 4 ja 5. Sekä kilpaileva että ei-kilpaileva immunomääritysperiaate on kuvattu edellä olettaen, että reaktion immunomääritysosa on viety loppuun.

5 Kuvissa 1-5 on käytetty seuraavia viitemerkintöjä: kiinteä faasi 1, kantajaproteiini kp, vasta-aine 2, antigeeni tai hapteeni 3, antigeeni 4, pysyvä ja fluoresoiva lantanidi-kelaatti Kel:Eu, bioaffiniteettisidos nuoli bio, kovalentti-nen sidos kov ja lantanidikelaatin ja bioaffiniteettikom-10 pieksin välinen katkeava kovalenttisidos kkov.

Keksinnön mukaisesti lantanidikelaatti vapautetaan liuokseen rikkomalla joku kuvattu bioaf f initeettisidos. Tässä yhteydessä voidaan myös katkaista kovalenttinen sidos. Käytettäessä menetelmää, jossa bioaffiniteettisidokset rikotaan, ei kat-15 keavaa kovalenttista sidosta tarvita fluoresoivan lantanidikelaatin ja leimatun bioaffiniteettiyhdisteen välissä. Kunkin vapautumisprosessin aikana kelaattikompleksi lantanidi-ionin ja kelaattiligandin välillä on säilytettävä koskemattomana. Näin ollen fluoresoiva lantanidikelaatti vapautetaan liuok-20 seen sellaisenaan, josta se voidaan mitata tehokkaasti aika-erotteisella fluorometriällä. Tällöin ei kiinteän faasin materiaalin aiheuttama tausta eikä myöskään mikään ulkoinen lantanidikontaminaatio pääse vaikuttamaan tulokseen.

Reagoivien yhdisteiden välinen bioaffiniteettisidos (vasta-25 aineet, hapteenit, antigeenit, nukleiinihapot, reseptorit, lektiinit, hiilihydraatit, hormonit jne.) koostuu pääasiassa hydrofobisista vuorovaikutuksista, vetysidoksista, Van der Waalsin voimista ja ionisesta vuorovaikutuksesta. Näin ollen näiden sidosten täytyy katketa vapauttaakseen fluoresoivan 30 lantanidikelaatin liuokseen. Bioaf f initeettisidosten rikkomiseen tunnetaan useita tekijöitä kuten esim. pH, ionivahvuus, kaotrooppiset suolat, detergentit, orgaaniset liuottimet jne. Näitä tekijöitä voidaan käyttää bioaffiniteettisidoksen katkaisemiseen, jotta fluoresoiva lantanidikelaatti saadaan 35 vapautettua liuokseen.

7 88545

Katkeavien bifunktionaalisten molekyylien ja sidosten käyttö tunnetaan biomakromolekyylien kontaktikohtien tunnistamisessa ja niitä on myös käytetty menestyksekkäästi affiniteettikro-matografiässä eluoitaessa erittäin tiukasti sitoutuneita 5 ligandeja (Jayabaskaran et ai. Prep. Biochem. 1987, 17, s.

121-141, Montan et ai. Arch. Biochem. Biophys. 1982, 218, s. 101-108, Singh et ai., Arch Biochem. Biophys. 1979, 193, s. 284-293, Herman et ai., Anal. Biochem. 1986, 156, s. 48-55), makromolekyylisten reagenssien puhdistamisessa (Schwarzberg, 10 U.S. Patent 4.272.506), kaksisuuntaisten synteettisten vesik-kelien muodostamisessa (Chang et ai., Chem. Lett. 1987, s. 1385-1388), kaksisuuntaisessa entsyymien immobilisaatiossa (Carlsen, Hind. Antibiot. Bull. 1978, s. 105-108) ja ligandi-tiitterien ja kiinteän faasin kemiallisen tilan määrittämi-15 sessä (Marburg et ai., Anal. Biochem. 1989, 181, s. 242-249). Aikaisemmin on myös patentoitu reagenssi (British Patent 1.597.758), joita käytetään bioSpesifisiin affiniteettireak-tioihin perustuvissa määrityksissä. Reagenssi käsittää leimatun immunokemiallisen komponentin, joka koostuu raultikonju-20 gaatista, jossa on useita analyyttisesti osoitettavia ryhmiä liitettyinä toisiinsa katkeavilla kovalenttisidoksilla. Kyseinen multikonjugaatti on vuorostaan sidottu useilla katkaistavilla sidoksilla immunokemialliseen komponenttiin.

Meidän tietojemme mukaan aikaisemmin ei ole käytetty bioaf-25 finiteettisidosten katkaisua leiman saattamiseksi liuokseen kiinteällä faasilla tapahtuneen bioaffiniteettireaktion jälkeen. Myöskään ei ole tunnettua, että yksittäisen kova-lenttisidoksen katkaisua yksittäisen leiman vapauttamiseen olisi käytetty samanaikaisesti bioaffiniteettisidosten kat-30 kaisun yhteydessä.

* * 8 88545

Seuraavassa on lueteltu yleisimmin tunnetut kovalenttiset sidokset ja sidoksen katkaisemiseen käytetyt menetelmät:

Katkaistava sidos Kemiallinen katkaisumenetelmä

Disulfidi Pelkistäminen 5 Visinaaliset glykolit Perjodaatti

Fenyyliesteri Emäs / hydroksyyliamiini 1-hapetettu sulfoni Emäs

Atso Ditioniitti bis-Glykoliesteri Hydroksyyliamiini 10 Tioesteri Hydroksyyliamiini

Kemiallisten menetelmien lisäksi myös valottamista voidaan käyttää valonherkkien sidosten katkaisemiseen (Chow, The Chemistry of Amino, Nitraso and Nitro Compounds and Their Derivates, Part l, Ed. Patai, J. Wiley & Sons, N.Y. 1982, 15 s. 181-287). O-nitrofenyyliryhmät ovat tyypillisiä esimerkkejä valon vaikutuksesta katkeavista sidoksista: D.H. Rich & s.K. Gurwara, J. Am.Chem.Soc. 97 (1975) 1575:

Z-NHCO -£Ö> CH2OCOR hv Z-NHCO -{o>-CHO+HOCOR

N02 Ν<ζ"^ 20 D. H. Rich & s. K. Gurwara, Tetrahedron Lett. 1975 301:

Z-NHCO j£Ö>CH2NHC0R hv > Z-NHCO -<0>-CHO+H,NCOR

m2 NOT"^ B. Amit & Patchornik, Tetrahedron Lett. 1973 2205: / r3 -h^—^ R1COOH + muut valotuotteet 25 R2 no2 * β 88545

Useita vaihtoehtoisia katkeavia kovalenttisidoksia ja kemiallisia katkaisumenetelmiä, kuten myös valoa, voidaan käyttää kovalenttisidoksen katkaisemiseen niin, että fluoresoiva lantanidikelaatti vapautuu liuokseen.

5 Samanlaisia menetelmiä voidaan soveltaa myös muihin bioaf-finiteettimäärityksiin immunokemiallisten määritysten lisäksi. Esimerkiksi nukleiinihappohybridisaatio-määrityk-sissä kiinteällä faasilla leima voidaan vapauttaa liuokseen, kun hybridisaatiomääritys on viety loppuun. Kuvissa 6 10 ja 7 on esitetty tyypilliset tällaiset määritysvaihtoehdot. Esityksistä puuttuvat vain fluoresoivan lantanidikelaatin vapautuminen liuokseen. Kuvissa 1-5 esitettyjen viitemer-kintöjen lisäksi niissä on käytetty seuraavia merkintöjä: immobilisoitu koetin 5, kohde-DNA 6, leimattu koetin 7, 15 biotinyloitu koetin 8, biotiini bt ja immobilisoitu strep-tavidiini 9.

Myös hybridisaatio-määrityksissä fluoresoiva lantanidikelaatti voidaan vapauttaa liuokseen joko rikkomalla joku näkyvistä bioaffiniteettisidoksista tai katkaisemalla 20 kovalenttinen sidos tai yhdistämällä nämä kaksi vaihtoehtoa. Vapautumisprosessin aikana kelaattikompleksi lan-tanidi-ionin ja kelaattiligandin välillä pidetään ehjänä.

Keksintöä voidaan kuvata tarkemmin seuraavien ei-rajoit-tavien esimerkkien avulla: 25 Esimerkki l:

Immunoaffiniteettisidoksen katkaiseminen ei-kilpailevassa hTSH- määrityksessä

Koe järjestetään samoin kuin ei-kilpaileva määritys (kuva 4) paitsi, että kovalenttinen sidos on jätetty pois.

10 88545 Määritys

Polystyreenimikrotiitterikaivot pinnoitettiin mono-klonaalisella hTSH:n vastaaineella ja pinta kyllästettiin BSAilla. Toinen monoklonaalinen hTSHrn vasta-aine leimat-5 tiin fluoresoivalla europiumkelaatilla, 4-aminofenyy- lietynyyli-2,6-bis (Ν,Ν-bis (karboksimetyyli) - aminometyy-li) pyridiini-Eu:n isotiosyanaatti-johdannaisella. Tämä määritys tehtiin yksivaiheisena pinnoitetuissa mikrotiitte-rikaivoissa, jotka sisälsivät 50 μΐ roäärityspuskuria, hTSH-10 standardia ja 50 μΐ leimattua vasta-ainetta (50 ng). Inku-baatio tehtiin huoneenlämmössä (30 min.) mikrotiitterilevyä jatkuvasti ravistellen. Kaivot imettiin kuiviksi ja pestiin kuusi kertaa, jonka jälkeen bioaffiniteettisidos rikottiin lisäämällä 200 μΐ erilaisia katkaisuliuoksia. Kaivoja 15 ravisteltiin 2 min., jonka jälkeen aikaerotteinen fluoresenssi mitattiin jokaisesta katkaisuliuoksesta 2, 7, 32 68 minuutin välein. Katkaisuliuoksien koostumus oli seuraa-va: kaikki sisälsivät 50mM karbonaattipuskuria, pH 10.0 ja 0.1 % BSA:ta ja joko 20 0.2 Triton X-100:a tai 20 % Etanolia tai 10 % Glyserolia tai 1.0 % Asetonia tai 10 % Propanolia tai 25 5 mH NaSCN:a

Korkeimman standardin (500 μΐυ/ml) signaalitaso ja sen pysyvyys on esitetty kuvassa 11. Jokaisessa tapauksessa pyrittiin täydelliseen standardikuvaajaan. Kuva 8 näyttää standardikäyrän käytettäessä 20-prosenttista etanolia.

I: 11 88545

Esimerkki 2;

Katkeavan kovalenttisidoksen rikkominen

Mallitutkimuksessa fluoresenssisignaali oli yksin riippuvainen kovalenttisen sidoksen katkaisemisesta, sillä 5 mukana ei ollut bioaffiniteettisidosta.

Määrityksen kulku

Polystyreenimikrotiitterikaivot pinnoitettiin 1 Mg:11a BSA:ta (200 μΐ), joka leimattiin isotiosyanaattidisulfidin (SCN-S-S) europium-kelaattijohdannaisella (esimerkki 1).

10 Katkaisuliuosta (200 μΐ) lisättiin pinnoitettuihin kaivoihin ja 2 min. ravistelun jälkeen mitattiin liuoksessa olevan europiumkelaatin aikaerotteinen fluoresenssi. Testattiin erilaisia katkaisuliuoksia, jotka oli tehty 50 mM:n karbonaattipuskur i in.

15 Ditiotreitoli EtOH BSA

Katkaisuliuos pH mM % % 1 9 2 - 2 9 5 5 0.1 3 9 10 10 0.5 20 4 10 2 5 0.5 .5 10 5 10 6 10 10 - 0.1 7 11 2 10 0.1 8 11 5 - 0.5 25 Olennaista on, että BSA:ta ei vapautunut kiinteältä faasilta katkaisun aikana. Kuvassa 12 esitetään liuoksesta yllä kuvatuissa olosuhteissa mitattu fluoresenssi 2 ja 53 minuutin katkaisuajan jälkeen.

12 88545

Esimerkki 3:

Samanaikainen immunoaffiniteetti-sidoksien ia katkeavan kovalenttisidoksen rikkominen ei-kilpailevassa hTSH-määri-tvksessä 5 Kokeen toteuttaminen on yhdenmukainen vaihtoehdossa 1 kuvatun ei-kilpailevan määrityksen kanssa.

Määrityksen kulku;

Polystyreenimikrotiitterikaivot pinnoitettiin mono-klonaalisella hTSHrn vasta-aineella ja pinta kyllästettiin 10 BSArlla. Toinen monoklonaalinen hTSHrn vasta-aine leimattiin fluoresoivalla europiumkelaatilla, joka on 4-aminofe-nyylietynyyli-2,6-bis-(N,N-bis(karboksimetyyli)-aminometyy-li)pyridiini-Eu:n isotiosyanaattidisulfidi-johdannainen. Immunomäärityksen aikana (30 min. huoneenlämmössä, jatkuva 15 ravistelu)) kaivot sisälsivät 50 μΐ hTSH-standardia (0, 1, 10, 50, 250 ja 500 μΐυ/ml) ja leimattua vasta-ainetta (50 ng) sisältävää määrityspuskuria (50 μΐ). Inkubaation jälkeen kaivot imettiin kuiviksi ja pestiin kuusi kertaa ennen katkaisuliuoksen lisäämistä (200 μΐ) . Liuos sisälsi 20 % 20 EtOHrta, 2 mM ditiotreitolia ja 0.1 % BSArta 50mM:ssa karbonaattipuskurissa, pH 10. Kahden minuutin ravistelun jälkeen mitattiin liuoksessa olevan europiumkelaatin aika-erotteinen fluoresenssi. Tulokset on esitetty kuvassa 9.

Esimerkki 4: 25 Immunoaffiniteettisidosten ia katkeavan kovalenttisidoksen samanaikainen rikkominen 17-alfa-hvdroksiproaesteronin kilpailevassa määrityksessä

Koejärjestely on kuvattu kilpailevan määrityksen yhteydessä kuvassa 3.

13 88 545 Määrityksen kulku

Polystyreeni mikrotiitterikaivot on pinnoitettu polyklonaa-lisella anti-kani vasta-aineella. Polyklonaalinen kanin anti-17-alfa-0H-progesteronin vasta-aine laimennettiin 5 määrityspuskurissa (1:50.000) ja 100 μΐ laimennosta lisättiin jokaiseen kaivoon. Tämän jälkeen lisättiin 25 μΐ standardia (7, 16, 28, 57, 102 ja 261 nM). Vaiheessa 3 lisättiin lopuksi (100 μΐ, 4.8 nM) 4-aminofenyletynyyli-2.6-bis (Ν,Ν-bis (karboksimetyyli)-aminometyyli) pyridiini-Eu:n 10 isotiosyanaattidisulfidi-johdannaisella leimattua 17-alfa-OH-progesteronin johdannaista. Kolmen tunnin inkubaatio tehtiin huoneenlämmössä jatkuvasti ravistellen. Tämän jälkeen kaivot imettiin kuiviksi ja pestiin kuusi kertaa, jonka jälkeen lisättiin 200 μΐ katkaisuliuosta (kuten esi-15 merkissä 3) ja 2 min. kuluttua ravistelusta mitattiin liuoksen europium-kelaatin aikaerotteinen fluoresenssi. Kuvassa 10 on esitetty 17-alfa-OH-progesteroni-määrityksen standardikuvaaja. Saavutettu maksimisignaali 0-standardille oli 55.000 cps.

20

Claims (7)

14 88545 Patenttivaatimukset;

1. Kiinteällä faasilla tapahtuvaan bioaffiniteetti-reaktioon perustuva määritysmenetelmä, jossa mittaus 5 toteutetaan käyttämällä fluorometriaa, erityisesti aikaerotteista fluorometriaa, fluoresoivien lantanidi-kelaattien avulla, jolloin yksittäinen lantanidi-kelaatti kiinnitetään kovalenttisesti bioaffiniteetti-reaktion yhteen bioaffiniteettiyhdisteeseen leimatun 10 yhdisteen aikaansaamiseksi ja leimatun yhdisteen ylimäärä pestään pois bioaffiniteettireaktion päätyttyä, jolloin bioaffiniteettireaktion ja pesun jälkeen lantanidikelaatti, sisältäen sekä kelatoivan rakenteen että lantanidi-ionin kelatoituneessa muodossa, vapau-15 tetaan kiinteältä faasilta, tunnettu siitä, että lantanidikelaatti vapautetaan kiinteältä faasilta rikkomalla kiinteällä faasilla oleva bioaffiniteettiyh-disteiden välinen sidos esimerkiksi yhden tai useamman seuraavan tekijän vaikutuksesta: pH, lämpötila, 20 detergentti, kaotrooppinen suola, orgaaninen liuotin ja ionivahvuus.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että lantanidikelaatin vapautuessa 25 kiinteältä faasilta se on yhä kovalenttisesti sidottu mainittuun bioaffiniteettireaktion yhteen bioaffini-teettiyhdisteeseen.

3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, 30 tunnettu siitä, että vapautuksen jälkeen sama lantanidikelaatti mitataan liuoksesta fluorometriaa, erityisesti aikaerotteista f luorometriaa apuna käyttäen kelaatin ollessa edelleen sidoksissa mainittuun bioaffiniteettiyhdisteeseen. 35

4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että lantanidikelaatti, sisältäen sekä kelatoivan rakenteen että lantanidi-ionin, vapau- » S8545 tetaan kiinteään faasiin sidotusta, leimatusta bio-affiniteettiyhdisteestä rikkomalla myös katkeava kova-lenttisidos leimatun bioaff initeettiyhdisteen ja yksittäisen kelaatin väliltä esimerkiksi pelkistämällä, 5 hapettavalla hydrolyysillä tai valolla tai jollakin näiden yhdistelmällä.

5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että vapautuksen jälkeen sama 10 lantanidikelaatti mitataan liuoksesta fluorometriaa, erityisesti aikaerotteista fluorometriaa apuna käyttäen.

6. Jonkin edellisen patenttivaatimuksen 1-5 mukainen 15 menetelmä, tunnettu siitä, että bioaffiniteetti- reaktio on antigeeni-vasta-aine -reaktio, nukleiini-happohybridisaatio -reaktio, ligandi-reseptori -reaktio tai ligandi-lektiini -reaktio.

7. Jonkin edellisen patenttivaatimuksen 1-6 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kelatoitu lan-tanidi-ioni on joko europium, terbium, samarium tai dysprosium. 16 88545 Patentkrav;