FI87464B - Foerfarande foer isolering och rening av cyklodextriner. - Google Patents

Description

! 87464

MENETELMÄ SYKLODEKSTRIINIEN ERISTÄMISEKSI JA PUHDISTAMISEKSI - FÖRFARANDE FÖR ISOLERING OCH RENING AV CYKLODEXTRINER

5 Keksinnön kohteena on spesifisiä kromatografi sia menetelmiä minkä tahansa yksittäisen syklodekst-riinimuodon eristämiseksi ja puhdistamiseksi vesiseok-sista, jotka sisältävät asyklisiä oligosakkarideja ja syklodekstriinejä. Lisäksi nämä menetelmät soveltuvat 10 CD:iden kemiallisten johdannaisten puhdistukseen. Keksinnössä hyödynnetään kiinteitä kantajia, jotka kantavat sopivia, synteettisesti saatettuja ligandeja, jotka kykenevät spesifisesti vuorovaikutukseen yhden tai useamman syklodekstriinimuodon kanssa entsyymikonver-15 sioseoksessa.

Syklodekstriinit (sykliset glukoosioligomee-rit) ovat kaupallisesti tärkeitä tuotteita, jotka on saatu entsymaattisella menetelmällä liuotetusta tärkkelyksestä.

20 Koska syklodekstriinejä tuottava entsyymi katalysoi substraattien ja eri kokoisten syklodekstrii-nien välistä tasapainoa, niin keksinnön mukaisesti pääasiassa yhtä syklodekstriinilajia voidaan valmistaa jatkuvatoimisesti ja spesifisesti poistamalla haluttu 25 lopputuote seoksesta käyttäen asianmukaista affiniteet-tisorbenttia.

Esillä olevan keksinnön kohteena on edelleen yksivaiheinen menetelmä analyyttistä laatua olevien syklodekstriinien tai niiden analyyttistä laatua olevi-30 en kemiallisten johdannaisten valmistamiseksi isotermi-sesti.

Syklodekstriinit (CD:t) muodostetaan syk-lodekstriiniglukanotransferaasin (EC 2.4.1.19) (CGTaa-si) toiminnan kautta liuotetusta tärkkelyksestä tai 35 vastaavista substraateista, jotka sisältävät 1-4- alfa glykosidisiä sidoksia. CD:itä on kasvavasti hyödynnetty tieteen ja teknologian useilla alueilla monien yhdis- 2 87464 teiden, kuten vitamiinien, lääkeaineiden, saniteetti-ja maatalouden vaikutusaineiden ja aromiyhdisteiden, luontaisten ominaisuuksien muuttamiseksi. Äskettäin samanlaisia sovellutuksia on myös keksitty keinotekoi-5 sille, kemiallisesti muunnelluille syklodekstriineille. CD:iden käyttö perustuu niiden kykyyn muodostaa mole-kyylikomplekseja tai mikrokapseleita vaikutusaineiden kanssa ja siten muuttaa niiden fysikaalisia ja kemiallisia ominaisuuksia, kuten liukoisuutta, haihtuvuutta 10 ja absorptiota suolistosta.

CGTaasin entsymaattinen reaktio tuottaa pääasiassa kolmen CD-muodon seosta, joita merkitään alfa-, beta- ja gamma-CD. Monilla CGTaaseilla beta-muoto dominoi konversioseoksessa. Sen korkean pitoisuuden ja 15 alhaisen liukoisuuden kylmään veteen vuoksi beta CD voidaan edullisesti valmistaa puhtaassa kidemuodossa. Valitettavasti näin ei ole asian laita vähemmän yleisten CD-muotojen kanssa. Erityisesti tarvitaan puhtaampaa ja huomattavasti halvempaa gamma CD:a kuin mitä 20 tähän asti on ollut saatavilla, sillä eräät tärkeät lääkkeet hyötyisivät CD:issa mikrokapseloinnista. Nämä farmaseuttiset aineet ovat kuitenkin liian suuria mole-kyylikooltaan mahdutettavaksi muiden kuin gamma CD:ssa olevaan onteloon (internal cavity of gamma CD).

25 Gamma CD tuottamiseksi on keksitty menetelmiä, joissa käytetään orgaanisia liuottimia, kuten trikloo-rietyleeniä, tetrakloroetaania tai bromobentseeniä, /:* spesifisesti saostamaan sitä, mutta näitä menetelmiä ei voida käyttää, kun tuote on tarkoitettu elintarvike-. 30 tai farmaseuttiseen käyttöön, sillä se usein sisältää pieniä määriä myrkyllisiä liuottimia.

Tavallisesti 20 - 60 * tärkkelyksestä muutetaan CD:iksi riippuen käytetyn tärkkelyksen pitoisuudesta. Eristettäessä beta CD asykliset oligosakkaridit 35 täytyy muuntaa glukoosiksi tai poistaa ennen kuin beta CD-kiteytys on mahdollista. Kuitenkin, tavallisesti haluttaessa puhtaita alfa tai gamma CD, niin sokeri- 3 87464 fraktio täytyy poistaa, koska sen muuntaminen glukoosiksi ei riitä.

Alfa tai gamma CD erottaminen CD-seoksista on kaikkein hankalin vaihe niiden valmistuksessa. Tekniikan 5 tasossa tunnetaan kaksi pohjimmiltaan erilaista toteutustapaa, joissa käytetään vesipitoisia liuottimia. Ensimmäisessä menetelmässä CD:t erotetaan ekskluusio-kromatografiällä geeleillä, kuten ToyopearlR MolselectR, tai SephadexR (Eur. pat. hakemus 45464; Die Stärke 22 10 (1978) 276-279; esitteet tapahtumasta 1st Int. Symp. on

Cyclodextrins, Budapest 1981, toim. J. Szeijtli, ss. 61 - 68). Tämä toteutus vaatii suuret pylväät, kontrolloidun lämpötilan, ja pienimolekyylisten sokeroiden ja asyklisten dekstriinien esipoiston. Toinen toteutus 15 pohjautuu tiettyjen kaupallisesti saatavien, synteettisten adsorptiohartsien kykyyn adsorboida CD:itä, edellyttäen, että pylvään lämpötila on tarkasti kontrolloitu. Varhaisin keksintö tehtiin Yamamoton ja Hori-koshin toimesta (Die Stärke 33, (1981) 244-246). Käy-20 tettiin amberliteR XAD-4 adsorptiohartsia ja järjestelmä suunniteltiin puhdistamaan alfa CD. Tämä periaate patentoitiin myös gamma CD valmistamiseksi myöhemmin Horlkoshl et ai. toimesta vuonna 1984 (Eur. pat.hakemus 45464). Tämän menetelmän epäkohtina on, että tarvitaan 25 vaiheittaista lämpötilaohjelmaa, ja korkeat lämpötilat (85 - 97 °C) pitkäaikaisessa eluutiossa mahdollisesti aikaansaavat kemiallisia reaktioita. Lisäksi meillä on kokeellinen todiste, että CD:t adsorboituvat irrever-siibelisti hartseihin aikaansaaden hartsin alentuneen 30 adsorbtiokapasiteetin.

Glukoosin, maltoosin, ja alfa ja beta CD ad-sorptiokromatografinen erotus hiilellä on myös esitetty (J. Lammers, J. Chromatogr. 41, 1969, ss. 462-466) mutta kantajalla on alhainen kapasiteetti CD:iden pre-35 paratiiviseen puhdistukseen.

Patenttijulkaisussa US 4 418 144 on kuvattu γ-CD:iden valmistusta. Ko. julkaisun menetelmän mukaises- 4 87464 ti ensin valmistetaan sokeriliuos, joka sisältää pääasiassa a-, R- ja y-CD:itä sekä glukoosia, CD:t erotetaan vahvasti happaman kationinvaihtohartsin alkali-tai maa-alkalimetallisuolapylväällä ja lopuksi y-CD tai 5 y- ja β-CD erotetaan kontrolloidussa lämpötilassa absorboimalla hydrofobiseen huokoiseen polymeeriin sekä eluoimalla vedellä.

Esillä oleva keksintö tuo esiin parantuneen menetelmän yksittäisten CD:iden, erityisesti gamma CD 10 puhdistamiseksi. Spesifiset sorbentit syntetisoidaan tätä tarkoitusta varten. Kantajamatriisi on primäärisesti hydrofiilinen, mikä parantaa sorbenttien turpoamista vedessä ja lisää CD:iden diffusionaalisia nopeuksia huokoisen verkoston sisällä.

15 Esillä oleva keksintö tuo esiin yksinkertaisen ja tehokkaan menetelmän alfa, beta ja erityisesti gamma CD:iden, kuin myös niiden kemiallisten johdannaisten, eristämiseksi ja puhdistamiseksi.

Toisena kohteena on käyttää spesifisiä sor-20 bentteja entsymaattisen konversioreaktion ohjaamiseksi yhden CD-lajin suuntaan adsorboimalla haluttu laji sor-benttiin.

Keksinnölle tunnusomaisten seikkojen osalta viitataan patenttivaatimukseen 1.

25 Edellä olevat kohteet toteutetaan kemiallises ti yhdistelemällä erilaisia kompleksoivia aineita (li-gandeja) kiinteisiin kantajiin spesifisten affiniteet-tisorbenttejen saamiseksi jokaista CD-lajia tai niiden kemiallisesti syntetisoituja johdannaisia varten. Ku-30 vassa 1 on kaaviomaisesti esitetty esillä olevan keksinnön periaate. Ligandi voi muodostaa inkluusiokom-plekseja CD:iden kanssa. Kompleksin muodostustehokkuus : vaihtelee erilaisten CD-muotojen mukaan, ja tämän vuok si jokainen CD eluoidaan kromatografisesta pylväästä 35 sen erityisen tasapainokertoimen (K) mukaisesti. Spesifisen inkluusiokompleksimuodostuksen periaatteelle on tunnusomaista, että poistetaan liittyneet CD:t sorben- 5 87464 tista käyttämällä liukenevia ligandeja tai muita yhdisteitä, joiden tiedetään muodostavan suhteellisen vahvan kompleksin CD:iden kanssa.

Useita kantajamateriaaleja, joihin oli liitet-5 ty erilaisia ligandeja, kokeiltiin. Huokoiset hydrofii-liset matriisit ja ligandit, jotka sisälsivät polaarisia ryhmiä tai jotka liitettiin matriisiin polaaristen funktionaalisten ryhmien välityksellä, olivat kaikkein tehokkaimipia erotettaessa CD:itä toisistaan ja asyk-10 lisistä dekstriineistä. Alfa CD erotetaan edullisesti ligandeilla, jotka omaavat suhteellisen lyhyen (C4 -C?)-alkyyliketjun tai pidemmän alkyyliketjun, joka sisältää polaarisia ryhmiä, kuten - NH2, -CONH2, -OH, -R1 -NH-R2, -CN, R1-CH(OH)-R2 (R1 ja R2 tarkoittavat alkyyli-15 ryhmiä). Pitkät alkyyliketjut pidättävät alfa CD:n irreversiibelisti huoneenlämpötilassa. Beta CD:ta hidastetaan ligandeilla, kuten fenyylillä liitettynä polaarisen sidoksen välityksellä, substituioidulla fenyylillä (-NH2, -OCH3, -COOH, -CONH2, -N(R)2 -NOz tai -CN), 20 tryprofanyylillä substituoidulla imidatsoyylillä tai suuremmilla aromaattisilla rengassysteemeillä, kuten naftyylillä liitettynä asemien 2 tai 3 välityksellä ja edullisesti sisältäen polaarisia substituentteja. Gamma CD:11a on spesifisemmin vuorovaikutusta geelien kanssa, 25 jotka sisältävät substituoituja naftyylilignadeja edullisesti sidottuna asemien 1 tai 8 välityksellä. Nämä spesifiset kantajat parantavat CD:iden puhdistusta verrattuna aikaisempiin menetelmiin. Alfa, beta ja gamma CD:iden tai niiden johdannaisten eristys ja puh-30 distus voidaan toteuttaa isotermisesti, vesiliuoksissa, ja suurissa dekstriinipitoisuuksissa (35 % kuivapaino saakka) ilman, että asykliset sokerit ensin muunnetaan glukoosiksi ja suoritetaan kromatografinen vaihe iso-kraattisesti. Tämän keksinnön avulla on mahdollista 35 valmistaa puhtaita syklodekstriinejä suoraan konver-sioseoksista tai seoksista, joista beta CD on jo poistettu .

6 87464

Kuva 1 esittää pääpiirteittäin CD:iden spesifistä sorptiota johdettuun kantajaan/ kuva 2 esittää aminoidun Biogel” P-6 1,8-naf-tyylidianhydridijohdannaisen titrauskäyrää, 5 kuva 3 esittää gamma CD erotusta aminoidun

BiogelR P-6 1,8 naftyylidianhydridijohdannaisella, kuva 4 esittää alfa, beta ja gamma CD seoksen erotusta bentsoyloidulla amino-Biogel* P-2 pylväällä, ja kuva 5 esittää beta CD ja sen di- ja tri-mety-10 loitujen johdannaisten erotusta bentsoyloidulla amino-BiogelR P-6:11a.

Tämä keksintö tuo esiin spesifiset sorbentit jokaiselle CD-muodolle. Taulukko 1 esittää alfa, beta ja gamma CD:iden erotusta erilaisilla syntetisoiduilla 15 affiniteettisorbenteilla. Spesifiset sorbentit kehitettiin myös kemiallisesti johdetuille CD:ille.

Seuraavan tekijät vaikuttavat erilaisten sor-benttien ja erilaisten CD-alamuotojen vuorovaikutuksen spesifisyyteen: 20 Kun käytetään geelityypin ei-jäykkiä kantajia, niiden huokoisuuden täytyy huomattavasti ylittää eks-kluusioraja CD:ille johtuen osittaisesta geelin kutistumisesta johdannaisen muodostuksen aikana.

Ligandit pitäisi liittää polaaristen sidosten 25 välityksellä niiden tekemiseksi liukoiseksi vesifaasis-sa.

Edullinen ligandi gamma CD:lie on sen kokoinen, että se mahdollistaa penetraation gamma CD:ssa olevaan onteloon, mutta kertaa suurempi kuin alfa tai 30 beta CD:n ontelo. Vastaavasti edullinen ligandi beta CD:lie ei sovi alfa CD onteloon ja se on samanaikaisesti suhteellisen väljä gamma CD onteloon.

Liuoksessa vapaana olevan ligandin vuorovaikutuksen voimakkuutta ei voida suoraan hyödyntää CD:ille 35 sopivien sorbenttien suunnitelussa muutoin kuin arvioitaessa ligandin maksimimolekulaaridimensioita. Tämä johtuu siitä, että kompleksin muodostustapa CD:ihin ei 7 87464 ole välttämättä sama liuoksessa ja kiinteässä faasissa. Lisäksi ligandi liitetään kantajiin kemiallisesti ainakin yhden sen funktionaalisen ryhmän välityksellä. Esimerkiksi liuoksessa bentsyyliryhmä on tavallisesti 5 vahvimmin vuorovaikutuksessa alfa CD kanssa (Korpela et ai., J. Chromatogr. 290 (1984) ss. 351-361), mutta im-mobilisoituna ryhmä on pääasiallisesti vuorovaikutuksissa beta CD kanssa (taulukko 1). Tämä on ilmeistä johtuen liittyneiden ligandien keskinäisestä vuorovai-10 kutuksesta kiinteässä faasissa. Kuitenkin, mikäli li-gandit pakotetaan erilleen tilaryhmien (spacer groups) avulla (PEBR 94 geelin dimetyylibentsaldehydijohdannainen, kuten on taulukossa 1), saavutetaan liuostilaa vastaava spesifisyys. Liuosolosuhteet saavutetaan myös 15 käyttämällä hyvin alhaista ligandin substituutioastet-ta.

Liuoksessa kompleksimuodostusaste kasvaa tavallisesti lämpötilan laskiessa (Korpela et ai., J. Chromatogr. 290 (1984) ss. 351 - 361). Tämä tilanne ei 20 välttämättä pidä paikkaansa kiinteässä faasissa, koska lämpötilan edulliseen vaikutukseen voi vastavaikuttaa lisääntynyt ligandi - geeli tai ligandi - ligandi vuorovaikutus .

Eri kantajamateriaalit poikkeavat niiden te-25 hokkaan pinnanalan ja ligandin sitoutumisen suhteen. Tämä vaikuttaa sorbentin kapasiteettiin, mutta ei laadullisesti vaikuta CD:itä koskevaan erotusprofiiliin.

Sorbentit, jotka antavat erilaisia eluutioti-lavuuksia yksittäisille CD:ille, eivät välttämättä 30 erota niiden seoksia. Tämän voidaan olettaa johtuvan sitoutumismekanismien monimutkaisista interferensseistä.

Hyvin hydrofobiset ligandit eivät sido CD:itä tai sitovat niin heikosti ja hitaalla sitoutumisnopeu-35 della (indikoituna levein nauhoin kromatografiässä); sitominen voi olla myös irreversiibeliä. Ilmiö on jopa ilmeisempää hydrofobisilla matriiseilla.

8 87464

Taulukko 1: Alfa-, beta- ja gammasyklodekstrUnien erotus erilaisilla syntetisoiduilla affiniteettisorben-teilla

Syklodeks- 5 trilnien

Kantaja Esim. Reagenssi Sidos retentio

Selluloosa 2 1-propyyliamiini -NH- α=β=γ 2 1-pentyyliamiini -NH- α>β=γ 2 1-heksyyliamiini -NH- α>β>γ 10 2 1-dodesyyliamiini -NH- α>>β>γ 2 bentsyyliamiini -NH- β£α=γ 2 1-(aminometyyli)- naftaleeni -NH- α=β=γ 3 bentsoyylikloridi -NHCO- α=β=γ 15 2,12 2-hydroksi-3-nafto- iinihappo -NHCO α=β=γ 2,15 1,8-naftyylihappo- anhydridi -NHCO γ>β>α 2,12 2-naftoksietikka- 20 happo -NHCO β>α=γ SEPHAROSE* 4 oktyyliamiini isourea α>>β>γ 5 bentsyyliamiini isourea α=β=γ 7 DL-tyrosiini -CH2NH- β>α>γ 7 DL-fenyylialaniini -CH2NH- β>α>γ 25 7 DL-tryptofaani -CH2NH- β>>α>γ 7 6-(p-toluidino)-2- naftaleenisulfoni- happo -CH2-N- β>α>γ 7 l-(aminometyyli)- 30 naftaleeni -CH2NH- σ=β=γ PBEr 94 8 2,4-fluorodinitro- bentseeni -NH-Phe- α£β=γ 8,11 2,4-dimetoksibents- aldehydi -NHCH2- α>β^γ 35 Amberlite* 8 2,4-fluorodinitro- IRAr-45 bentseeni -NH-Phe α=β=γ

AmberliteR 8 2,4-fluorodinitro- 9 87464 IRAr-93 bentseeni -NH-Phe γ£β>α

Huokoinen lasi 9 bentsyyliamiini -CH2NHCH2- β>γ>α BIOGELr P-611 2,4-dimetoksibents- 5 aldehydi -NHCH2- α>β>γ 12 bentsoehappo -NHCO- β>α>γ 10,3 bentsoyylikloridi -NHCO- β>>α>γ 12 adamantyyli-l-kar- boksyylihappo -NHCO- β>>γ>α 10 12 linoleiinihappo -NHCO- α=β>γ 12 DL-tyrosiini -NHCO- β>α=γ 12 DL-fenyylialaniini -NHCO- a=fl=y 12 DL-tryptofaani -NHCO- α>β>γ 13 2,4,6-trinitrobent- 15 seenisulfonaatti -NH-Phe α=β=γ 14 2-naftoksietikka- happo -NHCO- β>γ>>α 14 2-hydroksi-3-naft- yylihappo -NHCO- β>>α=γ 20 15 1,8-naftyylihappo- anhydridi -NHCO- γ>>β>α SEPHACRYLr 15 1.8-naftyylihappo- S 200 anhydridi -NHCO- γ>>β>α 25 Huokoisilla materiaaleilla, joiden ekskluusio- rajat ovat luokkaa 1000 - 10 000 ja joilla on suhteellisen polaariset ligandit, on suurin kapasiteetti.

CD:iden vuorovaikutuksen voimakkuutta spesifisten sorbenttien kanssa ja sorbenttien turpoamista voi-30 daan säätää pH, ionivahvuuden ja liikkuvan faasin lämpötilan avulla.

Spesifisiä sorbentteja voidaan käyttää kasvattamaan erilaisten CD:iden ja näiden kemiallisten johdannaisten saantoa spesifisesti poistamalla syn-35 teesituote synteesiseoksesta: Tämän keksinnön mukaisesti valmistetut sorbentit ovat sopivia muuttamaan entsyymi CGTaasin katalysoimaa tasapainoa kohti haluttua ίο 8 7 464 CD lajia. Tämä toteutetaan edullisesti pylväiden sarjassa, jotka pylväät sisältävät immobilisoidun CGTaasin ja spesifisen sorbentin. Pylvääseen syötetään CGTaasin pienimolekyylisiä substraatteja sisältävä liuos. Vaikka 5 immobilisoitu CGTaasi ei ole erityisen tehokas makromo-lekyylisubstraatin tapauksessa (esim. gelatinoitu tärkkelys), tämä voidaan korvata halvoilla pienimolekyylisillä substraateilla, kuten beta-CD tai oligosakkarideilla, jotka sisältävät 3-15 glukoosiyksikköä, joil-10 la on vähäiset diffuusiorajoitukset. Vaihtoehtoisesti CD:t voidaan saattaa kosketuksiin spesifisten sorbent-tien kanssa dialyysikalvojen välityksellä.

Seuraavassa esitetään havainnollistavia esimerkkejä spesifisten sorbenttien synteesistä ja eri-15 laisten CD-muotojen puhdistuksesta käyttäen näitä spesifisiä sorbentteja:

Esimerkki 1: Selluloosan triatsiinijohdannainen

Synteesin periaate 20

Selluloosa-OH + NaOH->selluloosa-0-Na + /Cl /Cl 25 xN'Cv. /N_C\

Selluloosa·-O-C N + NaCI^-1---Cl-C N

n# % t

N-C N-C

ci \:i 30 10 g selluloosajauhoa MN 300 (Sigma) suspen- doitiin veteen ja turvotettiin yön yli huoneenlämpötilassa. Turvonnut materiaali pestiin 50 ml kylmällä (0 -5 °C) 2 M NaOH lasifiltterissä ja sitten 100 ml kylmällä (-20 °C) asetonilla. Jauhe suodatettiin ja slirret-35 tiin välittömästi astiaan, joka sisälsi 3 g syanu- riinikloridia (2,4,6-trikloori-l,3,5-triatsiin, Aldrich) kylmässä (-20 °C) asetonissa. Suspensiota sekoi- n 87464 tettiin jatkuvasti ja lisättiin 50 ml jääkylmää vettä. Liuoksen annettiin lämmetä 20 °C lämpötilaan saakka n.

10 min aikana (pH pitäisi olla silloin 1-2). Johdannainen pestiin lasifilterissä jääkylmällä etikkahapolla 5 (20 % vedessä) ja asetonilla (200 ml kukin). Säilytys asetonissa -20 °C lämpötilassa.

Esimerkki 2; Aminoitu selluloosa

Synteesin periaate 10

Cl NH-R

/N"C\ R-NH2 /N”C\

Selluloosa - O ~ C -> Selluloosa - 0~C N

.. ^N-C 2NaOH ΊΥ-cf 15 \ \

Cl NH-R

+ 2NaCI

20 250 ml 0.5 M bis-(aminopropyyli)amiinin vesi- liuosta valmistettiin ja sen pH sovitettiin 10 HC1 avulla. Mikäli kaikki amiini ei ollut liuennut, lisättiin tipoittain pieni määrä dimetyylisulfoksidia. Liuos jäähdytettiin jäähauteessa ja lisättiin 100 g kosteaa 25 triatsiini-selluloosaa. Suspensiota sekoitettiin jää-hautessa ja pH pidettiin 10 käyttäen 5 M NaOH. Kun emäksen kulutus loppui, aminoitu selluloosa pestiin vuoroin vedellä, 0,5 M NaOH, vedellä, etanolilla, asetonilla ja vedellä (500 ml kukin). Säilytys vedessä 0 30 °C lämpötilassa.

Muut selluloosan amino johdannaiset valmistettiin samalla tavoin, mutta bis-(aminopropyyli)amiini korvattiin aminoyhdisteiden ekvivalentilla molaarisella pitoisuudella.

i2 87 464

Esimerkki 3: Bentsoyloitu aminoselluloosa 10 g suodatettua kosteaa aminoitua selluloosaa (esim. 2) sekoitettiin veteen ja jäähdytettiin jäähau-teessa. Suspensiota sekoitettiin ja pH saatettiin 11 5 5 M NaOH avulla. Lisättiin 4 ml bentsoyylikloridia ti-poittain 30 min aikana pitäen pH arvossa 11. Tämän jälkeen lämpötilan annettiin nousta, 1 h aikana, huoneenlämpötilaan. Varovaista sekoitusta jatkettiin vielä n. 4 h. Suspensio suodatettiin ja kiintoaine pestiin vuo-10 roin vedellä, etanolilla, vedellä, 1 M NaCl ja vedellä (0.5 1 kukin). Säilytys vedessä 0 °C lämpötilassa.

Esimerkki 4:

Oktyyli-Sepharose CL 4B syntetisoitiin Affinity 15 chromatography: a Practical Approach Eds. by P.D.G.

Dean, W.S. Johnson ja F.A. Middle; RL Press Ltd., Oxford, Washington, D.C. (1985), 215 s, mukaisesti.

Esimerkki 5: 20 Fenyyli-Sepharose CL 4B syntetisoitiin Affinity chromatography (1985) Ed. by Dean et ai., mukaisesti.

Esimerkki 6: Epoksiaktivoitu Sepharose 4B

Sepharose CL 4B (200 ml; Pharmacia) pestiin 25 vedellä erotussuppilossa ja kostea geeli suspendoitiin 140 ml 0.6 M NaOH liuokseen, joka sisälsi 280 mg NaBH4. Lisättiin dimetyylisulfoksidia (20 ml), jonka jälkeen lisättiin 42 ml 1,4-butaanidiolidiglysidyylieetteriä (Sigma). Reaktion annettiin edetä 6 h ajan huoneenläm-30 pötilassa sekoituksella, jonka jälkeen geeli pestiin vedellä (2 1). Geeliä voitiin säilyttää + 5 °C lämpötilassa n. yhden viikon ajan.

Esimerkki 7: Aminoligandien liittäminen epoksiak- 35 tivoituun Sepharose-kantajaan 10 g kosteaa, imulla kuivattua, epoksiaktivoitua Sepharose CL 4B suspendoitiin 20 ml 0.1 M NaHC03 liuok- i3 87 4 64 seen, pH 10.5, joka sisälsi 0.5 g aminoligandia (esim. tyrosiini, tryptofaani, fenyylialaniini, 1-aminonafta-leeni) tai 6-(p-toluidino)-2-naftaleenisulfonihappoa). Seosta sekoitettiin yön yli huoneenlämpötilassa. Geeli 5 pestiin vedellä (100 ml) ja tris-HCl puskurilla (0.1 M, pH 9.0; 100 ml) ja jätettiin seisomaan samaan puskuriin yön yli. Pesua jatkettiin vuoroin vedellä, 50 % etanolilla, 100 % etanolilla, 50 % etanolilla, 0.1 M Na-asetaatilla, pH 3.0, ja vedellä (100 ml kukin).

10

Esimerkki 8; 2,4-fluorodinitrobentseeniin liittäminen PBE 94:ään 20 g kosteaa, imulla kuivattua PBE 94 kromato-fokusoivaa geeliä (Pharmacia, Ruotsi) pestiin 100 ml 15 0.1 M Na-fosfaattipuskurilla, pH 7.0, erotussuppilossa.

Geeli sisältää aminopolyelektrolyyttejä sidottuna Sep-harose-kantajaan. Geeli suspendoitiin edellä mainittuun puskuriin (30 ml) huoneenlämpötilassa. 50 millimoolia 2,4-fluorodinitrobentseeniä liuotettiin 5 ml metanoliin 20 ja tämä liuos lisättiin hitaasti (30 min aikana) sekoitettuun geelisuspensioon, pitäen pH arvossa 7 1 M NaOH avulla. Sekoitusta jatkettiin ja pH pidettiin arvossa 7, kunnes se pysyi vakiona ainakin 10 min ajan. Geeli pestiin vuoroin vedellä, 50 % etanolilla, 100 % etano-25 lilla, 50 % etanolilla, vedellä, 0.5 M NaCl ja vedellä (200 ml kukin).

2,4-fluorodinitrobentseenin liittäminen Amber-liitti IRA-45 ja Amberliitti IRA-93 hartseihin suori-tettin, kuten on esitetty PBE 94 johdannaisen tapauk-30 sessa.

Esimerkki 9: Huokoisen lasin bentsyylijohdannai nen

Huokoinen lasi (Sigma, PG-240-400) epoksi-akti-35 voitiin, kuten on kuvattu Larsenin toimesta julkaisussa Methods in Enzymology 104 (1984) s. 212. 5 g aktivoitua lasia, 5 ml dimetyylisulfoksidia, ja 10 ml bentsyy- i4 87^64 liamiinia ravistettiin varovasti huoneenlämpötilassa yön yli. Kantaja pestiin vuoroin vedellä (0.5 1), etanolilla (100 ml) ja eetterillä (50 ml) ja varastoitiin kuivana.

5

Esimerkki 10: Aminoetyyli Biogel P-6 valmistus

Periaate:

Biogel-CONH2+ H2N CH2CH2NH2 10 -iogel - NHCH2CH2 N H2 + N H 3 25 g Biogel P-6, 200 - 400 mesh (Bio-Rad Laboratories) lisättiin 500 ml etyleenidiamiiniin (tekninen 15 laatu, E. Merck) pyöröpohjaisessa kolvissa, joka on varustettu pystyjäähdyttäjällä ja magneettisekoittajal-la. Suspensiota pidettiin 110 - 115 °C lämpötilassa (öljyhaude) samalla jatkuvasti sekoittaen 4 h ajan. Seoksen annettiin jäähtyä huoneenlämpötilassa, suoda-20 tettiin, ja pestiin vuoroin vedellä, 0.2 NaCl, vedellä, 10 % etanolilla ja vedellä (2 1 kukin). Tämä jälkeen vesipitoisen geelisuspension (1 1) pH sovitettiin 3.0 5 M HC1 avulla ja pesua jatkettiin 10 % etanolilla (2 1), 50 % etanolilla (0.5 1), etanolilla (0.5 1), 50 % eta-25 nolilla (0.5 1) ja vedellä (2 1). Säilytys vesisuspensiona + 5 °C lämpötilassa.

Aminoetyyli Sephacryl S 200 valmistus suoritettiin samalla tavoin kuin aminoidun biogel P-6 valmistus paitsi, että refluksointi suoritettiin 100 °C lämpöti-30 lassa.

Esimerkki 11: 2,4-dimetoksibentsaldehydin liittäminen aminoetyyli Biogel P-6:een

Aminoitu Biogel P-6 (12 g kosteaa geeliä) sus-35 pendoitiin 20 ml veteen. Suspension pH sovitettiin 11 5M NaOH avulla. Geeliä pestiin vedellä (50 ml) ja tämän jälkeen metanolilla (100 ml). Tämän jälkeen se suspen- is 87464 doitiin metanoliin (30 ml) ja suspensioon lisättiin 20 millimoolia 2,4-dimetoksibentsaldehydiä (Aldrich). Suspensiota ravistettiin varovasti yön yli huoneenlämpötilassa. 5 millimoolia kiinteää NaBH, lisättiin ja 5 ravistusta jatkettiin yön yli + 5°C lämpötilassa. On huolehdittava, että astiaa ei suljeta täysin, sillä H2 kaasua vapautuu. Geeli pestiin vuoroin vedellä, 0.5 M NaCl, vedellä, 50 % etanolilla, etanolilla, 50 % etanolilla ja vedellä (100 ml kukin).

10

Esimerkki 12: Bentsoyloidun aminino Biogel P-6 valmis tus

Bentsoehappo (1 g) liuotettiin 30 ml lämpimään veteen ja pH sovitettiin 4.7 IM NaOH avulla. Mikäli 15 kaikki bentsoehappo ei liuennut, lisättiin pieni määrä metanolia hapon saattamiseksi liuokseen. Lisättiin 30 g imulla kuivattua, kosteaa, aminoitua Biogel P-6 liuokseen ja pH sovitettiin uudelleen 4.7 (HC1 tai NaOH). N-etyyli-N'-(3-dimetyyliaminopropyyli)karbodi-imidihydro-20 kloridi (1.5 g Sigma) liuotettiin 5 ml veteen 0 °C lämpötilassa. Liuos lisättiin tipoittain 30 min aikana geelisuspensioon huoneenlämpötilassa samalla jatkuvasti sekoittaen. Varovaista sekoitusta jatkettiin 4 - 8 h ajan. Tämän jälkeen geeli suodatettiin ja pestiin ero-25 tussuppilossa peräkkäisesti vedellä, 50 % etanolilla, metanolilla, 50 % etanolilla, vedellä, 0.2 M NaCl ja vedellä (1 1 kukin).

Oleellisesti samalla tavoin sidottiin muut karboksyyliligandit (adamantyyli-l-karboksyylihappo, 30 tyrosiini, tryptofaani, fenyylialaniini ja lino-leenihappo) aminoituun Biogel P-6 karboksyylifunktion kautta.

Esimerkki 13: Aminoidun Biogel P-6 trinitrobent- 35 seenijohdannainen 20 g kosteaa aminoitua Biogel P-6 pestiin 100 ml 0.1 M Na-tetraboraattipuskurilla, pH 9.3. Geeli sus- ie 87464 pendoitiin 20 ml samaan puskuriin. 2,4,6-trinitrobent-seenisulfonaattia (0.6 g) lisättiin, ja seosta sekoitettiin huoneenlämpötilassa 4 h ajan, samalla pitäen pH arvossa 9.3 IM NaOH avulla. Syvänpunainen geeli pes-5 tiin läpikotaisin vuoroin vedellä, 0.5 M NaCl, vedellä, 50 % etanolilla, etanolilla, 50 % etanolilla, ja vedellä (200 ml kukin).

Esimerkki 14; Aminoidun Biogel P-6 2-naftoksietik- 10 kahappojohdannainen 5 g 2-naftoksietikkahappoa liuotettiin 20 % dimetyylisulfoksidi-vesiliuokseen. Lisättiin 50 ml (a-settunut tilavuus) aminoitua Biogel P-6 ja pH sovitettiin 4.7 IM NaOH avulla. Suspensiota sekoitettiin jat-15 kuvasti 20 °C lämpötilassa, kun N-etyyli-N'-(3-dimetyy-liaminopropyyli)karbodi-imidihydrokloridi (4 g 20 ml vedessä 0 °C; Sigma) lisättiin tipoittain 30 min aikana, ja pH pidettiin arvossa 4.7. Varovaista sekoitusta jatkettiin 4 - 8 h ajan. Geeli pestiin vuoroin vedellä, 20 50 % etanolilla, etanolilla, 50 % etanolilla, vedellä, 0.5 M NaCl ja vedellä (500 ml kukin).

Aminoidun Biogel P-6 2-hydroksi-3-naftyylihap-pojohdannainen valmistettiin samalla tavoin.

25 Esimerkki 15: Aminoidun Biogel P-6 1,8-naftyyli- happoanhydridijohdannainen 50 ml (asettunut tilavuus) aminoitua Biogel P-6 ja 950 mg 1.8-naftyylihappoanhydridiä (Aldrich) suspen-doitiin 50 ml veteen huoneenlämpötilassa. Seosta sekoi-30 tettiin voimakkaasti samanaikaisesti kun pH nostettiin arvoon 11.0 (pH mittari) 5 M NaOH avulla. Lämpötila kohotettiin 40 °C, varovaista sekoitusta jatkettiin 40 °C 6 h ajan, ja pH pidettiin 11.0 ± 0.2 1 M NaOH avulla. Sitten geeli pestiin vuoroin vedellä, 50 % etano-35 lilla, etanolilla, 50 % etanolilla, vedellä, 0.5 M NaCl ja vedellä (500 ml kukin). Tämän menetelmän jälkeen asettunut tilavuus geeliä oli 22 - 25 ml. Tämän geelin 17 87464 14 ml titrauskäyrä on esitetty kuvassa 2.

Aminoidusta Biogel P-6 muodostettiin samalla tavoin johdannainen ftaalianhydridin ja pyromelliitti-happodianhydridin kanssa.

5

Esimerkki 16: 1,8-naftyylihappoanhydridi-aminoitu

Biogel P-6:n sukkiinihappojohdannainen 20 ml Biolgel P-6 1,8-naftyylihappojohdannaista (esimerkki 15 edellä) käsiteltiin 2 g sukkiinihappoan-10 hydridillä vapaiden aminoryhmien salpaamiseksi geelissä. Tämä suoritettiin kyllästetyssä natriumboraattili-uoksessa huoneenlämpötilassa jatkuvalla sekoituksella/ pitäen liuoksen pH arvossa 8 - 9 2 M NaOH avulla. Geeli pestiin samalla tavoin kuin esimerkin 15 geeli.

15

Esimerkki 17: Gamma CD puhdistus

Entsyymi CGTaasi valmistettiin alkalofiilisen Bacillus sp. avulla Matzuzawa et ai♦ mukaisesti (Die Starke, 27 (1975) 410). Konversioseos valmistettiin 20 konventionaalisten menetelmien mukaisesti (Nakamura & Horikoshi. Biotechnology and Bioengineering (1977) 87 - 99).

Osittain puhdistettu konversioseos, joka sisälsi 140 g lineaarisia sokereita, 20 g alfa CD, 21 g beta CD 25 ja 8 g gamma CD yhdessä litrassa vesiliuosta, saatettiin 1,8-naftyylihappoanhydridijohdettuun Biogel P-6 (esimerkki 15 taulukossa 1)-pylvääseen. Adsorbentti (170 ml) pakattiin lasipylvääseen (i.d. 2.2 cm) ja tasapainotettiin 200 ml 25 mM NaHC03, pH 10.5. Näyte (50 30 ml) syötettiin pylvääseen ja eluutio toteutettiin virtausnopeudella 80 ml/h (22 °C). Eluutio arvossa pH 3.0 (25 mM glysiinipuskuri) tuottaa yhtä tehokkaan erotuksen.

Gamma CD fraktiot välillä 270 - 350 ml kerättiin 35 (kts. kuva 3), käsiteltiin DowexR 50 X8 (200 - 400 mesh), H*-muodossa, kanssa puskurin poistamiseksi, aktiivihiilellä ja lopuksi haihdutettiin kuiviin pyörö- is 87 464 haihduttimessa. Saanto oli 80 - 85 % (verrattuna pylvääseen syötettyyn näytteeseen), ja puhtaus oli 100 ± 2 % määritettynä HPLC avulla Sigman gamma CD verrattuna.

5 Esimerkki 18; Gamma CD puhdistus Järjestelmä soveltui myös konsentroiduimpiin liuoksiin, jotka lisäksi sisälsivät korkeita pitoisuuksia gamma CD. 6 ml osittain puhdistettua konversioseos-ta, joka sisälsi 321 g sokereita per litra (4.0 % alfa 10 CD, 10.4 % beta CD, 28.5 % gamma CD, 43.0 % lineaarisia sokereita alle DP8, ja 14.1 % muita karbohydraatteja), syötettiin pylvääseen (i.d. 1.3 cm, tilavuus 27 ml), joka oli täytetty samalla sorbentilla kuin edellä. Eluutio toteutettiin 25 mM NaHC03 avulla, pH 10.5, 15 virtausnopeudella 15 ml/h. Gamma fraktio (välillä 45 -75 ml; gamma-muodon pitoisuus oli 18 g/1) kerättiin ja työstettiin kuten edellä. Tuotteen saanto ja puhtaus oli 90 - 94 % ja 96- 97 % vastaavasti. Geelin laskettu kapasiteetti gamma-muodolle oli 20.4 g/1.

20 Olemme toistaneet erotusmenetelmän 35 kertaa samoissa olosuhteissa eikä erotuskapasiteetissa tai fysikaalisissa ominaisuuksissa havaittu mitään muutoksia.

Mikäli eluutio suoritettin arvossa pH 3 10'3M 25 HC1 liuoksen avulla, niin hienoista geelimatrisiin kutistumista ilmeni useiden (10) toistettujen ajojen jälkeen .

Esimerkki 19: Beta CD puhdistus 30 0.125 ml näytettä, joka sisälsi alfa, beta ja gamma CD:itä 4 mM kutakin, syötettiin pylvääseen (15 ml), joka sisälsi Biogel P-6 bentsoehappojohdannaista (esimerkki 12). Eluutio suoritettiin huoneenlämpötilassa vedellä (virtausnopeus 6 ml/h). Beta CD fraktiot 35 (kts. kuva 4) kerättiin ja haihdutettiin kuiviin (saanto 95 %, puhtaus 100 + 2 %).

i9 87464

Esimerkki 20 : Alfa CD puhdistus Käytettiin samaa järjestelmää kuin esimerkissä 19/ paitsi että käytettiin heksyyliamino-johdettua selluloosaa (esimerkki 2). Saanto 88 %, puhtaus 100 ± 2 %.

5

Esimerkki 21: Beta CD di- ja tri-metyloitujen johdan naisten puhdistus.

Kromatografointi toteutettiin bentsoyloidulla Biogel P-6 (esimerkki 10; geelitilavuus 27 ml). Liikku-10 va faasi oli tislattu vesi ja näyteliuos sisälsi beta CD, heptakis(2,6-di-0-metyyli)-beta CD ja hepta-kis(2,3,6-tri-0-metyyli)-beta CD (0.5 mg kutakin). Kuvassa 5 näkyy, että yhdisteet erottuivat täydellisesti.

15

Esimerkki 22: Gamma CD tuotto beta CDrsta

Entsyymi CGTaasi immobilisoitiin CNBr-aktivoi-tuun sefaroosiin 4B valmistajan ohjeiden mukaisesti. (Pharmacia Fine Chemicals) käyttäen 15 mg proteiinia 20 per 3 g kuivaa geeliä. Immobilisoitu CGTaasi pakattiin lasipylvääseen (i.d. 0.5 cm, tilavuus 7.5 ml) ja pylvästä eluoitiin 10 mM beta CD vesiliuoksen kanssa virtausnopeudella 0.45 ml/min huoneenlämpötilassa. Eluaat-ti sisälsi 0.91 mM alfa CD, 7.32 mM beta CD, 1.52 mM 25 gamma CD ja pieniä määriä muita lineaarisia sokereita.

Edellä mainittu eluaatti (50 ml) kromatografoltiin sukkinyloidulla 1,8-naftyylihappoanhydridigeelillä (esimerkki 16) pylväässä, joka sisälsi 170 ml tätä geeliä. Eluutio suoritettiin tislatulla vedellä arvossa SV 30 =0.5. Gamma CD fraktiot kerättiin ja puhdistettiin kuten on kuvattu esimerkissä 17. Saanto oli 92 - 95 % ja tuotteen puhtaus 96 - 98 %. Muut sokeria sisältävät fraktiot yhdistettiin ja uutta beta CD lisättiin liuoksen alkuperäisen sokeripitoisuuden (12 % w/v) palautta-35 miseksi, ja sitten koko menetelmä toistettiin.

Esimerkit 1-16 kuvaavat spesifisten sorbent-tien synteesejä. Näissä synteeseissä ligandit saatetaan 20 8 7 4 64 kaupallisesti saataviin materiaaleihin. Vaihtoehtoisesti itse matriisi voitaisiin syntetisoida. Tämä toteutus tuo esiin halpoja sorbentteja, joilla on korkea kapasiteetti .

5 Esimerkit 17 - 21 esittävät alfa CD:iden, beta CD:iden (ja sen johdannaisten) ja gamma CD:iden puhdistusta. Puhdistus voitaisiin tietysti toteuttaa monilla muilla tämän keksinnön avulla toteutettavilla sorben-teilla. Näissä esimerkeissä on kuvattu paras sovellu-10 tusmalli.

Esimerkki 22 kuvaa toista sovellutusta, jossa esillä olevan keksinnön mukaisia sorbentteja voidaan käyttää lisäämään yhden CD muodon saantoa synteesiseok-sessa.

15

Claims (5)

2i 87464

1. Menetelmä minkä tahansa syklodekstriinien tai niiden synteettisesti valmistettujen johdannaisten 5 eristämiseksi ja puhdistamiseksi, tunnettu siitä, että: (a) mikä tahansa syklodekstriinejä sisältävä seos, joka on valmistettu entsymaattisesti tärkkelyksestä tai vastaavista materiaaleista tai muodostettu keinotekoi- 10 sesti, tai raaka tai osittain puhdistettu synteesiseos syklodekstriinijohdannaisten valmistusta varten saatetaan yhteyteen erityisesti suunniteltujen adsorbenttien kanssa, jotka adsorbentit sisältävät kovalenttisesti sidottuja ligandeja, jotka sopivat penetroitumaan syk-15 lodekstriinimolekyylissä olevaan onteloon ja siten muodostavat spesifisen inkluusiokompleksin halutun syklodekstriinin kanssa, ja (b) spesifisen inkluusiokompleksin annetaan muodostua halutun syklodekstriinin kanssa vesiliuoksissa, ja 20 (c) ei-toivottu materiaali poistetaan, ja haluttu syk lodekstriini kerätään eluoimalla vesiliuoksilla.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että erilaisten syklodekstrii-nimuotojen erotus asyklisistä dekstriineistä ja toisis-25 taan toteutetaan huokoisilla hydrofiilisillä matriiseilla, jotka on varustettu ligandeilla, jotka sisältävät edullisesti polaarisia ryhmiä tai jotka ovat liittyneenä matriisiin polaaristen funktionaalisten ryhmien välityksellä.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että alfa-syklodekstriini tai sen johdannaiset erotetaan edullisesti ligandeilla, jotka omaavat suhteellisen lyhyen (C4 - C7)alkyyliketjun tai pidemmän alkyyliketjun, joka sisältää polaarisia 35 ryhmiä, kuten -NH2, -CONH2, -OH, -R^NH-R2, -CN, R1-CH(OH)-R2, R1 ja R2 tarkoittaessa alkyyliryhmiä; ja että beta-syklodekstriini tai sen johdannaiset erote- 22 87464 taan ligandeilla, kuten polaarisen sidoksen välityksellä liitetyllä fenyylillä, substituoidulla fenyylillä (-NH2/ -OCH3/ -COOH, -CONH2, -N(R)2/ -N02 tai -CN), tryp-tofanyylillä-, substituoidulla imidatsolyylillä, tai 5 suuremmilla aromaattisilla rengasjärjestelmillä, kuten naftyylillä liitettynä asemien 2 tai 3 välityksellä ja edullisesti sisältäen polaarisia substituentteja; ja että gamma-syklodekstriini tai sen johdannaiset puhdistetaan edullisesti geeleillä, jotka on johdettu käyttä-10 en substituoituja naftyyliligandeja, jotka on edullisesti sidottu asemien 1 tai 8 välityksellä.

4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että spesifinen edullinen sor-bentti alfa-syklodekstriinille on heksyyliamiini-joh-15 dettu selluloosa, beta- syklodekstriinille tai mety-loiduille beta-syklodekstriineille huokoisen polyakryy-liamidin bentsoehappojohdannainen, ja gamma-syklodekstriinille 1,8-naftyylihappoanhydrillä johdettu huokoinen polyakryyliamidi.

5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että minkä tahansa syklodekts-riinilajin saantoa kasvatetaan poistamalla haluttu syk-lodekstriini tai sen johdannainen reaktiotasapainoti-lasta. 25 23 87 464