FI84518B - Analytiskt elektroforetiskt foerfarande som anvaender vaexlande, tvaergaoende elfaelt och elektroforesanordning. - Google Patents

Description

1 84518

Poikittaisia vaihtosähkökenttiä käyttävä analyyttinen sähkö-foreesimenetelmä ja sähköforeesilaite Tämä keksintö kohdistuu analyyttiseen sähköforeesimenetel-mään. Se on erityisen mielenkiintoinen, mitä tulee sen sovellutuksiin geenitekniikassa ja molekyylibiologiassa.

Keksintö, joka perustuu uudenlaiseen sähköforeesimenetel-mään, tekee mahdolliseksi mm. suorittaa tärkeitä analyysejä, jotka eivät olleet mahdollisia tai käytännöllisiä aikaisemmin tunnetuilla tekniikoilla. Potentiaalisia sovellutuksia ovat kromosomin DNA:n erottaminen, kromosomin kartoitus, geenikirjastojen tarkoituksenmukainen tuottaminen, tutkimukset eri lääkkeiden vaikutuksesta kromosomin DNA:hän ja polymeerien tarkoituksenmukainen karakterisointi. Tämä keksintö tekee mahdolliseksi erottaa suurella hajotusasteella ja suurilla nopeuksilla suurempia hiukkasia (molekyylejä) kuin mitä kyetään hajottamaan alan aikaisemmalla tekniikalla, massaltaan huomattavasti eroavien hiukkasten erottamiseksi samanaikaisesti. Edullisessa toteutusmuodossa keksintö tekee mahdolliseksi liuottaa soluja soluihin sisältyvien makromolekyylien sähköforeettista erottamista varten hajoamisen tai katkeilun ollessa minimaalista.

Sähköforeesi, jossa hiukkasia, kuten makromolekyylien seosta, siirretään esim. geelimatriisin läpi sähkökentän avulla, on tekniikka, jota käytetään yleisesti kvalitatiiviseen analyysiin ja erotukseen, talteenottoon ja puhdistukseen.

Se on erityisen tärkeä proteiinien, nukleiinihappojen ja kromosomien tutkimuksessa. Ks. esim. Cantor, C.R., et ai., Biophysical Chemistry, Freeman 1980, osa 2, sivut 676, 683.

Se on itse asiassa todennäköisesti useimmissa DNA- ja kro-mosomianalyyseissä käytetty päätyökalu.

Vaikeuksia syntyy, kun yritetään hyvin suurten hiukkasten sähköforeettista erotusta. Esimerkiksi käyttäen aikaisemmin tunnettua tekniikkaa suurimman rutiinimaisesti käsitellyn DNA-molekyylin koko on bakteriofagilla (3,2 x 107 daltonia). Täi- 2 84518 lainen kokorajoitus estää monenlaisten toivottujen analyysien suorittamisen. Esimerkiksi koskemattomat DNA:t ovat suurempia ja niiden kokoa tyypillisesti pienennetään, jotta olisi mahdollista työskennellä niillä. Tämä tuhoaa kuitenkin tärkeää informaatiota, joka on koodattuna DNA:ssa ja estää monia tärkeitä kokeita.

On ehdotettu laajennettavaksi geelisähköforeesia massaltaan suurempiin hiukkasiin pienentämällä geeliväkevyyksiä. Tämä vaikuttaa kuitenkin haitallisesti hajoamiseen, tekee koeolosuhteet vaikeiksi hallita eikä sitä ole menestyksellä sovellettu DNA-molekyyleihin, joiden molekyylipainot ovat yli n. 5 x 10® dal-tonia. Fangman, W.L., Nucleic Acids Research, Voi. 5, n:o 3, maaliskuu 1978, sivut 653-655; Serwer, P., et ai., Electrophoresis, 1981, Walter, deGreuyter and Coe, sivut 237-243.

Arvellaan, että hajoaminen aikaisemmin tunnetuissa sähköfo-reesitekniikoissa on kentästä riippuvainen, sillä pienemmät sähkökentän voimakkuudet antavat yleensä suuremman hajoamisen. Tästä johtuen sähköforeesiajot, joissa suurempaa hajoamista toivotaan, kestävät usein jopa 100 tuntia. Lisäksi hiukkasten liikkuvuuden ja sen vuoksi hajoamiskyvyn arvellaan vaihtelevan erotettavien hiukkasten massan logaritmin mukaan, mikä ei luonnollisestikaan ole kovin herkkä perusta erotusten aikaansaamiselle. Lisäksi tunnetussa alan aikaisemmassa gee-lisähköforeesissa eri geeliväkevyyksiä käytetään tyypillisesti eri massa- tai molekyylipainoalueille, mikä rajoittaa hiukkasten aluetta, jotka voidaan samanaikaisesti hajottaa. Edelleen aikaisemmin tunnettua sähköforeesitekniikkaa käytetään tyypillisesti erottamaan vain pieniä määriä hiukkasia eikä prosessia voida tarkoituksenmukaisesti laajentaa suuremmille määrille.

Huolimatta siitä, että sähköforeesia on käytetty jonkin aikaa, ja siitä, että sen tärkeät rajoitukset ja tarve voittaa ne on myös pitkään tunnettu, ei tunneta aikaisempia ehdotuksia, joilla nämä rajoitukset on onnistuneesti voitettu.

Keksinnön pääasialliset tunnusmerkit ilmenevät oheisista patenttivaatimuksista .

3 84518 Tämä keksintö on merkittävä poikkeama sähköforeesin vakiintuneista periaatteista ja perustuu yllättävään havaintoon, että tarkoituksellisesti vaihdeltujen sähkökenttien avulla aikaansaatu sähköforeesi aikaisemmin tunnetuissa sähköforeesimenetel-missä tavoiteltujen yhtenäisten kenttien sijasta johtaa odottamatta erittäin toivottaviin tuloksiin. Tarkemmin sanoen tämä keksintö perustuu havaintoon, että saadaan haluttu erotus, kun hiukkaset saatetaan alttiiksi vastaaville sähkökentille, jotka siirtävät niitä kaikenkaikkiaan suuntiin, jotka ovat yleensä poikittaisia vastaaviin kenttien yleissuuntiin nähden. Erityisen toivotut tulokset saavutetaan ainakin niissä tapauksissa, joita tähän saakka on tutkittu, kun ainakin yhdellä sähkökentistä on harkittu intensiteettigradientti poikittain sen omaa suuntaa vastaan. Erityisenä ei-rajoittavana esimerkkinä voidaan käyttää kahta kenttää, jotka vuorottelevat vastaavien korkeiden ja matalien intensiteettien välillä keskenään eri vaiheissa ja ovat toisiaan vastaan poikittaisissa suunnissa. Esimerkiksi toinen kentistä voi olla päällä, kun toinen on poissa jne. Erityisen hyvät tulokset saadaan, kun kenttien päällä- ja poissaoloajat ovat suhteessa erotettavien hiukkasten massaan, esim. kun päällä-ja poissaoloajat ovat verrannollisia hiukkasten massaan korotettuna suunnilleen potenssiin 1,5.

Eräs tämän keksinnön tärkeä etu on, että se laajentaa dramaattisesti hiukkasten massa-aluetta, joka voidaan erottaa sähköfo-reettisesti suurella hajotuksella. Ei-rajoittavana esimerkkinä uudella tekniikalla voidaan erottaa suurella hajotuksella hiukka- 9 siä, joiden massa on n. 1,2 x 10 daltonia, kun taas aikaisemmin tunnettujen pienemmän hajotuksen aikaansaavien menetelmien g ylärajan arvellaan olevan n. 0,5 x 10 daltonia. Arvellaan, että tällä uudella tekniikalla voidaan hajottaa myös hiukkasia, g jotka ovat suurempia kuin 1,2 x 10 daltonia. Toinen tärkeä etu on, että uudessa tekniikassa hajotus on paljon vähemmän riippuvainen sähkökentän intensiteetistä; tästä johtuen tätä uudenlaista sähköforeesia voidaan ajaa paljon suuremmalla nopeudella, mikäli tuotettu lämpö voidaan helposti poistaa. Tämän seurauksena tyypillinen laboratorioajo voidaan suorittaa 4-8 4 84518 tunnissa, kun taas vastaavat ajot käyttäen alan aikaisempaa tekniikkaa, vaativat 12-100 tuntia. Toinen uuden tekniikan merkittävä etu on, että voidaan käyttää suurempia näytemääriä alalla aikaisemmin tunnettuun verrattuna, mikä antaa parantuneen hajoamisen ja herkkyyden. Lisäetuna on, että uudella tekniikalla voidaan samanaikaisesti samassa geelissä hajottaa hiukkasia laajemmalta massan alueelta kuin arvellaan mahdolliseksi alan aikaisemmalla tekniikalla. Ei-rajoittavana esimerkkinä uudella tekniikalla voidaan samanaikaisesti samassa geelissä 6 9 hajottaa hiukkasia, joiden massa vaihtelee välillä n. 10 -10 daltonia. Aikaisemmin tunnetussa tekniikassa olisi vaadittu useita eri geeliväkevyyksiä hajottamaan hiukkaset kapeammalla 6 8 massan alueella välillä n. 10-10 daltinia. Vielä eräänä tärkeänä keksinnön piirteenä tämän tekniikan on havaittu minimoivan soluista peräisin oleville makromolekyyleille aiheutettu käsittelyvaurio liuottamalla solut tai sferoplastit geelin lohkossa, joka on sama kuin sähköforeesigeeli tai sekoittuva sen kanssa ja juurruttamalla koko lohko sähköforeesikammioon.

Nämä ja muut keksinnön edut sekä keksinnön lisäpiirteet käyvät ilmi seuraavasta yksityiskohtaisesta kuvauksesta.

Kuva 1 on osittain aukileikattu perspektiivikuvanto sähköforee-sikammiosta, joka on hyödyllinen selostettaessa tiettyjä keksinnön periaatteita.

Kuva 2 on ylätasokuvanto samasta kammiosta.

Kuva 3 on osittain kaavamainen ja osittain lohkokaavio, joka esittää esimerkkinä olevan kammion elektrodien keskinäistä kytkentää.

Kuvat 4-7 esittävät esimerkkinä olevia sähkökenttiä, jotka toimivat sähköforeesikammiossa.

Kuva 8 esittää hiukkasten liikettä uudenlaisessa sähköforeesissa. Kuva 9 esittää suuren DNA-molekyylin hypoteettista kiertymistä ja liikettä agaroosigeelin läpi poikittaisten sähkökenttien vaikutuksesta, jotka toimivat eri vaiheessa.

5 84518

Kuva 10 esittää yhtenäisen sähkökentän hypoteettista vaikutusta suureen DNA-molekyyliin agaroosigeelissä.

Kuva 11 on samanlainen kuin kuva 10, mutta esittää sellaisen sähkökentän hypoteettista vaikutusta, jolla on huomattava intensiteettigradientti kohtisuorassa kentän suuntaa vastaan.

Kuva 12 esittää jäähdytetyn purkurin kierrätystä sähköforeesi-kammion läpi.

Kuva 13 esittää hajotusta, joka on saatu kokeellisessa esimerkissä käyttäen uudenlaista sähköforeesia.

Kuva 14 on perspektiivikuvanto muotista, jota käytetään solujen tai sferoplastien liuottamiseen itse geelilohkoissa, jotka myöhemmin sijoitetaan niille sopiviin syvennyksiin sähköforeesi-geeliin.

Esimerkkinä olevaa laboratoriolaitetta, joka on hyödyllinen selostettaessa tiettyjä keksinnön periaatteita, esitetään kuvassa 1 osittain aukileikattuna perspektiivikuvantona ja kuvassa 2 ylätasokuvantona. Se käsittää ylhäältä avonaisen, suorakaiteenmuotoisen sähköforeesikammion 10, joka on tehty sähköä eristävästä materiaalista, kuten 6 mm:n pleksilasista ja jonka mitat ovat n. 10 x 10 cm. Se pitää pohjallaan kerrosta väliainetta 12, kuten agaroosigeeliä, jota yleisesti käytetään sähköforeesis-sa ja jota ympäröivät elektrodit 14. Elektrodit ovat ohuita (0,81 mm) platinalankoja, jotka ulottuvat kukin pystysuorassa n. 19 mm:n etäisyydelle ja on sijoitettu n. 1,5 cm:n päähän toisistaan kuten kuvan 2 ylätasokuvannosta nähdään.

Eräänä esimerkkinä elektrodilangat voivat tulla kammion sisään vastaavien reikien läpi, jotka on sijoitettu vaakasuoraan riviin n. 19 mm kammion sisäpohjan yläpuolelle, jokaisen langan kulkiessa alaspäin pitkin vastaavaa sisäsivuseinämää kammion sisäpohjalle. Haluttujen sähkökenttien kehittämiseksi elektrodit 14 on yhdistetty keskenään kuvan 3 esittämällä tavalla. Erityisesti tasavirtateholähde 16 (kuten Biorad Model 500) syöttää tasavirtatehoa releeseen 18 (kuten DPDT, 115 voltin vaihtovirta-rele) , jota ohjelmoituva ajastin 20 ohjaa (kuten Lindberg Enterprises Chrontrol 4-kanavainen CT-sarja) näistä kahdesta 6 84518 ulostuloparista valitun yhdistämiseksi lähteestä 16 tulevaan tasavirtatehoon. Releen 18 toinen ulostulopari (joka koostuu negatiivisesta ja positiivisesta ulostulopäätteestä) on yhdistetty elektrodien 14 ylä-ja pohjariveihin (kuten kuvasta 3 nähdään) jokaiselle elektrodille tarkoitetun vastaavan diodin kautta. Kuitenkin vain silloin kun kytkin 22 on suljettu, kaikki ylärivin elektrodit on yhdistetty releen 18 negatiiviseen ulostulopäätteeseen; kun kytkin 22 on avoin, vain oikeanpuoleisin elektrodi 14 on kytkettynä. Releen 18 toinen pari ulostulopäätteitä on samalla tavoin yhdistetty elektrodien 14 vasempaan ja oikeaan riviin käyttäen samanlaista kytkintä 24 vastaavaan tarkoitukseen. Säätömuuntajia R voidaan käyttää muuttamaan asiaankuuluvia jännitteitä samoin kuin voidaan käyttää teholähteen 16 säätimiä. Ajastimen 20 säätimet määräävät milloin tietty releen 18 päätepari on jännitteinen ja milloin se on jännitteetön.

Kun kytkin 22 on suljettu ja releen ulostulot, jotka syöttävät jännitettä elektrodien 14 ylä- ja alariveihin, ovat päällä, esim. +200 ja -200 voltin jännitteissä, oleellisesti tasainen sähkökenttä E on asetettu sähköforeesikammion pohjan poikki, kuten kuva 4 kaavamaisesti esittää. Kuvan 4 lyhyet nuolet ovat yhtä pitkiä, mikä osoittaa kentän oleellista yhtenäisyyttä ja pitempi nuoli osoittaa kentän yleissuuntaa (positiivisista negatiivisiin elektrodeihin).

Vaikka todellisuudessa kenttä ei ole intensiteetiltään täysin yhtenäinen kaikkialla geelissä johtuen yksittäisten, toisistaan erilleen sijoitettujen elektrodien fysikaalisesta sijoituksesta ja muista syistä ja vaikka yleissuunta voi poiketa jonkin verran pystysuorasta (kuten kuvassa 4 esitetään), tämän patenttimääri-tyksen tarkoituksiin näitä kenttiä kutsutaan yhtenäisiksi ja ne erottuvat selvästi kentistä, jotka on tarkoituksella tehty epäyhtenäisiksi esim. aiheuttamalla toiminnallisesti intensiteetti-gradientti poikkisuunnassa koko kentän suuntaa vastaan.

7 84518

Kenttä El, joka on epäyhtenäinen siinä mielessä, että sillä on toiminnallisesti merkittävä intensiteettigradientti poikki-suunnassa kentän yleiseen suuntaan nähden, kuvataan kuvassa 5 ja se saadaan tässä esimerkissä avaamalla kytkin 22 siten, että vain kuvan 5 oikeassa yläkulmassa oleva elektrodi säilyy +200 V:n potentiaalissa, kun taas jokainen pohjaelektrodi on -200 V:n potentiaalissa. Kuvassa 5 esitetty sähkökenttä on jonkin verran viuhkamainen, mitta sillä on yhä yleissuunta, jota esittää pitempi nuoli ja jota voidaan tarkastella yksittäisten kenttien vektorisummana, jotka kentät johtuvat vastaavista potentiaali-eroista oikean yläkulman elektrodin ja pohjarivin yksittäisten elektrodien välillä. Mielenkiintoinen intensiteettigradientti on poikkisuunnassa kentän yleissuuntaan nähden, kuten nuoli G esittää ja se johtuu siitä, että etäisyys oikean yläkulman elektrodin ja pohjarivin elektrodien välillä kasvaa (ja tästä johtuen yksittäisten kenttien intensiteetti tilavuusyksikköä tai pinta-alayksikköä kohti pienenee), kun liikutaan vasemmalle pitkin pohjariviä, kuten lyhyempien nuolten pienenevät pituudet osoittavat.

Samoin kuin kytkin 24 on auki ja releen ulostulot yhdistetty vasemman alakulman elektrodiin ja oikeanpuoleisessa rivissä olevat elektrodit ovat jännitteisiä, syntyy samanlainen kenttä E2, kuten kuva 6 esittää. Ainoa merkittävä ero kuvan 5 ja kuvan 6 kenttien välillä on, että kuvan 6 kentällä on eri yleissuunta, joka on poikittainen kuvan 5 kentän El suuntaan nähden.

Eräs odottamaton havainto, jota tässä keksinnössä käytetään hyväksi, on että jos sellaiset kentät kuin El ja E2 vuorottele-vat eri vaiheissa keskenään vastaavan korkean ja matalan intensiteetin välillä taajuuksilla, jotka on valittu hiukkasten (esim. makromolekyylien) massan perusteella, jotka hiukkaset on määrä erottaa sähköforeettisesti, hiukkaset liikkuvat alkuasennosta, kuten kohdasta 26 yleissuuntaan D, joka on poikittain sekä kenttää El että E2 vastaan ja jokaisella hiukkasella liikkeen nopeus riippuu massasta (tai varauksesta). Tämän seurauksena massoiltaan (varauksiltaan) erilaiset hiukkaset kulkevat 8 84518 eri etäisyyksille alkuasennosta 26 muodostaen kaistoja kuten Ml, M2, M3 ja M4 kuvassa 8, joissa kevyemmät hiukkaset kulkevat pitemmät matkat alkuasennosta.

On huomattava, että sanonta "poikittainen" ei rajoitu tässä patenttimäärityksessä käytettynä 90°:n tai lähellä sitä olevaan kulmaan, vaan käsittää muutkin huomattavat leikkauskulmat. Käytettäessä sitä sähkökenttien, kuten El:n ja E2:n välisen kulman suhteen sen on tarkoitettu sulkevan pois vain ne alan aikaisemmat sähkökenttien väliset kulmat, jotka johtuivat häiriö-tapauksista tai kyvyttömyydestä saavuttaa käytännössä yhtenäisen ja yksisuuntaisen kenttien yhdistelmän suunnittelutavoitetta. Käytettäessä sitä hiukkasliikkeen kokonaissuunnan välisen kulman suhteen, sanonnan "poikittainen" tarkoitetaan jälleen sulkevan pois vain kulmat, jotka olivat peräisin häiriötapauksista tai alan aikaisempien laitteiden kyvyttömyydestä saattaa sähköforeet-tista liikettä sattumaan yhteen toivotun kentän suunnan kanssa. Sanonta "toiminnallisesti merkittävä" tarkoittaa intensiteetti-gradienttia, joka on riittävä saamaan asianmukaiset kentät siirtämään asianmukaisia hiukkasia poikittaiseen suuntaan kentän yleissuuntiin nähden, kuten on esitetty esimerkiksi kuvassa 7.

Tyydyttävät tulokset voidaan saada joissakin tapauksissa sähkökentillä, jotka vuorottelevat ja ovat poikittaisia toistensa suhteen yllä selostetulla tavalla, mutta ovat oleellisesti yhtenäisiä, kuten kenttä E kuvassa 4. Kuitenkin tyypillisesti paremmat tulokset saadaan, kun toisella kentistä on tarpeellinen intensiteettigradientti poikkisuunnassa sen yleiseen suuntaan nähden. Tyypillisesti paremmat tulokset saadaan, kun molemmilla kentillä on tällaiset intensiteettigradientit.

Vaikka mekanismi, jolla uudentyyppinen sähköforeesi toimii, ei ole täysin tunnettu, arvellaan että vuorottelevien kenttien käyttö saa suuren hiukkasen, kuten DNA-kierukkamolekyylin pusertumaan agaroosimatriisiin orientoitumalla ensin pitkin toisen kentän yleissuuntaa ja sitten toisen yleissuuntaan jne. Lisäksi 9 84518 arvellaan, että gradienttikenttien (kuten El:n ja E2:n) käyttö yhtenäisten kenttien (kuten E:n) sijasta aiheuttaa leikkaus-vaikutuksen, joka auttaa venyttämään molekyyliä haluttuun suuntaan. Kuva 9 esittää tätä hypoteesia esittämällä sattumanvaraisesti kiertynyttä DNA-molekyyliä, jota yhtenäinen sähkökenttä E' työntää agaroosigeelimatriisiin ja joka pusertuu geeliin muuttumalla pitkänomaiseen sylinterimäiseen muotoon (käärme) . Tämä käärme saatetaan sitten yhtenäisen sähkökentän E":n alaiseksi ja väännetään vähitellen pois alkuperäisestä käärme-muodostaan, kunnes se muodostaa uuden käärmeen, joka tällä kertaa on suuntautunut pitkin kentän E" yleissuuntaa jne. niin, että sen kokonaisliikesuunta on pitkin kenttien E' ja E" suuntien likimääräistä vektorisummaa. Tätä alkuperäistä hypoteesia on kuitenkin muuttanut myöhempi arvelu, että pitkäketjuiset makromolekyylit, kuten DNA eivät todennäköisesti muodosta käärmettä, kun niiden kiertosäde on suurempi kuin tehokas geeli-huokossäde. Sen sijaan tällaiset makromolekyylit todennäköisesti tiivistyvät muotoon, joka muistuttaa enemmän "oluttölkkiä” kuin käärmettä, kuten kuvassa 10 esitetään eivätkä tämän vuoksi liiku helposti suuntaan, joka on poikittain "oluttölkkien" pituusakseliin nähden. Itse asiassa arvellaan, että gradientin käyttö yhtenäisen kentän sijasta on eräs kriittisistä tekijöistä, joilla pakotetaan suuret molekyylit, kuten DNA-molekyylit haluttuun pitkänomaiseen, sylinterimäiseen tai käärmeen muotoon, kuten kuvassa 11 esitetään. Lisäksi arvellaan, että sen taajuuden sopiva valinta, jolla muutoksen toisesta kentästä toiseen pitäisi tapahtua, on verrannollinen aikaan, joka mielenkiintoiselta hiukkaselta (molekyyliltä) kuluu suuntautumiseen haluttuun pitkänomaiseen sylinterimäiseen tai käärmemuotoon, ja että tämä aika t on verrannollinen hiukkasen massaan (molekyyli-painoon) M, geelin tehokkaaseen huokossäteeseen r ja hiukkasen mitattuun nopeuteen geelissä v, riippuvuuden t = M ' /(rv).

On korostettava, että vaikka yllä mainittu hypoteesi on yhdenmukainen tähän saakka saatujen kokeellisten tulosten kanssa, sitä ei ole pidettävä keksinnön suojapiiriä rajoittavana tekijänä, koska keksintö saa aikaan hyödylliset tuloksensa riippu- 10 8451 8 matta siitä, että sen takana olevaa ilmiötä ei ehkä tunneta hyvin ja riippumatta siitä mahdollisuudesta, että siihen voi liittyä kokonaan erilainen mekanismi.

Seuraavat esimerkit esittävät keksinnön tiettyjä kohtia, mutta niiden ei luonnollisestikaan tule katsoa rajoittavan sen suoja-piiriä.

Yleiset sähköforeettiset olosuhteet esimerkeille A, B ja C

2

Noin 1 cm paksut geelit valettiin 10 cm :n kertakäyttöisiin neliönmuotoisiin Petri-maljoihin. Kolot näytettä varten muodostettiin tavanomaiseen tapaan käyttäen muovikampaa, jonka 6,25 x 2,00 mm:n hampaat olivat 3,18 mm:n päässä toisistaan.

Geelit koostuivat 1,5 %:n matalan endo-osmoosin agaroosista (Miles Biochemical Company) liuotettuna TBE:een (10,3 g Tris, 5,5 g boorihappoa ja 0,93 g dinatrium-EDTA:a/1). Sähköforeesi-puskuria (TBE) kierrätettiin jatkuvasti magneettikäyttöisen polypropeeniperäisen keskipakopumpun (Fischer Scientific) kautta ja jäähdytettiin suljetun kiertokulun jäähdytetyssä hauteessa (Haake, tyyppi T-52) kuten kuvassa 12 on esitetty. Kierrätys-putkien sisääntulo- ja poistopäät olivat lähellä geeliä ja ne syöttivät ja poistivat nestemäistä puskuria geelineliön kahdessa lävistäjän suhteen vastakkaisessa kulmassa. Näytteet asetettiin koloihin käyttäen Gilson Pipetman-laitetta, jossa pipetin kärjen päät oli leikattu leikkausvaikutuksen minimoimiseksi.

DNA muuttui silmin havaittavaksi, kun geelejä oli liotettu 0,5 mikrogrammassa etidiumbromidia/ml TBE. Valokuvat otettiin käyttäen Polaroid 107-filmiä ja lyhyen UV-aallonpituuden valaistusta. Valotusajat vaihtelivat välillä 15-180 s aukolla f8 näytteistä riippuen.

Esimerkki A: Merkki-DNA:n valmistus ja sähköforeesi

Bakteriofagivirukset T7, T2 ja G valmistettiin liuottamalla annettua virusmäärää yli yön 50°C:ssa NDS:ssä, kuten ovat kuvanneet Laurer et ai., Journal of Microbiology, 1975, 9j>: 309-326.

Saatuja liuotteita dialysoitiin sitten yli yön sähköforeesi-puskuria vastaan. Bakteriofagien DNA-massojen arvellaan n 84518 daltoneina olevan: T7 = 2,7 χ 10^; Τ2 = 1,2 χ 10® ja G = 5 χ 10®.

0,02 mikrogramman näyte kutakin DNA:a asetettiin koloihin 5 mikrolitrassa 10 %:sta glyseriiniä, TBE:a ja 0,0015 %:sta bromifenolisinistä. Näytteitä ajettiin geelien yhdellä kentällä 15 minuuttia ennen sykintää. Optimisykeajät sekunneissa niiden makromolekyylien hajottamiseksi, joiden molekyylipainot olivat lähellä seuraavia esimerkkejä tai juuri niissä, olivat T7 =0,25; T2 =4 ja G = 20. Sanonta "sykeaika" viittaa sykkeen leveyteen, ts. aikaväliin, jolla toinen kentistä on päällä (tai korkea), kun taas toinen on pois päältä (tai matala). Tässä kokeessa käytettiin kuvissa 5 ja 6 esitetyn tyyppisiä kenttiä ja jännitetasoja, ts. molemmilla kentillä oli intensiteetti-gradientit. Tässä kokeessa saatu suhteellinen liikkuvuus oli G = 1; T2 = 2,5 ja T7 = 8.

Esimerkki B: Hiivan DNA

Eri hiivalajeja kasvatettiin puolikatkaisuvaiheeseen 100-1000 mlrssa YPD:a (YPD: 1 g hiivauutetta, 2 g dekstroosia ja 2 g baktopeptonia lisättynä 1 litraan tislattua vettä). Sfero- plastit valmistettiin kuten ovat esittäneet Cryer et ai.,

Progress in Cell Biology, Voi. 12, 1975, sivut 39-44. Sferoplas- teja liuotettiin sitten NDS:ään yli yön 50°C:ssa. Hiivaliuot- teita valmistettiin NDS:ään vaihdellen väkevyyksiä välillä n.

9 10 10 -2 x 10 solua/ml liuotetta. Yleensä 90 mikrolitraa liuo-tetta panostettiin käyttäen sinikärkistä (kapasiteetti 1 ml) Pipetman-laitetta. Näytteitä ajettiin 1,5 %:seen agaroosigee-liin 100 V:n jännitteellä 45 minuutin ajan yhdellä kentällä.

15-45 sekunnin pulssiajat 200 V:n jännitteellä (kuvien 5 ja 6 kentät El ja E2) antoivat kuvassa 13 pienennetyssä mittakaavassa esitetyt molekyylipainohajotukset.

Esimerkki C: Etidiumbromidi Käytettiin esimerkin B koeolosuhteita paitsi, että geelit ajettiin pimeässä ja ne sisälsivät 0,5 mikrogrammaa/ml etidiumbro-midia geelissä samoin kuin kierrätyspuskuria ja pulssiajat olivat 30 ja 45 sekuntia käyttäen D-273 hiivaliuotteita. Saatiin monien kromosomien selvä hajoaminen.

i2 8451 8

Yllä olevissa esimerkeissä liuotus tehtiin tavanomaiseen tapaan ja liuotteet siirrettiin sähköforeesigeeliin tavanomaiseen tapaan. On tunnettua että tällainen liuotteiden käsittely voi johtaa hauraiden makromolekyylien murtumiseen ja muuhun vahingoittumiseen. On kuitenkin löydetty tapa välttää oleellisesti tällaiset haitalliset vaikutukset ja se muodostaa osan tästä keksinnöstä. Erityisesti tämän keksinnön mukaisesti soluja tai sferoplasteja (solut ilman soluseinämiä) voidaan suspendoida agaroosigeeliin ja tämä geeli voidaan kaataa muotteihin istukkaiden muodostamiseksi. Istukkaat asetetaan sitten liuotusliuok-seen suspendoitujen solujen tai sferoplastien liuottamiseksi ja sen jälkeen koskemattomat istukkaat asetetaan tiiviisti sähkö-foreesigeelissä oleviin yhteensopiviin koloihin. Istukkaat muodostava geeli voi olla sama kuin sähköforeesigeeli tai yhteensopiva sen kanssa.

Tässä uudessa tekniikassa käytetty tyypillinen muotti esitetään perspektiivikuvantona kuvassa 14 ja se käsittää parin yhteensopivia suorakulmaisia laattoja 14a ja 14b, jotka voidaan kiinnittää kuvatussa esitysmuodossa ruuvien 14c avulla. Ylälaatassa 14a on lukuisia valukanavia 14d, jotka kulkevat laatan koko paksuuden läpi, kun taas pohjalaatta on umpinainen. Kun laatta on koottu kuvassa 14 esitettyyn muotoon, sopivaa agaroosigeeliä suspendoituine soluineen tai sferoplasteineen kaadetaan valukanaviin 14d ja annetaan jähmettyä. Laatat 14a ja 14b otetaan sitten erilleen ja istukaskappaleet, kuten 14e vedetään varovasti ulos, asetetaan liuotusmateriaaliin olosuhteissa, jotka riittävät tyydyttävään liuotukseen ja pannaan sitten huolellisesti ja tiiviisti niille sopiviin koloihin, jotka on muodostettu sähköforeesigeeliin esim. kammalla, jonka ulkoprofiili ja mitat sopivat valukanaviin 14d. Seuraava esimerkki D kuvaa sähköforeesia, jossa käytetään tätä uutta tekniikkaa.

Esimerkki D: Liuotus geeli-istukkaissa

Hiivasferoplasteja (10 ^ - 10^ solua/ml 9 %:sta heikosti geelit-tyvää agaroosia TBE:ssä) suspendoitiin agaroosigeeliin ja i3 8451 8 kaadettiin muottikanaviin istukkaiden muodostamiseksi. Istukkaat asetettiin sitten 50°C:ssa olevaan NDCreen yli yön, jolloin suspendoidut sferoplastit liukenivat. Hiivasoluja, joita oli aikaisemmin käsitelty merkaptoetanolilla, suspendoi-tiin myös 1 %:seen agaroosigeeliin, mutta tässä tapauksessa 75 mikrolitraa Zymolyase 5000-seosta (2 mg/ml 0,01 M natriumfos-faattia, 50 %:nen glyseriini) lisättiin istukkaseokseen ennen istukkaiden valamista. 75 mikrolitraa Zymolyase:a lisättiin myös 0,8 ml:aan LET (0,5-M tetranatrium-EDTA, 0,01 M Tris, pH = 7,5). Valetut istukkaat hiivasoluineen lisättiin LETriin ja haudutettiin yli yön 37°C:ssa. Saadut suspendoidut sferoplastit liuotettiin sitten NDStään. Sekä solu- että sfero-plasti-istukkaat asetettiin niille sopiviin koloihin sähkö-foreesigeeliin. Sähköforeesi käyttäen yllä esimerkkien A-C yhteydessä selostettuja olosuhteita antoi hyvän kromosomi-DNA:n hajotuksen.

Esimerkki E: Kaksoispien-DNA

7 2.5 x 10 3T3-R500-hiiren solua liuotettiin 0,3 ml:aan NDS 50°C:ssa neljän (4) päivän ajan. Liuote panostettiin sitten 1.5 %:n agaroosikennoihin TBErssä ja ajettiin 200 V:n jännitteellä käyttäen 30 sekunnin pulssitusta. Saatiin yksi hajanainen kaista. Se liikkui ikäänkuin sillä olisi ollut koskemattoman kaksoispien-DNA:n molekyylipaino (molek.paino n. 600 x 10^). Merkkiaineena oli G-fagi (molek.paino n. 500 x 10°).

Yllä selostetulla uudenlaisella sähköforeesilla on lukuisia sovellutuksia. Eräänä esimerkkinä käyttäen tätä tekniikkaa hiivan kromosomi-DNA on ensimmäistä kertaa onnistuttu erottamaan ja sen koko karakterisoimaan. Toinen uuden tekniikan käyttö on DNA-gyraasikompleksien luonteen tutkiminen E. coli-bakteerien ylikiertyneissä kromosomidomeeneissa gyraasikohtien kartoittamiseksi ja täten työkalujen aikaansaamiseksi eukaryoottista kromosomianalyysiä varten. Uusi tekniikka on erityisen edullinen, kun eri molekyylit, kuten eri DNA-molekyylit ovat massaltaan lähellä toisiaan. Vuorottelevien kenttien käyttö, joilla i4 84 51 8 kaikilla on intensiteettigradientti, pyrkii terävöittämään dramaattisesti hajotusta ja tekemään mahdolliseksi odottamattoman hajotuksen molekyyleillä, joiden massat ovat lähellä toisiaan. Toinen käyttö on suuren kaistalukumäärän hajottaminen samassa geelissä: tärkeä seikka, kun analysoidaan eukaryoottista DNA:a. Vielä eräs uudenlainen sähköforeesin käyttö on puhdistaa molekyylejä, kuten entsyymejä, esim. uroki-naasia, myosiineja, tai hyaluronihappoja puhdistetun näytteen saamiseksi, joka voi toimia perustana kehitettäessä tapaa valmistaa samaa tai vastaavaa molekyyliä. Vielä eräänä käyttönä eri aineiden, kuten lääkkeiden vaikutus voidaan arvioida niiden vaikutuksella kromosomeihin, nukleiinihappoihin ja proteiineihin johtuen tämän keksinnön aikaansaamasta kyvystä erottaa tällaisia materiaaleja. Vielä muuna esimerkkinä polymeerejä voidaan tarkasti ja nopeasti analysoida molekyylipainojakautuman, haaroittuneisuuden ja muiden fysikaalisten ominaisuuksien suhteen käyttämällä uudenlaista sähköforeesia. Vielä muuna esimerkkinä koskemattomia tai leikattuja ihmisen, eläimen tai kasvien kromosomeja voidaan analysoida käyttäen uudenlaista sähköforeesia.

Pitäisi olla selvää, että laboratoriolaite, jota selostettiin kuvien 1-8 yhteydessä ja niissä käytetyt määrätynlaiset sähkökentät, ja kuvan 14 yhteydessä selostettu istukasvalulaite ovat vain tyypillisiä esimerkkejä, jotka ovat sopivia keksinnön tiettyjen periaatteiden selostamiseen. Lukuisat muunnokset ovat mahdollisia ja ne kuuluvat keksinnön suojapiiriin. Esimerkiksi eri lailla muotoiltua sähköforeesikammiota tai eri lailla tuotettuja, jaettuja tai vaihdettuja sähkökenttiä voidaan käyttää sikäli kuin hiukkasiin vaikutetaan sähkökentillä, jotka vaihtelevät ajan mukana, mikä siirtää niitä kokonaissuuntiin, jotka ovat yleensä poikittaisia ainakin kahteen asiaankuuluvaan, toiminnallisesti merkittävään kenttään nähden. Halutut kentät voidaan esimerkiksi kehittää eri lailla muotoilluilla elektrodeilla, sopivasti viritetyillä keloilla tai muilla lähteillä tai eri (laadultaan) lähteiden yhdistelmillä ja asiaankuuluvia is 8451 8 kentän suuntia voidaan säätää muilla keinoin, kuten rajoituksetta muuttamalla kentän nettosuuntaa ja muuttamalla elektrodin ominaisuuksia (esim. potentiaalia). Samoin haluttu kentän gradientti voidaan tuottaa kuinka monella tavalla tahansa, kuten valitsemalla asiaankuuluville elektrodeille sopiva muoto, pitämällä eri elektrodiosia eri potentiaaleissa tai kahden tai useamman kentän vuorovaikutuksella. Lisäksi useampaa kuin kahta kenttää voidaan käyttää sikäli kuin nettovaikutus voi ainakin vaikuttaa hiukkaseen halutulla tavalla ensin yhteen suuntaan, sitten toiseen suuntaan, joka on poikittainen ensimmäiseen nähden jne. hiukkasen siirtämiseksi kolmanteen suuntaan, joka on poikittainen kahteen ensimmäiseen nähden.

On havaittu toivottavaksi yllä kuvatussa uuden sähköforeesilait-teen edullisessa esimerkkitoteutusmuodossa käyttää lukuisia erillisiä elektrodeja ja yhdistää ne keskenään laitteiden (kuten diodien) kautta, jotka sallivat virran kulun jokaiseen vain valittuun suuntaan. Lisäksi on havaittu toivottavaksi saada lankaelektrodit kulkemaan pitkin kammion sisäsivuseinämiä pystysuunnassa tai lähes pystysuunnassa, koska tällaiset elektrodit tekevät erityisen vaivattomaksi kehittää haluttuja sähkökenttiä ja koska, kun tällaiset elektrodit ovat riittävän pitkiä pystysuunnassa, on mahdollista käyttää useita geelikerroksia toistensa päällä, jotka kaikki sisältävät hiukkasnäytteitä ja saattaa ne kaikki oleellisesti identtisten sähkökenttien alaiseksi sähkötoreesin suorittamiseksi kaikissa niissä samanaikaisesti. Monimutkaisempien kenttien kehittämiseksi tai suuremman valinnanvapauden aikaansaamiseksi tuotettaessa ominaisuuksiltaan valikoituja kenttiä, kuten kentät E, El ja E2 kuvissa 4-6 jokaisella elektrodilla (tai ainakin valitun elektrodimäärän elektrodeilla) voi olla oma kytkettävä tehonsyöttöliitäntänsä siten, että jokaista voidaan selektiivisesti pitää missä tahansa positiivisessa tai negatiivisessa sähköpotentiaalissa valitulla alueella (tai maatettuna). Joissakin tapauksissa riittää vain kolme elektrodia ja kaksi niistä voi olla yhdistetty (ajoittaisesti) samaan potentiaaliin, mikäli ne toimivat yhdessä toistensa kanssa tuottaen ainakin kaksi sähkökenttää, 16 8451 8 joilla on halutut ominaisuudet (ts. ovat poikittaisia toisiinsa nähden).

Eräänä muunnoksena yllä kuvattu uudenlainen sähköforeesijärjestely voi käyttää hyväksi suurtaajuusvaihtokytkentää poikittaisten kenttien välillä, esim. taajuuksien alueella n. 10^-10^ Hz asetettuna yhden tai useamman muuttumattoman tai hitaamman vaih-tokytketyn kentän, kuten yllä selostettujen kenttien E, El ja E2 päälle. Arvellaan, että nopeasti vaihtokytketty kenttä tai kentät voivat auttaa pyörittämään (tai orientoimaan) hiukkasia, kuten makromolekyylejä halutulla tavalla, kun taas muuttumaton ja hitaasti vaihtokytketty kenttä tai kentät voivat toimia siirtäen hiukkasia haluttuun yleissuuntaan. Tässä järjestyksessä, joka koostuu nopeasti vaihtokytketyistä kentistä ja muuttumattomista tai hitaasti vaihtokytketyistä kentistä, voidaan itse asiassa käyttää vain kahta poikittaista kenttää, joista vähintään toisella on muuttumaton tai hitaasti vaihtokytketty intensi-teettikomponentti ja nopeasti vaihtokytketty intensiteettikom-ponentti asetettuna sen päälle. Esimerkiksi keskenään poikittaisia kenttiä El ja E2, kuten kuvassa 7 voidaan käyttää, mutta ainakin toisella elektrodeista voi olla asetettuna kuvatun neliöaaltoisen jännitteen aaltomuodon päälle paljon korkeamman taajuuden jänniteaaltomuoto, jolla on valittu amplitudi, kuten 6 9 taajuudella n. 10 -10 Hz.

Claims (17)

1. Analyyttinen sähköforeettinen menetelmä ennalta määrätyn likimääräisen massan omaavien hiukkasten erottamiseksi saattamalla sanotut hiukkaset sopivassa väliaineessa vähintään kahden sähkökentän (E', E") alaiseksi, jossa kenttien suunnat ovat toistensa suhteen poikittain ja jotka vaihtele-vat korkean ja matalan intensiteetin välillä eri vaiheessa toistensa kanssa, hiukkasten siirtämiseksi kokonaissuuntiin, jotka ovat yleensä poikittaisia kenttien suuntien suhteen hiukkasten erottamiseksi, tunnettu siitä, että vaihtelun taajuus valitaan erotettavien hiukkasten ennalta määrätyn likimääräisen massan perusteella.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että ainakin yhdellä kentistä on intensiteettigra-dientti poikkisuunnassa sen yleissuuntaan nähden ainakin osan ajasta, jonka se vaikuttaa hiukkasiin.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että vaihtelun taajuus riippuu hiukkasten ennalta määrätystä likimääräisestä massasta korotettuna potenssiin 1,5.

4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että hiukkaset ovat polypeptidimolekyylejä.

5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että hiukkaset ovat myosiini- tai hyaluronihappomole-kyylejä.

6. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että hiukkaset ovat nukleiinihappomolekyylejä.

7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että nukleiinihappomolekyylit ovat DNA-molekyylejä.

8. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että hiukkaset ovat kromosomeja. « 84518

9. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että sanotut kromosomit ovat peräisin eukaryootista.

10. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että hiukkaset ovat ihmisen kromosomeja.

11. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että hiukkaset ovat eläinkromosomeja.

12. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että hiukkaset ovat kasvikromosomeja.

13. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että hiukkaset ovat hiivakromosomeja.

14. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että hiukkaset liikkuvat geeliväliaineessa, jonka tehokas huokoskoko on pienempi kuin hiukkasten koko.

15. Patenttivaatimuksen 14 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että erotettavat hiukkaset saadaan liuottamalla koko soluja tai sferoplasteja samaan tai yhteensopivaan geeliin ja että sanottu sähköforeettinen erotus suoritetaan erottamatta ensin sanottuja hiukkasia liuotetuista kokonaisista soluista tai sferoplasteista.

16. Sähköforeesilaite, joka käsittää tuen (10) väliainetta varten, johon yksi tai useampia erotettavien, ennalta määrätyn likimääräisen massan omaavien hiukkasten näytteitä voidaan asettaa; välineen (14) ainakin kahden sähkökentän kehittämiseksi, jotka vaikuttavat hiukkasiin ja joiden kent-täsuunnat ovat toisiinsa nähden poikittaiset ja elimiä (16, 18, 20) kyseisten kenttien toistuvaksi vaihtelemiseksi alhaisten ja korkeiden intensiteettien välillä, jotka ovat eri faasissa toistensa suhteen hiukkasten liikuttamiseksi yleissuunnissa, jotka ovat pääasiallisesti poikittaisia kenttien suuntien suhteen, tunnettu siitä, että mainitut vaihteluelimet (16, 18, 20) on sovitettu toimimaan taajuu- 8451 8 della, joka on valittu erotettavien hiukkasten ennalta määrätyn likimääräisen massan perusteella.

17. Patenttivaatimuksen 16 mukainen sähköforeesilaite, tunnettu siitä, että kentän kehittävä väline (14) käsittää vähintään kolme erillistä elektrodia, jotka ovat välimatkan päässä toisistaan ja elimiä (18, 20, 22, 24) vastaavien elektrodien pitämiseksi vastaavissa valituissa potentiaaleissa vastaavien valittujen ajanjaksojen ajan.