FI81834C - Ny jordbrukskemikalie benaemnd çsubstans nr 51262ç, samt dess framstaellning. - Google Patents

Description

81834 1 Uusi maanviljelyskemikaali, joka on nimetty "aineeksi no. 51262", sekä sen valmistaminen

Ny jordbrukskemikalie benämnd "substans nr 51262", samt dess framställning 5 Tämä keksintö kohdistuu uuteen yhdisteeseen, joka on nimetty "aineeksi no. 51262" sekä menetelmään tämän aineen valmistamiseksi.

-jQ Lisäksi keksinnön kohteena on mikro-organismikanta, jota viljelemällä ainetta no. 51262 tässä keksinnössä tuotetaan.

Yhdisteellä on kasveja tappavaa aktiivisuutta sekä kasvien kasvua hidastavaa aktiivisuutta, ja sitä käytetään tätä ainetta aktiivisena .jg aineosanaan sisältäviin kasvimyrkyissä ja kasvien kasvua säätelevissä aineissa.

Koska aineen no. 51262 rakennetta ei olla toistaiseksi täysin selvitetty, niin sitä voidaan luonnehtia sen ominaisuuksien ja valmistusta-2q van perusteella, ja on siten pääasiallisesti tunnettu siitä, että se on saatu viljelemällä mikro-organismia Streptomyces hygroscopicus SANK 63584 (talletusnumero FERM BP-958), ja jolla yhdisteellä on seuraavia | : ominaisuuksia: 25 (a) ulkonäkö: neutraaleja, värittömiä kiteitä; (b) ominaiskiertokyky: (a]25 - +28,8° (C-1,04, H20, natriumin D-viiva); (c) alkuaineanalyysi: laskettu yhdisteelle C7H10N2O6: C, 38.54 %; H, 4.62 %; N, 12.84 %; 30 todettu: C, 38.55 %; H, 4.53 %; N, 12.90 %; ;; (d) kiteiden sulamispiste: 187-189°C; (e) molekyylikaava: C7H10N2O6; (f) molekyylipaino: 218; (g) ultraviolettisäteilyn absorptiospektri: esitetään liitteenä olevien 35 piirustusten kuviossa 1, ja siinä ei esiinny absorptiomaksimia aallonpituuden 220 nm yläpuolella vesiliuoksena; (h) infrapunasäteilyn absorptiospektri: infrapunasäteilyn absorptiospektri, KBr-tablettina mitattuna, esitetään liitteenä olevien piirustusten kuviossa 2; 2 81834 ^ (i) ydirunagneettisen resonanssin spektri (NMR-spektri): ydinmagneettisen resonanssin spektri (S ppm), mitattuna taajuudella 400 MHz raskaassa vedessä, käyttäen sisäisenä standardina tetrame-tyylisilaania, esitetään liitteenä olevien piirustusten kuviossa 3; 5 (j) liukoisuus: liukenee veteen metanoliin ja etanoliin; ei liukene etyyliasetaattiin eikä asetoniin; (k) värireaktiot: positiivinen rikkihapon, anisaldehydin ja rikkihapon-seoksen sekä kaliumpermanganaatin reaktioissa; (l) ohutkerroskromatografia: 10 Rf-arvo - 0,3, saatu silikageelilevyllä no. 5715 (Merck Co.), joka kehitettiin etyyliasetaatin, isopropanolin ja veden seoksella, tilavuussuhteessa 50:10:2.

Keksinnön mukainen menetelmä aineen no. 51262 valmistamiseksi on pää-15 asiassa tunnettu siitä, että menetelmässä viljellään ainetta no. 51262 tuottavaa mikro-organismia, joka on Streptomyces hygroscopicus SANK 63584 (talletusnumero FERM BP-958), jonka jälkeen aine no. 51262 erotetaan kasvatusalustasta.

20 Keksinnön avulla voidaan saada aikaan aktiivisena aineosanaan ainetta !’ i no. 51262 sisältävä maatalouskemiallinen valmiste, jolla on kasveja tappavaa tai kasvien kasvua säätävää aktiivisuutta.

Vähän aikaa sitten löydetyn mikro-organismin, Streptomyces sp. SANK 25 63584, tunnusomaiset piirteet esitetään jäljempänä. Nämä tunnusomaiset • : piirteet määritettiin viljelemällä mikro-organismia lukuisilla erilai silla, kansainvälisen Streptomyces-projektin (International Streptomyces Project; ISP) esittämillä alustoilla, tai alustalla, jota S.A. Waksman suosittelee teoksen "The Actinomycetes” toisessa osassa, kai-30 kissa tapauksissa 28°C:n lämpötilassa.

. . 1. Morfologiset ominaisuudet

Kannan SANK 63584 vegetatiivinen rihmasto kasvaa hyvin ja haaroittuen ·,·. 35 isp-.n esittämällä alustalla, kun organismia on viljelty 28°C lämpötilas sa 14 vuorokautta. Ilmarihmastossa nähdään mikroskoopilla tarkasteltaessa yksinkertaisia haaroja. Itiöketjun muoto on lähinnä suljettu spiraali. Itiöketjun pinnan rakenne on myhkyräinen ja ryppyinen. Erityisiä

II

3 81834 1 kuten sklerotium-esiintymiä, katkennutta vegetatiivista rihmastoa tai itiö-koteloita (sporangium) ei havaittu.

2. Kasvatusominaisuudet 5

Ilmarihmasto muuttui kosteaksi ja mustaksi viljelyn edetessä. Liukoisia väriaineita ei syntynyt. Taulukossa 1 esitetään tulokset, jotka saatiin kasvattamalla organismia 14 vuorokautta 28°C;n lämpötilassa erilaisilla tavanomaisilla viljelyalustoilla. Värien nimet ja numerot ovat julkaisun 10 "Guide to Color Standard", yhtiön Nippon Shikisai Kenkyusho, Tokio,

Japani, julkaiseman käsikirjan mukaiset.

Taulukko 1 15 ______

Kasvatusalusta Ominaisuus Kannan SANK 63584 käyttäytyminen

Sakkaroosi- G Ei kovin hyvä, matala vaalean kellertävän nitraatti-agar oranssi (2-9-9) ;· 20 ' AM Jonkin verran muodostunut, samettimainen, ruskehtavan valkoinen (1-6-6) R Vaalean ruskea (2-8-9) 25 SP Puuttuu

Glukoosi- G Hyvä, matala, vaalea, kellertävän oranssi asparagiini-agar (2-9-9) 30 AM Jonkin verran muodostunut, samettimainen, valkoinen R Vaalean kellertävän ruskea (2-9-9) 35 SP Puuttuu 1 Taulukko 1 (jatkoa) a 81834

Kasvatusalusta Ominaisuus Kannan SANK 63584 käyttäytyminen 5 _

Glyseroli- G Runsasta, matala, vaalea, kellertävän asparagiini oranssi (2-9-9) agar (ISP5) 10 AM Ei kovin hyvä, samettimainen, valkoinen R Vaalean kellertävän oranssi (2-9-9) SP Puuttuu 15 _

Epäorgaanisten G Runsasta, matala, vaalea, kellertävän suolojen ja ruskea (6-7-9) tärkkelyksen agar (ISP4) 20 AM Runsasti muodostunut, samettimainen, ruskehtavan harmaata (1-5-6) R Kellertävän ruskea (6-6-8) 25 SP Puuttuu

Tyrosiiniagar G Runsasta, matala, vaalea, kellertävän (ISP7) ruskea (4-8-9) 30 AM Ei kovin hyvä, samettimainen, valkoinen • · R Kellertävän ruskea (6-7-8) 35 SP Puuttuu

II

1 Taulukko 1 (jatkoa) 5 81834

Kasvatusalusta Ominaisuus Kannan SANK 63584 käyttäytyminen 5 _

Peptoni- G Runsasta, matala, vaalea, kellertävän hilvauute-agar ruskea (4-8-9) (1SP6) 10 AM Jonkin verran muodostunut, samettimainen, valkoinen R Vaalean kellertävän ruskea (6-7-9) 15 SP Puuttuu

Ravintoagar G Hyvä, matala, vaalean kellertävän (Difco) ruskea (4-8-9) 20 AM Jonkin verran muodostunut, samettimainen, valkoinen R Vaalean kellertävän ruskea (4-8-9) -•’25 SP Puuttuu

Hlivauute- G Runsasta, matala, vaalean kellertävän mallasuute-agar ruskea (6-7-9) (ISP2) 30 AM Runsaasti muodostunut, samettimainen, ;·_ ruskehtavan harmaa (1-5-6) R Kellertävän ruskea (6-5-8) 35 SP Puuttuu Ί Taulukko 1 (jatkoa) 6 81834

Kasvatusalusta Ominaisuus Kannan SANK 63584 käyttäytyminen 5 _

Kaurajauhoagar G Runsasta, matala, vaalean kellertävän (ISP3) ruskea (6-7-9) AM Runsaasti muodostunut, samettimainen, 10 ruskean valkoinen (1-6-6) R Kellertävän ruskea (6-6-8) SP Puuttuu 15 _

Vesiagar G Heikko, matala, vaalean kellertävän oranssi (2-9-9) AM Ei kovin hyvä, samettimainen, heikosti 20 ruskehtavan valkoinen (1-7-6) ; R Heikosti ruskehtavan harmaa (2-8-7) SP Puuttuu 25 __

Perunauute G Heikko, matala, vaalean kellertävän . porkkanauute- oranssi (2-9-9) agar 30 AM Ei kovin hyvä, samettimainen, ruskehtavan harmaa (1-5-6) • - R Heikosti ruskehtavan valkoinen (1-7-6) ..· 35 SP Puuttuu

II

7 81834 1 Otsikon "Ominaisuus" alla esiintyvillä lyhenteillä on seuraava merkitys: G: kasvu; AM: ilmamyseell; R: kääntöpuoli; SP: liukoinen pigmentti.

3, Fysiologiset ominaisuudet 5

Kannan SANK 63584 fysiologiset ominaisuudet esitetään taulukossa 2.

Taulukko 2 10 _ Tärkkelyksen hydrolyysi +

Gelatiinin nesteyttäminen +

Nitraatin pelkistäminen +

Maidon koagulolmlnen 15 Maidon peptanolntl +

Kasvulämpötilan alue (alusta 1) 11-46 °C

Kasvun optimilämpötila (alusta 1) 24-38 °C

Kasvu NaCl:n läsnäollessa 7 % kasvaa 10 % ei kasva 20 Kaseiinin hajottaminen + . Tyrosiinin hajottaminen + ' ; Ksantiinin hajottaminen

Melanoidiplgmentln tuotanto (alusta 2) 1 Melanoidiplgmentln tuotanto (alusta 3) 25 Melanoidiplgmentln tuotanto (alusta 4) * ·

Edellä mainitut alustat ovat seuraavat: 30 Alusta 1: Hllvauute - mallasuute-agar (ISP 2)

Alusta 2: Tryptoni-hiivauute-ravintoliuos (ISP 1)

Alusta 3: Peptoni-hiivauute-rauta-agar (ISP 6) . Alusta 4: Tyroslinlagar (ISP 7).

35 Hiililähtelden hyväksikäyttöä tarkasteltiin sen Jälkeen, kun kantaa SANK

63584 oli lnkuboltu 14 vuorokautta, käyttäen Prldham-Gottlleb:in perue-agaralustaa. Koska kanta SANK 63584 kykenee kasvamaan, ainakin jossain mää- 8 81834 1 rin, tässä perusalustassa ilman minkäänlaista lisättyä hiilen lähdettä, niin on vaikeata kuvata täsmällisesti sen kykyä hyväksikäyttää hiilen lähteitä. Taulukossa 3 esitetään eri lähteiden suhteellinen hyväksikäyttö, jolloin edellä mainitun perusalustan hyväksikäyttöä pidetään negatiivi-5 sena (-) vertailuna.

Taulukko 3 10 D-glukoosi + D-fruktoosi + L-arabinoosi + L-ramnoosi - D-ksyloosi + sakkaroosi inositoli - raffinoosi D-mannitoli + vertailu - 15 _ + : käyttää hyväksi + : käyttää jonkin verran hyväksi - : ei käytä hyväksi 20 • - 4. Koko solun komponentit / ' Kannan SANK 63584 soluseinämiä tutkittiin käyttämällä Becker:ln et el.

menetelmää ^Applied Microbiology, 1_2, 421 (1964) J. Tällöin todettiin 25 L,L-diaminopimeelihapon ja glysiinin läsnäolo, ja näin ollen pääteltiin, ,j,: että soluseinämät olivat tyyppiä 1. Kannan SANK 63584 koko solun sokeri- ,· · komponentteja tutkittiin Lechevalierrin menetelmällä [ Journal of

Laboratory and Clinical Medicine, Tl, 934 (1968).7. Tunnusomaista sokeri-profiilia ei todettu.

30 ··. Edellä esitettyjen havaintojen perusteella tämän uuden kannan katsottiin kuuluvan actinomycetes-organismien Streptomyces-sukuun, ja sille annet-. tiin nimeksi Streptomyces sp. SANK 63584. Jokin aika sitten se liitet tiin lajiin Streptomyces hygroscopicus, ja näin ollen siitä voidaan käyt- 35 tää nimitystä Streptomyces hygroscopicus SANK 63584.

Il » 81834 1 Kannan SANK 63584 tunnistaminen toteutettiin ISP-raporttien, teoksen "Bergey's Manual of Determinative Bacteriology" (8. laitos), teoksen "The Actinomycetes", nide 2, sekä muun viimeaikaisen, streptomycetes-organismien taksonomiaa käsittelevän kirjallisuuden perusteella.

5

Kanta SANK 63584 on tallennettu kantakokoelmaan Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry, Japani, joulukuun 14. päivänä 1984 taltiointinumerolla FERM P-8004, ja se tallennettiin uudestaan Budapestin 10 sopimuksessa esitetyillä ehdoilla mainitun laitoksen, Fermentation

Reserch Institute, kantakokoelmaan tammikuun 9. päivänä 1986 taltiointi-numerolla FERM BP-958.

Varmuuteen on päästy siitä, että kanta SANK 63584 tuottaa ainetta 15 no. 51262. Kuitenkin, kuten hyvin tunnetaan, actinomycetes-organismien yleiseen luokkaan kuuluvien mikro-organismien ominaisuudet saattavat vaihdella huomattavasti, ja näissä mikro-organismeissa saattaa helposti esiintyä mutaatiota, sekä luonnollisten syiden seurauksena että myöskin keinotekoisen induktion tuloksena. Näin ollen tämän keksinnön mukainen 20 menetelmä käsittää kaikkien Streptomyces-sukuun luokiteltavissa olevien ·· · mikro-organismien käytön, joilla mikro-organismeilla on lisäksi tunnus omaisena piirteenä uuden kannan SANK 63584 tavoin kyky tuottaa ainetta no. 51262.

25 Streptomyces-sukuun kuuluvien mikro-organismien, ja erityisesti lajin Streptomyces hygroscopicus kantojen viljely tämän keksinnön mukaisesti ainetta no. 51262 tuottaen voidaan toteuttaa olosuhteissa, jolta tavanomaisesti käytetään viljeltäessä actinomycetes-lajeja, erityisesti nestevlljelmänä ja viljelmää mielellään ravistellen tai sekoittaen sekä 30 ilmastaen. Viljelyyn käytetty ravintoalusta on täysin tavanomainen ja sisältää komponentteja, joita tavallisesti käytetään actinomycetes-organismeja kasvatettaessa. Erityisesti, alustan tulisi sisältää mielellään assimiloituvan hiilen lähteen, joista sopivina esimerkkeinä mainittakoon glukoosi, maltoosi, sakkaroosi, mannltoll» melasei, glyseroli, 35 dekstriini, tärkkelys, soijapavuista saatava öljy ja puuvillan siemenistä saatava öljy: assimiloituvan typen lähteen, joista sopivina esimerkkeinä mainittakoon soijajauho, maapähkinäjauho, puuvillan siemenistä 10 81 834 1 saatava jauho, fermamiini, kalajauho, maissinjyvien liotusvesi, peptoni, lihauute, puristehiiva, hiivauute, natriumnitraatti, ammoniumnitraatti tai ammoniumsulfaatti; sekä yhtä tai useampaa epäorgaanista suolaa, kuten natriumkloridia, fosfaatteja, kalsiumkarbonaattia ja tarvittaessa hiven-5 aineina toimivia metallisuoloja. Kun viljely toteutetaan nestemäisessä alustassa, niin yleensä on toivottavaa sisällyttää alustaan vaahdon esto-ainetta (esimerkiksi silikoniöljyä, kasviöljyä tai sopivaa pinta-aktiivista ainetta).

10 Viljeleminen toteutetaan sopivasti olennaisesti neutraalissa pH-arvossa, sekä lämpötilassa, joka on alueella 24-38 °C, mieluummin alueella 24-30 °C, ja mieluiten 28 °C:n lämpötilassa.

Aineen no. 51262 muodostumista viljelyn edetessä voidaan seurata lukui-15 silla tavanomaisilla tekniikoilla, jotka on tarkoitettu biologisesti aktiivisten aineiden muodostumisen seuraamiseen mikrobiviljelmässä, ja joita on tarkasteltava ohessa ainoastaan vähäisessä määrin, mikäli lainkaan. Sopivana tekniikkana on johonkin herkkään kasvilajiin, esimerkiksi lajiin Brasslca Rapa (L) var. "Komatsuna", kohdistuvan inhiboi-. . 20 van aktiivisuuden toteaminen viljelyliuoksesta.

• · · · ’* Syntyneen aineen no. 51262 määrä saavuttaa tavallisesti suuremman arvonsa, : kun viljely on kestänyt 60-120 tuntia, ja selvästi ollaan todettu, että aineen no. 51262 erottaminen viljelyalustasta on toivottavaa viimeistään 25 sillä hetkellä, kun tämä suurin arvo saavutetaan. Tämä ajanjakso voi kul-V; tenkin vaihdella, riippuen viljelyn olosuhteista ja viljelytekniikoista, ja lyhyempi tai pitempi ajanjakso saattaa olla asianmukainen kulloistenkin olosuhteiden mukaan. Oikea viljelyalka voidaan kussakin tapauksessa määrittää helposti rutiinikokein käyttämällä sopivia seuraamismenetel-... 30 miä, esimerkiksi edellä mainittua menetelmää.

' * Aine no, 51262 on vesiliukoista ja sitä vapautuu pääasiallisesti vilje- : lyalustan nesteosaan, joten se voidaan ottaa talteen poistamalla vilje lyalustasta kiintoaines, myseeli mukaan lukien, esimerkiksi suodatta-35 maila, käyttäen mieluiten suodatuksen apuainetta kuten pilmaata, tai sentrifugolmalla. Tämän jälkeen se voidaan ottaa talteen erotetusta neste-osasta tavanomaisia menetelmiä käyttäen, käyttäen hyväksi sen ominaisia

II

11 81834 1 fysikokemiallisia ominaisuuksia ja toivottaessa se voidaan tämän jälkeen puhdistaa.

Aine no. 51262 erotetaan mieluiten mainitussa nesteosassa läsnäolevista 5 muista tuotteista adsorbentin avulla, adsorboiden joko epäpuhtaudet tai adsorboiden aine no. 51262 tai adsorboimalla molemmat erikseen tai yhdessä, jonka jälkeen aine no. 51262 eluoidaan. Lukuisia erilaisia adsor-bentteja voidaan käyttää: erityisen tyydyttävistä adsorbenteista mainittakoon esimerkkeinä: aktivoitu hiili sekä hartsimalset adsorbentit kuten 10 tuote Amberlite (rekisteröity tavaramerkki) XAD-2.XAD-4 tai XAD-7 (yhtiön Rohm & Haas tuote), ja tuote Dialon (rekisteröity tavaramerkki) HP10, HP20, CHP20P tai HP50 (yhtiön Mitsubishi Chemical Industries Co., Ltd.). Nesteosassa läsnäolevat epäpuhtaudet voidaan poistaa johtamalla aineen no. 51262 sisältävä liuos yhdestä tai useammasta edellä mainitusta adsor-15 bentista muodstuvan kerroksen tai kolonnin läpi tai adsorboimalla aine no. 51262 yhteen tai useampaan näistä adsorbenteista, ja eluolmalla tämän jälkeen aine no. 51262 sopivalla eluentilla. Sopivia eluentteja ovat metanolin, asetonin tai butanolin vesiseokset.

20 Täten saatua ainetta no. 51262 voidaan puhdistaa edelleen lukuisilla eri tavoilla. Sopivia menetelmiä ovat mm. kolonnissa toteutettava partitio-.·; kromatografia selluloosatuotteella, kuten esimerkiksi tuotteella Avicel (yhtiön Asahi Chemical Industry Co., Ltd. rekisteröity tavaramerkki) tai tuotteella Sephadex LH-20 (ruotsalaisen yhtiön Pharmacia rekisteröity 25 tavaramerkki). Aineen no. 51262 sisältävässä nesteosassa läsnäolevat epäpuhtaudet voidaan poistaa myöskin adsorboimalla ne erilaisiin kationin-valhtohartseihin (vahva tai heikko), kuten hartsiin Dowex 50W (yhtiön Dow Chemical Co., Ltd. rekisteröity tavaramerkki) tai hartsiin Amberlite IRC-50 (yhtiön Rohm & Haas rekisteröity tavaramerkki) tai anioninvaihto-30 hartsiin (kuten Dowex 1 tai Dialon WA10).

Ainetta no. 51262 voidaan puhdistaa edelleen kromatografiseetl silikä-geeliä käyttäen, mikäli välttämätöntä. Yhtä tällaista puhdlstamistek-niikkaa tai mitä tahansa niiden yhdistelmää voidaan käyttää puhtaan aineen 35 no. 51262 saamiseksi, jolla aineella on edellä kuvatut fyeikokemialllset omina!suudet.

12 81 834 1 Kirjallisuutta tutkimalla ei olla löydetty mitään sellaista tunnettua yhdistettä, jonka ominaisuudet vastaisivat täysin aineen no. 51262 ominaisuuksia, ja näin ollen on vedetty se johtopäätös, että aine no. 51262 on uusi yhdiste.

5

Aineella no. 51262 on sekä herbisidistä että kasvien kasvua hidastavaa aktiivisuutta. Herbisidinen aktiivisuus tarkoittaa sitä, että aine vahingoittaa kasveja ja saattaa lopulta tappaa ne. Toisaalta hidastava aktiivisuus tarkoittaa sitä, että aine hidastaa tai tukahduttaa kasvin kasvun 11-10 mentämättä kuitenkaan herbisidistä aktiivisuutta, joka johtaisi solujen kuolemaan (necrosis) ja kasvin menehtymiseen. Kasvin reaktio aineelle (eli tutkittiinpa aineen herbisidistä tai kasvua hidastavaaa vaikutusta) vaihtelee riippuen antomenetelmästä, aineen no. 51262 pitoisuudesta Ja käsiteltävän kasvin herkkyydestä tälle aineelle. Kuten jäljempänä esite-15 tään, tämän keksinnön mukaisella yhdisteellä on erinomaista, erilaisiin rikkaruohoihin kohdistuvaa herbisidistä vaikutusta, levitettynä sekä ennen kasvin tunkeutumista maanpinnan yläpuolelle että sen jälkeen, ja näin ollen se on käyttökelpoinen kasvimyrkky kasvien lehdistölle levitettynä. Jäljempänä esitetään muös se, että tämä aine voi viivästyttää kasvien 20 kasvua niitä kuitenkaan tappamatta. Näin ollen aineen odotetaan olevan käyttökelpoista estämään riisikasvien taittumisen lyhentämällä riisi-kasvien kortta, vähentämään ruohonleikkuun tarvetta ja lyhentämään kas-- · vien perkaamiseen tai siistimiseen kuluvaa aikaa nurmikon ja puutarha kasvien kasvua hidastamalla, pienentämään kukkivien kasvien kokoa, ja 25 niin edelleen.

Tämän keksinnön mukainen maanviljelyskemiallinen (agrokemiallinen) valmiste, käytettiinpä sitä kasvimyrkkynä tai kasvien kasvun säätelijänä, voi sisältää pelkästään ainetta no. 51262 tai tätä ainetta seoksena kan-30 tajan ja/tai apuaineen kanssa. Tämä valmiste voidaan tehdä mihin tahansa agrokemikaaleille tavanomaiseen muotoon, siitä on voitu tehdä esimerkiksi pölymälstä, tai karkeata pölyä, rakeita, mikrorakelta, kostuvaa jauhetta, veteen liukenevaa jauhetta tai siitä on voitu tehdä nestemäinen tuote. Luonnollisestikaan tässä valmisteessa ei ole välttämätöntä käyttää aineen 35 no. 51262 täysin puhdasta muotoa, ja aineen puhdistaminen voidaan luonnollisestikin pysäyttää missä valheessa tahansa, ja tuloksena olevaa raakaa ainetta voidaan käyttää valmisteen aktiivisena aineosana, li 13 81834 1 Näissä valmisteissa käytettävät kantaja-aineet voivat olla synteettisiä tai luonnollisia, orgaanisia tai epäorgaanisia aineita, ja niitä sekoitetaan tämän keksinnön mukaisen yhdisteen kanssa helpottamaan aktiivisen aineosan varastointia, kuljetusta ja käsittelemistä, tai edesauttamaan 5 aktiivisen aineosan kulkeutumista kasvien sisään. Nämä kantaja-aineet voivat olla kiinteitä tai nestemäisiä. Erimerkkeinä kiinteistä kantajaaineis-ta mainittakoon seuraavat epäorgaaniset materiaalit: savi, talkki, piimää, kaoliini, bentoniitti, kalsiumkarbonaatti, kipsi, synteettinen saostunut silika, attapulgiitti, zeoliitti ja hohkakivi: seuraavat synteettiset ja 10 luonnolliset hartsit: kumaronihartsi, alkydihartsit, polyvinyylikloridi, esterikumi ja ksantaanikumi; sellaiset vahat kuten karnubavaha tai paraf-fiinivaha; sekä muut orgaaniset materiaalit kuten pähkinän kuoret (esimerkiksi saksanpähkinöistä tai muista pähkinöistä) tai soijajauho. Esimerkkeinä nestemäisistä kantaja-aineista mainittakoon vesi ja alkoholit, ku-15 ten metanoli, etanoli, isopropanoli tai etyleeniglykoli.

Mikäli valmisteen on tarkoitus sisältää pinta-aktiivista ainetta, niin se voi olla ionista tai ioneja muodostamatonta, ja sitä käytetään parantamaan valmisteen dispergoitumista, kostumista tai leviämistä. Esimerkkeinä 20 anionislsta pinta-aktlivisista aineista mainittakoon llgnlinisulfonlhapon - . natrium- ja kalsiumsuola, natriumoleaatti, natriumdodekyyli-bentseeni- sulfonaatti, natrium-dialkyyli-sulfonsukkinaatit, polyoksietyleenin ;· alkyyli-aryyli-eetteri-sulfaattien tai polyoksietyleenin alkyyli-esteri- sulfaattien natrium-, ammonium- ja amilnisuolat, tai polyoksietyleenin 25 alkyyli-fosfaattien vapaat hapot tai suolat. Kationisista pinta-aktiivi-sista aineista mainittakoon korkeammat alifaattlset amiinit sekä näiden amiinien ja etyleenioksidin väliset kondensaatit, kvaternääriset ammonium-kloridit, N-alkyyliamlinin asetaatit ja N-alkyyliamiinin oksidit. Amfo-teerisiä pinta-aktiivisia aineita ovet esimerkiksi betalinit ja amino-30 happojen tyyppiset pinta-aktiiviset aineet. Esimerkkeinä ioneja muodos-tamattomista pinta-aktiivisista aineista mainittakoon: rasvahappojen - - glyseridi- ja sakkaroosiesterit, etyleenioksidin ja korkeampien allfaat- tisten alkoholien väliset kondensaatit, etyleenioksidin Ja alkyyli-fenolien tai alkyylinaftolien väliset kondensaatit, korkeampien rasva-35 happojen amidit ja etokslloidut amidit, sorbltaanln tai etoksiloitujen sorbltaanien ja korkeampien rasvahappojen väliset esterit, glyseroll-boraattien tai etoksiloitujen glyseroliboraattien ja korkeampien rasva- 14 81834 1 happojen väliset esterit sekä etyleenioksidin ja propyleenioksidin väliset kopolymeerit.

Tämän keksinnön mukaiset valmisteet voivat toivottaessa sisältää myös 5 muita komponentteja, esimerkiksi: suojaavia kolloidaalisia aineita, kuten gelatiinia, arabikumia, kaseiinia, polyvinyylialkoholia tai karboksi-metyyliselluloosaa; tai paksuntavia aineita, kuten natriumpolyfosfaattia tai bentoniittia. Laajemman soveltuvuusalueen saavuttamiseksi ja työn säästämiseksi tämän keksinnön mukainen valmiste voidaan toivottaessa 10 yhdistää muihin fungisideihin, insektisideihin, herbisideihin, kasvien kasvua sääteleviin aineisiin ja lannoitteisiin.

Tätä keksintöä havainnollistetaan edelleen seuraavilla esimerkeillä, joista esimerkit 1 ja 2 havainnollistavat aineen no. 51262 valmistamista, 15 kun taas esimerkit 3-7 kuvaavat aineen no. 51262 vaikutusta ja esimerkit 8-12 havainnollistavat tätä ainetta sisältäviä valmisteita.

Esimerkki 1 20 Aineen no. 51262 valmistaminen : Platinasilmukallinen kannan Streptomyces sp. SANK 63584 kasvustoa siir- rostettiin kuhunkin neljään 500 millilitran Erlenmeyer-pulloon, joista .1.' kukin sisälsi 80 ml koostumukseltaan seuraavanlaista alustaa (prosentti- 25 set osuudet ovat painoprosentteja): '·* Glukoosi 3 2

Hiiva 1 Z

Soijajauho 3 Z

30 Kalsiumkarbonaatti 0,4 %

MgS04 x 7H20 0,2 %

Vaahdonestoaine 0,01 % (Nissan Disfoam CB-442, saatavana yhtiöstä 35 Nissan Chemical Industrien Ltd.)

Vettä sadaksi prosentiksi pH 7,2 ennen sterilointia.

li 15 81 834 1 Mikro-organismia kasvatettiin tämän jälkeen käyttäen pyörivää ravisteli-jaa nopeudella 220 rpm, 72 tunnin ajan 28°C:n lämpötilassa.

2 ml tuloksena saatua siemenviljelmää siirrostettin kuhunkin 130 Erlen-5 meyer-pulloon, joiden tilavuus oli 500 ml, ja joista kukin sisälsi 80 ml tätä samaa kasvatusalustaa, ja mikro-organismia kasvatettiin 96 tunnin ajan 28°C:n lämpötilassa käyttäen pyörivää ravistelijaa nopeudella 220 rpm. Tuloksena saadut kasvatusalustat ja pesuliuokset, yhteensä 11,4 litraa, yhdistettiin ja tähän lisättiin 1 kg suodatuksen apuaineena toimivaa tuo-10 tetta Celite 545 (yhtiön Johns Manville Products Corp. tavaramerkki), ja seos suodatettiin, jolloin saatiin 11 litraa suodosta, jonka pH on 7,1. Tämän jälkeen suodos johdettiin kromatografiakolonnin läpi, joka kolonni oli täytetty 3 litralla aktiivihiiltä (yhtiön Wako Pure Chemicals Industries Ltd. tuote) aineen no. 51262 adsorboimiseksi.

15

Kolonni pestiin 4,5 litralla ionitonta vettä, ja sitten toivottu aine eluoitiin 15 litralla asetonin 10-prosenttisella (v/v) vesiliuoksella.

Nämä 15 litraa aktiivista eluaattia tiivistettiin haihduttamalla alennetussa paineessa, jonka jälkeen jäännös lyofilisoitiin, jolloin saatiin 20 61 g raakajauhetta, joka sisälsi toivottua ainetta no. 51262. Toivot- : : taessa tätä raakajauhetta voidaan käyttää sellaisenaan agrokemikaaleissa.

Tämän jälkeen raakajauhe adsorboitiin kromatografiakolonniin, joka sisälsi 500 ml tuotetta Avicel (yhtiön Asahi Chemical Industry Co., Ltd. tavara-25 merkki), joka Avicel oli edeltä käsin tasapainoitettu asetonitriilillä. Sitten tätä kolonnia eluoitiin puolestaan 2 litralla asetonitriiliä, 3 litralla asetonitriilin 97-prosenttista vesiliuosta (v/v) ja lopuksi 6 litralla asetonitriilin 85-prosenttista vesiliuosta (v/v). Eluaatista kerättiin 1 litran suuruisia fraktioita, ja toivottua ainetta no. 51262 30 todettiin olevan läsnä 6.-9. fraktioissa. Nämä fraktiot yhdistettiin, tiivistettiin haihduttamalla alennetussa paineessa, jonka jälkeen ne lyofilisoitiin, jolloin saatiin 4,6 g jauhetta. Tämä jauhe liuotettiin pieneen määrään metanolin 50-prosenttista vesiliuosta (v/v) ja se adsorboitiin Sephadex LH-20-geeliä (ruotsalaisen yhtiön Pharmacia rekisteröity 35 tavaramerkki) sisältävään kolonniin, joka oli edeltä käsin tasapainoitettu metanolin 50-prosenttisella vesiliuoksella (v/v). Kolonnia eluoitiin metanolin 50-prosenttisella vesiliuoksella, (v/v) ja eluaatista kerättiin 15 16 81 834 1 millilitran fraktioita. Fraktiot 36-50 sisälsivät toivotun aineen no.

51262 ja ne otettiin talteen, yhdistettiin, tiivistettiin haihduttamalla alennetussa paineessa ja johdettiin uudestaan saman Sephadex LH-20-kolonnin läpi. Eluoituneet fraktiot otettiin talteen ja lyofilisoitiin, 5 jolloin saatiin 334 gramman suuruinen näyte ainetta no. 51262, jonka puhtaus oli noin 70 Z.

300 mg tätä näytettä adsorboitiin silikageeliä sisältävään kolonniin (yhtiön Merck Co. tuote), joka oli edeltä käsin tasapainoitettu kloro-10 formin ja metanolin seoksella tilavuussuhteessa 10:1. Toivottu aine eluoitiin kloroformin ja metanolin seoksella, tilavuussuhteessa 6:1, ja eluaatista kerättiin 15 millilitran suuruisia fraktioita. Fraktiot 22-60 otettiin talteen, yhdistettin, tiivistettiin haihduttamalla alennetussa paineessa, jonka jälkeen jäännös käsiteltiin kromatografisesti prepara-15 tiivisella, silikageelistä valmistetulla ohutkerroslevyllä, käyttäen kehi-tysliuoksena etyyliasetaatin, isopropanolin ja veden seosta tilavuussuhteessa 50:10:2. Toivottu aine uutettiin kloroformin ja metanolin seokseen, tilavuussuhteessa 6:1, ja uutos tiivistettiin haihduttamalla alennetussa paineessa, ja sitten lyofilisoitiin, jolloin ainetta no. 51262 20 saatiin 25,5 mg värittömänä jauheena, jolla oli seuraavat ominaisuudet: (a*) ulkonäkö: neutraali, väritön jauhe; (b1) ominaiskiertokyky: * +24,4° (C 0,61, H^O, natriumin , ·. D-viiva); - 25 (c1) alkuaineanalyysi: laskettu yhdisteelle C^H^N^O^: C, 35.59 %; H, 5.08 Z; N, 11.86 X; todettu: C, 35.65 %; H, 5.00 5; N, 11.71 X; sekä edellä kuvatut ominaisuudet (e)-(l).

30 Esimerkki 2 : : Aineen no. 51262 valmistaminen 260 mg osittain puhdistettua ainetta no. 51262 valmistettiin esimerkissä 35 1 kuvatulla menetelmällä (olennaisesti identtinen siihen vaiheeseen saak ka, jossa vaiheessa saatiin puhtaudeltaan noin 70-prosenttisen raakatuot-teen näyte) ja tämä osittain puhdistettu yhdiste liuotettiin pieneen

II

17 81 834 1 määrään vettä. Tämä liuos adsorboitiin kolonniin, joka sisälsi 300 ml tuotetta Diaion CHP-20P ja eluoitiin vedellä. Eluaatista kerättiin 5 millilitran fraktioita ja toivottu aine no. 51262 eluoitui fraktioiden 61-67 mukana, joilla fraktioilla todettiin yksi ainoa täplä ohutkerros-5 kromatografisilla levyillä. Nämä fraktiot yhdistettiin, tiivistettiin haihduttamalla alennetussa paineessa ja lyofilisoitiin, jolloin saatiin 41 g toivottua ainetta no. 51262 värittömänä jauheena, jolla oli samat ominaisuudet kuin esimerkissä 1 saadulla tuotteella.

10 Esimerkki 3

Kiteisen aineen no. 51262 valmistaminen

Esimerkissä 2 kuvattu menetelmä toistettiin, jolloin ainetta no. 51262 15 saatiin 130 mg värittömänä jauheena. Kaikki tämä jauhe liuotettiin kuumaan asetoniin, ja tämän jälkeen tuloksena oleva liuos jäähdytettiin. Erottuneet kiteet otettiin talteen, jolloin ainetta no. 51262 saatiin 37 mg värittöminä neulamaisina kiteinä, joilla oli edellä kuvatut ominaisuudet (a)-(l).

20 ; Esimerkki 4

Inhiboiva vaikutus, joka kohdistuu Komatsuna-kasvin siementen itämiseen 25 Steriloitua puuvillavanua laitettiin noin 5 millimetrin korkuiseksi kerrokseksi koeputken (10 mm x 100 mm) pohjalle, jonka jälkeen se kasteltiin 0,5 millilitralla joko tislattua vettä tai vesiliuosta, joka sisälsi ainetta no. 51262 erilaisina pitoisuuksina. Kuhunkin koeputkeen laitettiin noin 10 kasvista Komatsuna (Brassica Rapa (L) var. Komatsuna Hara) 30 saatua siementä, ja niitä seisotettiin 3 vuorokautta 28°C:n lämpötilassa *: aineen no. 51262 Inhiboivan pitoisuuden määrittämiseksi itämisen tai sen puuttumisen perusteella. Komatsuna-siementen itämisen inhiboivaksi, aineen no. 51262 pienimmäksi mahdolliseksi pitoisuudeksi todettiin täten 3,13 pm/ml.

35 is 81834 1 Esimerkki 5

Koe, jossa maaperä käsitellään ennen kasvien kohoamista maan pinnan yläpuolelle 5

Muoviseen astiaan laitettiin ylänkömultaa siten, että mullan pinta-alaksi 2 saatiin noin 150 cm , jonka jälkeen siihen istutettiin seuraavista yksivuotisista, ylängöillä esiintyvistä rikkaruohokasveista saatuja siemeniä, jotka peitettiin samalla mullalla: Setaria faberi Herrm.; Digitaria 10 sanquinalis (L) Scorp; Echinochloa crus-galli (L.) Beauv.; Setaria viridis (L.) Beauv.; Amaranthus retroflexus L.; Brassica arvensis (L.) Kuntze; Chenopodium album L.; Abrosia artemsiifolla L.; Abutilon theophrasti Medic; sekä Sida spinosa L.

15 Kun siemenien kylvämisestä oli kulunut vuorokausi, mullan päälle ruiskutettiin aineen no. 51262 vesiliuosta (valmistettu esimerkissä 13 kuvatulla tavalla) tasaisesti, 15 ml kutakin astiaa kohden. Tämän jälkeen astioita seisotettiin 3 viikkoa kasvihuoneessa, jonka jälkeen kasvien kasvua tarkasteltiin. Aineen no. 51262 herbisidinen vaikutus todettiin 20 vertaamalla tällä aineella käsiteltyjen kasvien kasvua aineella käsittelemättömien kasvien kasvuun, ja tulokset esitetään seuraavassa taulu-: kossa 4, seuraavia koodeja käyttäen: kasvun inhibitio 0-5 Z tehokkuus 0 25 kasvun inhibitio 6-30 Z tehokkuus 1 - . kasvun inhibitio 31-50 Z tahokkuus 2 kasvun inhibitio 51-70 Z tehokkuus 3 kasvun inhibitio 71-95 Z tehokkuus 4 kasvun inhibitio 96-100 Z tehokkuus 5 30

II

35 1 Taulukko 4 19 81 834

Annostus (aktiivista ainetta kg/ha) 5 2,5 1,25

Kapealehtiset rikkaruohokasvit

Setaria faberi Herrm. 5 5 10 Digitaria sanquinalis (L) Scop. 5 5

Echinochloa crus-galli (L) Beauv. 5 5

Setaria viridis (L) Beauv. 5 5

Leveälehtiset rikkaruohokasvit 15

Amaranthus retroflexus L. 5 4

Brassica arvensis (L) Kuntze 5 5

Chenopodium album L. 3 1

Abutilon theophrasti Medic. 5 3 20 Sida spinose L. 5 4 : Ambrosia artemlsiifolia L. 5 2

Esimerkki 6 25

Lehdistön käsitteleminen

Rikkaruohokasvien (lueteltu taulukossa 5) siemeniä kylvettiin astioihin, peitettiin mullalla, ja seisotettiin kasvihuoneessa, esimerkissä 5 esite-30 tyn menetelmän mukaisesti. Kun siementen kylvämisestä oli kulunut 10 1 vuorokautta, aineen no. 51262 vesiliuokseen (valmistettu jäljempänä esimerkissä 11 kuvatulla tavalla), jonka pitoisuus oli taulukon 5 mukainen, sekoitettiin 0,03 % w/w Gramin S-levitintä (yhtiön Sankyo Co. Ltd. tavaramerkki). Kuhunkin astiaan rulskutettln 5 ml täten saatua liuosta.

35 Kasveja tarkasteltiin 10 vuorokautta käsittelyn jälkeen, ja aineen no. 51262 herbisidlnen vaikutus määritettiin ja se esitetään esimerkissä 5 kuvattuja koodeja käyttäen.

20 81 834 1 Taulukko 5

Annostus (aktiivista ainetta, ppm) 5 500 250

Kapealehtiset rikkaruohokasvit

Setaria faberl Herrm. 4 3 10 Digitaria sanqulnalis (L) Scop. 5 5

Echinochloa crus-galli (L) Beauv. 5 5

Setaria viridls (L) Beauv. 5 5

Leveälehtiset rikkaruohokasvit 15

Amaranthus retrofluxes L. 5 3

Brassica arvensis (L) Kuntze 5 5

Chenopodium album L. 3 2

Abutilon theophrasti Medic. 5 5 20 Sida spinosa L. 5 5 - * Abrosa artemisiifolia L. 5 5 : Esimerkki 7 25

Kasvin kasvun hidastuminen

Muoviastiaan laitettiin ylänkömultaa, jolloin pinnan alaksi saatiin 2 150 cm . Siihen kylvettiin riisipelloilla käytettyä riisiä, soijapapuja, 30 maissia ja puuvillaa. Sitten kuhunkin astiaan Istutettiin erään moni-*** vuotisen kasvin (purple nutsedge: Cyperus rotundus) mukuloita, ja sieme net ja mukulat peitettiin samalla mullalla. Astioita seisotettiin kasvi-huoneessa 10 vuorokautta, jonka jälkeen aineen no. 51262 vesiliuoksiin (valmistettu jäljempänä esimerkissä 11 kuvatulla tavalla), joiden pitoi-35 suudet olivat asianmukaiset, sekoitettiin 0,03 Z v/v Graniin S-levitintä. Kuhunkin astiaan ruiskutettiin 5 ml tuloksena olevaa liuosta. Käsiteltyjen kasvien kasvua verrattiin 2 viikon kuluttua vertailuun, jota ei

II

2i 81834 1 oltu käsitelty aineella no. 51262. Niiden kasvien, jotka oli käsitelty aineen no. 51262 liuoksella, jonka pitoisuus oli 125 ppm, kasvu oli hidastunut 50 % kaikkien kasvien tapauksessa, kun taas niissä astioissa, jotka oli käsitelty aineen no. 51262 liuoksella, jonka pitoisuus oli 5 500 ppm, purple nutsedge-kasvin versojen ja juuriston kasvu oli täysin estynyt.

Esimerkki 8 10 Toksisuus

Aineen no. 51262 liuosta annettiin hiirille suonen sisäisesti määränä 100 mg ruumiin painokiloa kohden. Hiiriä tarkkailtiin 14 vuorokautta, ja niissä ei todettu mitään tavallisuudesta poikkeavaa.

15

Esimerkki 9 Rakeet 20 Esimerkissä 1 kuvatulla menetelmällä toteutetun kasvatuksen jälkeen kasvatusalusta adsorboitiin aktiivihiiltä sisältävään kolonniin. Aktiivinen fraktio, joka eluoitiin asetonin 10-prosenttisella (v/v) vesiliuoksella, haihdutettiin kuiviin alennetussa paineessa, jolloin saatiin raaka-jauhetta. Tämä raakajauhe lluotettin veteen 50-prosenttiseksi (w/w) vesi-25 liuokseksi ja tämä adsorboitiin rakeisen hohkakiven päälle (koko 10-48 mesh, Tyler standardi) rakeiden saamiseksi.

Esimerkki 10 30 Kostuva jauhe 50 paino-osaa esimerkissä 9 kuvattua raakajauhetta, 3 osaa natrlum-dodekyyli-bentseenisulfonaattia, 2 osaa polyvinyylialkoholia Ja 45 osaa savea sekoitettiin keskenään homogeeniseksi massaksi, ja jauhettiin kos-35 tuvan jauheen saamiseksi.

1 Esimerkki 11 22 81834

Veteen liukeneva jauhe 5 50 paino-osaa ainetta no. 51262, 2 osaa polyoksietyleenin nonyylifenyyli- eetteriä, 10 osaa synteettistä silikaa ja 38 osaa ammoniumsulfaattia sekoitettiin homogeeniseksi seokseksi, jolloin saatiin veteen liukenevaa jauhetta.

10 Esimerkki 12

Nestemäinen valmiste 10 osaa ainetta no. 51262 ja 2 osaa natriumlauryylisulfaattia liuotettiin 15 tasaisesti 88 osaan metanolia, jolloin saatiin nestemäinen valmiste.

Esimerkki 13

Nestemäinen valmiste 20 10 osaa ainetta no. 51262 ja 2 osaa natriumdodekyyli-bentseenisulfo- naattia liuotettiin 88 osaan vettä, jolloin saatiin nestemäinen valmiste.

25 30 * · » j

II

35

Claims (4)

1. 23 8 1 8 3 4 ^ Patenttivaatimukset
2. 1. Yhdiste, jolle on annettu nimeksi "aine no. 51262", joka on tunnettu siitä, että se on saatu viljelemällä mikro-organismia Strep-5 tomyces hygroscopicus SANK 63584 (talletusnumero FERM BP-958), ja jolla yhdisteellä on seuraavia ominaisuuksia: (a) ulkonäkö: neutraaleja, värittömiä kiteitä; (b) ominaiskiertokyky: [a]20 - +28,8° (C - 1,04, H20, natriumin D-vii-10 va); (c) alkuaineanalyysi: laskettu yhdisteelle C7H10N2O6 C, 38.54 %; H, 4.62 %; N, 12.84 %; todettu: C, 38.55 %; H, 4.53 %; N, 12.90%; (d) kiteiden sulamispiste: 187-189°C; 15 (e) molekyylikaava: C7Hi0N2O6; (f) molekyylipaino: 218; (g) ultraviolettisäteilyn absorptiospektri: kuten liitteenä olevien piirustusten kuviosta 1 nähdään, siinä ei esiinny absorptiomaksimia aallonpituuden 220 nm yläpuolella vesi-·. 20 liuoks ena; (h) infrapunasäteilyn absorptiospektri: infrapunasäteilyn absorptiospektri, KBr-tablettina mitattuna on liitteenä olevien piirustusten kuvion 2 mukainen; (i) ydinmagneettisen resonanssin spektri: 25 ydinmagneettisen resonanssin spektri ($ ppm), mitattuna taajuudella 400 MHz raskaassa vedessä, käyttäen sisäisenä standardina tetrame-tyylisilaania, on liitteenä olevien piirustusten kuvion 3 mukainen; (j) liukoisuus: liukenee veteen, metanoliin ja etanoliin; ei liukene etyyliasetaattiin eikä asetoniin; (k) värireaktiot: positiivinen rikkihapon, anisaldehydin ja rikkihapon seoksen sekä kaliumpermanganaatin reaktioissa; * (1) ohutkerroskromatografia: Rf-arvo - 0,3, saatu silikageelilevyillä no. 5715 (Merck Co.), joka kehitettiin etyyliasetaatin, isopropanolin ja veden seoksella, tila-35 vuussuhteessa 50:10:2. 24 81834 ^ 2. Menetelmä patenttivaatimuksessa 1 määritellyn aineen no. 51262 val mistamiseksi, tunnettu siitä, että menetelmässä viljellään ainetta no. 51262 tuottavaa mikro-organismia, joka on Streptomyces hyg-roscopicus SANK 63584 (talletusnumero FERM BP-958), jonka jälkeen aine 5 no. 51262 erotetaan kasvatusalustasta.
3. 3. Jonkin patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, t u n n e t t u siitä, että kasvattaminen tapahtuu 24-38°C:n lämpötilassa, edullisesti 28°C:n lämpötilassa. 10
4. 4. Mikro-organismikanta , tunnettu siitä, että se on Streptomyces hygroscopicus SANK 63584 (talletusnumero FERM BP-958). 15 20 25 30 35 II ^ Patentkrav 25 81 834