FI80712C - Foerfarande foer framstaellning av rent toxin a ur clostridium difficile och en enligt foerfarandet framstaelld produkt. - Google Patents

Description

1 80712

Menetelmä puhtaan toksiini A:n valmistamiseksi Clostridium difficilestä ja menetelmällä valmistettu tuote Tämä keksintö koskee menetelmää puhtaan toksiini 5 A:n valmistamiseksi Clostridium difficilestä sekä menetelmällä valmistettua C. difficilen puhdasta toksiini A:ta.

Anaerobinen organismi Clostridium difficile (C. difficile) on yhdistetty antibioottiin liittyvään valekal-voiseen paksunsuolentulehdukseen ja tuloksena siitä on 10 kehitetty kokeita, joilla varmistetaan C. difficile-anti-geenin läsnäolo ihmisen ulostenäytteissä.

Eräs sellainen koe, joka käsittää ihmisen uloste-viljelmän, vaatii erityiset laitteet ja pitkän ajan. Tämä koe ilmaisee myös ne C. difficile-lajit, jotka eivät tuota 15 toksiineja, ja antaa näin vääriä positiivisia tuloksia.

Toinen koe käsittää päinvastoin toimivan immuno-elektroforeesin, tämän kokeen ollessa kuitenkin nykyisin käytettynä riittämättömän herkkä havaitsemaan toksineja, ja se antaa paljon vääriä positiivisia tuloksia.

20 Vielä eräs koe käsittää entsyymi-immuunikokeen; sellaisen kokeen ollessa nykyisin kuitenkin riittämätön erottamaan myrkyllisten ja myrkyttömien lajien välillä ja tästä syystä koe voi antaa väärään johtavia tuloksia.

Tässä on nyt tutkittu C. difficilen toksiinien vas-25 ta-aineita, C. difficilen toksiineja ja myrkyllisen C. difficilen tutkimista.

Tarjotaan käyttöön monospesifinen vasta-aine C. difficilen toksiinille A, ja sellainen monospesifinen vasta-aine ylläpidettynä kiinteällä alustalla.

30 Tarjotaan käyttöön myös monospesifinen vasta-aine C. difficilen toksiinille B, ja sellainen monospesifinen vasta-aine ylläpidettynä kiinteällä alustalla.

Tämän keksinnön mukaan tarjotaan käyttöön C. difficilen puhdas toksiini A, joka voidaan liittää kiinteälle 35 alustalle.

2 80712

Tarjotaan edelleen käyttöön koe C. difficilen toksiinille A, joka käyttää monospesifistä vasta-ainetta toksiinille A.

Lisäksi tarjotaan käyttöön tutkimusmenetelmä myr-5 kyllistä C. difficileä varten.

Termi "monospesifinen vasta-aine toksiinille A" kuten sitä tässä käytetään, tarkoittaa vasta-ainetta, jolla ei ole mitään määrättyjä paikkoja muille C. difficile-antigeeneille kuin toksiinille A.

10 Termi "monospesifinen vasta-aine toksiinille B" kuten sitä tässä käytetään, merkitsee vasta-ainetta, jolla ei ole mitään määrättyjä paikkoja muille C. difficile-antigeeneille kuin toksiinille B.

Termi "monospesifinen vasta-aine" kuten sitä on 15 tässä käytetty, sisältää sellaisen vasta-aineen monoklo-naalisessa muodossa.

On ymmärrettävä, että monospesifisiä vasta-aineita toksiinille A ja/tai toksiinille B voidaan valmistaa muista organismeista kuin C. difficilestä niin kauan, kuin 20 vasta-aineella ei ole määrättyä paikkaa muille C. diffici-le-antigeeneille.

C. difficile-vasta-aine tai vasta-aine C. diffici-lelle merkitsee vasta-ainetta, joka ei ole monospesifinen ja joka sen vuoksi käsittää vasta-aineseoksen, joka sisäl-25 tää vasta-aineet C. difficilen toksiineille (vasta-aine toksiinille A ja vasta-aine toksiinille B) ja vasta-aineet C. difficilen ei-toksiineille.

Vasta-aine myrkylliselle C. difficilelle tai vasta-aine erityisesti C. difficilelle tarkoittaa vasta-ainetta, 30 jolla ei ole määrättyjä paikkoja C. difficilen muille antigeeneille kuin toksiinille A ja toksiinille B (vasta-aineseos erityisesti vain toksiinille A ja toksiinille B).

Toksiini A on C. difficilen toksiini, jota yleensä pidetään suoliston limakalvomyrkkynä. Toksiinilla A on 35 alkuperäinen molekyylipaino välillä 550 000 ja 600 000 ja 3 80712 isoelektrinen piste 5,5; se ei sisällä havaittavaa prote-aasivaikutusta. Se on inertti pH:ssa 2,0 ja pysyvä pH:ssa 10,0. Toksiini A eluoidaan DEAE:stä puskurilla, joka sisältää 0,16 M NaCl.

5 Toksiini B on C. difficilen toksiini, jota yleensä pidetään C. difficilen solumyrkkynä. Toksiini B:llä on alkuperäinen molekyylipaino välillä 380 000 ja 470 000 ja isoelektrinen piste 3,8; se ei sisällä havaittavaa fosforia, mutta sisältää hyvin pieniä määriä hiilihydraattia 10 (joka voi olla epäpuhtautta), eikä se osoita havaittavaa proteaasivaikutusta. Toksiini B on inertti pH-arvoissa alle 2,0 ja yli 10,0, ja se eluoidaan DEAE-pylväästä suolalla, jonka konsentraatio on 0,4 M.

On ymmärrettävissä kuitenkin, että vaikka toksiinia 15 A pidetään suoliston limakalvomyrkkynä, sellaisella toksiinilla A on myös solumyrkkyominaisuutta.

Erään tämän keksinnön näkökannan mukaan toksiini A, joka on osittain puhdistettu erottamalla toksiinista B, ja jossa vielä on joitakin ei-myrkyllisiä proteiineja, puh-20 distetaan edelleen puhtaan toksiinin A saamiseksi.

Keksinnön mukaiselle menetelmälle on tunnusomaista, että C. difficilen osittain puhdistetun toksiini A:n vesipitoisen liuoksen pH ja molaarisuus säädetään, joka liuos on oleellisesti vapaa toksiini B:stä ja joka sisältää jon-25 kin verran myrkyttömiä proteiineja, jolloin toksiini A saostuu ilman, että myrkyttömät proteiinit saostuvat ja ilman, että toksiini A denaturoituu, mainitun pH:n ollessa alle 6,0 ja mainitun molaarisuuden ollessa alle 0,1 M; ja saostunut toksiini A otetaan talteen puhtaana proteiinina. 30 Kun vesiliuoksen pH säädetään arvoon alle 6,0, ja kun vesiliuoksen molaarisuus säädetään alemmaksi kuin 0,1 M, toksiini A saostuu ilman muiden proteiinien saostumista tai toksiinin denaturoimista. Yleensä pH on ainakin 5,0, edullisen pH:n ollessa 5,3 - 5,7, parhaan tuloksen ollessa 35 saavutettavissa pH:ssa 5,5. Liuoksen molaarisuus on yleen- 4 80712 sä ainakin 0,001 M, parhaan tuloksen ollessa saavutettavissa 0,1 M:ssä.

Molaarisuus ja pH voidaan säätää käyttämällä sopivaa suolapuskuria, esim. natriumasetaattipuskuria. Molaa-5 risuuden säätö voidaan mukavasti suorittaa dialyysillä, vaikka muutkin menetelmät ovat sopivia.

Saostunut puhdas toksiini A saadaan vesiliuoksesta ja se voidaan liuottaa veteen puskuroidussa pH:ssa noin 7,5.

10 Osittain puhdistettu toksiini A, joka puhdistetaan keksinnön mukaan puhtaan toksiinin A saamiseksi, voidaan saada alalla yleensä tunnetuilla menetelmillä. Esimerkiksi sakan yllä oleva neste myrkyllisen C. difficilen soluviljelmästä konsentroidaan ultrasuodatuskalvolla, joka pidät-15 tää vain suuret molekyylit (mp. yli 100 000) ja pidättynyt aine käsitellään kromatografiapylväässä. Pylväs (DEAE) eluoidaan sitten natriumkloridigradienteilla (ensimmäinen gradientti on 0,01 - 0,25 M NaCl yhdessä 0,3 M:n NaCl-pe-sun kanssa ja toinen gradientti on 0,3 - 0,6 M NaCl), en-20 simmäisen gradientin eluoidessa toksiinin A ja toisen gradientin toksiinin B.

Termi "puhdas toksiini A" kuten sitä on tässä käytetty, merkitsee sitä, että toksiinin A valmistus on vapaa epäpuhtauksista (vain toksiini A on läsnä) kun tutkitaan 25 alalla tunnetuilla erittäin tarkoilla analyysimenetelmillä.

Termi "osittain puhdistettu" tässä käytettynä merkitsee, että joitakin epäpuhtauksia, mutta ei kaikkia, on poistettu.

30 Puhdas toksiini A, kun se on valmistettu edellä kuvatuilla menetelmillä, on puhdas seuraavilla kritee-rioilla: yksittäinen vyöhyke akryyliamidigeelielektroforee-silla valmistettuna 100 pg:n kanssa proteiinia geelipyl-35 västä kohti (Davis-, SDS- ja gradienttigeelit); 5 80712 yksittäinen immunopresipitiinikaari ristikkäisillä immunoelektroforeesilevyillä vastaseerumien kanssa, jotka on tehty täydelliseen C. difficile-antigeenien seokseen; ja 5 puhdas toksiini A eläimeen injektoituna saa aikaan monospesifisen vasta-aineen valmistumisen toksiinille A.

Monospesifinen vasta-aine C. difficilen toksiinille A ja monospesifinen vasta-aine C. difficilen toksiinille B voidaan valmistaa useilla erilaisilla menetelmillä.

10 Erään menetelmän mukaan C. difficile-viljelmän, joka oli valmistettu tunnetulla viljelymenetelmällä, sakan yllä olevat nesteet keitetään kaikkien kuumaa kestämättömien proteiiniantigeenien (myrkyllinen ja myrkytön antigeeni) tuhoamiseksi ja näin saadaan aine, joka sisältää 15 vain C. difficilen kuumuutta kestäviä antigeenejä. Nämä antigeenit tuetaan sitten ensimmäiseen syanogeenibromidil-la tuettuun aktivoituun pylvääseen.

Osittain puhdistettu toksiini A ja osittain puhdistettu toksiini B, joista kumpikin on saatu DEAE-kromato-20 grafiapylväästä saadusta eluointinesteestä kuten edellä on kuvattu, liitetään toiseen ja kolmanteen syanogeenibromi-dilla aktivoituun Sepharose&-pylvääseen, tässä järjestyksessä.

Vasta-aineet karkeille C. difficile-antigeenitok-25 siineille (sellainen toksiini sisältää sekä toksiinia A että toksiinia B, kuten myös monia muita antigeenejä, jotka on valmistettu bakteerien avulla) valmistetaan sopivassa eläimessä, esim. vuohessa, ja syntynyt vasta-aine muodostuu C. difficile-antigeenin vasta-aineseoksesta (sel-30 lainen vasta-aineseos sisältää vasta-aineita toksiinille A ja toksiinille B sekä vasta-aineita myrkyttömille antigeeneille mukaan luettuina vasta-aineet kuumuutta kestäville antigeeneille). Myrkyttömät vasta-aineet (paitsi vasta-aineet myrkyttömille kuumuutta kestäville antigee-35 neille) poistetaan vasta-aineseoksesta saattamalla koske- 6 80712 tukseen myrkyttömän C. difficile-lajin kokonaisten solujen kanssa, jolloin ne siinä yhteydessä sitovat muut vasta-aineet ei-myrkyllisiin aineisiin, paitsi vasta-aineet myrkyttömille kuumuutta kestäville antigeeneille.

5 Sen jälkeen vasta-aineseos (joka nyt sisältää vas ta-aineet toksiineille ja vasta-aineet myrkyttömille kuumuutta kestäville antigeeneille) pannaan sitten ensimmäiseen pylvääseen, jossa kuumuutta kestäviä C. difficile-antigeenejä säilytetään, jolloin sokerivasta-aineet kuulo muutta kestäville antigeeneille sitoutuvat.

Seos, jossa ei ole vasta-ainetta kuumuutta kestäviä antigeenejä vastaan ja joka sisältää vasta-aineet toksiineille A ja B, jaetaan sitten kahteen osaan; ja yksi osa pannaan toiseen pylvääseen, jossa pidetään puhdasta tok-15 siinia A, ja toinen osa pannaan kolmanteen pylvääseen, jossa osittain puhdistettua toksiinia B pidetään, jolloin toisessa pylväässä vasta-aine toksiinille A sitoutuu selektiivisesti ylläpidettyyn toksiiniin A ja kolmannessa pylväässä vasta-aine toksiinille B sitoutuu selektiivises-20 ti ylläpidettyyn toksiiniin B.

Vasta-aineet toksiinille A ja vasta-aineet toksiinille B eluoidaan sen jälkeen toisesta ja kolmannesta pylväästä, tässä järjestyksessä, esim. käyttämällä kaliumtio-syanaattia tuottamaan monospesifinen vasta-aine toksiinil-25 le A ja monospesifinen vasta-aine toksiinille B, tässä j ärjestyksessä.

Joissakin tapauksissa, kuten tässä jäljempänä on kuvattu, vasta-aineen toksiinille A ja vasta-aineen toksiinille B muodostama seos (sen jälkeen kun myrkyttömät 30 antigeenit on poistettu) voidaan käyttää erottamatta mono-spesifiseen vasta-aineeseen jokaiselle toksiineista, esim. tutkittaessa myrkyllistä C. difficileä.

Vaihtoehtoisesti voidaan monospesifinen vasta-aine toksiinille A valmistaa panemalla karkea C. difficile-vas-35 ta-aine pylvääseen, joka on tuettu immobilisoidulla puh- 7 80712 taalla toksiinilla A. Myrkyttömät A-vasta-aineet poistetaan pylväästä runsaasti pesemällä ja jäljellä olevat vasta-aineet, jotka ovat liittyneet toksiiniin A, eluoidaan kaliumtiosyanaatilla.

5 Vaihtoehtoisesti monospesifinen vasta-aine toksii nille A voidaan valmistaa puhdistetusta toksiinista A, joka on valmistettu edellä kuvatulla tavalla, injektoimalla toksiini A (sekoitettuna pieneen määrään formaldehydiä myrkyllisyyden alentamiseksi tuhoamatta antigeenisyyttä 10 tai neutraloituna vasta-aineen kanssa) sopivaan eläimeen, esim. vuoheen. Monospesifinen vasta-aine toksiinille A saadaan sitten edellisessä kappaleessa kuvatulla menetelmällä.

Monospesifisiä vasta-aineita ja toksiineja voidaan 15 ylläpitää kiinteällä alustalla käytettäväksi C. difficilen tutkimiseen. Vaihtoehtoisesti sellaisia vasta-aineita ja toksiineja voidaan käyttää sellaisessa tutkimuksessa kan-nakkeettomassa muodossa.

Käytettäessä kiinteätä alustaa, kiinteä alusta voi 20 olla mikä tahansa monista kiinteistä aineista ja sitä voidaan käyttää missä tahansa muodossa monista mahdollisista, esim. levyt, tarjottimet, hiukkaset, putket, laatat jne.

Edustavina esimerkkeinä sopivista alustoista voidaan mainita synteettiset polymeerialustat, kuten poly-25 styreeni, polypropyleeni, substituoitu polystyreeni (esim. aminoitu tai karboksyloitu polystyreeni), polyakryyliami-dit, polyamidit, polyvinyylikloridi jne.; lasihelmet; aga-roosi jne. Alustat voivat sisältää reaktiivisia ryhmiä, esim. karboksyyliryhmiä, aminoryhmiä jne. antamaan mahdol-30 lisuus suoraan sitoutumiseen alustaan.

Mainitut vasta-aineet ja toksiinit voidaan tukea kiinteälle alustalle monilla eri tavoilla, esimerkiksi adsorptiolla, kovalenttisella kytkennällä, aktivoimalla sopiva alusta proteiinilla A jne.

β 80712

Edustavina esimerkkeinä sopivista kytkentäaineista voidaan mainita dialdehydit, esimerkiksi glutaarialdehy-di, sukkiinialdehydi, malonialdehydi jne; tyydyttämätön aldehydi, esim. akroleiini, metakroleiini, krotonaldehydi 5 jne.; karbodi-imidit; di-isosyanaatit; dimetyyliadipimaat-ti; syaaniuriinikloridi jne. Sopivan kytkentäaineen valinnan pitäisi olla selvää alaan perehtyneille tässä olevista tiedoista.

Samalla tavalla antigeeni voidaan tukea aktivoimalle) la sopiva alusta, esimerkiksi syanogeenibromidilla aktivoitu alusta.

Tämän tutkimuksen vasta-aineita ja toksiineja voidaan käyttää tutkittaessa joko toksiinia A tai toksiinia B C. difficilestä tai myrkyllistä C. difficileä (sekä tok-15 siinia A että toksiinia B).

Joissakin sellaisista kokeista käytetään yhtä tai useampaa ainetta "leimatussa" tai "merkityssä" muodossa, ja sellaiset leimat tai merkit ovat sitä tyyppiä, joka on alalla tunnettua kokeissa käytettäviksi. Niinpä esimerkik-20 si leima tai merkki voi olla radioaktiivinen aine, kuten radioaktiivinen jodi, radioaktiivinen koboltti, tritium jne.; entsyymi; fluoresoiva aine; kerniluminesenssiaine jne.

Leimat voidaan lisätä eri aineisiin menetelmillä, 25 joita yleensä käytetään alalla. Samalla tavalla leima tai merkki voidaan havaita menetelmillä, jotka ovat alalla tunnettuja, esimerkiksi radioaktiivisten leimojen laskurit, entsyymien kolorimetrinen määritys jne.

Edellä mainittuja vasta-aineita ja toksiineja voi-. . 30 daan käyttää tuetussa ja/tai tukemattomassa muodossa C.

difficilen tutkimiseen.

Erään suoritusmuodon mukaan tarjotaan käyttöön koe C. difficilen toksiinille A käyttämällä monospesifistä vasta-ainetta toksiinille A.

9 80712 Tämän suoritusmuodon erään näkökannan mukaan vasta-aine C. difficilelle tuetaan kiinteälle alustalle, esimerkiksi mikrotiitterilevylle. Tuettu C. difficile-vasta-aine saatetaan sitten kosketukseen analysoitavan näytteen (ana-5 lyytti) kanssa, kuten potilaan ulosteen laimennuksen kanssa, ja tuloksena sellaisesta kosketuksesta mikä tahansa analyytissä läsnäoleva toksiini A, kuten myös muut C. dif-ficilen antigeenit, sitoutuvat tuettuun C. difficile-vas-ta-aineeseen. Sen jälkeen sitoutunut analyyttierä saate-10 taan kosketukseen monospesifisen vasta-aineen kanssa C. difficilen toksiinille A (kasvatettu erilaisessa eläimessä kuin se, jossa C. difficile-vasta-aine kasvatettiin), ja sellainen monospesifinen vasta-aine sitoutuu vain mihin tahansa analyyttierässä läsnä olevaan toksiiniin A.

15 Tämä monospesifinen vasta-aine voi itse olla lei mattu entsyymillä, fluoresenssiaineella tai radioaktiivisella aineella, kuten edellä on kuvattu, ja toksiinin A läsnäolo voidaan määrittää havaitsemalla tämän leiman läsnäolo. Vaihtoehtoisesti toksiiniin A sitoutunut monospesi-20 finen vasta-aine voidaan havaita käyttämällä leimattua vasta-ainetta, joka on spesifinen sen eläimen vasta-aineelle, jossa monospesifinen vasta-aine kasvatettiin; tämä sitoutuu monospesifiseen vasta-aineeseen, joka on liittynyt toksiiniin A. Tätä menetelmää pidetään alalla kaksin-25 kertaisena vasta-aineen kerrosmuotona ELISA-kokeessa.

Toksiinin A läsnäolo analyytissä voidaan määrittää sen vuorovaikutuksessa monospesifisen toksiinin A vasta-aineen kanssa kokeessa.

Edellä esitettyä menetelmää voidaan myös käyttää 30 toksiinin B määrittämiseen analyytissä käyttämällä mono-spesifistä vasta-ainetta toksiinille B toksiinille A mono-spesifisen vasta-aineen sijasta.

Toisessa C. difficilen toksiinin A kokeessa monospesifinen vasta-aine toksiinille A voidaan tukea kiin-35 teälle alustalle, esimerkiksi mikrotiitterilevylle, ja 10 80712 tuettu monospesifinen vasta-aine toksiinille A saatetaan kosketukseen analyytin kanssa, jonka epäillään sisältävän toksiinia A, jolloin näytteessä läsnäoleva toksiini A (ja vain toksiini A) sitoutuu tuettuun monospesifiseen vasta-5 aineeseen. Sitoutuneen toksiinin A läsnälo ja/tai määrä voidaan sitten määrittää saattamalla kosketukseen sitoutunut toksiini A C. difficile-vasta-aineeseen leimatussa muodossa, jolloin sellainen leimattu vasta-aine sitoutuu sitoutuneeseen toksiiniin A. Analyytissä läsnä olevan tok-10 siinin A läsnäolo ja/tai määrä määritetään sitten määrittämällä sitoutuneen leimatun vasta-aineen läsnäolo ja/tai määrä.

Edellä esitettyä menetelmää voidaan myös käyttää kokeessa toksiinille B korvaamalla monospesifinen vasta-15 aine toksiinille A monospesifisellä vasta-aineella toksiinille B.

Vielä erään toksiinille A olevan kokeen mukaan ana-lyytti, joka sisältää tai jonka epäillään sisältävän toksiinia A, tuetaan kiinteälle alustalle, kuten mikrotiit-20 terilevylle niin, että ainakin toksiini A analyytissä on tuettu kiinteälle alustalle. Tämän toksiinin läsnäolo havaitaan sitten monospesifisellä vasta-aineella toksiinille A. Tuettu toksiini A sitoo selektiivisesti vain monospesi-fisen vasta-aineen toksiinille A. Niinpä monospesifinen 25 vasta-aine tuetaan kiinteälle alustalle analyytin tuetun toksiinin A avulla. Tällä vasta-aineella voi olla liittyneenä leima, kuten entsyymi, joka sallii sen havaitsemisen, tai voidaan käyttää leimattua vasta-ainetta, joka reagoi toksiiniin sitoutuneeseen vasta-aineeseen (kerros-30 ELISA-menetelmä). Sitoutuneen leimatun vasta-aineen läsnäolo ja/tai määrä on analyytissä olevan toksiinin A läsnäolon tai määrän merkki.

Vielä erään analyysin mukaan toksiini A voidaan havaita agglutinaatiomenetelmällä. Sellaisen menetelmän mu-35 kaan kiinteät hiukkaset, jotka ovat herkistyneet toksii- 11 80712 nille A monospesifisten vasta-aineiden kanssa, saatetaan kosketukseen analyytin kanssa, joka sisältää tai jonka epäillään sisältävän toksiinia A, ja aiheuttavat toksiinin A läsnäollessa sellaisten hiukkasten agglutinaation.

5 Agglutinaatioanalyysi on myös sopiva toksiinin B

havaitsemiseen käyttäen toksiinille B monospesifisiä vasta-aineita toksiinille A monospesifisten vasta-aineiden sijasta.

Vielä erään toisen analyysin mukaan toksiini A voi-10 daan määrittää hidastamalla agglutinaatiomenetelmää saattamalla puhtaalle toksiinille A herkistyneet kiinteät hiukkaset (tai karkealle toksiinia A sisältävälle C. dif-ficilen toksiinille herkistyneet) kosketukseen sekä analyytin kanssa, joka sisältää tai jonka epäillään sisältä-15 vän toksiinia A, että C. difficilen monospesifisten vasta-aineiden kanssa, jolloin toksiinin A ollessa läsnä analyy-tissä monospesifisillä vasta-aineilla tapahtuva herkistyneiden hiukkasten agglutinaatio hidastuu.

Sellaista menetelmää voidaan myös käyttää määritet-20 täessä toksiinia B herkistämällä hiukkaset karkealle toksiinille ja käyttämällä monospesifistä vasta-ainetta toksiinille B.

Lisämuunnoksena analyysiä voidaan käyttää määrittämään myrkyllinen C. difficile (toksiini A ja/tai toksii-25 ni B) käyttämällä vasta-ainetta myrkylliselle C. diffici-lelle (seos, jossa on monospesifinen vasta-aine toksiinille A ja monospesifinen vasta-aine toksiinille B, ja jossa ei ole määrättyjä paikkoja myrkyttömille antigeeneille). Käyttämällä sellaisten monospesifisten vasta-aineiden 30 seosta on mahdollista määrittää joko toksiinin A tai toksiinin B läsnäolo näytteessä.

Tätä keksintöä kuvataan edelleen seuraavien esimerkkien avulla.

12 8071 2

Esimerkki 1 Tämä esimerkki kohdistuu toksiinille A monospesifi-sen vasta-aineen valmistukseen ja toksiinille B monospesi-fisen vasta-aineen valmistukseen.

5 Bakteerit ja kasvuolosuhteet 2 litran aivo-sydän infuusio-dialyysiputkellisiin pulloihin istutettiin 0,1 ml aktiivisesti kasvavaa viljelmää C. difficile VPI-lajia 11186 (myrkytön) ja C. difficile VPI-lajia 10463 (myrkyllinen), jotka ovat saatavissa 10 Virginia Polytechnic Institute-nimisestä laitoksesta, ja pullot inkuboitiin 37°C:ssa 3 päivää. Solut saatiin dia-lyysipussin sisältä sentrifugoimalla sisältö 9 000 x g; 15 minuuttia).

Keitetyn seolunesteen valmistus (BCW) - Sepharose^, 15 ja toksiini A (Tox A) - Sepharose**-' ja toksiini B

(Tox B) - Sepharos^*-1

Lajin 10463 pakatut solut (noin 15 ml saatuna 12 pullosta) pestiin 3 kertaa (30 ml pesua kohti) 0,1 M NaHC03 - 0,5 M NaCl-liuoksella (pH 8). Solujen pesunesteet •: 20 yhdistettiin ja seosta kuumennettiin 100°C:ssa 15 minuut tia. Saostunut aine poistettiin sentrifugoimalla (12 000 x g; 30 minuuttia) ja neste sakan yltä (noin 34 mg prote--·- iinia 90 ml:ssa) lisättiin 60 ml:aan Sepharos^ 4B:tä

(Pharmacia, Uppsala, Ruotsi), joka oli aktivoitu 18 g:11a 25 CNBr. Suspensiota sekoitettiin hiukan 4°C:ssa yön yli ja liittymätön aine poistettiin pesemällä geeli yhden pylvään tilavuudella 0,1 M NaHC03 - 0,5 M NaCl-liuosta. Pesunesteen proteiinianalyysi osoitti, että geelivalmiste sisälsi noin 0,3 mg proteiinia ml:ssa geeliä. Sepharosd*-geelissä 30 jäljellä olevat aktiiviset ryhmät pysäytettiin lisäämällä yksi pylvään tilavuus 1 M etanoliamiinia (pH 8) ja sekoittamalla geeliä 4°C:ssa yön yli. Geeli, merkitty BCW-Sepha-rose, pestiin 4 kertaa vaihtelevilla tilavuuksilla (2 pylvään tilavuutta pesua kohti) 0,1 M natriumasetaatti - 0,5 35 M natriumkloridi-liuosta (pH 4) ja 0,1 M NaHC03 - 0,5 M

13 8071 2

NaCl-liuosta (pH 8).

Osittain puhdistettu toksiini A ja toksiini B valmistettiin ioninvaihtokromatografialla DEAE-Sepharose® CL-6B:llä (Pharmacia Fine Chemicals), kuten on kuvattu 5 esimerkissä 2, ja jokaista valmistetta dialysoitiin yön yli 4°C:ssa 0,1 M NaHC03 - 0,5 M NaCl-liuosta vastaan. Toksiini A (noin 3,3 mg proteiinia 20 ml:ssa) ja toksiini B (noin 1,1 mg proteiinia 20 ml:ssa) liitettiin molemmat kuten on kuvattu BCW-Sepharoselle, 20 ml:aan Sepharose^ 10 4B:tä, joka oli aktivoitu 7 g:lla CNBr. Proteiinianalyysit pesunesteistä osoittivat, että Tox A-Sepharose£ ja Tox B-Sepharose® sisälsivät 170 pg proteiinia ja 54 pg proteiinia ml:ssa geeliä, tässä järjestyksessä.

Toksiinien A ja B vastaisten monospesifisten anti-15 seerumien puhdistus

Valmistettiin vuohen antiseerumi kuten aikaisemmin kuvattiin, käyttäen jäähdytettyä formaldehydiä (M. Erlich, R. L. Van Tassell, J. M. Libby ja T. D. Wilkins, 1980, Production of Clostridium difficile antitoxin, Infect. 20 Immun. 28, ss. 1041 - 1043) karkeata toksiineja A ja B sisältävää C. difficile-toksiinivalmistetta vastaan. Anti-seerumia (5 ml) lisättiin suspensioon, jossa oli lajin 11186 soluja (1,5 ml pakattuja soluja 3 ml:ssa 0,85-%:ista NaCl) ja seos homogenisoitiin varovasti Potter Elvehjam-25 kudosjauhimella ja pyöritettiin sitten 2 tuntia huoneen lämmössä. Solut poistettiin sitten sentrifugoinnilla (12 000 x g; 30 minuuttia) ja sakan yllä oleva neste kuljetettiin 0,45 pm:n kalvon läpi ja konsentroitiin lX:een Minicon-B15-konsentroijalla (Amicon Corp., Lexington, 30 Mass.). Lajin 11186 solu-adsorboitu antiseerumi (4,1 ml) pantiin BCW-Sepharose-pylvääseen (1,5 x 31,4 cm) ja adsor-boitumaton aine eluoitiin huoneen lämmössä 2 pylvään tilavuudella 0,1 M NaHCO, - 0,5 M NaCl-liuosta (pH 8) virtausnopeudella 40 ml/min. Eluaatti konsentroitiin lX:een ult-35 rasuodatuksella solusekoituslaitteessa, jossa oli PM 10- 14 8071 2 kalvo (Amicon Corp.) BCW-Sepharose-eluaatti (4,1 ml) jaettiin 2 erään, jotka pantiin Tox A-Sepharosei® - ja Tox B-Sepharose^-pylväisiin (1 x 25 cm). Adsorboitumaton aine eluoitiin huoneen lämmössä jokaisesta pylväästä 2 pylvään 5 tilavuudella 0,1 M NaHC03 - 0,5 M NaCl-liuosta (pH 8) virtausnopeudella 40 ml/min. Eluaatit konsentroitiin lX:een ultrasuodatuksella.

Tox A-Sepharoseen<& ja Tox B-Sepharoseen^1 sitoutuneiden vasta-aineiden eluointi 10 Kun adsorboitumaton aine oli eluoitu Tox A-Sepha-

rosesta^ ja Tox B-Sepharosesta^, pylväät pestiin 0,1 M NaHC03 - 0,5 M NaCl-liuoksella (pH 8), kunnes ei ollut enää mitään havaittavaa adsorbenssia 280 nm:ssä. Geeleihin sitoutuneet vasta-aineet eluoitiin käyttämällä 5 ml 3,5 M 15 KSCN (pH 6,8) jokaiseen pylvääseen ja pesemällä 0,1 M

NaHC03 - 0,5 M NaCl-liuoksella. Noin 2 pylvään tilavuutta kerättiin jokaisesta pylväästä. Eluaatit dialysoitiin 4 litraa vastaan 0,1 M boraattipuskuroitua suolaliuosta (pH 5,8) 4°C:ssa yön yli ja konsentroitiin lX:een ultrasuoda-20 tuksella.

Tox A-Sepharose^-pylväästä eluoitu vasta-aine on monospesifinen vasta-aine C. difficilen toksiinille A ja Tox B-SepharosefS»-pylväästä eluoitu vasta-aine on monospesifinen vasta-aine C. difficilen toksiinille B.

25 IgG-fraktion puhdistus

Tox A-Sepharos^- ja Tox B-Sepharos^-pylväästä eluoidut vasta-aineet puhdistettiin kromatografiällä DEAE Affi-Gel Blue:Hai®' (Bio-Rad Laboratories, Rockville Centre, NY) valmistajan suosittelemalla kanin IgG:n puhdistuk-30 seen sopivalla tavalla.

Antiseeruminäytteet (2 ml) pantiin DEAE Affi-Gel Blue&-pylvääseen (1 x 31,8 cm) ja eluoitiin virtausnopeudella 20 ml/tunti. Fraktiot (2 ml), jotka sisälsivät puhdistettua IgG:tä, yhdistettiin ja konsentroitiin lX:een 35 ultrasuodatuksella.

is 8071 2

Esimerkki 2 Tämä esimerkki kohdistuu C. difficilen puhtaaseen toksiiniin A.

Bakteerikantaa, Clostridium difficile-kantaa 10463, 5 kasvatettiin 2 litran aivo-sydän infuusio-(BHI)-dialyysi-pulloissa 72 tuntia 37°C:ssa. Kun oli sentrifugoitu 8 000 x g:llä 10 minuuttia ja suodatettu 0,45 pm:n kalvosuodat-timen läpi (Millipore Corp., Bedford, MA), viljelmän neste (noin 750 ml) konsentroitiin 50 ml:ksi ultrasuodatuksella 10 4°C:ssa käyttäen XM-100-kalvosuodatinta (Amicon Corp., Lexington, MA) kanavatyyppisellä konsentroijalla. Pidättynyt aine pestiin 1 500 ml:11a 50 mM Tris-HCl-puskuria (pH

7,5) (4°C) ja konsentroitiin lopulliseen tilavuuteen 40-50 ml. Tämä poisti monia pieniä molekyylipainon epäpuh-15 tauksia. Konsentroitu neste pantiin 2,5 x 10 cm:n DEAE-Sepharos^t CL-6B-pylvääseen, joka oli tasapainotettu 50 mM Tris-HCl:llä (pH 7,5). Näytteen panon jälkeen pylväs pestiin 200 ml:11a 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), joka sisälsi 0,05 M NaCl. Näyte eluoitiin ensin 300 ml:n suoralla NaCl-20 gradientilla 50 mM Tris-HCl-puskurissa (0,05 - 0,25 M NaCl) ja sen jälkeen 150 ml:11a 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), joka sisälsi 0,3 M NaCl. Toinen 300 ml:n suora gradientti (0,3 - 0,6 M NaCl) samassa puskurissa seurasi 0,3 M NaCl-pesua. Pylväiden virtausnopeus oli 55 - 60 ml/tunti (pai-25 novoima) 4°C:ssa. Fraktiot (4,2 ml) kerättiin ja analysoitiin solumyrkkyjen suhteen käyttäen CHO-KI-soluja.

Fraktiot, jotka sisälsivät korkeimmat solumyrkky-tiitterit, yhdistettiin, suodatussteriloitiin ja säilytettiin 4°C:ssa. Toksiinit, jotka eluoituivat ensimmäisessä 30 ja toisessa NaCl-gradientissa, merkittiin toksiineiksi A ja B, tässä järjestyksessä, ja ne ovat osittain puhdistettua toksiinia A ja B, tässä järjestyksessä.

5 - 10 ml toksiinifraktioita ensimmäisestä DEAE-gradientista (toksiini A) dialysoitiin yhtä litraa vastaan 16 80712 0,01 M natriumasetaattipuskuria (pH 5,5) 4°C:ssa 18-24 tuntia.

Dialysoitu aine sentrifugoitiin sakan saamiseksi 169 x g:llä 10 minuuttia ja pestiin sitten 5 ml:11a samaa 5 asetaattipuskuria ja sentrifugoitiin jälleen. Sakka liuotettiin 5-10 ml:aan 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), joka sisälsi 0,05 M NaCl, ja puhtaan toksiinin A liuos suodatusste-riloitiin ja säilytettiin 4°C:ssa.

Esimerkki 3 10 Seuraavia puskureita käytetään analysoitaessa tok siineja A ja B.

Karbonaattipuskuri (pinnoitepuskuri) 1,59 g Na2 C03 2,93 g NaHC03 15 0,20 g NAN3 täytä litraksi dH20:11a; pH 9,6; säilytä huoneen lämmössä (käytä 2 viikon kuluessa). Fosfaattipuskuroitu suolaliuos Tweenfc 20 (PBS-T) 8,0 g NaCl 20 0,2 g KH2P04 ; 2,9 g Na2HOP4.12 H20 (2,2 g Na2HOP4.7 H20) 0,2 g KC1 0,5 ml Tweer^ 20 (polyoksietyleenisorbitaanimono-lauraatti) 25 0,2 g NaN3 täytä litraksi dH20:11a; pH 7,4. Dietanoliamiinipuskuri (emäksiselle fosfataasisubstraatil-le) 97 ml dietanoliamiinia 30 800 ml dH20 0,2 g NaN3 100 mg MgCl2 .6 H20 titraa pH-arvoon 9,8 1 M HCl:lla ja täytä tilavuus litraksi dH20:11a; 35 säilytä tummassa pullossa huoneen lämmössä; 17 8071 2 substraattiliuokseksi lisää 1 mg substraattia ml:aan puskuria.

Clostridium difficile-toksiinien A ja B analyysi: 5 (1) Lisää 200 μΐ 1/10 000 laimennusta (karbonaattipus- kurissa; pH 9,6) kanin antiseerumia (vasta-aine C. diffi-cilelle) jokaiseen koloon Dynatech Immulon 2-tyyppisellä mikrotiitterilevyllä. Inkuboi 4°C:ssa yön yli.

(2) Tyhjennä levy ja lisää 200 μΐ PBS-T, joka sisältää 10 0,5 % naudan seerumin albumiinia jokaiseen koloon. Inkuboi levy 37°C:ssa 30 minuuttia.

(3) Tyhjennä levy ja lisää 200 μΐ PBS-T jokaiseen koloon. Inkuboi huoneen lämmössä 5 minuuttia.

(4) Tyhjennä levy ja lisää 200 μΐ näytteen laimennusta 15 tai myrkyn laimennusta (1:2) PBS-T:ssä koloihin. Inkuboi levy joko 37°C:ssa 1 tunti tai huoneen lämpötilassa yön yli.

(5) Tyhjennä levy ja pese jokainen kolo 3 kertaa PBS-T:llä.

20 (6) Lisää 200 μΐ 1/1 000 laimennusta PBS-T:ssä monospe- sifistä vasta-ainetta joko toksiinille A tai toksiinille B jokaiseen koloon. Inkuboi levy 37°C:ssa 1 tunti.

(7) Tyhjennä levy ja pese jokainen kolo 3 kertaa PBS-T:llä.

25 (8) Lisää 200 μΐ 1/800 laimennusta (PBS-T:ssä) kanin anti-vuohen-IgG:tä liitettynä emäksiseen fosfataasiin jokaiseen koloon. Inkuboi levy 37°C:ssa 1 tunti.

(9) Tyhjennä levy ja pese jokainen kolo 3 kertaa PBS-T:llä.

30 (10) Lisää 200 μΐ p-nitrofenyylifosfaattia (1 mg/ml di- etanoliamiinipuskurissa) jokaiseen koloon. Inkuboi levy huoneen lämmössä 1 tunti.

(11) Lisää 20 μΐ 5 N NaOH jokaiseen koloon reaktion lopettamiseksi .

is 8071 2 (12) Sekoita sisällöt jokaisesta kolosta 0,8 ml:n kanssa dH2O (kokonaistilavuus koeseoksessa noin 1 ml) ja mittaa adsorbanssi 405 nm:ssä.

Tämä keksintö on erityisen edullinen siksi, että 5 sillä on mahdollista tuottaa vasta-aineita, jotka ovat spesifisiä vain C. difficilen toksiineille.

Lopputuloksena tarjotaan käyttöön analyysi, jolla on tarkoitus määrittää näiden toksiinien läsnäolo, pikemmin kuin C. difficilen läsnäolo, joka vähentää tai poistaa 10 väärät positiiviset tulokset.

Edelleen saavutetaan se etu, että saadaan analyysi, joka voidaan suunnata joko jompaan kumpaan toksiineista tai molempiin toksiineihin.

Tällainen toksiinianalyysi on nopea ja myös halvem-15 pi kuin aikaisemmat analyysit.

Lukuisat muunnokset ja variaatiot ovat mahdollisia edellä esitetyn tiedon valossa.

Claims (5)

19 8071 2

1. Menetelmä puhtaan toksiini A:n valmistamiseksi Clostridium difficilestä, tunnettu siitä, että

5 C. difficilen osittain puhdistetun toksiini A:n vesipitoisen liuoksen pH ja molaarisuus säädetään, joka liuos on oleellisesti vapaa toksiini B:stä ja joka sisältää jonkin verran myrkyttömiä proteiineja, jolloin toksiini A saostuu ilman, että myrkyttömät proteiinit saostuvat ja ilman, 10 että toksiini A denaturoituu, mainitun pH:n ollessa alle 6,0 ja mainitun molaarisuuden ollessa alle 0,1 M; ja saostunut toksiini A otetaan talteen puhtaana proteiinina.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että pH on vähintään 5,0 ja molaa- 15 risuus on vähintään 0,001 M.

3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että pH on alueella 5,3 - 5,7.

4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että pH on 5,5 ja molaarisuus 20 0,01 M.

5. C. difficilen puhdas toksiini A, tunnet-t u siitä, että se on valmistettu jonkin patenttivaatimuksista 1-4 mukaisella menetelmällä. 20 8071 2