FI80712C - FOERFARANDE FOER FRAMSTAELLNING AV RENT TOXIN A UR CLOSTRIDIUM DIFFICILE OCH EN ENLIGT FOERFARANDET FRAMSTAELLD PRODUKT. - Google Patents
FOERFARANDE FOER FRAMSTAELLNING AV RENT TOXIN A UR CLOSTRIDIUM DIFFICILE OCH EN ENLIGT FOERFARANDET FRAMSTAELLD PRODUKT. Download PDFInfo
- Publication number
- FI80712C FI80712C FI840950A FI840950A FI80712C FI 80712 C FI80712 C FI 80712C FI 840950 A FI840950 A FI 840950A FI 840950 A FI840950 A FI 840950A FI 80712 C FI80712 C FI 80712C
- Authority
- FI
- Finland
- Prior art keywords
- toxin
- difficile
- antibody
- antibodies
- monospecific
- Prior art date
Links
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Description
1 807121 80712
Menetelmä puhtaan toksiini A:n valmistamiseksi Clostridium difficilestä ja menetelmällä valmistettu tuote Tämä keksintö koskee menetelmää puhtaan toksiini 5 A:n valmistamiseksi Clostridium difficilestä sekä menetelmällä valmistettua C. difficilen puhdasta toksiini A:ta.This invention relates to a process for the preparation of pure toxin 5 A from Clostridium difficile and to a pure toxin A of C. difficile prepared by the process.
Anaerobinen organismi Clostridium difficile (C. difficile) on yhdistetty antibioottiin liittyvään valekal-voiseen paksunsuolentulehdukseen ja tuloksena siitä on 10 kehitetty kokeita, joilla varmistetaan C. difficile-anti-geenin läsnäolo ihmisen ulostenäytteissä.The anaerobic organism Clostridium difficile (C. difficile) has been associated with antibiotic-associated pseudomembranous colitis and has resulted in the development of experiments to confirm the presence of C. difficile antigen in human stool samples.
Eräs sellainen koe, joka käsittää ihmisen uloste-viljelmän, vaatii erityiset laitteet ja pitkän ajan. Tämä koe ilmaisee myös ne C. difficile-lajit, jotka eivät tuota 15 toksiineja, ja antaa näin vääriä positiivisia tuloksia.One such experiment involving a culture of human feces requires special equipment and a long time. This experiment also detects those C. difficile species that do not produce 15 toxins and thus gives false positive results.
Toinen koe käsittää päinvastoin toimivan immuno-elektroforeesin, tämän kokeen ollessa kuitenkin nykyisin käytettynä riittämättömän herkkä havaitsemaan toksineja, ja se antaa paljon vääriä positiivisia tuloksia.The second experiment involves the opposite immunoelectrophoresis, however, this experiment, when used today, is insufficiently sensitive to detect toxins and gives many false positive results.
20 Vielä eräs koe käsittää entsyymi-immuunikokeen; sellaisen kokeen ollessa nykyisin kuitenkin riittämätön erottamaan myrkyllisten ja myrkyttömien lajien välillä ja tästä syystä koe voi antaa väärään johtavia tuloksia.Another experiment comprises an enzyme immunoassay; however, such an experiment is currently insufficient to distinguish between toxic and non-toxic species and for this reason the experiment may give false results.
Tässä on nyt tutkittu C. difficilen toksiinien vas-25 ta-aineita, C. difficilen toksiineja ja myrkyllisen C. difficilen tutkimista.Antibodies to C. difficile toxins, C. difficile toxins, and toxic C. difficile have now been studied here.
Tarjotaan käyttöön monospesifinen vasta-aine C. difficilen toksiinille A, ja sellainen monospesifinen vasta-aine ylläpidettynä kiinteällä alustalla.A monospecific antibody to C. difficile toxin A is provided, and such a monospecific antibody maintained on a solid support.
30 Tarjotaan käyttöön myös monospesifinen vasta-aine C. difficilen toksiinille B, ja sellainen monospesifinen vasta-aine ylläpidettynä kiinteällä alustalla.Also provided is a monospecific antibody to C. difficile toxin B, and such a monospecific antibody maintained on a solid support.
Tämän keksinnön mukaan tarjotaan käyttöön C. difficilen puhdas toksiini A, joka voidaan liittää kiinteälle 35 alustalle.According to the present invention there is provided pure toxin A of C. difficile which can be attached to a solid support.
2 807122 80712
Tarjotaan edelleen käyttöön koe C. difficilen toksiinille A, joka käyttää monospesifistä vasta-ainetta toksiinille A.A test for C. difficile toxin A using a monospecific antibody to toxin A is further provided.
Lisäksi tarjotaan käyttöön tutkimusmenetelmä myr-5 kyllistä C. difficileä varten.In addition, a test method for saturated C. difficile myr-5 is provided.
Termi "monospesifinen vasta-aine toksiinille A" kuten sitä tässä käytetään, tarkoittaa vasta-ainetta, jolla ei ole mitään määrättyjä paikkoja muille C. difficile-antigeeneille kuin toksiinille A.The term "monospecific antibody to toxin A" as used herein means an antibody that does not have any specific sites for C. difficile antigens other than toxin A.
10 Termi "monospesifinen vasta-aine toksiinille B" kuten sitä tässä käytetään, merkitsee vasta-ainetta, jolla ei ole mitään määrättyjä paikkoja muille C. difficile-antigeeneille kuin toksiinille B.The term "monospecific antibody to toxin B" as used herein means an antibody that does not have any specific sites for C. difficile antigens other than toxin B.
Termi "monospesifinen vasta-aine" kuten sitä on 15 tässä käytetty, sisältää sellaisen vasta-aineen monoklo-naalisessa muodossa.The term "monospecific antibody" as used herein includes such an antibody in monoclonal form.
On ymmärrettävä, että monospesifisiä vasta-aineita toksiinille A ja/tai toksiinille B voidaan valmistaa muista organismeista kuin C. difficilestä niin kauan, kuin 20 vasta-aineella ei ole määrättyä paikkaa muille C. diffici-le-antigeeneille.It is to be understood that monospecific antibodies to toxin A and / or toxin B may be prepared from organisms other than C. difficile as long as the antibody does not have a designated site for other C. difficile antigens.
C. difficile-vasta-aine tai vasta-aine C. diffici-lelle merkitsee vasta-ainetta, joka ei ole monospesifinen ja joka sen vuoksi käsittää vasta-aineseoksen, joka sisäl-25 tää vasta-aineet C. difficilen toksiineille (vasta-aine toksiinille A ja vasta-aine toksiinille B) ja vasta-aineet C. difficilen ei-toksiineille.C. difficile antibody or antibody to C. difficile means an antibody that is not monospecific and therefore comprises a mixture of antibodies comprising antibodies to C. difficile toxins (antibody toxin A and antibody to toxin B) and antibodies to C. difficile non-toxins.
Vasta-aine myrkylliselle C. difficilelle tai vasta-aine erityisesti C. difficilelle tarkoittaa vasta-ainetta, 30 jolla ei ole määrättyjä paikkoja C. difficilen muille antigeeneille kuin toksiinille A ja toksiinille B (vasta-aineseos erityisesti vain toksiinille A ja toksiinille B).An antibody to a toxic C. difficile or an antibody specifically to C. difficile means an antibody that does not have specific sites for C. difficile antigens other than toxin A and toxin B (an antibody mixture specifically for toxin A and toxin B only).
Toksiini A on C. difficilen toksiini, jota yleensä pidetään suoliston limakalvomyrkkynä. Toksiinilla A on 35 alkuperäinen molekyylipaino välillä 550 000 ja 600 000 ja 3 80712 isoelektrinen piste 5,5; se ei sisällä havaittavaa prote-aasivaikutusta. Se on inertti pH:ssa 2,0 ja pysyvä pH:ssa 10,0. Toksiini A eluoidaan DEAE:stä puskurilla, joka sisältää 0,16 M NaCl.Toxin A is a C. difficile toxin commonly considered an intestinal mucosal toxin. Toxin A has an initial molecular weight of between 550,000 and 600,000 and 3,80712 isoelectric point 5.5; it does not contain a detectable protease effect. It is inert at pH 2.0 and stable at pH 10.0. Toxin A is eluted from DEAE with a buffer containing 0.16 M NaCl.
5 Toksiini B on C. difficilen toksiini, jota yleensä pidetään C. difficilen solumyrkkynä. Toksiini B:llä on alkuperäinen molekyylipaino välillä 380 000 ja 470 000 ja isoelektrinen piste 3,8; se ei sisällä havaittavaa fosforia, mutta sisältää hyvin pieniä määriä hiilihydraattia 10 (joka voi olla epäpuhtautta), eikä se osoita havaittavaa proteaasivaikutusta. Toksiini B on inertti pH-arvoissa alle 2,0 ja yli 10,0, ja se eluoidaan DEAE-pylväästä suolalla, jonka konsentraatio on 0,4 M.5 Toxin B is a C. difficile toxin commonly considered a C. difficile cytotoxic. Toxin B has an initial molecular weight between 380,000 and 470,000 and an isoelectric point of 3.8; it does not contain detectable phosphorus, but contains very small amounts of carbohydrate 10 (which may be an impurity), and does not show a detectable protease effect. Toxin B is inert at pH values below 2.0 and above 10.0 and is eluted from the DEAE column with a salt concentration of 0.4 M.
On ymmärrettävissä kuitenkin, että vaikka toksiinia 15 A pidetään suoliston limakalvomyrkkynä, sellaisella toksiinilla A on myös solumyrkkyominaisuutta.It will be appreciated, however, that although toxin 15 A is considered an intestinal mucosal toxin, such toxin A also has cytotoxic properties.
Erään tämän keksinnön näkökannan mukaan toksiini A, joka on osittain puhdistettu erottamalla toksiinista B, ja jossa vielä on joitakin ei-myrkyllisiä proteiineja, puh-20 distetaan edelleen puhtaan toksiinin A saamiseksi.In one aspect of the present invention, toxin A, which has been partially purified by separation from toxin B and still has some non-toxic proteins, is further purified to obtain pure toxin A.
Keksinnön mukaiselle menetelmälle on tunnusomaista, että C. difficilen osittain puhdistetun toksiini A:n vesipitoisen liuoksen pH ja molaarisuus säädetään, joka liuos on oleellisesti vapaa toksiini B:stä ja joka sisältää jon-25 kin verran myrkyttömiä proteiineja, jolloin toksiini A saostuu ilman, että myrkyttömät proteiinit saostuvat ja ilman, että toksiini A denaturoituu, mainitun pH:n ollessa alle 6,0 ja mainitun molaarisuuden ollessa alle 0,1 M; ja saostunut toksiini A otetaan talteen puhtaana proteiinina. 30 Kun vesiliuoksen pH säädetään arvoon alle 6,0, ja kun vesiliuoksen molaarisuus säädetään alemmaksi kuin 0,1 M, toksiini A saostuu ilman muiden proteiinien saostumista tai toksiinin denaturoimista. Yleensä pH on ainakin 5,0, edullisen pH:n ollessa 5,3 - 5,7, parhaan tuloksen ollessa 35 saavutettavissa pH:ssa 5,5. Liuoksen molaarisuus on yleen- 4 80712 sä ainakin 0,001 M, parhaan tuloksen ollessa saavutettavissa 0,1 M:ssä.The method according to the invention is characterized in that the pH and molarity of an aqueous solution of partially purified toxin A of C. difficile is adjusted, which solution is substantially free of toxin B and which contains some non-toxic proteins, whereby toxin A precipitates without non-toxic proteins precipitate and without denaturation of toxin A at said pH less than 6.0 and said molarity less than 0.1 M; and the precipitated toxin A is recovered as pure protein. When the pH of the aqueous solution is adjusted to less than 6.0, and when the molarity of the aqueous solution is adjusted to less than 0.1 M, toxin A precipitates without precipitation of other proteins or denaturation of the toxin. In general, the pH is at least 5.0, with a preferred pH of 5.3 to 5.7, with a best result being achieved at pH 5.5. The molarity of the solution is generally at least 0.001 M, with the best result being obtained at 0.1 M.
Molaarisuus ja pH voidaan säätää käyttämällä sopivaa suolapuskuria, esim. natriumasetaattipuskuria. Molaa-5 risuuden säätö voidaan mukavasti suorittaa dialyysillä, vaikka muutkin menetelmät ovat sopivia.The molarity and pH can be adjusted using a suitable salt buffer, e.g. sodium acetate buffer. Adjustment of molaa-5 can be conveniently performed by dialysis, although other methods are suitable.
Saostunut puhdas toksiini A saadaan vesiliuoksesta ja se voidaan liuottaa veteen puskuroidussa pH:ssa noin 7,5.The precipitated pure toxin A is obtained from aqueous solution and can be dissolved in water at a buffered pH of about 7.5.
10 Osittain puhdistettu toksiini A, joka puhdistetaan keksinnön mukaan puhtaan toksiinin A saamiseksi, voidaan saada alalla yleensä tunnetuilla menetelmillä. Esimerkiksi sakan yllä oleva neste myrkyllisen C. difficilen soluviljelmästä konsentroidaan ultrasuodatuskalvolla, joka pidät-15 tää vain suuret molekyylit (mp. yli 100 000) ja pidättynyt aine käsitellään kromatografiapylväässä. Pylväs (DEAE) eluoidaan sitten natriumkloridigradienteilla (ensimmäinen gradientti on 0,01 - 0,25 M NaCl yhdessä 0,3 M:n NaCl-pe-sun kanssa ja toinen gradientti on 0,3 - 0,6 M NaCl), en-20 simmäisen gradientin eluoidessa toksiinin A ja toisen gradientin toksiinin B.Partially purified toxin A, which is purified according to the invention to give pure toxin A, can be obtained by methods generally known in the art. For example, the supernatant fluid from a cell culture of toxic C. difficile is concentrated on an ultrafiltration membrane that retains only large molecules (mp. over 100,000) and the retained material is treated on a chromatography column. The column (DEAE) is then eluted with sodium chloride gradients (first gradient is 0.01 to 0.25 M NaCl together with 0.3 M NaCl wash and second gradient is 0.3 to 0.6 M NaCl), before The first 20 gradients elute toxin A and the second gradient toxin B.
Termi "puhdas toksiini A" kuten sitä on tässä käytetty, merkitsee sitä, että toksiinin A valmistus on vapaa epäpuhtauksista (vain toksiini A on läsnä) kun tutkitaan 25 alalla tunnetuilla erittäin tarkoilla analyysimenetelmillä.The term "pure toxin A" as used herein means that the preparation of toxin A is free of impurities (only toxin A is present) when tested by highly accurate analytical methods known in the art.
Termi "osittain puhdistettu" tässä käytettynä merkitsee, että joitakin epäpuhtauksia, mutta ei kaikkia, on poistettu.The term "partially purified" as used herein means that some, but not all, of the impurities have been removed.
30 Puhdas toksiini A, kun se on valmistettu edellä kuvatuilla menetelmillä, on puhdas seuraavilla kritee-rioilla: yksittäinen vyöhyke akryyliamidigeelielektroforee-silla valmistettuna 100 pg:n kanssa proteiinia geelipyl-35 västä kohti (Davis-, SDS- ja gradienttigeelit); 5 80712 yksittäinen immunopresipitiinikaari ristikkäisillä immunoelektroforeesilevyillä vastaseerumien kanssa, jotka on tehty täydelliseen C. difficile-antigeenien seokseen; ja 5 puhdas toksiini A eläimeen injektoituna saa aikaan monospesifisen vasta-aineen valmistumisen toksiinille A.Pure toxin A, when prepared by the methods described above, is pure by the following criteria: a single zone prepared by acrylamide gel electrophoresis with 100 pg of protein per gel column (Davis, SDS and gradient gels); 5,80712 single immunopressipitin arcs on cross-linked immunoelectrophoresis plates with antisera prepared in a complete mixture of C. difficile antigens; and 5 pure toxin A injected into the animal results in the production of a monospecific antibody to toxin A.
Monospesifinen vasta-aine C. difficilen toksiinille A ja monospesifinen vasta-aine C. difficilen toksiinille B voidaan valmistaa useilla erilaisilla menetelmillä.A monospecific antibody to C. difficile toxin A and a monospecific antibody to C. difficile toxin B can be prepared by a variety of methods.
10 Erään menetelmän mukaan C. difficile-viljelmän, joka oli valmistettu tunnetulla viljelymenetelmällä, sakan yllä olevat nesteet keitetään kaikkien kuumaa kestämättömien proteiiniantigeenien (myrkyllinen ja myrkytön antigeeni) tuhoamiseksi ja näin saadaan aine, joka sisältää 15 vain C. difficilen kuumuutta kestäviä antigeenejä. Nämä antigeenit tuetaan sitten ensimmäiseen syanogeenibromidil-la tuettuun aktivoituun pylvääseen.According to one method, the supernatants of a C. difficile culture prepared by a known culture method are boiled to destroy all non-heat-resistant protein antigens (toxic and non-toxic antigen) to obtain a substance containing only C. difficile heat-resistant antigens. These antigens are then supported on a first cyanogen bromide-supported activated column.
Osittain puhdistettu toksiini A ja osittain puhdistettu toksiini B, joista kumpikin on saatu DEAE-kromato-20 grafiapylväästä saadusta eluointinesteestä kuten edellä on kuvattu, liitetään toiseen ja kolmanteen syanogeenibromi-dilla aktivoituun Sepharose&-pylvääseen, tässä järjestyksessä.Partially purified toxin A and partially purified toxin B, each obtained from the eluent obtained from the DEAE chromatograph-20 column, as described above, are coupled to the second and third cyanogen bromide-activated Sepharose & columns, respectively.
Vasta-aineet karkeille C. difficile-antigeenitok-25 siineille (sellainen toksiini sisältää sekä toksiinia A että toksiinia B, kuten myös monia muita antigeenejä, jotka on valmistettu bakteerien avulla) valmistetaan sopivassa eläimessä, esim. vuohessa, ja syntynyt vasta-aine muodostuu C. difficile-antigeenin vasta-aineseoksesta (sel-30 lainen vasta-aineseos sisältää vasta-aineita toksiinille A ja toksiinille B sekä vasta-aineita myrkyttömille antigeeneille mukaan luettuina vasta-aineet kuumuutta kestäville antigeeneille). Myrkyttömät vasta-aineet (paitsi vasta-aineet myrkyttömille kuumuutta kestäville antigee-35 neille) poistetaan vasta-aineseoksesta saattamalla koske- 6 80712 tukseen myrkyttömän C. difficile-lajin kokonaisten solujen kanssa, jolloin ne siinä yhteydessä sitovat muut vasta-aineet ei-myrkyllisiin aineisiin, paitsi vasta-aineet myrkyttömille kuumuutta kestäville antigeeneille.Antibodies to coarse C. difficile antigen toxins (such a toxin contains both toxin A and toxin B, as well as many other antigens produced by bacteria) are prepared in a suitable animal, e.g., a goat, and the resulting antibody forms C from an antibody mixture of difficile antigen (such an antibody mixture contains antibodies to toxin A and toxin B as well as antibodies to non-toxic antigens, including antibodies to heat-resistant antigens). Non-toxic antibodies (except antibodies to non-toxic heat-resistant antigens) are removed from the antibody mixture by contact with whole cells of the non-toxic C. difficile species, thereby binding other antibodies to non-toxic substances. , except antibodies to non-toxic heat-resistant antigens.
5 Sen jälkeen vasta-aineseos (joka nyt sisältää vas ta-aineet toksiineille ja vasta-aineet myrkyttömille kuumuutta kestäville antigeeneille) pannaan sitten ensimmäiseen pylvääseen, jossa kuumuutta kestäviä C. difficile-antigeenejä säilytetään, jolloin sokerivasta-aineet kuulo muutta kestäville antigeeneille sitoutuvat.5 The antibody mixture (which now contains antibodies to toxins and antibodies to non-toxic heat-resistant antigens) is then applied to a first column in which heat-resistant C. difficile antigens are stored, whereby the sugar antibodies bind to hearing-resistant antigens.
Seos, jossa ei ole vasta-ainetta kuumuutta kestäviä antigeenejä vastaan ja joka sisältää vasta-aineet toksiineille A ja B, jaetaan sitten kahteen osaan; ja yksi osa pannaan toiseen pylvääseen, jossa pidetään puhdasta tok-15 siinia A, ja toinen osa pannaan kolmanteen pylvääseen, jossa osittain puhdistettua toksiinia B pidetään, jolloin toisessa pylväässä vasta-aine toksiinille A sitoutuu selektiivisesti ylläpidettyyn toksiiniin A ja kolmannessa pylväässä vasta-aine toksiinille B sitoutuu selektiivises-20 ti ylläpidettyyn toksiiniin B.The mixture, which has no antibody against heat-resistant antigens and which contains antibodies to toxins A and B, is then divided into two parts; and one part is placed on a second column holding pure toxin A and the other part is placed on a third column holding partially purified toxin B, wherein in the second column the antibody to toxin A selectively binds to the maintained toxin A and in the third column the antibody to the toxin A B binds selectively to maintained toxin B.
Vasta-aineet toksiinille A ja vasta-aineet toksiinille B eluoidaan sen jälkeen toisesta ja kolmannesta pylväästä, tässä järjestyksessä, esim. käyttämällä kaliumtio-syanaattia tuottamaan monospesifinen vasta-aine toksiinil-25 le A ja monospesifinen vasta-aine toksiinille B, tässä j ärjestyksessä.The antibodies to toxin A and the antibodies to toxin B are then eluted from the second and third columns, respectively, e.g., using potassium thiocyanate to produce a monospecific antibody to toxin A and a monospecific antibody to toxin B, respectively.
Joissakin tapauksissa, kuten tässä jäljempänä on kuvattu, vasta-aineen toksiinille A ja vasta-aineen toksiinille B muodostama seos (sen jälkeen kun myrkyttömät 30 antigeenit on poistettu) voidaan käyttää erottamatta mono-spesifiseen vasta-aineeseen jokaiselle toksiineista, esim. tutkittaessa myrkyllistä C. difficileä.In some cases, as described below, a mixture of antibody to toxin A and antibody to toxin B (after removal of non-toxic antigens) can be used without separation to a monospecific antibody for each of the toxins, e.g., in the study of toxic C. difficile.
Vaihtoehtoisesti voidaan monospesifinen vasta-aine toksiinille A valmistaa panemalla karkea C. difficile-vas-35 ta-aine pylvääseen, joka on tuettu immobilisoidulla puh- 7 80712 taalla toksiinilla A. Myrkyttömät A-vasta-aineet poistetaan pylväästä runsaasti pesemällä ja jäljellä olevat vasta-aineet, jotka ovat liittyneet toksiiniin A, eluoidaan kaliumtiosyanaatilla.Alternatively, a monospecific antibody to toxin A can be prepared by applying a coarse C. difficile antibody to a column supported on an immobilized pure toxin A. Non-toxic antibodies A are removed from the column by extensive washing and the remaining antibodies are removed. substances associated with toxin A are eluted with potassium thiocyanate.
5 Vaihtoehtoisesti monospesifinen vasta-aine toksii nille A voidaan valmistaa puhdistetusta toksiinista A, joka on valmistettu edellä kuvatulla tavalla, injektoimalla toksiini A (sekoitettuna pieneen määrään formaldehydiä myrkyllisyyden alentamiseksi tuhoamatta antigeenisyyttä 10 tai neutraloituna vasta-aineen kanssa) sopivaan eläimeen, esim. vuoheen. Monospesifinen vasta-aine toksiinille A saadaan sitten edellisessä kappaleessa kuvatulla menetelmällä.Alternatively, a monospecific antibody to toxin A can be prepared from purified toxin A prepared as described above by injecting toxin A (mixed with a small amount of formaldehyde to reduce toxicity without destroying antigenicity or neutralizing with the antibody) in a suitable animal, e.g., a goat. A monospecific antibody to toxin A is then obtained by the method described in the previous paragraph.
Monospesifisiä vasta-aineita ja toksiineja voidaan 15 ylläpitää kiinteällä alustalla käytettäväksi C. difficilen tutkimiseen. Vaihtoehtoisesti sellaisia vasta-aineita ja toksiineja voidaan käyttää sellaisessa tutkimuksessa kan-nakkeettomassa muodossa.Monospecific antibodies and toxins can be maintained on a solid support for use in C. difficile research. Alternatively, such antibodies and toxins may be used in such a study in a non-carrier form.
Käytettäessä kiinteätä alustaa, kiinteä alusta voi 20 olla mikä tahansa monista kiinteistä aineista ja sitä voidaan käyttää missä tahansa muodossa monista mahdollisista, esim. levyt, tarjottimet, hiukkaset, putket, laatat jne.When a solid substrate is used, the solid substrate may be any of a number of solids and may be used in any of a variety of forms, e.g., plates, trays, particles, tubes, tiles, and the like.
Edustavina esimerkkeinä sopivista alustoista voidaan mainita synteettiset polymeerialustat, kuten poly-25 styreeni, polypropyleeni, substituoitu polystyreeni (esim. aminoitu tai karboksyloitu polystyreeni), polyakryyliami-dit, polyamidit, polyvinyylikloridi jne.; lasihelmet; aga-roosi jne. Alustat voivat sisältää reaktiivisia ryhmiä, esim. karboksyyliryhmiä, aminoryhmiä jne. antamaan mahdol-30 lisuus suoraan sitoutumiseen alustaan.Representative examples of suitable substrates include synthetic polymeric substrates such as poly-styrene, polypropylene, substituted polystyrene (e.g., aminated or carboxylated polystyrene), polyacrylamides, polyamides, polyvinyl chloride, etc .; glass beads; agarose, etc. The media may contain reactive groups, e.g., carboxyl groups, amino groups, etc., to allow direct binding to the media.
Mainitut vasta-aineet ja toksiinit voidaan tukea kiinteälle alustalle monilla eri tavoilla, esimerkiksi adsorptiolla, kovalenttisella kytkennällä, aktivoimalla sopiva alusta proteiinilla A jne.Said antibodies and toxins can be supported on a solid support in many different ways, for example by adsorption, covalent coupling, activation of a suitable support with protein A, etc.
β 80712β 80712
Edustavina esimerkkeinä sopivista kytkentäaineista voidaan mainita dialdehydit, esimerkiksi glutaarialdehy-di, sukkiinialdehydi, malonialdehydi jne; tyydyttämätön aldehydi, esim. akroleiini, metakroleiini, krotonaldehydi 5 jne.; karbodi-imidit; di-isosyanaatit; dimetyyliadipimaat-ti; syaaniuriinikloridi jne. Sopivan kytkentäaineen valinnan pitäisi olla selvää alaan perehtyneille tässä olevista tiedoista.Representative examples of suitable coupling agents include dialdehydes, for example, glutaraldehyde, succinic aldehyde, malonic aldehyde, etc .; unsaturated aldehyde, e.g. acrolein, methacrolein, crotonaldehyde 5, etc .; carbodiimides; diisocyanates; dimetyyliadipimaat-phosphate; cyanurine chloride, etc. The choice of a suitable coupling agent should be apparent to those skilled in the art from the information contained herein.
Samalla tavalla antigeeni voidaan tukea aktivoimalle) la sopiva alusta, esimerkiksi syanogeenibromidilla aktivoitu alusta.Similarly, the antigen may be supported by activating a suitable support, for example a cyanogen bromide activated support.
Tämän tutkimuksen vasta-aineita ja toksiineja voidaan käyttää tutkittaessa joko toksiinia A tai toksiinia B C. difficilestä tai myrkyllistä C. difficileä (sekä tok-15 siinia A että toksiinia B).The antibodies and toxins of this assay can be used to test for either toxin A or toxin B from C. difficile or toxic C. difficile (both toxin A and toxin B).
Joissakin sellaisista kokeista käytetään yhtä tai useampaa ainetta "leimatussa" tai "merkityssä" muodossa, ja sellaiset leimat tai merkit ovat sitä tyyppiä, joka on alalla tunnettua kokeissa käytettäviksi. Niinpä esimerkik-20 si leima tai merkki voi olla radioaktiivinen aine, kuten radioaktiivinen jodi, radioaktiivinen koboltti, tritium jne.; entsyymi; fluoresoiva aine; kerniluminesenssiaine jne.In some such experiments, one or more substances are used in "labeled" or "labeled" form, and such labels or indicia are of the type known in the art for use in experiments. Thus, for example, the label or label may be a radioactive substance such as radioactive iodine, radioactive cobalt, tritium, etc .; enzyme; fluorescent agent; kerniluminescent agent, etc.
Leimat voidaan lisätä eri aineisiin menetelmillä, 25 joita yleensä käytetään alalla. Samalla tavalla leima tai merkki voidaan havaita menetelmillä, jotka ovat alalla tunnettuja, esimerkiksi radioaktiivisten leimojen laskurit, entsyymien kolorimetrinen määritys jne.Labels can be added to various substances by methods commonly used in the art. Similarly, a label or label can be detected by methods known in the art, for example, counters for radioactive labels, colorimetric determination of enzymes, and the like.
Edellä mainittuja vasta-aineita ja toksiineja voi-. . 30 daan käyttää tuetussa ja/tai tukemattomassa muodossa C.The aforementioned antibodies and toxins can be. . 30 may be used in supported and / or unsupported form C.
difficilen tutkimiseen.to study difficile.
Erään suoritusmuodon mukaan tarjotaan käyttöön koe C. difficilen toksiinille A käyttämällä monospesifistä vasta-ainetta toksiinille A.In one embodiment, an assay for C. difficile toxin A is provided using a monospecific antibody to toxin A.
9 80712 Tämän suoritusmuodon erään näkökannan mukaan vasta-aine C. difficilelle tuetaan kiinteälle alustalle, esimerkiksi mikrotiitterilevylle. Tuettu C. difficile-vasta-aine saatetaan sitten kosketukseen analysoitavan näytteen (ana-5 lyytti) kanssa, kuten potilaan ulosteen laimennuksen kanssa, ja tuloksena sellaisesta kosketuksesta mikä tahansa analyytissä läsnäoleva toksiini A, kuten myös muut C. dif-ficilen antigeenit, sitoutuvat tuettuun C. difficile-vas-ta-aineeseen. Sen jälkeen sitoutunut analyyttierä saate-10 taan kosketukseen monospesifisen vasta-aineen kanssa C. difficilen toksiinille A (kasvatettu erilaisessa eläimessä kuin se, jossa C. difficile-vasta-aine kasvatettiin), ja sellainen monospesifinen vasta-aine sitoutuu vain mihin tahansa analyyttierässä läsnä olevaan toksiiniin A.80712 In one aspect of this embodiment, the antibody to C. difficile is supported on a solid support, e.g., a microtiter plate. The supported C. difficile antibody is then contacted with a test sample (analyte 5), such as a dilution of a patient's feces, and as a result of such contact, any toxin A present in the analyte, as well as other C. difficile antigens, bind to the supported C. difficile antibody. The bound analyte lot is then contacted with a monospecific antibody to C. difficile toxin A (raised in a different animal than the one in which the C. difficile antibody was grown), and such monospecific antibody binds only to any of the antibodies present in the analyte lot. toxin A.
15 Tämä monospesifinen vasta-aine voi itse olla lei mattu entsyymillä, fluoresenssiaineella tai radioaktiivisella aineella, kuten edellä on kuvattu, ja toksiinin A läsnäolo voidaan määrittää havaitsemalla tämän leiman läsnäolo. Vaihtoehtoisesti toksiiniin A sitoutunut monospesi-20 finen vasta-aine voidaan havaita käyttämällä leimattua vasta-ainetta, joka on spesifinen sen eläimen vasta-aineelle, jossa monospesifinen vasta-aine kasvatettiin; tämä sitoutuu monospesifiseen vasta-aineeseen, joka on liittynyt toksiiniin A. Tätä menetelmää pidetään alalla kaksin-25 kertaisena vasta-aineen kerrosmuotona ELISA-kokeessa.This monospecific antibody may itself be detected with an enzyme, fluorescent agent or radioactive agent, as described above, and the presence of toxin A can be determined by detecting the presence of this label. Alternatively, a monospecific antibody bound to toxin A can be detected using a labeled antibody specific for the antibody of the animal in which the monospecific antibody was grown; this binds to a monospecific antibody associated with toxin A. This method is considered in the art as a two- to 25-fold layered form of antibody in an ELISA assay.
Toksiinin A läsnäolo analyytissä voidaan määrittää sen vuorovaikutuksessa monospesifisen toksiinin A vasta-aineen kanssa kokeessa.The presence of toxin A in an analyte can be determined by its interaction with a monospecific toxin A antibody in an assay.
Edellä esitettyä menetelmää voidaan myös käyttää 30 toksiinin B määrittämiseen analyytissä käyttämällä mono-spesifistä vasta-ainetta toksiinille B toksiinille A mono-spesifisen vasta-aineen sijasta.The above method can also be used to determine toxin B in an analyte using a monospecific antibody to toxin B instead of a monospecific antibody to toxin A.
Toisessa C. difficilen toksiinin A kokeessa monospesifinen vasta-aine toksiinille A voidaan tukea kiin-35 teälle alustalle, esimerkiksi mikrotiitterilevylle, ja 10 80712 tuettu monospesifinen vasta-aine toksiinille A saatetaan kosketukseen analyytin kanssa, jonka epäillään sisältävän toksiinia A, jolloin näytteessä läsnäoleva toksiini A (ja vain toksiini A) sitoutuu tuettuun monospesifiseen vasta-5 aineeseen. Sitoutuneen toksiinin A läsnälo ja/tai määrä voidaan sitten määrittää saattamalla kosketukseen sitoutunut toksiini A C. difficile-vasta-aineeseen leimatussa muodossa, jolloin sellainen leimattu vasta-aine sitoutuu sitoutuneeseen toksiiniin A. Analyytissä läsnä olevan tok-10 siinin A läsnäolo ja/tai määrä määritetään sitten määrittämällä sitoutuneen leimatun vasta-aineen läsnäolo ja/tai määrä.In another C. difficile toxin A assay, a monospecific antibody to toxin A can be supported on a solid support, e.g., a microtiter plate, and the 80,80712 supported monospecific antibody to toxin A is contacted with an analyte suspected of containing toxin A, with toxin A present in the sample. (and toxin A only) binds to the supported monospecific antibody. The presence and / or amount of bound toxin A can then be determined by contacting the bound toxin A with the C. difficile antibody in a labeled form, wherein such labeled antibody binds to the bound toxin A. The presence and / or amount of toxin A present in the analyte is then determined by determining the presence and / or amount of bound labeled antibody.
Edellä esitettyä menetelmää voidaan myös käyttää kokeessa toksiinille B korvaamalla monospesifinen vasta-15 aine toksiinille A monospesifisellä vasta-aineella toksiinille B.The above method can also be used in an experiment on toxin B by replacing a monospecific antibody to toxin A with a monospecific antibody to toxin B.
Vielä erään toksiinille A olevan kokeen mukaan ana-lyytti, joka sisältää tai jonka epäillään sisältävän toksiinia A, tuetaan kiinteälle alustalle, kuten mikrotiit-20 terilevylle niin, että ainakin toksiini A analyytissä on tuettu kiinteälle alustalle. Tämän toksiinin läsnäolo havaitaan sitten monospesifisellä vasta-aineella toksiinille A. Tuettu toksiini A sitoo selektiivisesti vain monospesi-fisen vasta-aineen toksiinille A. Niinpä monospesifinen 25 vasta-aine tuetaan kiinteälle alustalle analyytin tuetun toksiinin A avulla. Tällä vasta-aineella voi olla liittyneenä leima, kuten entsyymi, joka sallii sen havaitsemisen, tai voidaan käyttää leimattua vasta-ainetta, joka reagoi toksiiniin sitoutuneeseen vasta-aineeseen (kerros-30 ELISA-menetelmä). Sitoutuneen leimatun vasta-aineen läsnäolo ja/tai määrä on analyytissä olevan toksiinin A läsnäolon tai määrän merkki.According to another experiment on toxin A, an analyte containing or suspected of containing toxin A is supported on a solid support, such as a microtite plate, so that at least toxin A in the analyte is supported on a solid support. The presence of this toxin is then detected by a monospecific antibody to toxin A. Supported toxin A selectively binds only the monospecific antibody to toxin A. Thus, the monospecific antibody is supported on a solid support by analyte-supported toxin A. This antibody may be associated with a label, such as an enzyme that allows its detection, or a labeled antibody that reacts with a toxin-bound antibody may be used (layered ELISA method). The presence and / or amount of bound labeled antibody is an indication of the presence or amount of toxin A in the analyte.
Vielä erään analyysin mukaan toksiini A voidaan havaita agglutinaatiomenetelmällä. Sellaisen menetelmän mu-35 kaan kiinteät hiukkaset, jotka ovat herkistyneet toksii- 11 80712 nille A monospesifisten vasta-aineiden kanssa, saatetaan kosketukseen analyytin kanssa, joka sisältää tai jonka epäillään sisältävän toksiinia A, ja aiheuttavat toksiinin A läsnäollessa sellaisten hiukkasten agglutinaation.According to another analysis, toxin A can be detected by an agglutination method. According to a method, solid particles sensitized to monospecific antibodies to toxin 1180712 A are contacted with an analyte containing or suspected of containing toxin A and causing agglutination of such particles in the presence of toxin A.
5 Agglutinaatioanalyysi on myös sopiva toksiinin B5 Agglutination assay is also suitable for toxin B
havaitsemiseen käyttäen toksiinille B monospesifisiä vasta-aineita toksiinille A monospesifisten vasta-aineiden sijasta.detection using toxin B monospecific antibodies instead of toxin A monospecific antibodies.
Vielä erään toisen analyysin mukaan toksiini A voi-10 daan määrittää hidastamalla agglutinaatiomenetelmää saattamalla puhtaalle toksiinille A herkistyneet kiinteät hiukkaset (tai karkealle toksiinia A sisältävälle C. dif-ficilen toksiinille herkistyneet) kosketukseen sekä analyytin kanssa, joka sisältää tai jonka epäillään sisältä-15 vän toksiinia A, että C. difficilen monospesifisten vasta-aineiden kanssa, jolloin toksiinin A ollessa läsnä analyy-tissä monospesifisillä vasta-aineilla tapahtuva herkistyneiden hiukkasten agglutinaatio hidastuu.In yet another assay, toxin A can be determined by slowing the agglutination process by contacting solid particles sensitized to pure toxin A (or coarse sensitized to coarse toxin A-containing C. difficile toxin) and an analyte containing or suspected of containing toxin A. A, and C. difficile monospecific antibodies, with the agglutination of sensitized particles by monospecific antibodies in the presence of toxin A in the assay being retarded.
Sellaista menetelmää voidaan myös käyttää määritet-20 täessä toksiinia B herkistämällä hiukkaset karkealle toksiinille ja käyttämällä monospesifistä vasta-ainetta toksiinille B.Such a method can also be used to determine toxin B by sensitizing the particles to a coarse toxin and using a monospecific antibody to toxin B.
Lisämuunnoksena analyysiä voidaan käyttää määrittämään myrkyllinen C. difficile (toksiini A ja/tai toksii-25 ni B) käyttämällä vasta-ainetta myrkylliselle C. diffici-lelle (seos, jossa on monospesifinen vasta-aine toksiinille A ja monospesifinen vasta-aine toksiinille B, ja jossa ei ole määrättyjä paikkoja myrkyttömille antigeeneille). Käyttämällä sellaisten monospesifisten vasta-aineiden 30 seosta on mahdollista määrittää joko toksiinin A tai toksiinin B läsnäolo näytteessä.As a further modification, the assay can be used to determine toxic C. difficile (toxin A and / or toxin-25) B using an antibody to toxic C. difficile (a mixture of a monospecific antibody to toxin A and a monospecific antibody to toxin B). and with no designated sites for non-toxic antigens). Using a mixture of such monospecific antibodies, it is possible to determine the presence of either toxin A or toxin B in a sample.
Tätä keksintöä kuvataan edelleen seuraavien esimerkkien avulla.The present invention is further illustrated by the following examples.
12 8071 212 8071 2
Esimerkki 1 Tämä esimerkki kohdistuu toksiinille A monospesifi-sen vasta-aineen valmistukseen ja toksiinille B monospesi-fisen vasta-aineen valmistukseen.Example 1 This example is directed to the production of a monospecific antibody to toxin A and the production of a monospecific antibody to toxin B.
5 Bakteerit ja kasvuolosuhteet 2 litran aivo-sydän infuusio-dialyysiputkellisiin pulloihin istutettiin 0,1 ml aktiivisesti kasvavaa viljelmää C. difficile VPI-lajia 11186 (myrkytön) ja C. difficile VPI-lajia 10463 (myrkyllinen), jotka ovat saatavissa 10 Virginia Polytechnic Institute-nimisestä laitoksesta, ja pullot inkuboitiin 37°C:ssa 3 päivää. Solut saatiin dia-lyysipussin sisältä sentrifugoimalla sisältö 9 000 x g; 15 minuuttia).5 Bacteria and Growth Conditions 2-liter brain-heart infusion-dialysis tube flasks were inoculated with 0.1 ml of active-growing culture of C. difficile VPI species 11186 (non-toxic) and C. difficile VPI species 10463 (toxic) available from 10 Virginia Polytechnic Institute and the flasks were incubated at 37 ° C for 3 days. Cells were obtained from inside a dialysis bag by centrifugation at 9,000 x g; 15 minutes).
Keitetyn seolunesteen valmistus (BCW) - Sepharose^, 15 ja toksiini A (Tox A) - Sepharose**-' ja toksiini BPreparation of boiled broth (BCW) - Sepharose ^, 15 and toxin A (Tox A) - Sepharose ** - 'and toxin B
(Tox B) - Sepharos^*-1(Tox B) - Sepharos ^ * - 1
Lajin 10463 pakatut solut (noin 15 ml saatuna 12 pullosta) pestiin 3 kertaa (30 ml pesua kohti) 0,1 M NaHC03 - 0,5 M NaCl-liuoksella (pH 8). Solujen pesunesteet •: 20 yhdistettiin ja seosta kuumennettiin 100°C:ssa 15 minuut tia. Saostunut aine poistettiin sentrifugoimalla (12 000 x g; 30 minuuttia) ja neste sakan yltä (noin 34 mg prote--·- iinia 90 ml:ssa) lisättiin 60 ml:aan Sepharos^ 4B:täPacked cells of species 10463 (approximately 15 ml obtained from 12 flasks) were washed 3 times (30 ml per wash) with 0.1 M NaHCO 3 to 0.5 M NaCl solution (pH 8). The cell washes were combined and heated at 100 ° C for 15 minutes. The precipitate was removed by centrifugation (12,000 x g; 30 minutes) and the supernatant (about 34 mg of protein in 90 ml) was added to 60 ml of Sepharos® 4B.
(Pharmacia, Uppsala, Ruotsi), joka oli aktivoitu 18 g:11a 25 CNBr. Suspensiota sekoitettiin hiukan 4°C:ssa yön yli ja liittymätön aine poistettiin pesemällä geeli yhden pylvään tilavuudella 0,1 M NaHC03 - 0,5 M NaCl-liuosta. Pesunesteen proteiinianalyysi osoitti, että geelivalmiste sisälsi noin 0,3 mg proteiinia ml:ssa geeliä. Sepharosd*-geelissä 30 jäljellä olevat aktiiviset ryhmät pysäytettiin lisäämällä yksi pylvään tilavuus 1 M etanoliamiinia (pH 8) ja sekoittamalla geeliä 4°C:ssa yön yli. Geeli, merkitty BCW-Sepha-rose, pestiin 4 kertaa vaihtelevilla tilavuuksilla (2 pylvään tilavuutta pesua kohti) 0,1 M natriumasetaatti - 0,5 35 M natriumkloridi-liuosta (pH 4) ja 0,1 M NaHC03 - 0,5 M(Pharmacia, Uppsala, Sweden) activated with 18 g of 25 CNBr. The suspension was stirred slightly at 4 ° C overnight and unbound material was removed by washing the gel with a single column volume of 0.1 M NaHCO 3 to 0.5 M NaCl solution. Protein analysis of the washing liquid showed that the gel preparation contained about 0.3 mg of protein per ml of gel. The remaining active groups on the Sepharosd * gel were stopped by adding one column volume of 1 M ethanolamine (pH 8) and stirring the gel at 4 ° C overnight. The gel, labeled BCW-Sepha-rose, was washed 4 times with varying volumes (2 column volumes per wash) of 0.1 M sodium acetate - 0.5 35 M sodium chloride solution (pH 4) and 0.1 M NaHCO 3 - 0.5 M
13 8071 213 8071 2
NaCl-liuosta (pH 8).NaCl solution (pH 8).
Osittain puhdistettu toksiini A ja toksiini B valmistettiin ioninvaihtokromatografialla DEAE-Sepharose® CL-6B:llä (Pharmacia Fine Chemicals), kuten on kuvattu 5 esimerkissä 2, ja jokaista valmistetta dialysoitiin yön yli 4°C:ssa 0,1 M NaHC03 - 0,5 M NaCl-liuosta vastaan. Toksiini A (noin 3,3 mg proteiinia 20 ml:ssa) ja toksiini B (noin 1,1 mg proteiinia 20 ml:ssa) liitettiin molemmat kuten on kuvattu BCW-Sepharoselle, 20 ml:aan Sepharose^ 10 4B:tä, joka oli aktivoitu 7 g:lla CNBr. Proteiinianalyysit pesunesteistä osoittivat, että Tox A-Sepharose£ ja Tox B-Sepharose® sisälsivät 170 pg proteiinia ja 54 pg proteiinia ml:ssa geeliä, tässä järjestyksessä.Partially purified toxin A and toxin B were prepared by ion exchange chromatography on DEAE-Sepharose® CL-6B (Pharmacia Fine Chemicals) as described in Example 2, and each preparation was dialyzed overnight at 4 ° C with 0.1 M NaHCO 3 - 0, Against 5 M NaCl solution. Toxin A (approximately 3.3 mg of protein in 20 ml) and toxin B (approximately 1.1 mg of protein in 20 ml) were both added as described for BCW-Sepharose to 20 ml of Sepharose ^ 4 4B, which was activated with 7 g of CNBr. Protein analyzes of the washings showed that Tox A-Sepharose® and Tox B-Sepharose® contained 170 pg of protein and 54 pg of protein per ml of gel, respectively.
Toksiinien A ja B vastaisten monospesifisten anti-15 seerumien puhdistusPurification of monospecific anti-15 sera against toxins A and B.
Valmistettiin vuohen antiseerumi kuten aikaisemmin kuvattiin, käyttäen jäähdytettyä formaldehydiä (M. Erlich, R. L. Van Tassell, J. M. Libby ja T. D. Wilkins, 1980, Production of Clostridium difficile antitoxin, Infect. 20 Immun. 28, ss. 1041 - 1043) karkeata toksiineja A ja B sisältävää C. difficile-toksiinivalmistetta vastaan. Anti-seerumia (5 ml) lisättiin suspensioon, jossa oli lajin 11186 soluja (1,5 ml pakattuja soluja 3 ml:ssa 0,85-%:ista NaCl) ja seos homogenisoitiin varovasti Potter Elvehjam-25 kudosjauhimella ja pyöritettiin sitten 2 tuntia huoneen lämmössä. Solut poistettiin sitten sentrifugoinnilla (12 000 x g; 30 minuuttia) ja sakan yllä oleva neste kuljetettiin 0,45 pm:n kalvon läpi ja konsentroitiin lX:een Minicon-B15-konsentroijalla (Amicon Corp., Lexington, 30 Mass.). Lajin 11186 solu-adsorboitu antiseerumi (4,1 ml) pantiin BCW-Sepharose-pylvääseen (1,5 x 31,4 cm) ja adsor-boitumaton aine eluoitiin huoneen lämmössä 2 pylvään tilavuudella 0,1 M NaHCO, - 0,5 M NaCl-liuosta (pH 8) virtausnopeudella 40 ml/min. Eluaatti konsentroitiin lX:een ult-35 rasuodatuksella solusekoituslaitteessa, jossa oli PM 10- 14 8071 2 kalvo (Amicon Corp.) BCW-Sepharose-eluaatti (4,1 ml) jaettiin 2 erään, jotka pantiin Tox A-Sepharosei® - ja Tox B-Sepharose^-pylväisiin (1 x 25 cm). Adsorboitumaton aine eluoitiin huoneen lämmössä jokaisesta pylväästä 2 pylvään 5 tilavuudella 0,1 M NaHC03 - 0,5 M NaCl-liuosta (pH 8) virtausnopeudella 40 ml/min. Eluaatit konsentroitiin lX:een ultrasuodatuksella.Goat antiserum was prepared as previously described using chilled formaldehyde (M. Erlich, RL Van Tassell, JM Libby, and TD Wilkins, 1980, Production of Clostridium difficile antitoxin, Infect. 20 Immun. 28, pp. 1041-1043) coarse toxins A and Against a C. difficile toxin preparation containing B. Anti-serum (5 ml) was added to a suspension of 11186 cells (1.5 ml packed cells in 3 ml of 0.85% NaCl) and the mixture was gently homogenized with a Potter Elvehjam-25 tissue grinder and then spun for 2 hours at room temperature. temperature. The cells were then removed by centrifugation (12,000 x g; 30 minutes) and the supernatant was passed through a 0.45 membrane and concentrated to 1X with a Minicon-B15 concentrator (Amicon Corp., Lexington, 30 Mass.). Cell-adsorbed antiserum of species 11186 (4.1 mL) was applied to a BCW-Sepharose column (1.5 x 31.4 cm) and the non-adsorbed material was eluted at room temperature with 2 column volumes of 0.1 M NaHCO 3. NaCl solution (pH 8) at a flow rate of 40 ml / min. The eluate was concentrated to 1x by ult-35 fat filtration in a cell mixer with PM 10-148071 2 membrane (Amicon Corp.) BCW-Sepharose eluate (4.1 mL) was divided into 2 aliquots placed in Tox A-Sepharosei® and Tox B-Sepharose ^ columns (1 x 25 cm). The non-adsorbed material was eluted at room temperature from each column with 2 column 5 volumes of 0.1 M NaHCO 3 to 0.5 M NaCl solution (pH 8) at a flow rate of 40 ml / min. The eluates were concentrated to 1x by ultrafiltration.
Tox A-Sepharoseen<& ja Tox B-Sepharoseen^1 sitoutuneiden vasta-aineiden eluointi 10 Kun adsorboitumaton aine oli eluoitu Tox A-Sepha-Elution of antibodies bound to Tox A-Sepharose <and Tox B-Sepharose ^ 1 After the non-adsorbed material was eluted with Tox A-Sepharose
rosesta^ ja Tox B-Sepharosesta^, pylväät pestiin 0,1 M NaHC03 - 0,5 M NaCl-liuoksella (pH 8), kunnes ei ollut enää mitään havaittavaa adsorbenssia 280 nm:ssä. Geeleihin sitoutuneet vasta-aineet eluoitiin käyttämällä 5 ml 3,5 M 15 KSCN (pH 6,8) jokaiseen pylvääseen ja pesemällä 0,1 Mrosé® and Tox B-Sepharose®, the columns were washed with 0.1 M NaHCO 3 to 0.5 M NaCl solution (pH 8) until no detectable adsorbence was present at 280 nm. Antibodies bound to the gels were eluted using 5 ml of 3.5 M KSCN (pH 6.8) on each column and washing with 0.1 M
NaHC03 - 0,5 M NaCl-liuoksella. Noin 2 pylvään tilavuutta kerättiin jokaisesta pylväästä. Eluaatit dialysoitiin 4 litraa vastaan 0,1 M boraattipuskuroitua suolaliuosta (pH 5,8) 4°C:ssa yön yli ja konsentroitiin lX:een ultrasuoda-20 tuksella.NaHCO 3 - 0.5 M NaCl solution. Approximately 2 column volumes were collected from each column. The eluates were dialyzed against 4 liters of 0.1 M borate buffered saline (pH 5.8) at 4 ° C overnight and concentrated to 1x by ultrafiltration.
Tox A-Sepharose^-pylväästä eluoitu vasta-aine on monospesifinen vasta-aine C. difficilen toksiinille A ja Tox B-SepharosefS»-pylväästä eluoitu vasta-aine on monospesifinen vasta-aine C. difficilen toksiinille B.The antibody eluted from the Tox A-Sepharose® column is a monospecific antibody to C. difficile toxin A and the antibody eluted from the Tox B-Sepharose® column is a monospecific antibody to C. difficile toxin B.
25 IgG-fraktion puhdistus25 Purification of IgG fraction
Tox A-Sepharos^- ja Tox B-Sepharos^-pylväästä eluoidut vasta-aineet puhdistettiin kromatografiällä DEAE Affi-Gel Blue:Hai®' (Bio-Rad Laboratories, Rockville Centre, NY) valmistajan suosittelemalla kanin IgG:n puhdistuk-30 seen sopivalla tavalla.Antibodies eluted from the Tox A-Sepharos® and Tox B-Sepharos® columns were purified by chromatography on DEAE Affi-Gel Blue: Hai® '(Bio-Rad Laboratories, Rockville Center, NY) as recommended by the manufacturer for rabbit IgG purification. in an appropriate way.
Antiseeruminäytteet (2 ml) pantiin DEAE Affi-Gel Blue&-pylvääseen (1 x 31,8 cm) ja eluoitiin virtausnopeudella 20 ml/tunti. Fraktiot (2 ml), jotka sisälsivät puhdistettua IgG:tä, yhdistettiin ja konsentroitiin lX:een 35 ultrasuodatuksella.Antiserum samples (2 mL) were applied to a DEAE Affi-Gel Blue & column (1 x 31.8 cm) and eluted at a flow rate of 20 mL / hr. Fractions (2 mL) containing purified IgG were combined and concentrated to 1x by ultrafiltration.
is 8071 2is 8071 2
Esimerkki 2 Tämä esimerkki kohdistuu C. difficilen puhtaaseen toksiiniin A.Example 2 This example is directed to pure C. difficile toxin A.
Bakteerikantaa, Clostridium difficile-kantaa 10463, 5 kasvatettiin 2 litran aivo-sydän infuusio-(BHI)-dialyysi-pulloissa 72 tuntia 37°C:ssa. Kun oli sentrifugoitu 8 000 x g:llä 10 minuuttia ja suodatettu 0,45 pm:n kalvosuodat-timen läpi (Millipore Corp., Bedford, MA), viljelmän neste (noin 750 ml) konsentroitiin 50 ml:ksi ultrasuodatuksella 10 4°C:ssa käyttäen XM-100-kalvosuodatinta (Amicon Corp., Lexington, MA) kanavatyyppisellä konsentroijalla. Pidättynyt aine pestiin 1 500 ml:11a 50 mM Tris-HCl-puskuria (pHThe bacterial strain, Clostridium difficile strain 10463, 5, was grown in 2-liter brain-heart infusion (BHI) dialysis flasks for 72 hours at 37 ° C. After centrifugation at 8,000 xg for 10 minutes and filtration through a 0.45 μm membrane filter (Millipore Corp., Bedford, MA), the culture fluid (approximately 750 mL) was concentrated to 50 mL by ultrafiltration at 10 4 ° C: using an XM-100 membrane filter (Amicon Corp., Lexington, MA) with a channel-type concentrator. The retained material was washed with 1,500 mL of 50 mM Tris-HCl buffer (pH
7,5) (4°C) ja konsentroitiin lopulliseen tilavuuteen 40-50 ml. Tämä poisti monia pieniä molekyylipainon epäpuh-15 tauksia. Konsentroitu neste pantiin 2,5 x 10 cm:n DEAE-Sepharos^t CL-6B-pylvääseen, joka oli tasapainotettu 50 mM Tris-HCl:llä (pH 7,5). Näytteen panon jälkeen pylväs pestiin 200 ml:11a 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), joka sisälsi 0,05 M NaCl. Näyte eluoitiin ensin 300 ml:n suoralla NaCl-20 gradientilla 50 mM Tris-HCl-puskurissa (0,05 - 0,25 M NaCl) ja sen jälkeen 150 ml:11a 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), joka sisälsi 0,3 M NaCl. Toinen 300 ml:n suora gradientti (0,3 - 0,6 M NaCl) samassa puskurissa seurasi 0,3 M NaCl-pesua. Pylväiden virtausnopeus oli 55 - 60 ml/tunti (pai-25 novoima) 4°C:ssa. Fraktiot (4,2 ml) kerättiin ja analysoitiin solumyrkkyjen suhteen käyttäen CHO-KI-soluja.7.5) (4 ° C) and concentrated to a final volume of 40-50 mL. This removed many small molecular weight impurities. The concentrated liquid was applied to a 2.5 x 10 cm DEAE-Sepharose CL-6B column equilibrated with 50 mM Tris-HCl (pH 7.5). After sample loading, the column was washed with 200 ml of 50 mM Tris-HCl (pH 7.5) containing 0.05 M NaCl. The sample was eluted first with a 300 ml direct gradient of NaCl-20 in 50 mM Tris-HCl buffer (0.05-0.25 M NaCl) and then with 150 ml of 50 mM Tris-HCl (pH 7.5), which contained 0.3 M NaCl. Another 300 ml straight gradient (0.3-0.6 M NaCl) in the same buffer was followed by 0.3 M NaCl washing. The flow rate of the columns was 55-60 ml / hour (weight-25 novo) at 4 ° C. Fractions (4.2 mL) were collected and analyzed for cytotoxicity using CHO-KI cells.
Fraktiot, jotka sisälsivät korkeimmat solumyrkky-tiitterit, yhdistettiin, suodatussteriloitiin ja säilytettiin 4°C:ssa. Toksiinit, jotka eluoituivat ensimmäisessä 30 ja toisessa NaCl-gradientissa, merkittiin toksiineiksi A ja B, tässä järjestyksessä, ja ne ovat osittain puhdistettua toksiinia A ja B, tässä järjestyksessä.Fractions containing the highest cytotoxic titers were pooled, filter sterilized and stored at 4 ° C. Toxins eluting in the first 30 and second NaCl gradients were designated toxins A and B, respectively, and are partially purified toxins A and B, respectively.
5 - 10 ml toksiinifraktioita ensimmäisestä DEAE-gradientista (toksiini A) dialysoitiin yhtä litraa vastaan 16 80712 0,01 M natriumasetaattipuskuria (pH 5,5) 4°C:ssa 18-24 tuntia.5 to 10 ml of toxin fractions from the first DEAE gradient (toxin A) were dialyzed against one liter of 16,80712 0.01 M sodium acetate buffer (pH 5.5) at 4 ° C for 18-24 hours.
Dialysoitu aine sentrifugoitiin sakan saamiseksi 169 x g:llä 10 minuuttia ja pestiin sitten 5 ml:11a samaa 5 asetaattipuskuria ja sentrifugoitiin jälleen. Sakka liuotettiin 5-10 ml:aan 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), joka sisälsi 0,05 M NaCl, ja puhtaan toksiinin A liuos suodatusste-riloitiin ja säilytettiin 4°C:ssa.The dialyzed material was centrifuged at 169 x g for 10 minutes to obtain a precipitate and then washed with 5 ml of the same acetate buffer and centrifuged again. The precipitate was dissolved in 5-10 ml of 50 mM Tris-HCl (pH 7.5) containing 0.05 M NaCl, and the pure toxin A solution was filter sterilized and stored at 4 ° C.
Esimerkki 3 10 Seuraavia puskureita käytetään analysoitaessa tok siineja A ja B.Example 3 10 The following buffers are used in the analysis of toxins A and B.
Karbonaattipuskuri (pinnoitepuskuri) 1,59 g Na2 C03 2,93 g NaHC03 15 0,20 g NAN3 täytä litraksi dH20:11a; pH 9,6; säilytä huoneen lämmössä (käytä 2 viikon kuluessa). Fosfaattipuskuroitu suolaliuos Tweenfc 20 (PBS-T) 8,0 g NaCl 20 0,2 g KH2P04 ; 2,9 g Na2HOP4.12 H20 (2,2 g Na2HOP4.7 H20) 0,2 g KC1 0,5 ml Tweer^ 20 (polyoksietyleenisorbitaanimono-lauraatti) 25 0,2 g NaN3 täytä litraksi dH20:11a; pH 7,4. Dietanoliamiinipuskuri (emäksiselle fosfataasisubstraatil-le) 97 ml dietanoliamiinia 30 800 ml dH20 0,2 g NaN3 100 mg MgCl2 .6 H20 titraa pH-arvoon 9,8 1 M HCl:lla ja täytä tilavuus litraksi dH20:11a; 35 säilytä tummassa pullossa huoneen lämmössä; 17 8071 2 substraattiliuokseksi lisää 1 mg substraattia ml:aan puskuria.Carbonate buffer (coating buffer) 1.59 g Na 2 CO 2 2.93 g NaHCO 3 0.20 g NAN 3 fill to one liter with dH 2 O; pH 9.6; store at room temperature (use within 2 weeks). Phosphate buffered saline Tweenfc 20 (PBS-T) 8.0 g NaCl 20 0.2 g KH 2 PO 4; 2.9 g Na2HOP4.12 H2O (2.2 g Na2HOP4.7 H2O) 0.2 g KCl 0.5 ml Tweer ^ 20 (polyoxyethylene sorbitan monourate) 0.2 0.2 g NaN3 fill to one liter with dH2O; pH 7.4. Diethanolamine buffer (for basic phosphatase substrate) 97 ml diethanolamine 30 800 ml dH 2 O 0.2 g NaN 3 100 mg MgCl 2 .6 H 2 O titrate to pH 9.8 with 1 M HCl and make up to one liter with dH 2 O; 35 Store in a dark bottle at room temperature; 17 8071 For 2 substrate solutions, add 1 mg of substrate per ml of buffer.
Clostridium difficile-toksiinien A ja B analyysi: 5 (1) Lisää 200 μΐ 1/10 000 laimennusta (karbonaattipus- kurissa; pH 9,6) kanin antiseerumia (vasta-aine C. diffi-cilelle) jokaiseen koloon Dynatech Immulon 2-tyyppisellä mikrotiitterilevyllä. Inkuboi 4°C:ssa yön yli.Analysis of Clostridium difficile toxins A and B: 5 (1) Add 200 μΐ 1 / 10,000 dilutions (in carbonate buffer; pH 9.6) of rabbit antiserum (antibody to C. diffilis) to each well with Dynatech Immulon 2-type microtiter plate. Incubate at 4 ° C overnight.
(2) Tyhjennä levy ja lisää 200 μΐ PBS-T, joka sisältää 10 0,5 % naudan seerumin albumiinia jokaiseen koloon. Inkuboi levy 37°C:ssa 30 minuuttia.(2) Empty the plate and add 200 μΐ PBS-T containing 10 0.5% bovine serum albumin to each well. Incubate the plate at 37 ° C for 30 minutes.
(3) Tyhjennä levy ja lisää 200 μΐ PBS-T jokaiseen koloon. Inkuboi huoneen lämmössä 5 minuuttia.(3) Empty the plate and add 200 μΐ PBS-T to each well. Incubate at room temperature for 5 minutes.
(4) Tyhjennä levy ja lisää 200 μΐ näytteen laimennusta 15 tai myrkyn laimennusta (1:2) PBS-T:ssä koloihin. Inkuboi levy joko 37°C:ssa 1 tunti tai huoneen lämpötilassa yön yli.(4) Empty the plate and add 200 μΐ sample dilution 15 or toxin dilution (1: 2) in PBS-T to the wells. Incubate the plate at either 37 ° C for 1 hour or at room temperature overnight.
(5) Tyhjennä levy ja pese jokainen kolo 3 kertaa PBS-T:llä.(5) Empty the plate and wash each well 3 times with PBS-T.
20 (6) Lisää 200 μΐ 1/1 000 laimennusta PBS-T:ssä monospe- sifistä vasta-ainetta joko toksiinille A tai toksiinille B jokaiseen koloon. Inkuboi levy 37°C:ssa 1 tunti.20 (6) Add 200 μΐ 1/1000 dilution in PBS-T of monospecific antibody to either toxin A or toxin B to each well. Incubate the plate at 37 ° C for 1 hour.
(7) Tyhjennä levy ja pese jokainen kolo 3 kertaa PBS-T:llä.(7) Empty the plate and wash each well 3 times with PBS-T.
25 (8) Lisää 200 μΐ 1/800 laimennusta (PBS-T:ssä) kanin anti-vuohen-IgG:tä liitettynä emäksiseen fosfataasiin jokaiseen koloon. Inkuboi levy 37°C:ssa 1 tunti.25 (8) Add 200 μΐ 1/800 dilution (in PBS-T) of rabbit anti-goat IgG coupled to alkaline phosphatase in each well. Incubate the plate at 37 ° C for 1 hour.
(9) Tyhjennä levy ja pese jokainen kolo 3 kertaa PBS-T:llä.(9) Empty the plate and wash each well 3 times with PBS-T.
30 (10) Lisää 200 μΐ p-nitrofenyylifosfaattia (1 mg/ml di- etanoliamiinipuskurissa) jokaiseen koloon. Inkuboi levy huoneen lämmössä 1 tunti.30 (10) Add 200 μΐ p-nitrophenyl phosphate (1 mg / ml in diethanolamine buffer) to each well. Incubate the plate at room temperature for 1 hour.
(11) Lisää 20 μΐ 5 N NaOH jokaiseen koloon reaktion lopettamiseksi .(11) Add 20 μΐ of 5 N NaOH to each well to stop the reaction.
is 8071 2 (12) Sekoita sisällöt jokaisesta kolosta 0,8 ml:n kanssa dH2O (kokonaistilavuus koeseoksessa noin 1 ml) ja mittaa adsorbanssi 405 nm:ssä.is 8071 2 (12) Mix the contents of each well with 0.8 ml of dH2O (total volume in the test mixture about 1 ml) and measure the adsorbence at 405 nm.
Tämä keksintö on erityisen edullinen siksi, että 5 sillä on mahdollista tuottaa vasta-aineita, jotka ovat spesifisiä vain C. difficilen toksiineille.This invention is particularly advantageous because it makes it possible to produce antibodies specific only for C. difficile toxins.
Lopputuloksena tarjotaan käyttöön analyysi, jolla on tarkoitus määrittää näiden toksiinien läsnäolo, pikemmin kuin C. difficilen läsnäolo, joka vähentää tai poistaa 10 väärät positiiviset tulokset.As a result, an assay is provided to determine the presence of these toxins, rather than the presence of C. difficile, which reduces or eliminates false positive results.
Edelleen saavutetaan se etu, että saadaan analyysi, joka voidaan suunnata joko jompaan kumpaan toksiineista tai molempiin toksiineihin.A further advantage is obtained in that an analysis is obtained which can be directed either to one of the two toxins or to both toxins.
Tällainen toksiinianalyysi on nopea ja myös halvem-15 pi kuin aikaisemmat analyysit.Such a toxin assay is rapid and also less expensive than previous assays.
Lukuisat muunnokset ja variaatiot ovat mahdollisia edellä esitetyn tiedon valossa.Numerous modifications and variations are possible in light of the above disclosure.
Claims (5)
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
FI840950A FI80712C (en) | 1984-03-08 | 1984-03-08 | FOERFARANDE FOER FRAMSTAELLNING AV RENT TOXIN A UR CLOSTRIDIUM DIFFICILE OCH EN ENLIGT FOERFARANDET FRAMSTAELLD PRODUKT. |
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
FI840950A FI80712C (en) | 1984-03-08 | 1984-03-08 | FOERFARANDE FOER FRAMSTAELLNING AV RENT TOXIN A UR CLOSTRIDIUM DIFFICILE OCH EN ENLIGT FOERFARANDET FRAMSTAELLD PRODUKT. |
FI840950 | 1984-03-08 |
Publications (4)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
FI840950A0 FI840950A0 (en) | 1984-03-08 |
FI840950A FI840950A (en) | 1985-09-09 |
FI80712B FI80712B (en) | 1990-03-30 |
FI80712C true FI80712C (en) | 1990-07-10 |
Family
ID=8518694
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
FI840950A FI80712C (en) | 1984-03-08 | 1984-03-08 | FOERFARANDE FOER FRAMSTAELLNING AV RENT TOXIN A UR CLOSTRIDIUM DIFFICILE OCH EN ENLIGT FOERFARANDET FRAMSTAELLD PRODUKT. |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
FI (1) | FI80712C (en) |
-
1984
- 1984-03-08 FI FI840950A patent/FI80712C/en not_active IP Right Cessation
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
FI840950A (en) | 1985-09-09 |
FI80712B (en) | 1990-03-30 |
FI840950A0 (en) | 1984-03-08 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US4533630A (en) | Toxins and antibodies of C. difficile | |
US3966898A (en) | Method and reagent for determining immunologic materials | |
Turkova | Oriented immobilization of biologically active proteins as a tool for revealing protein interactions and function | |
Doellgast et al. | Sensitive enzyme-linked immunosorbent assay for detection of Clostridium botulinum neurotoxins A, B, and E using signal amplification via enzyme-linked coagulation assay | |
US4410660A (en) | Binding assay for the detection of mycobacteria | |
US4879218A (en) | Antibody for C.difficile | |
US4575484A (en) | Binding assay for the detection of mycobacteria | |
US4530833A (en) | Toxins and antibodies of C. difficile | |
EP0153519B1 (en) | Toxins and antibodies of c. difficile | |
JPH01114758A (en) | Manufacture of antibody fragment preparation containing no papain | |
Halbert | THE USE OF PRECIPITIN ANALYSIS IN AGAR FOR THE STUDY OF HUMAN STREPTOCOCCAL INFECTIONS: III. THE PURIFICATION OF SOME OF THE ANTIGENS DETECTED BY THESE METHODS | |
CA1329196C (en) | Verocytotoxin receptor assay | |
US4489158A (en) | Binding assay for the detection of mycobacteria | |
US5601830A (en) | Staphylococcus aureus enterotoxin H and methods of use | |
Muronetz et al. | Use of protein–protein interactions in affinity chromatography | |
Guesdon et al. | An immunoenzymatic method for measuring low concentrations of antigens by single radial diffusion | |
FI80712C (en) | FOERFARANDE FOER FRAMSTAELLNING AV RENT TOXIN A UR CLOSTRIDIUM DIFFICILE OCH EN ENLIGT FOERFARANDET FRAMSTAELLD PRODUKT. | |
Nickerson et al. | Indirect visualization of Staphylococcus aureus protein A | |
Strange et al. | The rapid detection and determination of sparse bacterial populations with radioactively labelled homologous antibodies | |
EP0154064A1 (en) | Toxins and antibodies of C. difficile | |
EP0298991B1 (en) | Novel lectins derived from bacterial pili | |
FI81366C (en) | Method for Obtaining Antibodies Specific to Clostr idium difficile Toxins and Using Antibodies in Methods for Determining Toxins | |
Heinzel et al. | Immunoadsorbents: Non-specific binding of proteins to albumin-Sepharose | |
CA1237073A (en) | Toxins and antibodies of c.difficile | |
CA1222695A (en) | Toxins and antibodies of clostridium difficile |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM | Patent lapsed |
Owner name: WILKINS, TRACY DALE Owner name: SULLIVAN, NADINE MICHELE |