FI81366C - Foerfarande foer erhaollande av antikroppar, som aer specifika mot clostridium difficile-toxiner och anvaendning av antikroppar vid foerfaranden foer bestaemning av toxiner. - Google Patents

Description

1 81366

Menetelmä Clostridium difficile-toksiineille spesifisten vasta-aineiden saamiseksi ja vasta-aineiden käyttö toksiinien määritysmenetelmissä 5 Tämä keksintö koskee menetelmiä vasta-aineiden saa miseksi, jotka ovat spesifisiä Clostridium difficile-toksiineille tai monospesifisiä C. difficilen toksiini A:lie tai B:lle. Keksintö koskee myös menetelmällä saatujen vasta-aineiden käyttöä myrkyllisten C. difficilien tai niiden 10 toksiini A:n tai B:n määritysmenetelmissä. Keksinnölle ovat tunnusomaisia patenttivaatimuksissa määritellyt seikat .

Anaerobinen organismi Clostridium difficile (C. difficile) on yhdistetty antibioottiin liittyvään valekal-15 voiseen paksusuolentulehdukseen, ja tästä syystä on kehitetty kokeita, jolla varmistetaan C. difficile-antigeenin läsnäolo ihmisen ulostenäytteissä.

Eräs sellainen koe käsittää ihmisen ulosteviljelyn, joka vaatii erityiset laitteet ja pitkän ajan. Tämä koe 20 ilmaisee myös ne C. difficile-kannat, jotka eivät tuota toksiineja, ja antaa näin vääriä positiivisia tuloksia.

Vielä eräs koe käsittää entsyymi-immunomääritysme-netelmän, joka nykyisin käytettynä ei kuitenkaan erota myrkyllisiä ja myrkyttömiä kantoja toisistaan, ja tästä 25 syystä koe voi antaa virheellisiä tuloksia.

Tässä on tutkittu C. difficilen toksiinien vasta-aineita, C. difficilen toksiineja, ja myrkyllisen C. difficilen määritysmenetelmää.

Tässä tarjotaan käyttöön monospesifinen vasta-aine 30 C. difficilen toksiini A:lie ja sellainen monospesifinen vasta-aine ylläpidettynä kiinteällä alustalla.

Tässä tarjotaan lisäksi käyttöön monospesifinen vasta-aine C. difficilen toksiini B:lle ja sellainen monospesif inen vasta-aine ylläpidettynä kiinteällä alustalla.

2 81366

Vielä tarjotaan käyttöön C. difficilen puhdas toksiini A ja sellainen toksiini kiinteällä alustalla.

Vielä erään näkökannan mukaan tarjotaan käyttöön määritysmenetelmä C. difficilen toksiini A:lie, jossei me-5 netelmässä käytetään monospesifistä vasta-ainetta toksiini A:lie.

Vielä erään näkökannan mukaan tarjotaan käyttöön määritysmenetelmä myrkylliselle C. difficilelle.

Termi "monospesifinen vasta-aine toksiini A:lie" 10 tässä käytettynä tarkoittaa vasta-ainetta, jolla ei ole mitään määrättyjä paikkoja muille C. difficile-antige.e-neille kuin toksiini A:lie.

Termi "monospesifinen vasta-aine toksiini B:lle" tässä käytettynä tarkoittaa vasta-ainetta, jolla ei ole 15 mitään määrättyjä paikkoja muille C. difficile-antigee-neille kuin toksiini B:lle.

Termiin "monospesifinen vasta-aine" tässä käytettynä sisältyy sellainen vasta-aine monoklonaalisessa muodossa.

20 On ymmärrettävä, että monospesifisiä vasta-aineita toksiini A:lie tai toksiini B:lle voidaan valmistaa muista organismeista kuin C. difficilestä, niin kauan kun vasta-aineella ei ole määrättyä paikkaa muille C. dif f icil€!-an-tigeeneille.

25 "C. difficile-vasta-aine" tai "vasta-aine C. diffi- cilelle" merkitsee vasta-ainetta, joka ei ole monospesifi-nen, ja joka sen vuoksi käsittää vasta-aineseoksen, joka sisältää vasta-aineet C. difficilen toksiineille (vasta-aine toksiini A:lie ja vasta-aine toksiini B:lle) ja vas-30 ta-aineet C. difficilen ei-toksiineille.

Vasta-aine myrkylliselle C. difficilelle tai vasta-aine erityisesti C. difficilen toksiineille tarkoittaa vasta-ainetta, jolla ei ole määrättyjä paikkoja C. difficilen muille antigeeneille kuin toksiini A:lie ja toksiini 35 B:lle (toksiini A:lie spesifisen ja toksiini B:lle spesifisen vasta-aineen seos).

3 81 6 6 6

Toksiini A on C. difficile-toksiini, jota yleensä pidetään suoliston limakalvomyrkkynä. Toksiini Ailia on alkuperäinen molekyylipaino välillä 550 000 ja 600 000, ja isoelektrinen piste 5,5; se ei sisällä havaittavasti hii-5 lihydraatteja tai fosforia, eikä sillä ole havaittavaa proteaasivaikutusta. Se on inertti pHissa 2,0 ja pysyvä pHissa 10,0. Toksiini A eluoidaan DEAEista puskurilla, joka sisältää 0,16 M NaCl.

Toksiini B on C. difficile-toksiini, jota yleensä 10 pidetään C. difficilen solumyrkkynä. Toksiini Billä on alkuperäinen molekyylipaino välillä 380 000 ja 470 000, ja isoelektrinen piste 3,8; se ei sisällä havaittavaa fosforia, mutta sisältää hyvin pieniä määriä hiilihydraatteja (joka voi olla epäpuhtautta), eikä osoita havaittavaa pro-15 teaasivaikutusta. Toksiini B on inertti pH-arvoissa alle 2,0 ja yli 10,0, ja se eluoidaan DEAE-pylväästä suolalla, jonka konsentraatio on 0,4 M.

On ymmärrettävissä kuitenkin, että vaikka toksiini Aita pidetään suoliston limakalvomyrkkynä, toksiini Ailia 20 on myös solumyrkkyominaisuuksia.

Tässä kuvataan myös miten toksiini A, joka on osittain puhdistettu erottamalla toksiini Bistä ja jossa vielä on joitakin ei-myrkyllisiä proteiineja, puhdistetaan edelleen puhtaan toksiini A:n saamiseksi. Keksinnön tämän nä-25 kökannan mukaan toksiini Ai n vesiliuoksen pH ja molaari-suus säädetään toksiini Am saostamiseksi ilman, että jäljellä olevat proteiinit saostuvat, jolloin saadaan puhdas toksiini A.

Tarkemmin ilmaistuna, vesiliuoksen pH säädetään 30 arvoon alle 6,0, jossa toksiini A saostuu ilman muiden proteiinien saostumista tai toksiinin denaturoitumista, ja vesiliuoksen molaarisuus säädetään alemmaksi kuin 0,1 M, jossa toksiini A saostuu ilman muiden proteiinien saostumista.

4 81 3 6 6

Yleensä pH on ainakin 5,0, edullisen pH:n ollessa 5,3 - 5,7 ja parhaan tuloksen ollessa saavutettavissa pH:ssa 5.5. Liuoksen molaarisuus on yleensä ainakin 0,001 M, parhaan tuloksen ollessa saavutettavissa 0,01 M:ssä. Molaari- 5 suus ja pH voidaan säätää käyttämällä sopivaa suolapusku-ria, esim. natriumasetaattipuskuria. Molaarisuuden säätö voidaan mukavasti saavuttaa dialyysillä, vaikka muutkin menetelmät ovat sopivia.

Saostunut puhdas toksiini A saadaan vesiliuoksesta 10 ja se voidaan liuottaa veteen puskuroidussa pH:ssa noin 7.5.

Osittain puhdistettu toksiini A, joka puhdistetaan puhtaan toksiini A:n saamiseksi, voidaan saada alalla yleisesti tunnetuilla menetelmillä. Esimerkiksi sakan yllä 15 oleva neste myrkyllisen C. difficilen soluviljelmästä konsentroidaan ultrasuodatuskalvolla, joka pidättää vain suuret molekyylit (mp. yli 100 000) ja pidättynyt aine käsitellään kromatografiapylväässä. Pylväs (DEAE) eluoidaan sitten natriumkloridigradienteilla (ensimmäinen gradientti 20 on 0,05 - 0,25 M NaCl yhdessä 0,3 M:n NaCl-pesun kanssa, ja toinen gradientti on 0,3 - 0,6 NaCl), ensimmäisen gradientin eluoidessa toksiini A:n ja toisen gradientin toksiini B:n.

Termi "puhdas toksiini A" tässä käytettynä merkit-25 see sitä, että toksiini A:n valmistus on vapaa epäpuhtauksista (vain toksiini A on läsnä), kun sitä tutkitaan alalla tunnetuilla erittäin tarkoilla analyysimenetelmillä.

Termi "osittain puhdistettu" tässä käytettynä merkitsee sitä, että joitakin epäpuhtauksia, mutta ei kaik-30 kia, on poistettu.

Puhdas toksiini A, kun se on valmistettu edellä kuvatuilla menetelmillä, on puhdas, kun se täyttää seuraa-vat kriteerit: yksittäinen vyöhyke akryyliamidigeeli-elektroforeesissa, 35 kun käytetään 100 pg proteiinia geeliliuskaa kohti (Davis-, SDS- ja gradienttigeelit); 5 81366 yksittäinen immunopresipitiinikaari ristikkäisillä immuno-elektroforeesilevyillä antiseerumien kanssa, jotka on tehty täydelliseen C. difficile-antigeenien seokseen; ja puhdas toksiini A eläimeen injektoituna saa aikaan mono-5 spesifisen vasta-aineen valmistumisen toksiini A;lie.

Monospesifinen vasta-aine C. difficilen toksiini A:lie ja monospesifinen vasta-aine C. difficilen toksiini B:lle voidaan valmistaa useilla erilaisilla menetelmillä.

Erään menetelmän mukaan C. difficile-viljelmän, 10 joka oli valmistettu tunnetulla viljelymenetelmällä, sakan yllä olevat nesteet keitetään kaikkien kuumuutta kestämättömien proteiiniantigeenien (myrkyllinen ja myrkytön antigeeni) tuhoamiseksi ja näin saadaan aine, joka sisältää vain C. difficilen kuumuutta kestäviä antigeenejä. Nämä 15 antigeenit tuetaan sitten ensimmäiseen syanogeenibromidil-la aktivoituun pylvääseen.

Osittain puhdistettu toksiini A ja osittain puhdistettu toksiini B, joista kumpikin on saatu DEAE-kromato-grafiapylväästä saadusta eluointinesteestä edellä kuvatul-20 la tavalla, liitetään toiseen ja vastaavasti kolmanteen syanogeenibromidilla aktivoituun Sepharose®-pylvääseen.

Vasta-aineet karkeille C. difficile-antigeenimyr-kyille (joka myrkky sisältää sekä toksiini A:ta että toksiini B:tä, kuten myös monia muita bakteerin tuottamia 25 antigeenejä) valmistetaan sopivissa eläimissä, esim. vuohissa, ja syntynyt vasta-aine koostuu C. difficile-anti-geenien vasta-aineseoksesta (sellainen vasta-aineseos sisältää vasta-aineita toksiini A:lie ja toksiini B:lle, sekä vasta-aineita myrkyttömille antigeeneille, mukaan-30 luettuina vasta-aineet kuumuutta kestäville antigeeneille). Myrkyttömät vasta-aineet (paitsi vasta-aineet myrkyttömille kuumuutta kestäville antigeeneille) poistetaan vasta-aineseoksesta saattamalla ne kosketuksiin myrkyttömän C. difficile-kannan kokonaisten solujen kanssa, jol-35 loin ne siinä yhteydessä sitovat muut vasta-aineet ei-myr- 6 81366 kyllisiin aineisiin (paitsi vasta-aineet myrkyttömille kuumuutta kestäville antigeeneille).

Sen jälkeen vasta-aineseos (joka nyt sisältää vasta-aineet toksiineille ja vasta-aineet myrkyttömille kuu-5 muutta kestäville antigeeneille) pannaan sitten ensimmäiseen pylvääseen, jossa on kuumuutta kestäviä C. difficile-antigeenejä, jolloin sokerivasta-aineet kuumuutta kestä-ville antigeeneille sitoutuvat.

Seos, jossa ei ole vasta-ainetta kuumuutta kestäviä 10 antigeenejä vastaan ja joka sisältää vasta-aineet toksiini A: lie ja B:lle, jaetaan sitten kahteen osaan; yksi osa pannaan toiseen pylvääseen, jossa on puhdasta toksiini A:ta, ja toinen osa pannaan kolmanteen pylvääseen, jossa on osittain puhdistettua toksiini B:tä, jolloin toisessa 15 pylväässä vasta-aine toksiini A:lie sitoutuu selektiivisesti tuettuun toksiini A:hän ja kolmannessa pylväässä vasta-aine toksiini B:lle sitoutuu selektiivisesti tuettuun toksiini B:hen.

Vasta-aineet toksiini A:lie ja vasta-aineet toksii-20 ni B:lle eluoidaan sen jälkeen toisesta ja vastaavasti kolmannesta pylväästä esim. käyttämällä kaliumtiosyanaat-tia saamaan monospesifinen vasta-aine toksiini B:lle.

Joissakin tapauksissa, kuten tässä jäljempänä on kuvattu, vasta-aineen toksiini A:lie ja vasta-aineen tok-25 ' siini B:lle muodostama seos (sen jälkeen kun myrkyttömät antigeenit on poistettu) voidaan käyttää erottamatta mono-spesifiseen vasta-aineeseen kullekin toksiinille, esim. määritettäessä myrkyllistä C. difficileä.

Vaihtoehtoisesti voidaan monospesifinen vasta-aine 30 toksiini A:lie valmistaa panemalla karkea C. difficile- vasta-aine pylvääseen, joka on tuettu immobilisoidulla puhtaalla toksiini Ailia. Myrkyttömät A-vasta-aineet poistetaan pylväästä runsaasti pesemällä ja jäljellä olevat vasta-aineet, jotka ovat liittyneet toksiini A:hän, eluoi-35 daan kaliumtiosyanaatilla.

Il 7 81 3 6 6

Vaihtoehtoisesti monospesifinen vasta-aine toksiini A:lie voidaan valmistaa puhdistetusta toksiini A:sta, joka on valmistettu edellä kuvatulla tavalla, injektoimalla toksiini A (sekoitettuna pieneen määrään formaldehydiä 5 myrkyllisyyden alentamiseksi tuhoamatta antigeenisyyttä tai neutraloituna vasta-aineen kanssa) sopivaan eläimeen, esim. vuoheen. Monospesifinen vasta-aine toksiini A: lie saadaan sitten edellisessä kappaleessa kuvatulla menetelmällä.

10 Monospesifisiä vasta-aineita ja toksiineja voidaan tämän keksinnön mukaisesti ylläpitää kiinteällä alustalla käytettäväksi C. difficilen määritykseen. Vaihtoehtoisesti sellaisia vasta-aineita ja toksiineja voidaan käyttää sellaisessa määrityksessä kannakkeettomassa muodossa.

15 Käytettäessä kiinteää alustaa, kiinteä alusta voi olla mikä tahansa monista kiinteistä aineista ja missä tahansa muodossa monista mahdollisista, esim. levyinä, tarjottimina, hiukkasina, putkina, laattoina jne.

Edustavina esimerkkeinä sopivista alustoista voi-20 daan mainita synteettiset polymeerialustat, kuten poly- styreeni, polypropyleeni, substituoitu polystyreeni (esim. aminoitu tai karboksyloitu polystyreeni), polyakryyliami-dit, polyamidit, polyvinyylikloridi jne., lasialusta, aga-roosi jne. Alustat voivat sisältää reaktiivisia ryhmiä, 25 esim. karboksyyliryhmiä, aminoryhmiä jne. antamaan mahdollisuus suoraan sitoutumiseen alustaan.

Tämän keksinnön mukaisesti valmistetut vasta-aineet ja toksiinit voidaan tukea kiinteälle alustalle monilla eri tavoilla, esimerkiksi absorptiolla, kovalenttisella 30 kytkennällä, aktivoimalla sopiva alusta proteiinilla A jne.

Edustavina esimerkkeinä sopivista kytkentäaineista voidaan mainita dialdehydit, esimerkiksi glurataldehydi, sukkiinialdehydi, malonialdehydi jne., tyydyttämätön alde-35 hydi jne., karbodi-imidit, di-isosyanaatit, dimetyyliadi- 8 81 3 6 6 pimaatti, syaaniuriinikloridi jne. Sopivan kytkentäaineen valinnan pitäisi olla selvää alaan perehtyneille tässä annetuista tiedoista.

Samalla tavalla antigeeni voidaan tukea aktivoimal-5 la sopiva alusta, esimerkiksi syanogeenibromidilla aktivoitu agaroosi.

Tämän keksinnön näkökannan mukaan keksinnön mukaisesti valmistettuja vasta-aineita ja mainittuja toksiineja voidaan käyttää C. difficilen joko toksiini A:n tai tok-10 siini B:n tai myrkyllisen C. difficilen (sekä toksiini A:ta että toksiini B:tä) määritysmenetelmissä.

Joissakin sellaisista määritysmenetelmistä käytetään yhtä tai useampaa ainetta "leimatussa" tai "merkityssä" muodossa, ja sellaiset leimat tai merkit ovat alalla 15 tunnettuja määrityksessä käytettäviksi. Niinpä esimerkiksi leima tai merkki voi olla radioaktiivinen aine, kuten radioaktiivinen jodi, radioaktiivinen koboltti, tritium jne., entsyymi, fluoresoiva aine, kemiluminesenssi-aine jne.

20 Leimat voidaan lisätä eri aineisiin menetelmillä, joita alalla yleensä käytetään. Samalla tavalla leima tai merkki voidaan havaita alalla tunnetuilla menetelmillä, esimerkiksi radioaktiivisten leimojen laskureilla, entsyymien kolorimetrisella määrityksellä jne.

25 Tässä kuvattuja vasta-aineita ja toksiineja voidaan käyttää tuetussa ja/tai tukemattomassa muodossa C. difficilen määritykseen.

Keksinnön erään suoritusmuodon mukaan tarjetaan käyttöön koe C. difficilen toksiini A:lie käyttämällä mo-30 nospesifistä vasta-ainetta toksiini A:lie.

Tämän suoritusmuodon erään näkökannan mukaan vasta-aine C. difficilelle tuetaan kiinteälle alustalle, esimerkiksi mikrotiitterilevylle. Tuettu C. difficile-vasta-aine saatetaan sitten kosketukseen näytteen (analyytti), kuten 35 potilaan ulosteen laimennuksen kanssa, ja tuloksena sei- g 81 3 6 6 laisesta kosketuksesta mikä tahansa analyytissä läsnäoleva toksiini A, kuten myös muut C. difficilen antigeenit, sitoutuvat tuettuun C. difficile-vasta-aineeseen. Sen jälkeen sitoutunut analyyttierä saatetaan kosketukseen C.

5 difficilen toksiini A:lie monospesifisen vasta-aineen kanssa (kasvatettu erilaisessa eläimessä kuin se, jossa C. difficile-vasta-aine kasvatettiin), ja sellainen monospe-sifinen vasta-aine sitoutuu vain mihin tahansa analyytti-erässä läsnäolevaan toksiini A:hän.

10 Tämä monospesifinen vasta-aine voi sinänsä olla leimattu entsyymillä, fluoresenssiaineella tai radioaktiivisella aineella kuten edellä on kuvattu, ja toksiini A:n läsnäolo voidaan määrittää havaitsemalla tämän leiman läsnäolo.

15 Vaihtoehtoisestri toksiini A:hän sitoutunut mono- spesifinen vasta-aine voidaan havaita käyttämällä leimattua vasta-ainetta, joka on spesifinen sen eläimen vasta-aineelle, jossa monospesifinen vasta-aine tuotettiin. Tämä sitoutuu monospesifiseen vasta-aineeseen, joka on liitty-20 nyt toksiini A:hän. Tätä menetelmää kutsutaan alalla ELISA-kokeen kaksinkertaiseksi vasta-aineen kerrostumaksi.

Toksiini A:n läsnäolo analyytissä voidaan määrittää sen vuorovaikutuksen avulla toksiini A:lie monospesifisen vasta-aineen kanssa kokeessa.

25 Edellä esitettyä menetelmää voidaan myös käyttää toksiini B:n määrittämiseen analyytissä käyttämällä mono-spesifistä vasta-ainetta toksiini B:lle, toksiini A: lie monospesifisen vasta-aineen sijasta.

Toisessa C. difficilen toksiini A:n kokeessa mono-30 spesifinen vasta-aine toksiini A:lie voidaan tukea kiin-teälle alustalle esimerkiksi mikrotiitterilevylle, ja tuettu monospesifinen vasta-aine toksiini A:lie saatetaan kosketukseen analyytin kanssa, jonka epäillään sisältävän toksiini A:ta, jolloin näytteessä läsnäoleva toksiini A 35 (ja vain toksiini A) sitoutuu tuettuun monospesifiseen ίο 81 3 6 6 vasta-aineeseen. Sitoutuneen toksiini A:n läsnäolo ja/tai määrä voidaan sitten määrittää saattamalla sitoutunut toksiini A kosketukseen C. difficile-vasta-aineen leimatun muodon kanssa, jolloin sellainen leimattu vasta-aine si-5 toutuu sitoutuneeseen toksiini A:hän. Analyytissä läsnäolevan toksiini A:n läsnäolo ja/tai määrä määritetään sitten määrittämällä sitoutuneen leimatun vasta-aineen läsnäolo ja/tai määrä.

Edellä esitettyä menetelmää voidaan myös käyttää 10 kokeessa toksiini B:lle korvaamalla toksiini A:lie mono-spesifinen vasta-aine toksiini B:lle monospesifisellä vasta-aineella.

Vielä erään toksiini A:lie olevan kokeen mukaan analyytti, joka sisältää tai jonka oletetaan sisältävän 15 toksiini A:ta, tuetaan kiinteälle alustalle, kuten mikro-tiitterilevylle niin, että ainakin toksiini A analyytissä on tuettu kiinteälle alustalle. Tämän toksiini A:n läsnäolo havaitaan sitten toksiini A:lie monospesifisellä vasta-aineella. Tuettu toksiini A sitoo selektiivisesti vain 20 toksiini A:lie monospesifisen vasta-aineen. Niinpä mono-spesifinen vasta-aine tuetaan kiinteälle alustalle analyy-tin tuetun toksiini A:n avulla. Tällä vasta-aineellci voi olla liittyneenä leima, kuten entsyymi, joka sallii sen havaitsemisen tai voidaan käyttää leimattua vasta-ainetta, 25 joka reagoi toksiiniin sitoutuneeseen vasta-aineeseen (kerros-ELISA-menetelmä). Sitoutuneen leimatun vasta-ai-neen läsnäolo ja/tai määrä on analyytissä olevan toksiini A:n läsnäolon tai määrän merkki.

Vielä erään analyysin mukaan toksiini A voidaan 30 havaita agglutinaatiomenetelmällä. Tällaisen menetelmän mukaisesti kiinteät hiukkaset, jotka on herkistetty toksiini A: lie monospesif isellä vasta-aineella, saatetaan kosketukseen analyytin kanssa, joka sisältää tai jonka epäillään sisältävän toksiini A:ta, ja toksiini A:n läsnä-35 ollessa aiheutuu tällaisten hiukkasten agglutinaatio.

Il li 81 3 6 6

Agglutinaatiomääritys on myös sopiva toksiini B:n havaitsemiseen käyttäen toksiini B:lle monospesifisiä vasta-aineita toksiini A:lie monospesifisten vasta-aineiden sijasta.

5 Vielä erään toisen menetelmän mukaan toksiini A

voidaan määrittää estämällä agglutinaatiomenetelmää saattamalla puhtaalle toksiini A:lie herkistyneet kiinteät hiukkaset (tai karkealle toksiini A: ta sisältävälle C. difficile-toksiinille herkistyneet) kosketukseen sekä ana-10 lyytin kanssa, joka sisältää tai jonka epäillään sisältävän toksiini A:ta, että C. difficilen monospesifisten vasta-aineiden kanssa, jolloin toksiini A: n läsnäollessa ana-lyytissä monospesifisillä vasta-aineilla tapahtuva herkistyneiden hiukkasten agglutinaatio estyy.

15 Tätä menetelmää voidaan käyttää myös määritettäessä toksiini B:tä herkistämällä hiukkaset karkealle toksiinille ja käyttämällä toksiini B:lle monospesifistä vasta-ainetta.

Lisämuunnoksena menetelmää voidaan käyttää määrit-20 tämään myrkyllinen C. difficile (toksiini A ja/tai toksiini B) käyttämällä vasta-ainetta myrkylliselle C. diffi-cilelle (seos, jossa on toksiini A:lie monospesifinen vasta-aine ja toksiini B:lle monospesifinen vasta-aine, joilla ei ole määrättyjä paikkoja myrkyttömille antigeeneil-25 le). Käyttämällä tällaisten monospesifisten vasta-aineiden seosta on mahdollista määrittää toksiini A:n ja toksiini B:n läsnäolo näytteessä.

Tätä keksintöä kuvataan edelleen seuraavien esimerkkien avulla.

30 Esimerkki 1 Tämä esimerkki kohdistuu toksiini A:lie monospesi-fisen vasta-aineen valmistukseen, ja toksiini B:lle mono-spesifisen vasta-aineen valmistukseen.

12 81 3 6 6

Bakteerit ja kasvuolosuhteet 2 litran aivo-sydän-infuusio-dialyysiputkellisiin pulloihin siirrostettiin 0,1 ml C. difficile VPI-kannan 11186 (myrkytön) ja C. difficile VPI-kannan 10463 (myrkyl-5 linen) aktiivisesti kasvavia viljelmiä, ja pulloja inku-boitiin 37°C:ssa 3 päivää. Solut saatiin dialyysipussin sisältä sentrifugoimalla sisältö (9 000 x g, 15 minuuttia ).

Solujen keitetyn pesunesteen valmistus (BCW) -10 Sepharosffi toksiini A (Tox A) - Sepharose®, toksiini B (Tox B)_- Sepharosd®

Kannan 10463 pakatut solut (noin 15 ml saatuna 12 pullosta) pestiin 3 kertaa (30 ml/pesu) 0,1 M NaHC03/0,5 M NaCl-liuoksella (pH 8). Solujen pesunesteet yhdistettiin 15 ja seosta kuumennettiin 100°C:ssa 15 minuuttia. Saostunut aine poistettiin sentrifugoimalla (12 000 x g, 30 minuuttia) ja neste sakan yltä (n. 34 mg proteiinia 90 ml:ssa) lisättiin 60 mlraan Sepharose!® 4B:tä (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Ruotsi), joka oli aktivoitu 18 g:11a CNBr. 20 Suspensiota sekoitettiin hiukan 4°C:ssa yön yli ja liittymätön aine poistettiin pesemällä geeli pylvään tilavuudella 0,1 M NaHC03/0,5 M NaCl-liuosta. Pesunesteen proteiini-analyysi osoitti, että geelivalmiste sisälsi noin 0,3 mg proteiinia ml:ssa geeliä. Sepharos^-geelissä jäljellä ole-25 vat aktiiviset ryhmät salvattiin lisäämällä pylvään tilavuus 1 M etanoliamiinia (pH 8) ja sekoittamalla geeliä 4°C:ssa yön yli. Geeli, merkitty BCW-Sepharose, pestiin 4 kertaa vaihtelevilla tilavuuksilla (2 pylvään tilavuutta-/pesu) 0,1 M natriumasetaatti/0,5 M. NaCl-liuosta (pH 4) ja 30 0,1 M NaHCOj/O, 5 M NaCl-liuosta (pH 8).

Osittain puhdistettu toksiini A ja toksiini B valmistettiin ioninvaihtokromatografialla DEAE-Sepharosd® Cl-6B:llä (Pharmacia Fine Chemicals) kuten on kuvattu esimerkissä 2, ja jokaista valmistetta dialysoitiin yön yli 35 4°C:ssa 0,1 M NaHC03/0,5 M NaCl-liuosta vastaan. Toksiini

II

13 81 3 6 6 A (noin 3,3 mg proteiinia 20 ml:ssa) ja toksiini B (noin 1,1 mg proteiinia 20 ml:ssa) liitettiin molemmat kuten on kuvattu BCW-Sepharoselle 20 ml:aan Sepharos^) 4B: tä, joka oli aktivoitu 7 g:11a CNBr. Proteiinianalyysit pesunes-5 teistä osoittivat, että Tox A-Sepharose ja Tox B-Sepharose sisälsivät 170 yg proteiinia ja vastaavasti 54 yg proteiinia ml:ssa geeliä.

Toksiini A:n ja toksiini B:n vastaisten monospesi-fisten antiseerumien puhdistus 10 Valmistettiin vuohen antiseerumi kuten aikaisemmin kuvattiin, käyttäen jäähdytettyä formaldehydiä (M. Ehrich, R. L. Van Tassell, J. M. Libby ja T. D. Wilkins, 1980; Production of Clostridium difficile antitoxin; Infect. Im-mun. 28, ss. 1041 - 1043) karkeata toksiini A:ta ja tok-15 siini B:tä sisältävää C. difficile-toksiinivalmistetta vastaan. Antiseerumia (5 ml) lisättiin suspensioon, jossa oli kannan 11186 soluja (1,5 ml pakattuja soluja 3 ml:ssa 0,85-%:ista NaCl) ja seos homogenisoitiin varovasti Potter Elvehjam-kudosjauhimella ja pyöritettiin sitten 2 tuntia 20 huoneen lämpötilassa. Solut poistettiin sitten sentrifu-goimalla (12 000 x g, 30 minuuttia) ja sakan yllä oleva neste vietiin 0,45 ym:n kalvon läpi ja konsentroitiin IX:een Minicon B15-konsentroijalla (Amicon Corp., Lexington, Mass., USA). Kannan 11186 solu-absorboitu antiseerumi 25 (4,1 ml) pantiin BCW-Sepharose-pylvääseen (1,5 x 31,4 cm) ja absorboitumaton aine eluoitiin huoneen lämpötilassa 2 pylvään tilavuudella 0,1 M NaHC03/0,5 M NaCl-liuosta (pH 8) virtausnopeudella 40 ml/min. Eluaatti konsentroitiin IX:een ultrasuodatuksella solusekoituslaitteessa, jossa 30 oli PM 10-kalvosuodatin (Amicon Corp.). BCW-Sepharose- eluaatti (4,1 ml) jaettiin 2 erään, jotka pantiin Tox A-Sepharose- ja Tox B-Sepharose-pylväisiin (1 x 25 cm). Absorboitumaton aine eluoitiin huoneen lämpötilassa jokaisesta pylväästä 2 pylvään tilavuudella 0,1 M NaHC03/0,5 M 35 NaCl-liuosta (pH 8) virtausnopeudella 40 ml/min. Eluaatit konsentroitiin lX:een ultrasuodatuksella.

1« 81366

Tox A-Sepharoseen ja Tox B-Sepharoseen sitoutuneiden vasta-aineiden eluointi

Kun absorboitumaton aine oli eluoitu Tox A-Sepharo-sesta ja Tox B-Sepharosesta, pylväät pestiin 0,1 M NaHC03/ 5 0,5 M NaCl-liuoksella (pH 8), kunnes ei ollut enää mitään havaittavaa absorbanssia 280 nm:ssä. Geeleihin sitoutuneet vasta-aineet eluoitiin käyttämällä 5 ml 3,5 M KSCN (pH 6,8) jokaiseen pylvääseen ja pesemällä 0,1 M NaHC03/0,5 M NaCl-liuoksella. Noin 2 pylvään tilavuutta kerättiin jo-10 kaisesta pylväästä. Eluaatit dialysoitiin 4 l:aa vastaan 0,1 M boraattipuskuroitua suolaliuosta (pH 5,8) 4°C:ssa yön yli ja konsentroitiin IXreen ultrasuodatuksella.

Tox A-Sepharose-pylväästä eluoitu vasta-aine on monospesifinen vasta-aine C-difficilen toksiini A:lie ja 15 Tox B-Sepharose-pylväästä eluoitu vasta-aine on monospesi-finen vasta-aine C-difficilen toksiini Brlle.

IgG-fraktion puhdistus

Tox A-Sepharose- ja Tox B-Sepharose-pylväästä eluoidut vasta-aineet puhdistettiin kromatografialla DEAE 20 Affi-Gel Blue'11a (Bio-Rad Laboratories, Rockville Centre, NY, USA) valmistajan suosittelemalla kanin IgG:n puhdistukseen sopivalla tavalla.

Antiseeruminäytteet (2 ml) pantiin DEAE Affi-Gel Blue-pylvääseen (1 x 31,8 cm) ja eluoitiin virtausnopeu-25 della 20 ml/h. Fraktiot (2 ml), jotka sisälsivät puhdistettua IgG, yhdistettiin ja konsentroitiin IXreen ultra-suodatuksella .

Esimerkki 2 Tämä esimerkki kohdistuu C. difficilen puhtaaseen 30 toksiini A:hän.

Bakteerikanta

Clostridium difficile VPI-kantaa 10463 kasvatettiin 2 litran aivo-sydän-infuusio (BHI)-dialyysipulloissa 72 tuntia 37°Crssa. Kun oli sentrifugoitu (8 000 x g, 10 mi-35 nuuttia) ja suodatettu 0,45 pmrn kalvosuodattimen läpi

II

15 81 366 (Millipore Corp., Bedford, MA, USA), viljelmän neste (noin 750 ml) konsentroitiin 50 ml:ksi ultrasuodatuksella 4°C:ssa käyttäen XM-100-kalvosuodatinta (Amicon Corp.) kanavatyyp-pisellä konsentroijalla. Pidättynyt aine pestiin 1 500 5 ml:11a 50 mM TRIS-HCl-puskuria (pH 7,5) (4°C) ja konsentroitiin lopulliseen tilavuuteen 40 - 50 ml. Tämä poisti monia pienimolekyylipainoisia epäpuhtauksia. Konsentroitu neste ladattiin 2,5 x 10 cm:n DEAE-Sepharos^Cl-6B-pylvää-seen, joka oli tasapainotettu 50 mM TRIS-HCl:lla (pH 7,5). 10 Näytteen latauksen jälkeen pylväs pestiin 200 ml:11a 50 mM TRIS-HC1 (pH 7,5), joka sisälsi 0,05 M NaCl. Näyte eluoi-tiin ensin 300 ml:n suoralla NaCl-gradientilla 50 mM TRIS-HCl-puskurissa (0,05 - 0,25 m NaCl) ja sen jälkeen 150 ml:11a 50 mM TRIS-HC1 (pH 7,5), joka sisälsi 0,3 M NaCl. 15 Toinen 300 ml:n suora gradientti (0,3 - 0,6 M NaCl) samassa puskurissa seurasi 0,3 M NaCl-pesua. Pylväiden virtausnopeus oli 55 - 60 ml/h (painovoima) 4°C:ssa. Fraktiot (4,2 ml) kerättiin ja analysoitiin solumyrkkyjen suhteen käyttäen CHO-KI-soluja.

20 Fraktiot, jotka sisälsivät korkeimmat solumyrkky- tiitterit, yhdistettiin, suodatussteriloitiin ja säilytettiin 4°C:ssa. Toksiinit, jotka eluoituivat ensimmäisessä ja toisessa NaCl-gradientissa, merkittiin toksiini A:ksi ja toksiini B:ksi, ja ne ovat osittain puhdistettua toksiini 25 A:ta ja toksiini B:tä.

5 - 10 ml toksiinifraktioita ensimmäisestä DEAE-gradientista (toksiini A) dialysoitiin 1 litraa vastaan 0,01 M natriumasetaattipuskuria (pH 5,5) 4°C:ssa 18 - 24 tuntia. Dialysoitu aine sentrifugoitiin (169 x g, 10 mi-30 nuuttia) sakan saamiseksi ja pestiin sitten 5 ml:11a samaa asetaattipuskuria ja sentrifugoitiin jälleen. Sakka liuotettiin 5-10 ml:aan 50 mM TRIS-HC1 (pH 7,5), joka sisälsi 0,05 M NaCl, ja puhtaan toksiini A:n liuos suodatussteriloitiin ja säilytettiin 4°C:ssa.

ie 81366

Esimerkki 3

Seuraavia puskureita käytetään analysoitaessa toksiini A:ta ja toksiini B:tä.

Karbonaattipuskuri (pinnoitepuskuri) 5 1,59 g Na2C03 2,93 g NaHC03 0,20 g NaN3 täytä litraksi dH20:lla (pH 9,6); säilytä huoneen lämpötilassa (käytä 2 viikon ku-10 luessa).

Fosfaattipuskuroitu suolaliuos-Tweeri^ 20 (PBS-T) 8,0 g NaCl 0,2 g KH2P04 2,9 g Na2HOP4 . 12 H20 (2,2 g Na2HOP4 . 7 H20 15 0,2 g KC1 0,5 ml TweeiP* 20 (polyoksietyleenisorbitaanimono-lauraatti) 0,2 g NaN3 täytä litraksi dH20:lla (pH 7,4) 20 Dietanoliamiinipuskuri (emäksiselle fosfataasisubstraeitil-le) 97 ml dietanoliamiinia 800 ml dH20 0,2 g NaN3 25 100 mg MgCl2 . 6 H20 titraa pH-arvoon 9,8 1 M HCl:lla ja täytä tilavuus litraksi dH20:11a; säilytä tummassa pullossa huoneen lämpötilassa; substraattiliuokseksi lisää 1 g substraattia ml:aan 30 puskuria.

Clostridium difficilen toksiini A:n ja toksiini B:n määritys: 1) Lisää 200 μΐ 1/10 000 laimennusta (karbonaattipus kurissa; pH 9,6) kanin antiseerumia (vasta-aine C. diffi-35 cilelle) jokaiseen Dynatech Immulon 2-tyyppisen mikrotiit-terilevyn koloon. Inkuboi 4°C:ssa yön yli.

Il 81366 2) Tyhjennä levy ja lisää 200 mg PBS-T, joka sisältää 0,5 % naudan seerumin albumiinia, jokaiseen koloon. Inku-boi levyä 37°C:ssa 30 minuuttia.

3) Tyhjennä levy ja lisää 200 μΐ PBS-T jokaiseen ko-5 loon. Inkuboi huoneen lämpötilassa 5 minuuttia.

4) Tyhjennä levy ja lisää 200 μΐ näytteen laimennusta tai toksiinin laimennusta (1:2) PBS-T:ssä koloihin. Inkuboi levyä joko 37°C:ssa 1 tunti tai huoneen lämpötilassa yön yli.

10 5) Tyhjennä levy ja pese jokainen kolo 3 kertaa PBS-T:llä.

6) Lisää 200 μΐ 1/1 000 laimennusta PBS-T:ssä monospe- sifistä vasta-ainetta joko toksiini A:lie tai toksiini B:lle jokaiseen koloon. Inkuboi levyä 37°C:ssa 1 tunti.

15 7) Tyhjennä levy ja pese jokainen kolo 3 kertaa PBS-T:llä.

8) Lisää 200 μΐ 1/800 laimennusta PBS-T:ssä kanin an- tivuohi-IgG:tä liitettynä emäksiseen fosfataasiin, jokaiseen koloon. Inkuboi levyä 37°C:ssa 1 tunti.

20 9) Tyhjennä levy ja pese jokainen kolo 3 kertaa PBS-T:llä.

10) Lisää 200 μΐ p-nitrofenyylifosfaattia (1 mg/ml di-etanoliamiinipuskurissa) jokaiseen koloon. Inkuboi levyä huoneen lämpötilassa 1 tunti.

25 11) Lisää 20 μΐ 5 N NaOH jokaiseen koloon reaktion lo pettamiseksi .

12) Sekoita sisällöt jokaisesta kolosta 0,8 ml:n kanssa dH20 (kokonaistilavuus koeseoksessa noin 1 ml) ja mittaa absorbanssi 405 nm:ssä.

30 Tämä keksintö on erityisen edullinen siksi, että sillä on mahdollista tuottaa vasta-aineita, jotka ovat spesifisiä vain C. difficile-toksiineille. Lopputuloksena tarjotaan käyttöön menetelmä, jolla on tarkoitus määrittää näiden toksiinien läsnäolo, pikemmin kuin C. difficilen 35 läsnäolo, mikä vähentää tai poistaa väärät positiiviset tulokset.

18 81 366

Edelleen tämä keksintö tarjoaa sen edun, että se sallii menetelmän, joka voidaan suunnata joko jompaan kumpaan toksiineista tai molempiin toksiineihin.

Esitetty toksiinien määritysmenetelmä on nopea ja 5 myös halvempi kuin aikaisemmat menetelmät.

Lukuisat muunnokset ja variaatiot tästä keksinnöstä ovat mahdollisia edellä esitetyn tiedon valossa, ja siten oheisten vaatimusten alueella keksintöä voi käyttää muutenkin kuin nyt on erityisesti kuvattu.

Il

Claims (38)

1. Menetelmä vasta-aineiden saamiseksi, jotka ovat spesifisiä Clostridium difficile-toksiineille, t u n - 5. e t t u siitä, että menetelmä käsittää C. difficile-vasta-aineen, joka sisältää vasta-aineet, jotka ovat spesifisiä C. difficile-toksiineille, vasta-aineen myrkyttömälle proteiiniantigeenille ja vasta-aineen myrkyttömälle kuumuutta kestävälle antigeenille, saattamisen kosketuk-10 seen myrkyttömän C. difficile-proteiiniantigeenin kanssa sitomaan vasta-aine myrkyttömälle proteiiniantigeenille siihen; mainitun C. difficile-vasta-aineen, jossa ei ole vasta-ainetta myrkyttömälle proteiiniantigeenille, saattamisen kosketukseen kuumuutta sietävän myrkyttömän C. dif-15 ficile-antigeenin kanssa sitomaan vasta-aine myrkyttömälle kuumuutta sietävälle antigeenille siihen; ja C. difficilen toksiineille spesifisen vasta-aineen talteenottamisen.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että myrkytön C. difficile-pro- 20 teiiniantigeeni on myrkyttömän C. difficile-kannan kokonaisten solujen muodossa.

3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että myrkytön kuumuutta sietävä C. difficile-antigeeni on tuettu kiinteälle alustalle.

4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että vasta-aine on tuettu kiinteälle alustalle.

5. Menetelmä monospesifisen vasta-aineen valmistamiseksi Clostridium difficilen toksiini A:lie, t u n -30 n e t t u siitä, että menetelmä käsittää C. difficile-vasta-aineen, joka sisältää vasta-aineet, jotka ovat spesifisiä C. difficilen toksiineille, vasta-aineen myrkyttömälle proteiiniantigeenille ja vasta-aineen myrkyttömälle kuumuutta sietävälle antigeenille, saattamisen kosketuk-35 seen myrkyttömän C. difficile-proteiiniantigeenin kanssa 20 8 1 3 6 6 sitomaan vasta-aine myrkyttömälle proteiiniantigeenille siihen; mainitun C. difficile-vasta-aineen, jossa ei ole vasta-ainetta myrkyttömälle proteiiniantigeenille, saattamisen kosketukseen myrkyttömän kuumuutta sietävän C. 5 difficile-antigeenin kanssa sitomaan vasta-aine myrkyttö mälle kuumuutta sietävälle antigeenille siihen; C. diffi-cilen toksiineille spesifisen vasta-aineen talteenottami-sen; C. difficilen toksiineille spesifisen vasta-aineen saattamisen kosketukseen C. difficilen kiinteälle alustal-10 le tuetun toksiini A:n kanssa sitomaan monospesifinen vasta-aine toksiini A:lie siihen; ja sen jälkeen toksiini A:lie monospesifisen vasta-aineen eluoimisen siitä.

6. Patenttivaatimuksen 5 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että myrkytön C. difficile-prote- 15 iiniantigeeni on C. difficilen myrkyttömän kannan kokonaisten solujen muodossa.

7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että myrkytön kuumuutta sietävä C. difficile-antigeeni on tuettu kiinteälle alustalle.

8. Menetelmä monospesif isen vasta-aineen saamiseksi Clostridium difficilen toksiini B:lle, tunnettu siitä, että menetelmä käsittää C. difficile-vasta-aineen, joka sisältää C. difficilen toksiineille spesifisiä vasta-aineita, vasta-aineen myrkyttömälle proteiiniantigeenille 25 ja vasta-aineen myrkyttömälle kuumuutta sietävälle antigeenille, saattamisen kosketukseen myrkyttömän C. diffi-cile-proteiiniantigeenin kanssa sitomaan vasta-aine myrkyttömälle proteiiniantigeenille siihen; mainitun C. dif-ficile-vasta-aineen, jossa ei ole vasta-ainetta myrkyttö-30 mille proteiiniantigeeneille, saattamisen kosketukseen myrkyttömän kuumuutta sietävän C. difficile-antigeenin kanssa sitomaan vasta-aine myrkyttömälle kuumuutta sietävälle antigeenille siihen; C. difficilen toksiineille spesifisen vasta-aineen talteenottamisen; C. difficilen tok-35 siineille spesifisen vasta-aineen saattamisen kosketukseen II 21 81366 C. difficilen kiinteelle alustalle tuetun toksiini B:n kanssa sitomaan monospesifinen vasta-aine toksiini B:lle siihen; ja sen jälkeen toksiini Brlle monospesifisen vasta-aineen eluoimisen siitä.

9. Patenttivaatimuksen 8 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että myrkytön C. difficile-prote-iiniantigeeni on myrkyttömän C. difficile-kannan kokonaisten solujen muodossa.

10. Patenttivaatimuksen 9 mukainen menetelmä, 10 tunnettu siitä, että myrkytön kuumuutta sietävä C. difficilen antigeeni on tuettu kiinteälle alustalle.

11. Patenttivaatimuksen 1 mukaisesti valmistetun vasta-aineen käyttö myrkyllisten Clostridium difficilien määritysmenetelmässä, jossa myrkyllisiä C. difficilejä si- 15 säItävä analyytti saatetaan kosketukseen C. difficile- toksiinien vastaisen spesifisen vasta-aineen kanssa sitomaan vain C. difficile-toksiineja vasta-aineeseen.

12. Patenttivaatimuksen 11 mukainen käyttö, tunnettu siitä, että määrityksessä käytettävä C. 20 difficilen vastainen vasta-aine tuetaan kiinteälle alustalle, tuettu C. difficilen vastainen vasta-aine saatetaan kosketukseen analyytin kanssa sitomaan C. difficile-anti-geeni tuettuun C. difficile-vasta-aineeseen ja sen jälkeen sitoutunut antigeeni saatetaan kosketukseen leimatussa 25 muodossa olevan monospesifisen vasta-aineen kanssa ja mainitun toksiinin läsnäolo määritetään havaitsemalla sitoutuneen leiman läsnäolo.

13. Patenttivaatimuksen 12 mukainen käyttö, tunnettu siitä, että leima on entsyymileima.

14. Patenttivaatimuksen 13 mukainen käyttö, tunnettu siitä, että entsyymileima on emäksinen fosfataasi.

15. Patenttivaatimuksen 11 mukainen käyttö, tunnettu siitä, että määrityksessä käytettävä vas- 35 ta-aine C. difficilelle on tuettu kiinteälle alustalle, 22 81 366 tuettu C. difficile-vasta-aine saatetaan kosketukseen ana-lyytin kanssa sitomaan C. difficile-antigeeni C. diffici-le-vasta-aineeseen, antigeeni saatetaan kosketukseen mo-nospesifisen vasta-aineen kanssa sitomaan monospesifinen 5 vasta-aine sitoutuneen antigeenin C. difficile-toksiinei- hin, sen jälkeen sitoutunut monospesifinen vasta-aine saatetaan kosketukseen leimatun muodon kanssa vasta-aineesta monospesifiselle vasta-aineelle, ja mainittujen C. diffi-cile-toksiinien läsnäolo määritetään havaitsemalla sitou- 10 tuneen leiman läsnäolo.

16. Patenttivaatimuksen 15 mukainen käyttö, tunnettu siitä, että leima on entsyymileima.

17. Patenttivaatimuksen 16 mukainen käyttö, tunnettu siitä, että entsyymileima on emäksinen 15 fosfataasi.

18. Patenttivaatimuksen 11 mukainen käyttö, tunnettu siitä, että monospesifinen vasta-aine tuetaan kiinteille hiukkasille ja myrkyllisten C. diffici-lien läsnäolo määritetään kiinteiden hiukkasten aggluti- 20 naatiolla.

19. Patenttivaatimuksen 5 mukaisesti valmistetun vasta-aineen käyttö Clostridium difficilen toksiini A:n määritysmenetelmässä, jossa toksiini Aita sisältävä ana-lyytti saatetaan kosketukseen C. difficilen toksiini A:n 25 vastaisen monospesifisen vasta-aineen kanssa sitomaan vain toksiini A mainittuun monospesifiseen vasta-aineeseen.

19 81 3 6 6

20. Patenttivaatimuksen 19 mukainen käyttö, tunnettu siitä, että määrityksessä käytettävä C. difficilen vastainen vasta-aine tuetaan kiinteälle alus- 30 talle, tuettu C. difficilen vastainen vasta-aine saate taan kosketukseen analyytin kanssa sitomaan C. difficile-antigeeni tuettuun C. difficile-vasta-aineeseen ja sen jälkeen sitoutunut antigeeni saatetaan kosketukseen leimatussa muodossa olevan monospesifisen vasta-aineen kanssa 35 ja mainitun toksiinin läsnäolo määritetään havaitsemalla sitoutuneen leiman läsnäolo. Il 23 81 3 6 6

21. Patenttivaatimuksen 20 mukainen käyttö, tunnettu siitä, että leima on entsyymileima.

22. Patenttivaatimuksen 21 mukainen käyttö, tunnettu siitä, että entsyymileima on emäksinen 5 fosfataasi.

23. Patenttivaatimuksen 19 mukainen käyttö, tunnettu siitä, että määrityksessä käytettävä vasta-aine C. difficilelle on tuettu kiinteälle alustalle, tuettu C. difficile-vasta-aine saatetaan kosketukseen ana- 10 lyytin kanssa sitomaan C. difficile-antigeeni C. diffici-le-vasta-aineeseen, antigeeni saatetaan kosketukseen mono-spesifisen vasta-aineen kanssa sitomaan monospesifinen vasta-aine sitoutuneen antigeenin toksiini A:hän, sen jälkeen sitoutunut monospesifinen vasta-aine saatetaan koske- 15 tukseen leimatun muodon kanssa vasta-aineesta monospesifi- selle vasta-aineelle, ja mainitun toksiini A:n läsnäolo määritetään havaitsemalla sitoutuneen leiman läsnäolo.

24. Patenttivaatimuksen 23 mukainen käyttö, tunnettu siitä, että leima on entsyymileima.

25. Patenttivaatimuksen 24 mukainen käyttö, tunnettu siitä, että entsyymileima on emäksinen fosfataasi.

26. Patenttivaatimuksen 19 mukainen käyttö, tunnettu siitä, että monospesifinen vasta-aine 25 tuetaan kiinteille hiukkasille ja toksiini A:n läsnäolo määritetään kiinteiden hiukkasten agglutinaatiolla.

27. Patenttivaatimuksen 19 mukainen käyttö, tunnettu siitä, että vasta-aine tuetaan kiinteälle alustalle.

28. Patenttivaatimuksen 27 mukainen käyttö, tunnettu siitä, että analyytti on läsnä uloste-näytteessä.

29. Patenttivaatimuksen 8 mukaisesti valmistetun vasta-aineen käyttö Clostridium difficilen toksiini B:n 35 määritysmenetelmässä, jossa toksiini B:tä sisältävä ana- 24 81 366 lyytti saatetaan kosketukseen C. difficilen toksiini B:n vastaisen monospesifisen vasta-aineen kanssa sitomaan vain toksiini B mainittuun monospesifiseen vasta-aineeseen.

30. Patenttivaatimuksen 29 mukainen käyttö, 5 tunnettu siitä, että määrityksessä käytettävä C. difficilen vastainen vasta-aine tuetaan kiinteälle alustalle, tuetun C. difficilen vastainen vasta-aine saatetaan kosketukseen analyytin kanssa sitomaan C. difficile-anti-geeni tuettuun C. difficile-vasta-aineeseen ja sen jälkeen 10 sitoutunut antigeeni saatetaan kosketukseen leimatussa muodossa olevan monospesifisen vasta-aineen kanssa ja mainitun toksiinin läsnäolo määritetään havaitsemalla sitoutuneen leiman läsnäolo.

31. Patenttivaatimuksen 30 mukainen käyttö, 15 tunnettu siitä, että leima on entsyymileima.

32. Patenttivaatimuksen 31 mukainen käyttö, tunnettu siitä, että entsyymileima on emäksinen fosfataasi.

33. Patenttivaatimuksen 29 mukainen käyttö, 20 tunnettu siitä, että määrityksessä käytettävä vasta-aine C. difficilelle on tuettu kiinteälle alustalle, tuettu C. difficile-vasta-aine saatetaan kosketukseen ana-lyytin kanssa sitomaan C. difficile-antigeeni C. difficile-vasta-aineeseen, antigeeni saatetaan kosketukseen mono-25 spesifisen vasta-aineen kanssa sitomaan monospesifinen vasta-aine sitoutuneen antigeenin toksiini B:hen, sen jälkeen sitoutunut monospesifinen vasta-aine saatetaan kosketukseen leimatun muodon kanssa vasta-aineesta monospesifi-selle vasta-aineelle, ja mainitun toksiini B:n läsnäolo 30 määritetään havaitsemalla sitoutuneen leiman läsnäolo.

34. Patenttivaatimuksen 33 mukainen käyttö, tunnettu siitä, että leima on entsyymileima.

35. Patenttivaatimuksen 34 mukainen käyttö, tunnettu siitä, että entsyymileima on emäksinen 35 fosfataasi. 25 81 3 6 6

36. Patenttivaatimuksen 29 mukainen käyttö, tunnettu siitä, että monospesifinen vasta-aine tuetaan kiinteille hiukkasille ja toksiini B:n läsnäolo määritetään kiinteiden hiukkasten agglutinaatiolla.

37. Patenttivaatimuksen 29 mukainen käyttö, tunnettu siitä, että vasta-aine tuetaan kiinteälle alustalle.

38. Patenttivaatimuksen 37 mukainen käyttö, tunnettu siitä, että analyytti on läsnä uloste-10 näytteessä. 26 81 366