FI72743C - Foerfarande foer framstaellning av nya makrolidantibiotika. - Google Patents

Description

1 72743

Menetelmä uusien makrolidiantibioottien valmistamiseksi Tämä keksintö koskee menetelmää uusien makrolidiryh-mään kuuluvien antibioottien valmistamiseksi. Uudet makro-5 lidiantibiootit valmistetaan lähtemällä erytronolidi B:stä, jonka kaava on 0 CE3y^\..· CH3

10 II

CH3\/^0H

T*-ch3

CH^H^'^O

15 0VS» CH3 nimittäin luonnonsubstraatista, joka on erytromysiini A:n biosynteettinen prekursori, ja puolisynteettisistä substraa-20 teista kuten erytronolidi A:sta, jonka kaava on 0 CH, JL CH, H0 l oh 25 0H3» | CH3

CH3CH2'' I)011! '•'f** OH

(Γν/'ΌΗ *H3 30 ja erytronolidi A-oksiimista/ jonka kaava on 2 72743

NOH

CH3

HO ^ OH

5 x Sr CH3 1 *'CH3 ch3ch2' 9 CH^y 'oh

OH

CH3 10

Keksinnön mukaisessa menetelmässä käytetään uutta mikro-organismia, Streptomyces antibioticus ATCC 31771, jota on saatu mutageenisen käsittelyn avulla mikro-organis-15 mistä Streptomyces antibioticus ATCC 11891, oleandomysii-nin tuottajasta. On tunnettua, ett Streptomyces antibioticus ATCC 11891 pystyy käyttämään puolisynteettistä substraattia (erytronolidi A-oksiimia) (Le Mahieu ym., J. Antib., XXIX (1976) 7, 728), mutta ei edellä mainittua 20 erytronolidi B:tä, joka on substraatti, jota voidaan saada suoraan fermentoinnin avulla asiallisin määrin ja täten taloudellisesti ajateltavissa olevin kustannuksin käyttämällä erytromysiiniä tuottavia mikro-organismeja ja niiden mutantteja.

25 Toisaalta on tunnettua, että erytromysiini on erit täin epästabiili happamessa ympäristössä, jolloin sen annon on tapahduttava esterien ja/tai suolojen muodossa, jotka, vaikka parantavatkin stabilisuutta, antavat tilaa hyvin tunnetuille aktiivisuudelle tyyppisille ominaisuuk-30 sille, jotka ovat terapeuttiselta kannalta katsoen arveluttavia ja epäedullisia, kuten myrkyllisyys maksalle, huono siedettävyys ja muut haitalliset ominaisuudet. Olean-domysiini itse on tunnettu erittäin suuresta toksisuudestaan .

35 Tämän keksinnön päätarkoituksena on uusien antibioot tien saaminen, joiden aktiivisuus on erytromysiinin kaltainen, mutta joilta puuttuvat tämän antibiootin edellä 3 72743 mainitut epäedulliset ominaisuudet ja jotka erityisesti ovat stabiileja happamessa ympäristössä ja joita voidaan antaa tarvitsematta turvautua toksisiin estereihin ja/tai suoloihin.

5 Keksinnön tarkoituksena on menetelmän luominen, jol la näitä antibiootteja saadaan lähtemällä uudesta mikro-organismista, joka pystyy käyttämään luonnonsubstraatteja ja puolisynteettisiä substraatteja, erityisesti erytro-nolidi B:tä.

10 Nämä tarkoitukset ovat toteutettavissa uusien makro- lidiantibioottien ja niihin liittyvän tämän keksinnön mukaisen valmistusmenetelmän avulla.

Keksinnön mukaiselle menetelmälle uusien makrolidi-antibioottien P15149, P15148, P15150 ja P15153 valmista-15 miseksi on tunnusomaista, että Streptomyces antibioticus ATCC 31771:n viljelmään lisätään sinänsä tunnetulla tavalla suoritettavan fermentoinnin aikana erytronolidi B:tä, inkuboidaan 100 tuntia, minkä jälkeen elatusaineesta otetusta näytteestä määritetään tuotettujen antibioottien 20 P15148, P15149, P15150 ja P15153 läsnäolo ja identtisyys ohutlevykromatografiän ja bioautografiän avulla tai suihkuttamalla levyille anisaldehydireagenssia, fermentointi-liemi suodatetaan, ulossuolataan ja uutetaan orgaanisella liuottimena, orgaaninen faasi ja vesifaasi erotetaan, 25 minkä jälkeen orgaanisesta faasista eristetään sinänsä tunnetuin työvaihein P15149, ja vesifaasista eristetään liuotinuutos-työvaiheita käyttäen ja liukoisuuseroavuuk-sien perusteella P15148, P15150 ja P151553. Uusi makroli-diantibiootti P15151 valmistetaan keksinnön mukaisesti si-30 ten, että Streptomyces antibioticus ATCC 31771:n viljelmään lisätään sinänsä tunnetulla tavalla suoritettavan fermentoinnin aikana erytronolidi A:ta, inkubointia jatketaan edelleen 60 tuntia, minkä jälkeen fermentoinnissa tuotetun antibiootin määrittämisen jälkeen ohutlevykroma-35 tografian ja bioautografiän avulla tai suihkuttamalla levyille anisaldehydireagenssia, antibiootti eristetään, 4 72743 ja uusi makrolidiantibiootti P15152 valmistetaan keksinnön mukaisesti siten, että Streptomyces antibioticus ATCC 31771:n viljelmään lisätään sinänsä tunnetulla tavalla suoritettavan fermentoinnin aikana erytronolidi A-oksiimia ja 5 inkubointia jatketaan edelleen 60 tuntia, minkä jälkeen, fermentoinnissa tuotetun antibiootin määrittämisen jälkeen ohutlevykromatografiän ja bioautografiän avulla tai suihkuttamalla levyille anisaldehydireagenssia, antibiootti eristetään .

10 Streptomyces antibioticus ATCC 31771 saadaan

Streptomyces antibioticus ATCC 11891:stä suorittamalla mutageeninen käsittely ultraviolettisäteillä, emissiomak-simin ollessa kohdalla 254 nm ja annoksen ollessa sellainen, että se tappaa noin 99,6 % itiöistä, jolloin haluttu 15 mikro-organismi lisäksi on sellainen, että se ei pysty tuottamaan oleandomysiiniä.

Tarkasteltaessa yksityiskohtaisemmin keksinnön mukaisesti valmistettuja uusia makrolidiantibiootteja, ne yksilöidään seuraavassa substraatin perusteella, josta ne on 20 valmistettu ja kromatograafisen analyysin tunnusmerkkien perusteella (patentinhakijan oman viitteen ollessa mainittuna suluissa) 1) 3-0-oleandrosyyli-5-0-desosaminyyli-(8S)-hydroksierytro-nolidi B (P15148), jonka kaava on 25 CH, "3^ /CH3 HO . 3 n

HO

h3c*.J ^ ch3 Lo~~^-ch3 ^

30 I

vS rQH3

H3C Y^CH3 L^C°CH3 0 V^-^-OH

ch3 35 5 72743

Sitä saadaan erytronolidi B:stä keksinnön mukaisesti käytetyn mikro-organismin avulla; ohutlevykromatograafises-sa analyysissä (TLC, silikageelilevy, eluentti: metyleeni-kloridi/95 % metanoli/väkevä ammoniakki, 90:10:1), R t on 5 0,8 oleandomysiinin suhteen ja 0,75 erytromysiini A:n suh teen. Käytettäessä anisaldehydireagenssia (jonka yhteydessä oleandomysiini värjäytyy violetin väriseksi ja erytromysiini A ruskeaksi) tämä antibiootti värjäytyy purppuranpunaiseksi. HPLC:tä (suurpaine-nestefaasikromatografiaa) käytet-10 täessä P15148 : aa vastaavan huipun retentioaika erytromysiini A:n suhteen on 0,69 ja oleandomysiinin suhteen 1,08.

2) 3-0-oleandrosyyli-5-0-desosaminyylierytronolidi B (P15149), jonka kaava on H„c CH, CH3 3 \ / 3

15 : N

0 H0 7-^7

Hqj> CH3 •*^ HO 7* ..k. ch3 CH3 25 Siitäkin saadaan fermentoimalla erytronolidi B:tä ja sen R t on 0,9 oleandomysiinin suhteen ja 0,85 erytromysiini A:n suhteen. Anisaldehydikokeessa se on väriltään violetti. HPLC:tä käytettäessä P15149:ää vastaavan huipun retentioaika erytromysiini A:n suhteen on 0,79 ja oleando-30 mysiinin suhteen 1,22.

3) 3-0-oleandrosyyli-5-0-desosaminyyli-15-hydroksierytrono-lidi B (P15150), jonka kaava on 6 72743 H,C CH, CH, 3 \ ^ 3

; 3 N

cy^\ h0-t—L-η H3C·· /-CH, ^^-<r^'CH3 , -γ ° •»VI K!!’ / °^rrSCH3 L ^<'och2 H0 0 3 10 cii3

Sitä saadaan fermentoimalla Streptomyces antibioticus 31771:n kanssa substraattina käytettävästä erytronolidi B:stä ja sen R on 0,47 oleandomysiinin suhteen ja 0,44 15 erytromysiini A:n suhteen. Anisaldehydikokeessa väri on purppuranpunainen. HPLCttä käytettäessä P15150:tä vastaavan huipun retentioaika erytromysiini A:n suhteen on 0,52 ja oleandomysiinin suhteen 0,80.

4) 3-0-oleandrosyyli-5-0-desosaminyyli-(8R)-8,19-epoksi-20 erytronolidi B (P15153), jonka kaava on H3C\ /CH3 np n Ο,^Ν. HO -T^J^r H3C, j I ^CH3 25 Η0^Η0'γ·0>

H3C ''S

H3C “t^CH 0CH3 0

Sitä saadaan fermentoimalla keksinnön mukaisesti käytetyn mikro-organismin avulla erytronolidi B:stä; ohutlevy-kromatograafisessa analyysissä (TLC) R ^ on 0,8 oleandomy-35 siinin suhteen ja 0,75 erytromysiini A:n suhteen. Käytettäessä anisaldehydi-reagenssia tämä antibiootti esintyy väriltään violettina.

7 72743 HPLC:tä käytettäessä P15153:a vastaavan huipun reten-tioaika on erytromysiini A:n suhteen 0,64 ja oleandomysiinin suhteen 0,99. Edellä mainittujen neljän antibiootin osalta, joita on saatu seoksena erytronolidi B:stä 100 tunnin fer-5 mentoinnin jälkeen ja ennen eristämistä, kokonaisantibioot-tiaktiivisuus, ilmaistuna erytromysiini A:n aktiivisuutena on noin 120-150 mcg/ml.

5) P15151. Sitä saadaan fermentoimalla Streptomyces antibio-ticus'in kanssa erytronolidi A:ta ja sen R , on 0,88 oleando- S u 10 mysiinin suhteen ja 0,8 erytromysiini A:n suhteen. Analysoitaessa viljelyväliainetta 90 tunnin fermentoinnin jälkeen antibioottiaktiivisuudeksi on saatu, erytromysiini A:n aktiivisuutena ilmaistuna, noin 70 mcg/ml.

6) P15152. Sitä saadaan erytronolidi A-oksiimista, sen Rf 15 on 0,47 oleandomysiinin suhteen ja 0,4 erytromysiini A:n suhteen.

Analysoitaessa viljelyväliainetta 90 tunnin inkuboin-nin jälkeen kokonaisantibioottiaktiivisuudeksi on todettu noin 50 mcg/ml (ilmaistuna erytromysiini A:n aktiivisuutena), 20 sellaisen aktiivisuuden viitatessa kuitenkin seokseen, jossa on P15152:ta ja toista samanaikaisesti muodostunutta antibioottia, joka on samaa, jota on jo kuvattu artikkelissa J. Antib., 29 (1976) 728.

Suunnattaessa nyt huomio uusien makrolidiantibiootti-25 en tutkimiseen, joita on valmistettu tämän keksinnön mukaisesti, niille kaikille on luonteenomaista erytromysiinin kaltainen bakteerien kasvua ehkäisevä spektri, ja stabili-suus happamessa ympäristössä, jolloin niiden anto suoraan suun kautta on mahdollista tarvitsematta turvautua esterei-*30 hin ja/tai suoloihin, joiden yhteydessä ilmenee edellä mainittuja epäedullisia ominaisuuksia ja onglemia. Edellä esitettyä vahvistaa taulukko 1, jossa on esitetty MlC-arvot, jotka ilmaisevat bakteerien kasvua ehkäisevän tehon, ja taulukko 2, josta ilmenevät stabilisuusarvot happamessa 35 ympäristössä. Näyttää uskottavalta, että keksinnön mukaisesti valmistettujen makrolidiantibioottien suuremman sta- 0 72743 o bilisuuden voidaan katsoa johtuvan neutraalin sokeri-olean-droosin läsnäolosta antibiootin molekyylissä (J. Antib., 7 (1976) 728).

9 72743 o £ in m in m .,_i ,—ι m n m cm m σι οι σι 3) m oi cn

-H in i—I H Ι/l IN rH iHi—ΙΓΟΟΟΟ1—llOr—I

U) rH - - CN - - HI 1¾ ΓΟ Γ0 A LO CO ΟΟΟΟΟΟΟΑΓΟ > c G -rH 0) ro n-r-ιιη LO lolo <t <t 'Τ <t «τ ίγ lo .p £ ,—| CT <T CO CT) «3· *3· «N "=Τ "3* «N CN CTi

£ -H O LA 1—I rH Ln r~ CO O ΟΟΟΟΟΟΙΠι I

I. (Il rH - CN V - «-''•'--(N -

ro o Λ o o a o o oooooooAO

LO dl p rH | «G 00 m g > cf in in m m r- «r rH G CD rH LO LO 00 00 CT CT CT <T (T CT 00

CbUCfl LO LOLOLnr~ r- rHi-HOrHi-HOOinr- tJl-H rH - - «N -

.. ;G CL| rHrHAO O OOOOOOOAO

G - -V

·· G JC O _ oo -h o <f Γ'ΐ^ι^Γ^ι^ίΤιΓ^ σι

•ς* -H rH 0000 00 00 <Ti<Ti<TLCTi<Ti^r<Ti CO

,—i en p ien r- r- in r— i— ooooooomo m-HirO rH - - CN - - -------<N-

rH ,Q g 1¾ O O A O O OOOOOOOAO

dl O §

Sh -h i

-(DG G I -H

G G (D m >iC cticti m in in m in r- «r .. e -H (D g -rl mmiOLD LD CT <T <T <T CT CT CTi

<T G CU i—ΙΟΉ - - CN in in rHrHrHrHrHOOincO

*t o ΰ ι/l O O A -

rH (Ti «0 rH rH O O O O O O O A O

m -n tn i -H

rH tn o G

Sh-H r- m inm^^^^^rcNLO eri

•H φ -p -rl CTlCTi «Ti <T CN CN CN CN «N rH O "«T

-•H e to m OrHinrH rH ooooooomo

G M H p 5-t - - «n - - -------OM

•H -H (0 W g O O A O O OOOOOOOAO

G Λ -H

i—I -rl O '—I I *H

•H Sh :G O G _ O en cu > Sh -h «tct r- in «n cn cn «n «n lo lo ct

Ai 5-1 G -p-rl ^T^J* CT <T i-HrHrHrHrHOO 'T

Ai g :G 5-, en <! o o in o h ooooooomo G O tn cn p 5h - - «n - - -------m-

rHOpien W g O O A O O OOOOOOOAO

G G P »0

G G G CD O O

Eh cd Ai P 00 r-m rH -h e ct 'T oo rH mcNm^cr^J* erm

O «o -h CD rornr-r- lo mmmcArHCNLOrHCN

5> -H P

- X O (¾¾¾¾ Pc (¾¾¾¾¾¾¾¾¾

G :G G PS PS PS 05 PS 05PSPSPSP5P5PSPSPS

·· > G · Eh i_3 p p p P PPPPPPPPP

03 CD -H rH

I» ί E Ph •H -H -H ^ G :G cd O1 oo m oo •H Ai Sh O m rH lo •h p <d g m-r lo r-- tnCDCD LO rH 00 rH m

>i P G IT

g G Ai G U U U (D ro m

O G G -H O U OOCDCDCDU G cr rH

Sh 5> P O Eh Eh m G G G Eh -H

-pen > <C <5 «TO CL) CU <C PUU

>>, G P en en «n -h -h -ri n en cd U U

p AS G G cnencn-H-HrHG G G ri CD P Eh Eh cd -rl GGGrHr—I O 0 O Ϊ G -G < < G -H G CCDCDCDGGUg g g Sji CD O, - «D en P (DPPPOOUG G G tr -h en en G-H-H-P -HGGGCDOEHa) CD<Dn°ra;rl::ltn

• •P>CD-H >GGGGG<dG G G >1 CD CD -P

< CD -H P g -H MHMH CU aagaE+JDH

cd -h -h tn -h en en en tn G G G -h •h-P-PO-h PGGGcotocucn cncncncn-HrHrHp

GAiGgGG-HOOOGGGG G G G G P P

•HGCnrHGCDcnOOOOOCUO OOOOCDincnG H ΰ (D -H tr G O O O O O U O' O OOOOPGGcn en e ρ·Ηθ.ουυοοοοοροοοοουυ 5h G I P O P I OOOOOgOOUUOOGUOm

g .. g O I O gi—IrHrH O O 5-i O m O O O OP O O G

oo G -H o P G 5h5h5hPPNPL0PPPP CD O OrH

pmpppcDppsASASOiQi a cuQiaacoop P rH Cji G Ai <! U ft a a (I) CD* (DU 0) CD CD CD 5=hP P-H

5-i m G -H GGGPPPPUPPPPPUOO

prHGPS · .PPPPPGPEHP-PPPO-P-PG

μ a ·η p rHCcowcococncncocmmmmuSSCQ

10 72743 0

LO LO

t—i <j\ in lo

IO LO ι—I LO LO LO LO LO OI LO OllOLO

H fsl - OJ OJ OI OJ LO OI - OJ - OI OJ

(¾ A O A A A A OJ A LO A LD A A

n

LO LO

i—I LO CO LD OJ LO

LO -r-HLOlOtOLOLOLO i—I CN]

H OJ - LO OI OI OJ ID OJ -OI - «.LO

Hl i—I O OJ A A A O] A rH A CO LD OJ

CO

H*

r-t LO LO LO

LO LO LO LO LO LO LO LO OJ LO OI LO

ι—I OJ - OJ OJ OI OJ LO OJ «.(N LO - OJ

CU A i-H A A A A OI A LO A OJ LO A

ΟΊ

H1 LO

H LO 0> LO LO OJ

LO OJ i—I LO LO LO LO LO LO «.LO - i-H LO

l—l - -OIOIOIOIOJOIOIOJ OJ - OJ

CU LD O Λ A A A Λ A '—I A rH CO A

C I -H LO

(0 >1 C ΟΊ LO OJ CL LO

<D £ -H LO i—l LO LO LO LO LO LO OI LO ι—I CO OI

r—I O -H OI - OJ OI OJ OI OI OI - OJ - - -

0 X! m A O A A A A A A LO A CO o LD

1 -H

O C 0~ O- LO

P -H LO OL ITI ldollo

-P -H OIO LO LO LOOLO LO r—I OJ

rO >i en m - -LOLOoiojLOoj - oi - - -

0 P >1 LO O OJ OI A A OI A O A i—I O LO

44 w ε

-P

(0

n I -H Ο Γ- LO

^ O C OI LO LO LO OL LD OL ID

P -H i-IOOJ LO LO — — O LO LO rH LO

i-l +J-Hl< - — — LO OJ OJ OJ OJ - OI - - - >1 03 CO O LD OJ A A iH ι—I O A H O r-t 0 P >i 44 W £ 44

C CO H* ^ r-H LD LO O

I-l rH i-H O «3· CO O ι-l O O ι—I

C <D OI OI LO LO i—l CTL CO LO OJ OI OIOIOJ

(13 -P

Eh 0 CUCUCUCUOjCUCUCUCUCU Cm CU CU

C3 « tt! (Ϊ PC PC PC

E-r hJXIlCl-4lCl-4l-4l-4l-4h4 X) PJ 1-4 o co ε ·Η ·Η

CO C3 -P -P

LD p 4-1 -P

<D ra -H en O CC

ta cu a) u ra -h e x: a»a) CNta ra o o is h φ en cu -p -p 0) C φ -H Eh e ro tn* -h O tntn C Φ O e <C -h «-ι tn -h ι—ι p -h -h •h eJ X4 O Cn cö-h μ -h υ tntn >r-i M P E tn 3 -H -h e uh Cn φ φ φ •H UH Sh H C -H p XI -H ra -H M ra e 5h5h

•H e O O ¢) U Φ ft (1) H £ etu P -H -H

-P -H C Φ C <T5 ta >i C O Q) CU Uh £ CC

(0 O CU Cn -P C (0 XI C C -H -H

en tn o ro rH tn O ε -h £ tn -h -h -h

Φ c3 oo TT-PraCraratntnLDrar^^c φ ιο p oi to H

C H h raoixCrH > C H (Oo £<n O -H *3* TS 'i* Φ m >i-H

I -H «S' -H -3- O rH OiHraiHOItnOpTOoi-HO-XIOO £ -H

£ XI σ> M O ·Η 01 tn £ Φ H CU H n3 H* φ -H ld o CO uo- o tn

(0 CUh (D'-η P-H C O CH φοι ι—I rH ra Shco u oi raoi P-H

PO tn aj tn <u t> O a) h CU e n φ X! -cc osutnuxixi-pcaenououriitnu-puou >, φ

Qjcj-Htj υ ω o o>h-hx:cj ocj o υ υ υ tn u peu • raEHOEHtnHPcnraXOEH>iEH «HE-irOEHCEH D4 0 (BliiCZCHiCftPiWiiiiKSiCtLOCtsstih^ 0 0 11 72743 α 0 Ή 03

Cu u 0 0 en :(t

C

0 >1 en 4-i en 4-) .. O) U -0 O -0 in y cm :0 O O O O O :0 :0 * - * - « g en -^r o o o o ^ o tn cm o o o o 0 :0 Ή Ή i—I i-4 I—10*

+J A A A A C

0 -H CD

H m :0 M en 4-) :0 ·ή 4-) 6 >1 g 0 :0 >i 4-1 λ; CM 0 0 Ο Ο Ο Ο Ο -H .

Oen - · - - * -H u λ; cn οι φ roo roo roo ro ο ι—ι »4 ,¾ CD o o o οΟΛ 0 g 1-4 r-4 1-4 --4 0 53

ι—10 A A A

0 & A

0(¾ 0 0

En 0 O 0 r0 Ή ·Η +> 44 en 4-10 0 O 0 0 0 0 tn cn0 o o o o o -ho •H .0 - - - - - Λ 4-1 1-4·· ΓΜΓΜ (N r-~ CM 00 CM O CM LO -H 0 •r4C CM ,-4 O O 44 g

-Q ι—I 0 O

0 -H A 0 0 4->0 4*

en -H :0 I

•H :0 -H

0 en 4-i en Φ >1 4-10 -|4 g -4 0 4-io en U4 4-> S4 λ <D eu o 4-) se 0 -μ 0 >i ·π hi<n tn

•Η0-ΗΦ — CD

03 <D 0 4-) 0 0 0 04-10 •H -H 4-> *ι t ·η τ~ι -ro 4-10 -H 0 <D 0) CD CD ·· 00en0 4-> 4-) 44 4Jen 00 >1. 0 0 0 0 00

44 g -H 00 0 O 0 O 0 Γ0 0-P

0 44 0 g'S«4J'3,4JUO4Jtn440 Φ 0 (4 ' i-4 i-4 —' ι—l ' ι—I ' 0 -r4M44 m lt> uo tn g to y -4n r4 ·4ν r-4 -4°* r-4 -Min i—| -4<n 0 0 <U μ K 53 53 5! 530

£0 > W Qj -P 5j Oi 44 (4 ä 4 (¾ 0t -P ft ft 4 K

12 72743

Seuraavat esimerkit valaisevat keksintöä, Streptomy-ces antibioticus ATCC 31771:n ja uusien antibioottien valmistusta .

Esimerkki 1 5 Mutantin Streptomyces antibioticus ATCC 31771:n val mistus

Oleandomysiiniä muodostavan Streptomyces antibioticus ATCC 11891:n itiöiden suspensiolle suoritettiin mutageeni- nen käsittely UV-säteilyn avulla (emissiomaksimi kohdalla 10 254 nm) annostuksen ollessa sellainen, että 99,6 % itiöistä 2 tuhoutuu (noin ergi/cm ). Eloon jääneet itiöt siirros-tettiin ravintoväliaineeseen ja muodostuneet pesäkkeet analysoitiin niiden kyvyttömyyden suhteen tuottaa oleandomysiiniä, käyttämällä menetelmää, jota on selostanut A. Kelner, 15 J. Bact. 57 (1949) 73.

Mutantit, jotka eivät kykene syntetisoimaan oleandomysiiniä (noin 2 % eloon jääneistä organismeista) on sitten analysoitu niiden kyvyn suhteen tunnistaa ja muuttaa substraatit erytronolidi B, erytronolidi A ja erytronolidi A-20 oksiimi uusiksi antibioottista aktiivisuutta omaaviksi yhdisteiksi .

Esimerkki 2

Antibioottien 3-0-oleandrosyyli-5-0-desosaminyyli-(8S)-8-hydroksierytronolidi B (P15148), 3-O-oleandrosyyli-25 5-O-desosaminyylierytronolidi B (P15149), 3-O-oleandrosyy-li-5-O-desosaminyyli-(8R)-8,19-epoksierytronolidi B (P15153) ja 3-0-oleandrosyyli-5-0-desosaminyyli-15-hydroksi-erytronolidi B (P15150) valmistus

Menetelmä A

30 Mutanttia Streptomyces antibioticus ATCC 31771 vil jellään agarviljelylevyillä elatusaineen ollessa seuraava: 13 72743 peptoni 0,2 grammaa/100 ml glyseriini 0,5 grammaa/100 ml sokeriruokomelassi 0,5 grammaa/100 ml K2HP04 0,1 grammaa/100 ml 5 MgS04-7H20 0,05 grammaa/100 ml

NaCl 0,5 grammaa/100 ml

FeS04.7H20 0,001 grammaa/100 ml

CoC12.6H20 0,002 grammaa/100 ml agar-agar 2,0 grammaa/100 ml 10 tislattu vesi määrätilavuuteen pH korjattu arvoon 7,0.

Yhden levyn itiömäärä siirrostetaan 500 ml:n Erlen-meyer-pulloon, sen sisältäessä 50 ml elatusainetta, jonka koostumus on seuraava: 15 dekstroosi 1,5 grammaa/100 ml soijapapujauho 3,0 grammaa/100 ml hiiva-autolysaatti 0,1 grammaa/100 ml

MgS04.7H20 0,1 grammaa/100 ml kalsiumkarbonaatti 1,0 grammaa/100 ml 20 soijapapuöljy 0,6 grammaa/100 ml tislattu vesi määrätilavuuteen

Pulloa inkuboidaan 28°C:ssa pyörivässä ravistimessa kierrosnopeuden ollessa 220 kierr./min. 24 tunnin ajan. Tämän ajan kuluttua 10 litran lasiseen käymisastiaan, jossa 25 on 5 litraa edellä mainittua elatusainetta, siirrostetaan 15 ml tätä viljelmää. Käymisastiaa inkuboidaan 28°C:ssa sekoittamalla kierrosnopeudella 800 kierr./min. ja ilmavirtauksen ollessa 0,6 v/v/min. 16 tunnin ajan. Tämän ajan kuluttua 3,5 litraa edellä mainittua viljelmää käytetään 30 200 litran teräksisen käymisastian ymppäämiseen, jossa on 100 litraa seuraavaa elatusainetta. dekstroosi 5,0 grammaa/100 ml soijapapujauho 2,0 grammaa/100 ml kuivattu leivinhiiva 0,4 grammaa/100 ml 35 maissijauho 1,6 grammaa/100 ml kalsiumkarbonaatti 3,0 grammaa/100 ml 14 72743

NaCl 0,3 grammaa/100 ml rasvaöljy 1,0 grammaa/100 ml vesijohtovesi määrätilavuuteen.

Inkubointi tapahtuu 28°C:ssa sekoittamalla kierrosno-5 peuden ollessa 250 kierr./min. ja ilmastuksen ollessa 1 v/v/min.

32-tuntisen kasvun jälkeen viljelmään lisätään 75 g erytronolidi B:tä ja inkubointia jatketaan edelleen 68 tuntia. Tämän ajan kuluttua viljelmäliemestä otettu näyte suo-10 datetaan ja uutetaan, pH:n ollessa 8,5, yhtä suurella tila-vuusmäärällä CE^C^. Uute analysoidaan ohutlevykromatograa-fisesti silikageelilevyillä, kehittämällä 2 tuntia seoksella CH.2^21 95-%:inen metanoli: väkevä NH^OH (90:10:1).

Levylle suoritetaan bioautografia Micrococcus luteus 15 (Sareina lutea)-ATCC 9341:ä vastaan, tai vaihtoehtoisesti levyt voidaan ruiskuttaa anisaldehydireagenssilla (0,5 til.-% anisaldehydiä seoksessa metanoli:jääetikkahappo: väk. rikkihappo, 85:10:5) ja lämmitetään 120°C:ssa 5 minuuttia .

20 Edellä mainituissa fermentointiolosuhteissa ja rinnan erytronolidi B:n käytön kanssa on valmistettu neljää uutta, antibioottista aktiivisuutta omaavaa ainetta, joista käytetään viitteitä P15148, P15149, P15150 ja P15153. TLC:tä käytettäessä näiden aineiden Rgt-arvot ovat 0,8, 0,9, 0,47 25 ja 0,8 oleandomysiinin suhteen. Erytromysiinin suhteen nämä Rgt-arvot ovat 0,75, 0,85, 0,44 ja 0,75.

Anisaldehydireagenssia käytettäessä tuotteet P15148, P15150 ja 15153 ovat väriltään purppuranpunaisia, kun taas P15149 on väriltään sinipunerva (oleandomysiini on sinipu-30 nerva, erytromysiinin ollessa ruskea).

Orgaanisesta uutteesta otettu näyte tarkistetaan myös HPLC:n avulla. Tässä tarkoituksessa se haihdutetaan, liuotetaan asetonitriiliin ja ruiskutetaan kolonniin (RP8 yum 25 cm; liikkuva faasi 0,01 mol. pH 7-fosfaattipuskuri ja 35 asetonitriili (36: 64); virtaus 2 ml/min; kolonnin lämpötila (40°C). Uusien aineiden P15148, P15149, P15150 ja 15 72743 P15153 osalta huiput ovat todettavissa retentioaikojen ollessa erytromysiini A:n suhteen 0,69, 0,79, 0,52 ja 0,64 ja oleandomysiinin suhteen 1,08, 1,22, 0,80 ja 0,99.

100 tunnin fermentoinnin jälkeen kokonaisantibiootti-5 aktiivisuus, ilmaistuna erytromysiini A:n aktiivisuutena, on noin 120-150 mcg/ml.

Sekoittaminen vähennetään minimiin pysäyttämällä ilman syöttö ja lämpötila alennetaan 15°C:seen.

Menetelmä B

10 Streptomyces erythreus NRRL 2338:n fermentointivil- jelmä valmistetaan olosuhteiden mukaisesti, joita on selostettu julkaistussa DE-hakemusjulkaisussa 1900647, 3/8 1970.

Lisäämällä 144 tunnin fermentoinnin jälkeen elatus-liemeen 4 til-% n-propanolia saadaan noin 500 mcg/ml eryt-15 rolidi B:tä ja jälkiä erytromysiinistä (vähemmän kuin 20 mcg/ml).

Tänä ajankohtana viljelmä sentrifugoidaan ja kirkas pintakerros steriloidaan suodattamalla.

Streptomyces antibioticus ATCC 31771:n kasvuviljel-20 mä valmistetaan menetelmässä A selostetun menettelytavan mukaisesti. Toinen kavuvaihe suoritetaan samoissa olosuhteissa siirrostamalla 1 ml kasvuviljelmää toiseen 500 ml:n Erlenmeyer-pulloon, jossa on 50 ml menetelmän A elatusai-netta. 1,0 ml toista kasvuviljelmää siirrostetaan 500 ml:n 25 Erlenmeyer-pulloon, jossa on 30 ml seuraavaa elatusainetta: dekstroosi 5,0 grammaa/100 ml soijapapujauho 2,0 grammaa/100 ml leivinhiiva 0,2 grammaa/100 ml maissijauho 0,3 grammaa/100 ml 30 kalsiumkarbonaatti 2,0 grammaa/100 ml vesijohtovesi määrätilavuuteen.

Pulloa inkuboidaan 28°C:ssa pyörivässä ravistimessa nopeudella 250 kierr./min. 32 tunnin inkuboinnin jälkeen pulloon lisätään 10 ml edellä selostettua kirkasta pinta-35 kerrosta ja inkubointia jatketaan edelleen 64 tuntia.

16 72743

Viljelmä analysoidaan menetelmässä A selostetun menetelmän mukaisesti. Kokonaisantibioottiaktiivisuudeksi (i1— mastuna erytromysiini A:n aktiivisuutena) saadaan noin 30 mcg/ml; HPLC:n avulla läsnä todetaan olevan neljää uutta 5 antibioottia P15148, P15149, P15150 ja P15153 samoin kuin jälkiä erytromysiini A:sta. Kontrollipulloissa, joihin ei lisätty erytronolidi B:tä sisältävää suodosta, antibioottista aktiivisuutta ei ilmennyt.

Esimerkki 3 10 Antibioottien 3-0-oleandrosyyli-5-0-desoaminyyli-(8S)- 8-hydroksierytronolidi B (P15148), 3-0-oleandrosyyli-5-0-desosaminyylierytronolidi B (P15149), 3-0-oleandrosyyli-5- O-desosaminyyli-(8R)-8,19-epoksierytronolidi B (P15153) ja 3-0-oleandrosyyli-5-0-15-hydroksierytronolidi B (P15150) 15 puhdistus

Lopulliseen fermentointiseokseen, joka on esitetty esimerkissä 2 (menetelmä A), lisätään sekoittaen 30 litraa 10-%:ista (paino/tilavuus) ZnSO^-liuosta ja 30 litraa 2-%:ista (paino/tilavuus) NaOHrn vesiliuosta. Suodatusapu-20 aineen lisäämisen jälkeen kiinteä aines poistetaan suodattamalla pyörivän suodattimen läpi vakuumissa sen jälkeen kun suodatinkakun kiinteätä ainesta on huuhdeltu yhtäjaksoisesti. Pestyt kiinteät aineet hävitetään ja suodatuksen päätyttyä saadaan talteen 150 litraa kirkasta suodosta.

25 Sen jälkeen suodos suolataan sopivalla suolalla, kuten NaCl:lla, Na2SO^:lla, (NH^^SO^illa ja näiden kaltaisilla suoloilla, käyttämällä niitä määrin 15-25 % (paino/ tilavuus), seuraavan, sopivalla veden kanssa sekoittumatto-malla liuottimella suoritettavan uuttamisen helpottamisek-30 si. Suodoksen pH korjataan välille 5,4-6,2 laimeilla hapoilla, kuten esimerkiksi fosfori- tai etikkahapolla.

Tässä työvaiheessa inaktiiviset kiinteät aineet saostuvat ja poistetaan sitten suodattamalla.

Sopiva veden kanssa sekoittumaton liuotin kuten bu-35 tyyliasetaatti, kloroformi, metyyli-isobutyyliketoni, mety-leenikloridi tai dikloorietaani saatetaan kosketuksiin kirk- 17 72743 kaan suodoksen kanssa, suhteen ollessa 20:n ja 50:n til-%:n välillä, käyttämällä apuna jatkuvatoimista keskipako-uutin-ta.

Työvaihe uusitaan kahdesti ja orgaaniset faasit yhdis-5 tetään. Yhdistetyt orgaaniset faasit sisältävät pääasiallisesti antibioottia P15149 . Vesifaasissa on antibiootteja P15148, P15150, P15153 ja jäljellä oleva P15149, joka ei ole täydellisesti uuttunut orgaanisesta faasista.

Orgaaninen faasi (noin 100 litraa) tislataan vakuu- 10 missä alhaisessa lämpötilassa noin 10 litran tilavuiseksi.

-4

Voimakkaasti sekoittaen lisätään 3 litraa 10 -molaa-rista asetaattipuskuria pH:n ollessa noin 4,0 ja sitten faasit erotetaan. Työvaihe toistetaan kolme kertaa ja lopuksi kaikki P15149 on vesifaasissa; paljon epäpuhtauksia 15 sisältävä liuotin hävitetään.

Yhdistetyt vesifaasit säädetään pH-arvoon noin 8,0 laimealla NaOHrlla ja sen jälkeen uutetaan kolme kertaa 3 litran erillä orgaanista liuotinta, kuten metyylietyyli-ketonilla tai butyyliasetaatilla. Vesifaasi hävitetään ja 20 orgaaniset faasit yhdistetään ja kuivataan vedettömällä

NaoS0.:11a.

2 4

Kuivattu liuos tislataan vakuumissa alhaisessa lämpötilassa 500 ml:n tilavuiseksi.

5 litraan polaaritonta liuotinta, kuten esim. heksaa-25 nia tai petrolieetteriä, joka on lämmitetty noin 40°C:seen, lisätään sekoittaen 500 ml konsentroitua liuosta; lisäys suoritetaan noin 1 tunnin kuluessa.

Lisäyksen päätyttyä lämmitys lopetetaan ja seos jäähdytetään hitaasti +5°C:seen.

30 Seoksen oltua paikoillaan noin 2 tuntia tuossa lämpö tilassa P15149:n saostuminen, joka alkoi jo noin l8°C:ssa, on tapahtunut täydellisesti.

Valkea ja höytymäinen sakka suodatetaan erilleen, pestään liuottimena ja kuivataan, jolloin saadaan 4,2 g 35 P15149:ää, jonka pituus HPLC-analyysin perusteella on 85 %.

18 72743

Analyyttisesti puhtaan näytteen saamiseksi kiinteätä ainetta on puhdistettava edelleen kromatografoimalla kolonnissa silikageelillä menetelmän mukaisesti, jonka on esittänyt N. L. Oleinick, J. Biol. Chem., 244 (1969) 3, 727.

5 Fraktiot 25-80, jotka sisältävät 3-O-oleandrosyyli- 5-0-desosaminyylierytronolidi B:tä (P15149), yhdistetään haihdutetaan kuiviin vakumissa 50°C:ssa, ja kiteytetään asetoni-n-heksaani-seoksesta, jolloin saadaan 1,835 g P15149:ää, jonka ominaisuudet ovat seuraavat: 10 sp.: 128-131°C; 0*0™ -68,2° (C = 1 metanolissa) ; UV (metanoli) 290 nm (6 59,8 ; IR (KBr) 3490, 1729, 1700 (olka), 1460, 1380, 1335, 1275, 1250, (olka), 1180, 1160, 1140, 1105, 1075, 1050, 1000, 945, 920, 890, 830 cm"1 (piirros 1).

15 Analyysi, laskettu yhdisteelle C36H65NOx2' ant°i seuraavat arvot: laskettu (%): C 61,43; H 9,30; N 1,99; saatu (%): C 61,34; H 9,38; N 2,05

Vesifaasit, jotka sisältävät antibiootteja P15148, 20 P15150, P15153 ja P15149 (joka ei ole uuttunut täydellises ti) , tehdään alkaliseksi laimealla NaOHrlla, uutetaan useaan kertaan samantilavuisilla CH2Cl2-erillä. Ennen kutakin uuttamista vesifaasin pH säädetään jälleen arvoon 9.

TLC- ja HPLC-kontrollien avulla voidaan yksilöidä uutteet, 25 jotka sisältävät ainoastaan antibioottia P15150 (liukenee vesifaasiin paremmin kuin muut) ja uutteiden sisältäessä edelleen yhdessä antibiootteja P15148, P15149, P15150 ja P15153.

Ainoastaan P15150:tä sisältävät orgaaniset faasit yh-30 distetään ja haihdutetaan kuiviin vakuumissa 50°C:ssa, jolloin saadaan 3,4 g antibioottia P15150, jonka kemialliset ja fysikaaliset ominaisuudet ovat seuraavat: OKID -55°c (C = 1 metanolissa); UV (metanoli) 288 nm ( £ 42); IR (KBr) 3460, 1715, 1700 (olka), 1455, 1375, 1330, 35 1300, 1270, 1255, 1240, 1170, 1105, 1045, 1000, 990, 980, 940, 915, 885, 825 cm 1 (piirros 2).

19 72743

Vastaavan hydrokloridin sulamispiste on 160-163°C (asetoni).

Analyysi, laskettu yhdisteelle / antoi seuraavat tulokset: 5 laskettu (%): C 57,17? H 8,80? N 1,85? Cl 4,69? saatu (%): C 56,92? H 8,77? N 1,91? Cl 4,59.

Toiset orgaaniset faasit, jotka sisältävät edelleen antibioottia P15150 ja jäljellä olevia antibiootteja, haihdutetaan kuiviin vakuumissa 50°C:ssa ja saatu jäännös puh-10 distetaan silikageelikolonnissa edellä mainitun N.L. Gleinick'in menetelmän mukaisesti.

Suorittamalla eluointi tässä menetelmässä mainitulla liuottimena kootaan fraktioita, jotka sisältävät ainoastaan P15149:ää (fraktiot 52-110), P15148:aa (fraktiot 130-15 185), P15153:a (fraktiot 260-450). Kun TLC- ja HPLC-kontrol- lien perusteella ilmenee, että eluoituneet fraktiot eivät sisällä enää P15153:a, eluointiliuotin vaihdetaan. Eluoi-malla isopropyylialkoholi-asetoni-seoksella (1:1,5) kootaan fraktioita, jotka sisältävät ainoastaan antibioottia 20 P15150. Fraktioista 52-110, yhdistettyinä ja vakuumissa 50°C:ssa kuiviin haihdutettuina, saatiin 0,425 g 3-O-olean-drosyyli-5-O-desosaminyylierytronolidi B:tä (P15149), jonka kemialliset ja fysikaaliset ominaisuudet asetoni-n-heksaa-niseoksesta, kiteyttämisen jälkeen ovat yhdenmukaiset omi-25 naisuuksien kanssa, jotka on ilmoitettu aikaisemmin eristetyn P15149:n osalta.

Fraktioista 130-185, yhdistettyinä ja vakuumissa 50°C:ssa kuiviin haihdutettuina, saatiin asetonista kiteyttämisen jälkeen 3,2 g 3-0-oleandrosyyli-5-0-desosaminyyli-30 (8S)-8-hydroksierytronolidi B:tä (P15148), jonka ominaisuu det olivat: sp. 204-206°C? -48,35° (C = 1 metanolissa) ? UV (metanoli) 280 nm ( £,39,2)? IR (KBr) 3590, 3520, 3440 (leveä) 3280 (leveä), 35 1725, 1455, 1380, 1365, 1305, 1280, 1270, 1260, 1175, 1155, 1095, 1060, 1050, 1020, 1005, 970, 935, 915, 885, 875, 820 cm ^ (piirros 3).

20 7 2 7 4 3

Analyysi, laskettu yhdisteelle C^Hg^NO^/ antoi seuraavat arvot: laskettu (%): C 60,06; H 9,10; N 1,94; saatu (%): C 60,12; H 8,93; N 1,92.

5 Fraktioista 260-450 yhdistettyinä ja vakuumissa 50°C:ssa kuiviin haihdutettuina saatiin asetoni/n-heksaani-seoksesta kiteyttämisen jälkeen 10,3 g 3-O-oleandrosyyli- 5-O-desosaminyyli-(8S)-8,19-epoksierytronolidi B:tä (P15153), jonka kemialliset ja fysikaaliset ominaisuudet 10 olivat seuraavat: sp. 125-130°C; 0*]^ -27,7° (C = 1 metanolissa) ; UV (metanoli) 294 nm (ζ32,7); IR(KBr) 3485, 1720, 1460, 1380, 1330, 1305, 1270, 1170, 1140, 1110, 1075, 1050, 1000, 930, 920, 890, 830 cm"1 15 (piirros 4).

Analyysi, laskettu yhdisteelle C^gHg ^NO.^ / antoi seuraavat arvot: laskettu (%): C 60,23; H 8,85; N 1,95; saatu (%): C 60,12; H 8,75; N 1,79.

20 Haihduttamalla vakuumissa kuiviin fraktiot, jotka on koottu käyttämällä isopropyylialkoholi-asetoni-seosta (1:1,5) ja kiteyttämällä sitten asetoni/n-heksaaani-seok-sesta, saadaan 15,4 g antibioottia P15150, jonka ominaisuudet ovat samat kuin aikaisemmin on mainittu.

25 Esimerkki 4

Antibiootin P15151:n valmistus

Streptomyces antibioticus ATCC 31771:n fermentointi-viljelmään, joka on valmistettu pulloon esimerkissä 2 selostetun menetelmän mukaisesti, lisätään 30 tunnin inku-30 boinnin jälkeen 15 mg erytronolidi A:ta, jota on valmistettu erytromysiini A:sta lähtien menetelmän mukaisesti, jota on selostettu artikkelissa J. Med. Chem. 17 (1974) 953. 60 tunnin jatkoinkuboinnin jälkeen viljelmäliemi analysoidaan esimerkissä 2 selostetulla tavalla ja antibioottiseksi 35 aktiivisuudeksi saadaan noin 70 mcg/ml (ilmaistuna erytromysiini A:n aktiivisuutena).

21 72743 TLC-analyysin perusteella on löydetty uusi aktiivinen aine, P15151, jonka Rf on 0,8 erytromysiini A:n suhteen ja 0,88 oleandomysiinin suhteen.

Tämä yhdiste on lisäksi erilainen kuin antibiootti 5 P15148, P15149, P15150 ja P15153.

Esimerkki 5

Antibiootin P15l52:n valmistus

Pulloon, jossa on viljelmää Streptomyces antibioticus ATCC 31771, jota on valmistettu esimerkissä 4 selostetun 10 menetelmän mukaisesti, lisätään 30 tunnin inkuboinnin jälkeen 15 mg erytronolidi A-oksiimia, jota on valmistettu kemiallisesti menetelmän mukaisesti, jota on selostettu artikkelissa J. Med. Chem. 17 (1974) 953.

60 tunnin jatkoinkuboinnin jälkeen viljelmäliemi ana-15 lysoidaan esimerkissä 2 selostetulla tavalla ja kokonais-antibioottiaktiivisuudeksi todetaan noin 50 mcg/ml (ilmaistuna erytromysiini A:n aktiivisuutena). TLC-analyysin perusteella on löydetty kaksi aktiivista ainetta, joista toinen on sama, jota on selostettu artikkelissa J. Antib., 20 29 (1976), 728, (Rf 0,73 oleandomysiinin suhteen), toisen ollessa uusi aine, josta käytetään viitemerkintää P15152, ja jonka Rf on 0,47 oleandomysiinin suhteen ja 0,44 erytromysiini A:n suhteen.

Claims (6)

22 7 2 7 4 3

1. Menetelmä uusien makrolidiantibioottien P15149 eli 5 3-0-oleandrosyyli-5-0-desosaminyylierytronolidi B, jonka kaava on „ _ F5 3"/3 “3<: >T^Vch30 ch

10 H0··^^ ΗΟ-';<..·° 3 h3c··> V "A L~0CH3

15 O 3 CH3 jonka Rgt on 0,9 oleandomysiinin suhteen ja 0,85 erytro-20 mysiinin suhteen (silikageelilevy, eluentti: metyleeniklo-ridi/95 % metanoli/väkevä ammoniakki, 90:10:1), ja joka värjäytyy purppuranpunaiseksi anisaldehydireagensilla, P15148 eli 3-0-oleandrosyyli-5-o-desosaminyyli-(8S)-hydroksi-25 erytronolidi B, jonka kaava on HO f 3 H3C^n'CH3 Ho-yvi^ H3C--J HO HO*'^y- · · u 30 H c ^^^3 (o J^° H3C 3 L__-^0CH3 J

35 CH3 72743 P15150 eli 3-0-oleandrosyyli-5-0-desosaminyyli-15-hydroksi- erytronolidi B, jonka kaava on ch3 h3c nj:h3 H0

0. Y\h I HO II 3 3H

0 X0 ch3 15 ja P15153 eli 3-0-oleandrosyyli-5-0-desosaminyyli-(8R)-8,19-epok-sierytronolidi B, jonka kaava on h3c^n^ch3

20 H3^Ti/CH3 S ” ">c ch3 joiden vastaavat Rst~arvot ovat 0,8, 0,47 ja 0,8 oleando-30 mysiinin ja 0,75, 0,44 ja 0,75 erytromysiinin suhteen (silikageelilevy, eluentti metyleenikloridi/95 % metano-li/väkevä ammoniakki 90:10:1), ja jotka värjäytyvät purppuranpunaisiksi anisaldehydireagenssilla, valmistamiseksi, tunnettu siitä, että Streptomyces antibioticus 35 ATCC 31771:n viljelmään lisätään sinänsä tunnetulla tavalla suoritettavan fermentoinnin aikana erytronolidi B:tä, 24 72743 inkuboidaan 100 tuntia, minkä jälkeen elatusaineesta otetusta näytteestä määritetään tuotettujen antibioottien P15148, P15149, P15150 ja P15153 läsnäolo ja identtisyys ohutlevykromatografiän ja bioautografiän avulla tai suih-5 kuttamalla levyille anisaldehydireagenssia, fermentointi-liemi suodatetaan, ulossuolataan ja uutetaan orgaanisella liuottimena, orgaaninen faasi ja vesifaasi erotetaan, minkä jälkeen orgaanisesta faasista eristetään sisänsä tunnetuin työvaihein P15149, ja vesifaasista eristetään liuo-10 tinuutos-työvaiheita käyttäen ja liukoisuuseroavuuksien perusteella. P15148, P15150 ja P15153.

2. Menetelmä uuden makrolidiantibiootin P15151 valmistamiseksi, jonka antibiootin Rf on 0,8 erytromysiini A:n suhteen ja 0,88 oleandomysiinin suhteen (silikageeli- 15 levy, eluentti: metyleenikloridi/95 % metanoli/väkevä ammoniakki, 90:10:1), tunnettu siitä, että Strep-tomyces antibioticus ATCC 31771:n viljelmään lisätään sinänsä tunnetulla tavalla suoritettavan fermentoinnin aikana erytronolidi A:ta, inkubointia jatketaan edelleen 20 60 tuntia, minkä jälkeen fermentoinnissa tuotetun anti biootin määrittämisen jälkeen ohutlevykromatografiän ja bioautografiän avulla tai suihkuttamalla levyille anisaldehydireagenssia, antibiootti eristetään.

3. Menetelmä uuden makrolidiantibiootin P15152 25 valmistamiseksi, jonka antibiootin Rf on 0,47 oleandomysiinin suhteen ja 0,44 erytromysiini A:n suhteen (silika-geelilevy, eluentti: metyleenikloridi/95 % metanoli/väkevä ammoniakki, 90:10:1), tunnettu siitä, että Streptcmyces antibioticus ATCC 31771:n viljelmään lisätään 30 sinänsä tunnetulla tavalla suoritettavan fermentoinnin aikana erytronolidi A-oksiimia ja inkubointia jatketaan edelleen 60 tuntia, minkä jälkeen, fermentoinnissa tuotetun antibiootin määrittämisen jälkeen ohutlevykroma-tografian ja bioautografiän avulla tai suihkuttamalla le-35 vyille anisaldehydireagenssia, antibiootti eristetään. 25 7 2 7 4 3