FI71165C - Foerfarande foer framstaellning av toxoplasma-antigen undersoekning av toxoplasma-immunitet - Google Patents

Description

71 1 65 ^ Menetelmä toksoplasma-antigecnin valmistamiseksi toksoplasmaimmuniteetin tutkimiseksi Förfarnnde för framställning av toxoplnsma-antigrn för undersökning av toxoplasma-immunitet 5

Keksinnön kohteena on menetelmä toksoplasma-antigeenin valmistamiseksi toksop.lasma-immuni.teet.in tutkimista varten, jonka menetelmän mukaan soluviljelmään ympätään sopivassa väliaineessa Toxoplasma gondii ja otetaan 10 talteen viljelyväliaine, josta solut ja toksoplasmat on poistettu, ja joka sisältää toksoplasma-eksoantigeenejä.

Toksoplasmoosi on tauti, jolle koko väestö näyttää tulevan yhä herkemmäksi. Se on erikoisen vakava sikiöille, ja toksoplasmisen immuniteetin ha-15 vaitseminen ennen avioitumista on nyt tehty esim. Ranskassa pakolliseksi.

Immuniteetti voidaan tutkia serologisilla kokeilla, mutta yksinkertaisuus- ja kustannussyistä on pyritty käyttämään ihokokeita hidastuneen yliherkkyyden havaitsemiseksi.

20

Jo vuonna 1948 on J.K. Frenkel esittänyt toksoplasma-antigeenejä, ' joita on sanottu "Toksoplasmiineiksi", hidastuneen yliherkkyyden havaitsemiseksi (Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine 1948, 68, 634-639). Nämä antigeenit oli muodostettu eläin-25 ten, kuten hiirien tai hamsterien vatsaontelokalvon tulehdusnesteessä olevien loisten raakajauheesta, jolloin 0,25-prosenttista fenolia on käytetty suoja-aineena reagenssin mahdollisten saastumisten estämiseksi varastoinnin aikana. Tämän tyyppinen reagenssl on sitten tuotu markkinoille, ja sitä on laajalti käytetty (katso julkaisuja W.F. Mc 30 CULLOCH - Public Health Reports 1963, 78 n:o 8, 689-698" ja J.L.

KRAHENBUHL - Infection and Immunity 1971, 3, n:o 2, 260-267). Tällainen valmiste ei kuitenkaan ole tyydyttänyt nykyisiä vaarattomuusnor-meja hiirien tulehdusnesteessä mahdollisesti esiintyvien kontaminanttien takia.

Sittemmin on yritetty valmistaa antigeenivalmisteita viljelemällä loista Toxoplasma gondii apinan munuaissoluista peräisin olevia solulinjoja 35 2 71165 1 käyttäen. Antigeeni on saatu jäähdyttämällä ja sulattamalla talteenotettu ja loisia (katso S.D. CHAPARAS et ai. - Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine 1966, 121, 734-739). Näillä antigeenisillä valmisteilla, joita on käytetty ruiskuttamalla aiheutettua ihonsi-5 säistä reaktiota soveltaen, esim. käyttämällä reagenssia, joka on valmistettu J.K. Frenkel'in töiden perusteella, on kuitenkin haittana, että ne sisältävät lukuisia loisista peräisin olevia hiukkasia.

Tämän jälkeen on voitu osoittaa viljelyistä, joissa on käytetty ihmi-10 sen diploidisoluista peräisin olevia solulinjoja tai apinan munuaisso- luista peräisin olevia solulinjoja, että toksoplasmat vapauttavat vilje-lyväliaineessa ekso-antigeenejä (P.T. DESGEORGES, X. RILLIAULT, P. AMBR0I-SE-THOMAS ja M. BOUTTAZ, Lyon Medical 30, 06, 80-243, 12, 737-740). On täten voitu osoittaa edulliseksi käyttää tällaisia toksoplasma-ekso-anti-15 geenejä toksoplasmisen immuniteetin tutkimiseksi. Näiden antigeenien etuna on itse asiassa, että niissä ei ole käytännöllisesti katsoen mitään toksoplasmoista kotoisin olevia hienojakoisia materiaaleja, ja että ne eivät sisällä soluista kotoisin olevia saasteita. Täten selitetyt antigeeniset valmisteet eivät kuitenkaan sovellu käytettäviksi ihmislää-20 kinnän alalla.

Keksinnön tarkoituksena on näin ollen aikaansaada tällainen toksoplas-ma-antigeeni toksoplasmisen immuniteetin tutkimiseksi, jolla antigeenillä on suuri puhtausaste, eikä siinä ole saasteita, jotka voisivat aiheut-25 taa suuria herkistymisvaaroja ihmisissä.

Keksinnön toisena tarkoituksena on aikaansaada sellainen antigeeni, jonka avulla voidaan tutkia toksoplasma-immuniteettia lhokokeilla multlpunktuu-ria soveltaen.

30

Keksinnön tarkoituksena on edelleen aikaansaada sellainen antigeeni, jota myös voidaan käyttää serologisissa kokeissa.

Keksinnön tarkoituksena on lisäksi aikaansaada sellainen antigeeni, joka 35 ei aiheuta vaaroja vlrussaaetumisesta.

Keksinnön mukainen menetelmä toksoplasma-antigeenin valmistamiseksi tokso- 3 711 65 1 plasmisen immuniteetin ilmaisemiseksi ihmisessä tai eläimessä on tunnettu siitä, että viljely suoritetaan toksoplasmojen ollessa läsnä väliaineessa, josta eläinseerumi, varsinkin vasikanseerumi on poistettu, että poistetaan soluista tai toksoplasmoista peräisin olevat toksoplasmojen ja seinämän 5 jätteet steriloivasti suodattamalla, että suodatuksen jälkeen saadussa liukoisessa antigeenissä mahdollisesti läsnä olevat virushiukkaset deakti-voidaan edullisesti formaliinilla, ja että liukoinen antigeeni konsentroidaan deaktivoinnin jälkeen.

10 Yksi HSR-yksikkö on määritelty antigeenimääräksi, joka ihonalaisesti ruiskutettuna 0,1 ml:n annoksena erikoisesti herkistettyyn marsuun antaa 100 mm reaktion 18 tunnissa tai 24 tunnissa.

Antigeenin konsentraatio on edullisesti suuruusluokkaa kaksisataakertai-15 nen, verrattuna alkuperäiseen saantoon.

Soluviljelyssä voidaan käyttää eri eläinlajien, kuten apinan, sian, kanan-poikasten primäärisistä munuaissoluista peräisin olevien solujen solulin-joja, mutta edullisesti käytetään joko ihmisen diploldisoluista peräisin 20 olevia tai eläinten heteroploidisista soluista peräisin olevia solulin-joja.

Edullisesti käytetään ihmisten diploldisoluista peräisin olevina solu-linjoina erästä solulinjaa MRC5, jota ovat kuvanneet J.P. JACOBS et ai.

25 - Nature 1970, 227, n:o 5254, 168-170, ja sitä on esim. saatavissa lai toksesta National Institute for Medical Research Holly Hill - London NW3 - Iso-Britannia.

Eläinten heteroploidisten solujen solullnjana käytetään edullisesti ei-30 tuumorigeenisiä solulinjoja, kuten erästä solulinjaa VERO, jota ovat kuvanneet B.J. MONTAGNON et coll. Intern. Symp. julkaisussa Reassessment of Inactivated Poliomyelitis Vaccine, Bilthoven 1980, Develop. Biol. Standard, 47, s. 55-64 (S. Karger, Basel 1981).

35 Keksinnön eräässä erikoisen edullisessa suoritusmuodossa suoritetaan riittävän suuri konsentroiminen, joka on vähintään 190-kertainen ja edullisesti noin 200-kertainen siten, että saadaan antigeeni, jonka 71 1 65 4 1 tiitteri on vähintään .160 yksikköä ELISA-kokeessa, mikä likimain viistää 500 HSR Merieux-yksikköä, minkä jälkeen antigeeni suspensoidnan glyseroliin siten, että voidaan käyttää tätä antigeeniä naarmuttamis-menetelmän, varsinkin nuiittpunktuurimenet eImän avulla.

5

Antigeenin ELlSA-tiitteri on laimennuksen käänteisarvon log, joka laimennus vastaa 50% optisesta maksimitiheydestä, joka määritellään käyttämällä levyä, joka sisältää antigeeniä ylimäärin. Tuntemattoman antigeenin aktiviteetti lausutaan suhteessa samoissa olosuhteissa 10 tiiratun standardi-antigeenin aktiviteettiin. Lasketaan suhteellinen tehokkuus, joka on yhtä kuin tuntemattoman antigeenin ELlSA-tiitterin ja standardi-antigeenin välisen eron antilogaritmi. Kokeiltavan antigeenin lopullinen tiitteri saadaan kertomalla sen suhteellinen tehokkuus standardi-tiitterillä, jo tulos esitetään yksikköinä millilitraa 15 kohden.

Soluviljelyä jatketaan edullisesti ymppäyksen jälkeen noin 6 päivää 37C:ssa.

20 Suodatusvaiheeseen voi edullisesti sisältyä ensimmäinen steriloiva suodatus, minkä jälkeen seuraa ultrasuodatusdialyysi ja sitten uusi steriloiva suodatus.

Deaktivointi suoritetaan edullisesti formaliinilla suhteessa 1:1000 25 noin 24 tunnin aikana huoneenlämmössä ja jatkuvasti sekoittaen.

Erään edullisena pidetyn suoritusmuodon mukaan suspendoidaan täten konsentroitu antigeeni glyseroliin tai muuhun kantoaineeseen siten, että sitä voidaan käyttää naarmutusmenetelmää, varsinkin multipunk-30 tuuria soveltaen.

Keksinnön muut edut ja tunnusmerkit selviävät luettaessa seuraavaa selitystä, joka on esitetty esimerkkinä.

35 Suoritetaan solujen MRC 5 viljely EAGLE BME-väliaineessa, johon on lisätty 10% vasikanseerumia. Tämä viljely suoritetaan pullossa, jonka 2 pinta on noin 500 cm .

5 71165 1 Viljely suoritetaan 37C:ssa 3 päivän aikana, jolloin solujen alkukon-sentraatio on 20 miljoonaa pulloa kohden EAGLE BME-väliaineessa, jossa lisäksi on 10% vasikanseerumia. Kolmantena päivänä väliaine korvataan EAGLE BME-väliaineella, johon on lisätty 2% vasikanseerumia. Pulloja 5 pidetään jälleen 37C:ssa 4 päivää. Tämän jälkeen pestään solukerros väliaineen tultua poistetuksi kolmasti fysiologisella suolavedellä ja pannaan solut jälleen EAGLE BME-väliaineeseen, jossa ei ole vasikanseerumia. Kaksikymmentäneljä tuntia näiden pesujen jälkeen vaihdetaan jälleen BME-väliaine uudeksi ilman vasikanseerumia, ennen kuin loiset 10 lisätään. Toksoplasmat, joita on ylläpidetty Swiss-tyyppisissä naaras-hiirissä, ympätään 2,4 x 10 toksoplasmaa suuruisena määränä viljely-väliaineen millilitraa kohden.

Tämän jälkeen suoritetaan viljely kuuden vuorokauden aikana 37C:ssa.

15

Kuudennen päivän jälkeen viljelyn pinnalle nouseva kerros otetaan talteen ja suoritetaan sillä ensimmäinen steriloiva suodatus (esisuo-datin AP 20 -AW 0,6-steriilit Millipore -suodattimet 0,22 ).

20 Tämän jälkeen lisätään formaliinia suhteessa 1:1000, ja liuos pidetään huoneenlämmössä jatkuvasti sekoittaen 24 tunnin aikana. Tätä deakti-vointivaihetta seuraa ultrasuodatusdialyysi ja vähintään noin 200-kertainen konsentroiminen Amicon-materiaalilla (kolonni ja solut) kalvoa PM 10 käyttäen.

25 Tämän jälkeen konsentraatilla suoritetaan vielä steriloiva uudelleen- © suodatus peräkkäisillä Millipore^suodattimilla (AP 20,8 ...0,45 , 0,22 ).

30 Tässä vaiheessa on saadun antlgeeniliuoksen hidastunut yliherkkyys-tiitteri marsussa vähintään 500 20% toksoplasmlsta HSR Merieux- yksikköä.

Puhdistettu liukoinen antigeeni, joka on konsentroitu ja deaktivoitu, 35 tiirataan tämän jälkeen serologisesti "in vitro" ELISA-kokeella, minkä jälkeen sen hidastunut yliherkkyysaktiviteetti kalibroidaan titraa-malla "in vivo" marsuissa, jotka on ennalta herkistetty Toxoplasma 6 71 1 65 1 gondii'n erikoisuutteella.

Lopuksi antigeeni suspendoldaan 70 prosenttiseen glyseroliin. Tämä valmiste on tarkoitettu pantavaksi multipunktuurilaicteen kärkiin.

5

Esikliinisillä tutkimuksilla on saatu seuraavat tulokset:

Marsuilla 10 _____________r------T-----------------------

Laimennus puhdas kolmas- kymmenes- kolmaskymme- sadas-

Antigeenit osa osa nesosa osa

Koeryhmä X 5,5 mm 4,2 2,5 0 0 15 ____________________________________________________

Koeryhmä Y5,8tnm 4,2 3,2 2,8 1 20 25 30 35 7 71 1 65 1 Ihmisissä

Ser. Antigeeni X Antigeeni X Antigeeni X

5 puhdas 1/3 1/10 T.L. p.i. 24 h 48 h 72 h 24 h 48 h 72 h 24 h 48 h 72 h kohde 160 4,5 4,5 3,5 0 3 2 2 2 2 JO A u.i. mn mn mn mn tnn mn mn mn kohde 80 0 33,50 0 0 0 0 0 B u.i. mn mn mn mn mn mn mn 15 kohde 8 0 2 2,5 - C u.i. mn mn

kohde 0000000000 D

20 ______________________________________________

Edellä esitetyn taulukon lyhenteiden selitys: - Ser. : serologia 25 - T.L. :lukuajankohdat - p.i. : immunofluoresenssin avulla - u.i. : kansainvälistä yksikköä 30 35

Claims (10)

71 1 65

1. Menetelmä toksoplasmn-antigoenin valmistamiseksi toksoplasma-immuni-teetin tutkimista varten, jonka menetelmän mukaan soluviljelmään ympä- 5 tään sopivassa väliaineeseessa Toxoplasma gondii ja otetaan talteen vil-jelyväliaine, josta solut ja toksoplasmat on poistettu, ja joka sisältää toksoplasma-eksoantigeenejä, tunnettu siitä, että viljely suoritetaan toksoplasmojen ollessa läsnä väliaineessa, josta eläinseerumi, varsinkin vasikanseerumi on poistettu, että poistetaan soluista tai tok-10 soplasmoista peräisin olevat toksoplasmojen ja seinämän jätteet steriloi-vasti suodattamalla, että suodatuksen jälkeen saadussa liukoisessa antigeenissä mahdollisesti läsnä olevat virushiukkaset deaktivoidaan, edullisesti formaliinilla, ja että liukoinen antigeeni konsentroidaan deakti-voinnin jälkeen. 15

1 Patenttivaatimukset

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että suoritetaan vähintään kaksisataakertainen konsentrointi.

3. Jommankumman patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, t u n -20 n e t t u siitä, että käytetään ihmisen diploidisoluista peräisin olevaa solulinjaa, ja varsinkin solulinjaa MRC 5.

4. Jommankumman patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että käytetään eläinten heteroploidisista soluista 25 peräisin olevaa solulinjaa, ja varsinkin solulinjaa VERO.

5. Jommankumman patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että käytetään primäärisolujen viljelmää.

6. Jonkin patenttivaatimuksen 1-5 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että antigeeni suspendoidaan glyseroliin.

7. Jonkin patenttivaatimuksen 1-6 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että soluviljelyt suoritetaan ymppäyksen jälkeen 6 päivän aikana 35 37°C:ssa.

8. Jonkin patenttivaatimuksen 1-7 mukainen menetelmä, tunnettu 71 1 65 1 siitä, että suodatukseen sisältyy steriloiva suodatusvaihe, minkä jälkeen seuraa ultrasuodatusdialyysi ja sitten uudelleen steriloiva suodatus .

9. Jonkin patenttivaatimuksen 1-8 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että deaktivointi suoritetaan formaliinilla.

10. Patenttivaatimuksen 9 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että deaktivointi formaliinilla suoritetaan noin kahdenkymmenenneljän 10 tunnin aikana formaliinilla suhteessa 1:1000 huoneenlämmössä. 15 20 25 30 35 71165