FI69082C - Foerfarande foer framstaellning av paromomycinderivat - Google Patents

Description

TM /m KUULUTUSjULKAISU 69082 ·$ΙΙί? utläggn,ngsskr,ft C (45) j' 1 j-' '· :; “ '·11" :: 12 1935 (51) Kv.lk.«/Int.CI.« c 07 H 15/232 SUOMI —FINLAND (21) Patenttihakemus — P»tent*nsöknlng 801 769 (22) HakemlspilvS — Ansöknlngsdag 02.06.80 (23) Alkupilvi — Glltlghetsdag 0 2.06.8 0 (41) Tullut julkiseksi — Bllvlt offentllg gg ^ 80

Patentti- ja rekisterihallitus Nähtävikslpsnon ja kuul.julkalsun pvm. - ’nR’« -

Patent- oeh registerstyrelsen v ' Ansökan utlagd och utl.skrlften publicerad ju . uo .05 (32)(33)(31) Pyydetty etuoikeus — Begird prloritet 07.06.79 Englanti-England(GB) 7919778 (71) Farmitalia Carlo Erba S.p.A., Via C. Imbonati, 2k, 20159 Milano, I tai ia-I taiien(IT) (72) Carlo Battistini, Novate Mi lanese (Ml) , Giuseppe Cassinelli, Voghera (PV) , Giovanni Franceschi, Milano, Rosanna Mazzoleni, Milano, Federico Arcamone, Nerviano (Ml), Italia-ltalien(lT) (7^) Oy Heinänen An (51») Menetelmä paromomys i in ider i vaatt Ien valmistamiseksi - Förfarande för fram-ställning av paromomycinderivat Tämän keksinnön kohteena on analogiamenetelmä yleisen kaavan (I) mukaisten, antibakteerisen ja terapeuttisen vaikutuksen omaa-vien paromomysiinijohdannaisten sekä niiden farmaseuttisesti hyväksyttävien additiosuolojen valmistamiseksi, jossa kaavassa R on vety- tai klooriatomi.

R1

.! ^OH

• · h H0 raH NH, Γ0Ηη OH 2 (I)

ho "Vt"·'r L-'°nI

HO U "Τ-Λ N--S

I NH- ( X OH

-NH/ V

69082

Keksinnön mukaisen menetelmän oleelliset tunnusmerkit käyvät selville patenttivaatimuksesta.

Tämän keksinnön mukaista prosessia havainnollistetaan sen eräinä suoritusmuotoina seuraavissa reaktiokaavioissa, jossa A on a syy 1i-tai bentsoyyliryhmä, Ph an fenyyliryhmä ja Bn on bentsyyliryhmä:

Ph '' 0--1

(1) \ Q

FA NHCOOBn

μπ BnOGCNH : I

n _ HU U---r------/ ""Vv. /___L - NHCOOBn

HO \ < 0 C^2 o P" !' I

i Ά F /

Bn00CHNCH2 j ;--O

BnOOCNH J QH

\ Ph —χ O-asylaatio tai\ ' ''O----- O-bentsoylaatio \ v ^ | \ ΑθΑ\__Α °\ [Z) * 1 A NHCOOBn Δη A0,Bn00CNH 11 _7- TV» / 0X>--Z-MHCOOBn

A0~v'Fx\V°^ QA

Bn00CHNCH2 \ X

BnOOCNH -J OA

/ / H0 cHoOH / hydrolyysi O) ao~^\__ 0

BnOpciiA NHCOOBn AQ n ' pH "7 NHCOOBn \ 1—0 Φ2 0^£--| A0 —\ ^0. 1

Bn00CHNCH2 | [

BnOOCNH XF ÖA ^ CHjOOCPh selektiivinen 'k A^-\__ ^ bentsoylaatio Βη00αΧ NHCi00Bn AQ b —.---') A0 F NHCOOBn \ F--0 CP2 0~.../-| A0 —Λ—1 \ I ^0-._ f 1 i"A k ) ^Α

Bn00CHNCH2 i \ X------ / (4)

BnOOCNH 0 J °A

li 69082

Cl (5) m2oocPh SO,Cl., \ o

Emäs ^ ΑΟ-Λ-- \ ' p"A NHCOOBn

\ BnOOCNH I I

VCS2 AO 0 \Vahva emäs A0 r* n ^—NHCOOBn v1 A0 '-! Λ j™ \ Bn00CHNCH2 | I---(

\ BnOOCNH ° J DA

PhS.CS.Cl \

Emäs \ \ CH^SSCO CH2OOOPh Υ^Ε-λ V rAl NHCOOBn

BnOOCNH | r AO ^---Uy

„ pj / ^__L— NHCOOBn Bu.SnH

ao_Yt:0\ ? ,,

BnOOCHNCHo | | I

* 0 OA

BnOOCNH O

PhSSCO CHoOOCPh Bu,SnH

BnOOCNH J NHCOOBn AO AOi 'π—-Γ-- - n CH-i / ______/_—NHCOOBn “XC iIa p'J^\ ^itA k s ολ

BnDOCHNCH., η N-ζ

BnOOCNH O^J OA

(10)

Bu~SnH

V

CHoOOCPh

BnOOCNH^ NHCOOBn AO A01 —7--^7 V>__ o ml ojCl-L- n™08" A0 —t- \ YD Ά oa

Bn00CHNCH2 ] X.--/

BnOOCNH O^J °A

(6) Λ 69082 rs NHCOOBn (6) Vahva emäs ^ HQ HO Bn00CNH |n_ f ^ «sv-H 0

Bn00CHNCH2 ^ 0H

BnOOCNH 0^ (i /Katalyyttinen hydraus (7) \.aj \ HO hT^\ J%

H0 OH

e7nch0 ' f \------,· 22 1

H2N Q___/ OH

Cl

Uk ^ _Vahv.s emäs --«^ \ > HOBnOOCNH A j^HCOOBn H0' " , __ 0 cL ο X--1--L- NHC0DBn

Bn00CHNCH2' pA \ ^ ^P °H

BnOOCNH A QH

/ Katalyyttinen hydraus C1 / 1 ch7oh /

vS

HO -L

T nh7 HO M2N :0_„ ______1^7 ηΗ0°Λ-- ° CA JO 0^-"^ NH2 H2NCH2 " I \___/

(12) H2N “H

5 69082 Lähtöaineena käytettävää 4', 6'-O-bentsyylideeni-penta-N-bentsyyli -oksikarbonyyliparomomysiiniä (1), voidaan valmistaa paromomysiinistä käyttämällä lähtöaineena luonnosta saatavaa aminoglysoksiidi-antibioottia ( Yhdysvaltain patenttijulkaisu no. 2 916 485 ja 3 065 147), jolloin käytetään sellaisia menetelmiä, jotka ovat selostetut julkaisuissa S. Hannessian et ai. in Tetrahedron Letters 4009 (1974) ja Canad. 3.Chem., 56, 1482 (1978).

0-Asyloinni1la tai bensoylatiolla saadaan heksa-0-asyyli- tai heksa-0-bentsoyyli johdannaisia (2), joista suorittamalla hydro-lyysi O-bentsylideeniryhmään, saadaan yhdistettä (3), jossa on kaksi vapaata hydroksiryhmää kohdassa 0-4' ja kohdassa C-6'. Suorittamalla selektiivinen bentsoylaatio 6"-asemaan saadaan 6"-0-bentsoyylijohdannaista (4), joka on ns. väliavain, jossa on yksinäinen vapaa hydroksiryhmä 4^-asemassa.

Kolme vaihtoehtoista mahdollisuutta on käytettävissä yhdisteen (4) muuttamiseksi yhdisteeksi (6). Ensimmäinen on yhdisteen (4) klooraaminen sulfuryylikloridi11a emäksen läsnäollessa, sopivimmin pyri-diinin, jolloin saadaan 4'-epi-kloori-4'-deoksi-johdannaista (5), minkä jälkeen suoritetaan deklooraus käsittelemällä saatua tuotetta tributyItiinihydridillä, sopivimmin tolueenissa ja atsobisiso-butyronitrii1in läsnäollessa. Toinen mahdollisuus on se, että käytetään S-mei.yy 1 i-dithiokarbonaattia (9), joka on valmistettu saattamalla yhdiste (4) reagoimaan hiilidisulfidin, vahvan emäksen ja. metyylijodidin kanssa käyttämällä sellaista menetelmää, joka on selostettu julkaisussa T. Hayashi et ai., Chem. Pharm. Bull., 26, 1986 (1978). Vahva emäs on sopivimmin natriumhydroksidi.

S-metyyli-dithiokarbonaatti voidaan tämän jälkeen pelkistää käyttämällä dibutyylitinahydridiä, jolloin saadaan kaavan (6) mukaista yhdistettä. Kolmas tapa on se, että käytetään S-fenyylidithiokar-bonaattia (10). Tämä aine voidaan valmistaa yhdisteessä (4) käsittelemällä sitä fenyylitio-tiokarbcnyyli-kloridi 11a, CgH^S. CS.C1, emäksen, sopivimmin pyridiinin läsnäollessa, minkä jälkeen suoritetaan käsittely käyttämällä menetelmää, joka on selostettu julkaisussa T. Hayashi et ai., Chem. Pharm. Bull., 2E5, 1 786 (1978).

S-fenyyli-dithiokarbonaatti (10) voidaan pelkistää käyttämällä tributyylitinahydraattia samalla tavoin kuin S-metyylidithiokarbo-naattia (9), jolloin saadaan yhdistettä (6).

Yhdisteen (6) de-O-asylointi tai de-O-bentso-oksylointi antaa 6 69082 tuoteeksi 4'-deoksi-penta-N-bentsyylioksikarbonyyli-paromamysiiniä (7), joka voidaan pelkistää käyttämällä katalyyttistä hydrausta siten, että katalyyttinä on 10 % palladiumia aktiivihiilen pinnalla, jolloin saadaan 4'-deoksiparomomysiiniä (Θ). Tämä voidaan puhdistaa käyttämällä pylväsionin vaihtoa.

Suorittama1 la samankaltainen de-O-asylointi tai de-O-bentsoylaatio käyttämällä yhdistettä (5) yhdisteen (6) asemesta ja suorittamalla tällöin tulokseksi saadun yhdisteen (11) samankaltainen pelkistys, saadaan 4‘'-deoksi-4'-epiklooriparomomysiiniä (12). Kaavojen (5), (6), (7), (9), (10), (11) mukaiset yhdisteet ovat uusia yhdisteitä ja ne kuuluvat esillä olevan keksinnön suojapiiriin.

4'-deoksiparomomysiini (Θ) ja 4'-deoksi-4'-epi-klooriparomomysiini (12) ovat käyttökelpoisia bakteerinvastaisia aineita sekä aktiivisia gram-positiivisia ja gram-negatiivisia bakteereita vastaan sekä myöskin alkueläimiä protozoa vastaan. Kaikkein suorin tapa parantaa luonnosta saatavien aminoglykoosiantibioottien bakteerinvastaista ns. spektriä voidaan aikaansaada siten, että entsymaattiset inakti-vaatiokohdat poistetaan tai suojataan ns. eteerisiin sivukohtiin eli suojakohtiin. On tunnettua, että hydraksiryhmä 3'-asemassa aminoglykosidiantibioteissa on taipuvainen entsymaattiseen inakti-vaatioon eli epäaktivoitumiseen niiden fosfotransferaasientsyymien johdosta, joita syntyy resistenttien bakteerikantojen vaikutuksesta ja myös sen johdosta, että tämän hydroksiryhmän poissaolo johtaa suurempaan aktiivisuuteen (Kirk-Othmer: "Encyclopedia of Chemical Technology", Voi. 2, 3. painos, 197Θ, kustantaja John Wiley &

Sons, Inc.). Koska lähellä oleva C-4', johon liittyy hydraksiryhmä, voi olla tehokkaasti vaikuttamassa epäaktiivisten entsyymien sitoutumiseen, kaikki muunnelmat kuten klooriatomin liittäminen tai hydroksiryhmän poistaminen voi aiheuttaa heikomman sitoutumisen ja harhaanjohtavan tunnistamisen.

69082

BIOLOGINEN_AKTIIVISUUS

4'-deoksi-paromomysiinillä (8) ja 4'-deoksi-4'-epi-klooriparomo-mysiinillä (12) on bakteerinvastaista aktiivisuutta "in vitro".

Nämä "in vitro” kokeet on suoritetttu käyttämällä sellaista menetelmää, jossa suoritetaan peräkkäisiä laimennuksia nestemäisessä väliaineessa (Nutrient Broth Difco) ja pienin inhibiittiopitoi-suus (MIC) määritettiin 24 tunnin inkubaatioajan kuluttua lämpötilassa 37°C. Kuten taulukossa 1 on esitetty, 4'-deoksi-paromo-mysiinillä (8) on samanlainen vaikutus kuin paromomysiinillä sensitiivisiä kantoja vastaan ja lisääntynyt aktiivisuus gram-nega-tiivisten bakteerien tiettyjä resistenttejä kantoja vastaan.

™ULUKKO_JU _ YHDISTEIDEN (8) JA (12) PIENIMMÄT INHIBOIBAT PITOI-SUUDET_XMcg/ml )._VERRATTUNA_PAROMOMYSIINIIN

Kanta Inaktivoiva Paromysiini (8) (12) entsyymi*

Staphylococcus 1,55 1,55 6,25

aureus 209 P

Escherichia 12,5 12,5 50 coli K 12

Escherichia ΑΡΗ (3’) I >200 >200 <200 coli K 12-R 112

Escherichia ΑΡΗ (3') II >200 50 200 coli K 12-R 148

Escherichia AAC (3) I 6,25 6,25 50 coli K 12-R 55

* APH (3') I : aminoglykosidi 3'-fosfotransferääsi I APH (3') II: aminoglykosidi 3'-fosfotransferaasi II AAC (3) I : aminoglykosidi 3-asetyylitransferaasi I

Taukossa 2 on esitetty 4'-deoksi-paromomysiinin (8) aktiivisuus proteiinisynteesin inhiboinnissa verrattuna paromomysiiniin ja paromomysiinin luonnolliseen 31-deoksianalogiin, joka tunnetaan nimellä lividomysiini A (vrt. Kirk-Othmer, Encyclopedia of Chemi- 8 69082 cal Technology, III Edition, Voi. 2, s. 839, yhdiste 21). Viimeksimainittu on ennestään tunnetuista yhdisteistä lähinnä keksinnön mukaisesti valmistettuja yhdisteitä.

TAULUKKO_2^_PROTEIINISYNTEESIÄ_INHIBOIVAT_KONSENTRAATIOT_^jiM2 ~ „ Yhdisteet 8 Lividomysiini A Paromomysiini „ .. " " -_ (sulfaati)

Ribosomit - „ 70 S ICoc 24 29 30 2 5 IC5Q 58 90 80 80 S IC._ 105 >400 72

c. D

ICcrt >400 7400 >400 50

Taulukossa 2 tarkoittavat IC0_ ja IC_„ (μΜ) konsentraatioita,

c. D DU

jotka inhiboivat 25 % ja 50 % polyfenyylialaniinin synteesistä escherchia coli (705) ja saccaromyles cereviasiae (80 S) -kantojen tuottamien ribosomien 1änsäo11essa. Molekyylin pidentäjät ja fenyy1ia1 ani ini t-RNA valmistettiin samoista mikro-organismeista.

Taulukossa 3 on esitetty taulukkoa 1 vastaavasti 4'-deoksi-paro-momysiinin (8) ja 4'-deoksi-4'-epi-klooriparomomysiinin (12) pienimmät inhiboivat pitoisuudet kantaa staphilococcus epidermidis FK 109 vastaan verrattuna vastaaviin paromomysiinin pitoisuuksiin. Pitoisuudet määritettiin "in vitro" käyttäen pitoisuuden puolittavia laimennuksia antibioottisella väliaineella No. 3 5 (Difco). Inokulaatio oli n. 10 solua/ml ja kantaa inkuboitiin 37°C:ssa 24 tunnin ajan.

TAULUKK0_3^_PIENIMMAT_INHIB0IVAT_K0NSENTRAATI0T_(_1xg/ml |

Kanta Inaktivoiva Paromomysiini (8) (12) entsyymi

Staphilococcus AAD (4') 50 3,12 12,5

epidermidis FK

109 _______ ______ I — — _l_—— Näitä uusia yhdisteitä voidaan käyttää antibioottisina aineina käsittelemään samoja sairauksia samalla tavoin kuin esitetyn paromo-myysiinin käytön avulla, jolloin annostukset ovat samankaltaisia kuin paromomysiinin.

9 69082

Tavanomaisesti käytettäviä liuottimia, laimennusaineita ja runko-aineita voidaan käyttää valmistettaessa sopivia annoksia. Paromo-myysiinijohdannaiset ovat käyttökelpoisia käsiteltäessä sairauksia ameebinen disentery shigellosis ja salmönelloosis.

Täten tämän keksinnön mukaiset yhdisteet ovat käyttökelpoisia bakteerinvastaisina aineina (varsinkin intestinaalisten bakteerien vaikutusten estämiseksi), ravinnon lisäaineina eläimen rehuissa, terapeuttisina aineina siipikarjalle ja eläimille sekä myöskin ihmisille, minkä lisäksi ne ovat erityisen arvokkaita käsiteltäessä sellaisia infektiosairauksia, jotka ovat aiheutuneet gram- i positiivisista ja gram-negatii,visista bakteerikannoista. Niitä voidaan käyttää käsiteltäessä systeemisiä bakteerien aiheuttamia infektiotauteja annostettuina ihonalaisesti eli parenteraalisesti, jolloin annostus on noin 250 mg - noin 3000 mg päivässä jaettuna annoksiin 3 tai 4 kertaa päivässä. Yleensä nämä yhdisteet ovat tehokkaita, jolloin niiden annostus on rajoissa noin 5,0-7,5 mg/kg kehon painosta aina 12 tunnin aikana.

Näiden yhdisteiden lisäaineina voidaan käyttää niiden farmaseuttisesti hyväksyttäviä suoloja, jotka voidaan valmistaa tavalliseen tapaan. Esimerkiksi mono-, di-, tri-, tetra- tai pentasuoloja (valinnan mukaan) voidaan muodostaa siten, että yksi mooli keksinnön mukaisia yhdisteitä yhdistetään 1-5 mooliin farmaseuttisesti hyväksyttäviin happoihin, joita ovat esimerkiksi sitruunahappo, askorbiinihappo, etikkahappo, kloorivetyhappo, rikkihappo, maleiini-happo, typpihappo, fosforihappo, bromivetyhappo ja muut hapot, joita yleensä käytetään valmistettaessa perusfarmaseuttisten eineiden suolojen aikaansaamiseksi.

Seuraavissa esimerkeissä, joissa kaikki lämpötilat ovat celsiusasteita, havainnollistetaan keksintöä.

ESIMERKKI 1

Heksa-O-asetyyli-4^ , 6*-0-bentsylideeni-pentä-IM-bentsoyylioksi-karbonyyliparomomysiini (2; Aaa8Btyyli) 11,1 g 4",6'-0-bentsylideeni-penta-N-bentsyylioksikarbonyyli-paromomysiiniä (1) (valmistettu menetelmällä Can.J. Chem, 56, 1482 (1978)), liuotettiin 112 ml:aan pyridiiniä ja 56 mli'ä!ähv * ________ .. ΤΓ" __ 10 69082 etikkahappoa lisättiin seokseen. Kolmen päivän kuluttua huoneen lämpötilassa liuos lisättiin hitaasti ja sekoittaen jääveteen.

Kun sekoitusta oli jatkettu 1 tunnin ajan, valkoinen kiinteä tuote poistettiin suodattamalla, pestiin useita kertoja vedellä ja liuotettiin metanoliin. Liuottimen haihdutuksen jälkeen saatiin - 12,7 g otsikossa mainittua yhdistettä.

Sulamispiste 124-127°C

* 21,0 (c o, 500 CHC13) NMR spektri (60 .MHz, CDC13) esittää korrektin aromäattis/asetyyli-protonisuhteen (1,66).

ESIMERKKI 2 ✓ 6,3^,2^,5^,3^^,4^ * -heksa-0-ase tyyli-pen ta-N-bent syy Iloksi-karbonyyliparomomysiini (3; A=asetyyli)

Liuos, jossa oli 12,3 g edellä olevan esimerkin mukaista yhdistettä, 500 mltssa etikkahappoa ja 125 mljssa vettä, annettiin seistä 90 tuntia huoneen lämpötilassa. Tämän jälkeen liuotin haihdutettiin pois ja jäännös liuotettiin metanoliin ja haihdutettiin kuiviin useita kertoja, jolloin saatiin 11,6 g otsikossa mainittua yhdistettä amorfisena kiinteänä aineena.

Sulamispiste 116-119°C

L ί5 * 19,9 (c 0,537 CHC13) NMR spektri (60 MHz, CDClg) esittää korrektin aromaattis/asetyyli-protonisuhteen (1,38).

ESIMERKKI 3 6,3^,2^,5^,3^^,4^ " -heksa-O-asetyy li-6^ -O-bentsdyyli-perita-N-bentsyylioksikarbonyyliparomomysiini (4; A=asetyyli) 10*1 g yhdistettä, joka oli valmistettu esimerkin 2 mukaan, liuotettiin 100 ml:aan kuivaa pyridiiniä ja .liuos jäähdytettiin lämpötilaan 0°. Tämän jälkeen lisättiin seokseen liuos, jossa oli 0.84 ml bentsoyylikloridia 2 mlsssa pyridiiniä hitaasti ja sekoittaen. Reaktioseosta pidettiin lämpötilassa 0°C ja sitä monijbeftiitiin 11 69082 käyttämällä vaihetta TLC. 43 tunnin jälkeen 0,42 ml bentsoyyli-kloridia 1 ml:ssa pyridiiniä lisättiin seokseen. 67 tunnin jälkeen lisättiin vielä reagenssia (0,2 ml bentsoyylikloridia 0,5 ml:ssa pyridiiniä) ja 96 tunnin kuluttua lisättiin vettä, minkä jälkeen seosta uutettiin kloroformilla. Uutokset tehtiin vedellä, 2 M kloorivetyhapolla, vedellä, natriumbikarbonaatin vesiliuoksella ja vedellä tässä järjestyksessä. Kuivauksen ja haihdutuksen jälkeen saatiin 10,9 g tuotosta jäännöksenä. Raaka tuote kromatografoitiin käyttämällä silica geeliä (0-2 % metanolia kloroformissa), jolloin saatiin 5,8 g otsikossa mainittua yhdistettä puhtaassa muodossa.

Sulamispiste 1.10-115°C

Ccal7g5 ♦ 26,3 (c 1,096 CHC13)

Analyysit yhdisteelle ^02^91^5^3^

Laskettu: C 59,95 H 5,58 N 4,26

Saatu: 59,87 5,77 4,19 NMR spektri (60 MHz, CDCl^) esittää korrektin aromaattis/asetyyli-protonisuhteen (1,671 ESIMERKKI 4 6,3*,2--,5^-,3"--,4*- <,-heksa-0-asetyyli-6<,-Q-bentsoyyli-4^-epi-kloori-4--deoksi-penta-N-bentsyylioksikarbonyyliparomomysiini (5; A=asetyyli) 1 g esimerkin 3 mukaista yhdistettä liuotettiin 15 mlraan kuivaa pyridiiniä ja 1,3 ml sulfuryylikloridia lisättiin pisaroittain jäähdytettyyn (0°) liuokseen. Kun seosta oli sekoitettu 3 tuntia lämpötilassa 0°C ja 18 tuntia huoneen lämpötilassa, suurin osa liuottimesta poistettiin tyhjössä ja sekä kloroformia että vettä lisättiin seokseen. Kun oli suoritettu ekstraktio käyttämällä kloroformia, ekstraktiotuotteet pestiin vedellä, kuivattiin ja haihdutettiin tyhjössä. Ns. raadat tuotteet puhdistettiin suorittamalla preparatiivinen TLC käsittely ja jälleen kiteyttäminen kloro-formi-eetteri-heksaani-seoksesta, minkä jälkeen saatiin 515 mg otsikossa mainittua yhdistettä puhtaassa tilassa. Yhdisteessä oli klooria ja sen Rf oli 0,37 liuottimessa, jossa oli tolueenia ja etyyliasetaattia (1/1 tilavuusprosenttia) (lähtöaine 4: Rf 0,23).

ijt'V

12

TT

Sulamispiste 105-115° ^ Λ ^ Λ Λ r -25 69082 + 30,3 (c 1,012 CHC13)

Analyysit yhdisteelle C^^ggClNgO^:

Laskettu: C 59,29 H 5,46 Cl 2,13 N 4,21

Saatu: 58,36 5,41 2,36 4,14 ESIMERKKI 5 6,3', 2", 5", 3'" ,4"'-heksa-0-asetyyli-6'-0-bentsoyyli-4'-deoksi-penta-N-bentsyylioksikarbonyyliparomomysiini (6; Asasetyyli)_

Liuosta, jossa oli 400 mg yhdistettä, joka oli valmistettu esimerkin 4 mukaisesti 16 ml:ssa tolueenia, kuumennettiin pysty-jäähdyttimen alla typpiatmosfäärissä, ja 0,8 ml tributyylitiini-hydridiä 0,8 ml:ssa tolueenia sekä 20 mg:ssa atsobisisobutyro-nitriiliä lisättiin seokseen.. Kun seosta oli kuumennettu 3 tuntia pystyjäähdyttimen alla, liuos haihdutettiin pois ja kiinteää jäännöstä pestiin n-heksaani11a, minkä jälkeen se liuotettiin kloroformiin ja seokseen lisättiin dietyylieetteriä ja n-heksaania, jolloin saatiin seostetuksi 385 mg otsikossa mainittua yhdistettä muodossa, joka oli riittävän puhdasta seuraavia reaktioita varten. Liuotin-järjestelmässä tolueeni: etyyliasetaatti (1:1 tilavuusprosentteja), yhdisteen Rf oli 0,31.

Sulamispiste 125-130° + 33,0 (c 1.116 CHCI3)

Analyysi yhdisteelle ^32^91^5^301

Laskettu: C 60,54 H 5,63 N 4,30

Saatu: 59,90 5,59 4,30 ESIMERKKI 6 4^-deoksi-penta-N-bentsyylioksikarbonyyliparomomysiini (7) 385 mg esimerkin 5 mukaista yhdistettä ilman enempää puhdistusta liuotettiin 14 ml:aan 0,05 N-metanolista natriummetoksidia ja sekoitettiin huoneen lämpötilassa 3 tuntia. Kiinteää hiilidioksidia 69082 ja vettä lisättiin seokseen ja liuos haihdutettiin kuiviin.

Tämän jälkeen lisättiin vettä saatuun tuotteeseen ja seosta uutettiin useita kertoja etyyliasetaatilla. Yhdistettyjä orgaanisia uutoksia pestiin vedellä ja .haihddtettiin kuiviin, jolloin saatiin 205 mg raakaa tuotetta. Suoritettaessa puhdistus käyttämällä preparatiivista menetelmää TLC, Jolloin käytettiin kloroformi: etyyli-asetaattirmetanoli suhteessa 40:25:9 tilavuusprosentteina eluantteina, saatiin 130 mg otsikossa mainittua yhdistettä puhtaassa muodossa, jonka Rf oli 0,22 samassa liuotinjärjestelmässä.

Sulamispiste 125-130°C

Ccxjj*5 + 41>Q (c 0,900 CHCI3)

Analyysit yhdistee lie C53H75N5°23s

Laskettu: C 59,56 H 5,95 N 5,51

Saatu: 50,74 5,70 5,36 ESIMERKKI 7 4'-deoksi-paromomysiini (8)

Liuokseen, jossa oli 130 mg esimerkin 6 mukaan valmistettua yhdistettä 16 ml:ssa 00 % etanolia lisättiin 1 ml syklohekseeniä 200 mg sellaista katalyyttiä,.jossa oli 10 % palladiumia hiilen pinnalla. Seosta keitettiin pystyjäähdyttimen alla 1,5 tuntia, suodatettiin ja haihdutettiin tyhjössä, jolloin saatiin 50 mg lopullista tuotetta. Tämä raaka tuote puhdistettiin colonnissa, jossa oli CG 50 (NH^+ muodossa, 100-200 mesh), jolloin saatiin 21 mg otsikossa mainittua tuotetta puhtaassa muodossa, sulamispiste 175-180°C, jolloin tuote hajosi. Tuote oli homogeeninen TCL tutkimuksessa, jolloin 20 %:isessa ammoniakkiliuoksessa oli butanolia: etanolia: vettä suhteissa 5:8:10:7 tilavuusprosentteina, ja jolloin sen Rf (kahteen kertaan kehitettynä) oli 0,33, hieman suurempi kuin Rf lividomysiinin B O'-deoksi-paramomysiininj: 0,30. Massaspektri (kenttädesorptia) osoitti ns. peak'in kohdalla m/e 600 (MH+), ja fragmentit kohdilla 440 ja 455 osoittivat deoksi-genaatiokohdan renkaassa A.

Tuote (vapaana) muutettiin sulfaattimuotoon lisäämällä seitien 0,2 M rikkihappoa pH 6,4.

14 69082

Sulamispiste (hajoaa) 230°C (sulfaattimuodossa) C^Jq5 + 58 (c 1,115 H2O) (sulfaattimuodossa) 5

Analyysi (sulfaattimuodossa) yhdisteelle ^23^45^5^13*2 ^2^^45

Laskettu : C 32,70 H 5,96 N 8,29

Saatu: 33,51 6,47 7,83 13C NMR (D20)(vapaana): 100,2 (C Ί'), 57,2 (C 2'), 68.8 (C 3"), 34,7 (C 4"), 67.9 (C S'), 64,0 (C 6') ESIMERKKI 8 6,3*, 2", 5" ,3' " ,4" '-heksa-0-asetyyll-6*-0-bentsovvli-4'-0-- Qmetyylitio) tiokarbonyyli3 -psnta-N-bentsyylioksikarbonyyli-paromomysiini, (9; Acasetyyli) 5 N natriumhydroksidia (0,28 ml) lisättiin pisaroittain jäällä jäähdytettyyn liuokseen, jossa oli 400 mg yhdistettä, joka oli valmistettu esimerkin 3 mukaisesti, ja 0,4 ml hiilidisulfidia 3 mlsssa dimetyylisulfoksidia. Tätä seosta sekoitettiin 20 minuuttia lämpötilassa 0°C. Tämän jälkeen lisättiin seokseen 0,6 ml metyylijodidia, jolloin seosta sekoitettiin jäähdyttämällä se huoneen lämpötilaan 30 minuuttia. Haihtuvien ragenssien ylimäärä poistettiin alennetussa paineessa ja lisäämällä suolavettä ekstra-hoitiin liuosta etyyliasetaatilla. Uutoksia tehtiin suolavedellä ja tämän jälkeen vedellä, jonka jälkeen suoritettiin kuivaus ja haihdutus, jolloin saatiin seos, jossa oli kolme yhdistettä, joiden Rf olivat vastaavasti 0,35, 0,42 ja 0,53 sellaisessa liuotin-seoksessa, jossa oli tolueenia ja etyyliasetaattia tilavuussuhteessa 1:1. Pääkomponentti, jolla oli pienin Rf-arvo eristettiin preparatiivisella TLC analyysillä, jolloin saatiin 125 mg etsikossa mainittua yhdistettä puhtaassa muodossa.

ESIMERKKI 9 6,3~,2~,5~,3~>,4*~-hBk3a-0-asstyyli-6,,-0-bentsovvli-4'-deoksi-penta-N-bentsyylioksikarbonyyliparomomysiini (6; A~asetyyli) o »\ -1

Pystyjäahdyttimen alla kuumennettuun liuokseen, jossa oli !'1'25 mg 69082 esimerkissä Θ selostetulla tavalla valmistettua yhdistettä Θ ml:ssa kuivaa tolueenia typpiatmosfäärissä, lisättiin 0,4 ml tributyyli-tinahydridiä 0,8 mlsssa tolueenia ja 10 mg:ssa atsobisisobutyro-nitriiliä. Kun seosta oli keitetty pystyjäähdyttimen alla 2,5 tuntia, reaktioreosta käsiteltiin esimerkissä 5 selostetulla tavalla, minkä jälkeen saatiin 70 mg tuotetta, jota ei voitu erottaa , esimerkin 5 mukaisesta tuotteesta.

ESIMERKKI 10 6,3^, 2", 5", 3" ', 4* ** -heksa-D-asetyy li-6^ -Q-bentsoyy 11-4^ - 0-C tfenyylitio? tiokarbonyyli77 -penta-N-bentsyylioksikarbonyyli-paromomysiini, (10; A=asetyyli)

Liuos, jossa oli esimerkin 3 mukaan valmistettua yhdistettä (1 g) 20 mlsssa kuivaa pyridiiniä, jäähdytettiin lämpötilaan 0°C, minkä jälkeen 4 g (fenyylitio) tiokarbonyylikloridia ja 100 mg 4-dimetyyliaminopyridiiniä lisättiin seokseen. Tätä seosta sekoitettiin huoneen lämpötilassa 5 päivää. Vettä tai jäävettä lisättiin ja seosta uutettiin kloroformilla. Uutokset tehtiin vedellä, 2 N kloorivetyhapolla, vedellä, natriumbikarbonaatti-liuoksella ja vedellä tässä järjestyksessä, minkä jälkeen suoritettiin kuivaus ja haihdutus kuiviin. Jäännös kromatografoitiin silica geelillä (tolueeni:etyyliasetaatti, 1:1 tilavuusprosenttia) minkä jälkeen suoritetulla puhdistuksella saatiin preparatiivise1la TLC analyysilla ja jälleenkiteytyksellä seoksesta kloroformi: eetteri:heksaani 600 mg otsikossa mainittua yhdistettä, joka oli kromatograafisesti tutkittuna homogeenista ja jonka Rf oli 0,34 liuotinseoksesta tolueeni:etyyliasetaatti (1:1 tilavuusprosenttia).

ESIMERKKI 11 6,3^,2-*,5**,3 ,4''heksa-0-asetyyli-6^-0-bentsoyyli-4^-deoksi- penta-N-bentsoyylioksikarbonyyliparomomysiini (6; Asasetyyli)

Pystyjäähdytyksen alla olevaan liuokseen valmistettiin esimerkin 10 mukaista yhdistettä (320 mg) 13 mlsssa kuivaa tolueenia käyttämällä suojakaasuna typpiatmosfääriä, jolloin lisättiin seokseen 2 ml tributyylitinahydridiä, joka oli laimennettu 4 ml:11a tolueenia ja 30 mg:11a atsobisisobutyronitriiliä. Kun keittämistä pys-tyjäähdyttimen alla oli suoritettu 2 tuntia, lopetettiin prosessi ___ TT” 16 69082 esimerkin 5 mukaisella tavalla, jolloin saatiin 50 mg otsikossa mainittua tuotetta.

ESIMERKKI 12 4'-deoksi-^-epi-kloori-penta-N-bentsyylioksi karbonyyliparomo-mysiini (11) 215 mg esimerkin 4 mukaan valmistettua yhdistettä liuotettiin 9 mitään 0,05 N metanolista natriummetoksidia, sekoitettiin 3 tuntia huoneen lämpötilassa. Esimerkin 6 mukaista käsittely-tapaa noudatettiin, jolloin p.reparatiivinen TLC antoi 125 mg otsikossa mainittua yhdistettä puhtaassa muodossa, jonka Rf oli 0,33 eluanttisysteemissa, jossa oli kloroformi:etyyliasetaatti: metanoli (40:25:9 tilavuusprosenttia).

ESIMERKKI 13 .

4*-deoksi-4*-epi-kloori-paromomysiinl (12) 125 mg esimerkin 12 mukaista yhdistettä liuotettiin 16 ml:aan metanolia, 5 ml:aan dioksania ja 2,8 ml:aan vettä ja 1,4 ml:aan etikkahappoa. 205 mg 10 %:ista palladiumia hiilen pinnalla lisättiin ja seosta hydrattiin huoneen lämpötilassa ja paineessa 5 tuntia. 2 tunnin jälkeen lisättiin (100 mg) vielä katalysaattoria. Reaktioseos suodatettiin ja kuivattiin jäähdyttämällä, jolloin 4.

saatu tuote puhdistettiin kolonnissa CG 50 (IMH^ muodossa, 100-200 mesh), minkä jälkeen eaatiin 52 mg otsikossa mainittua tuotetta puhtaassa muodossa, sulamispiste 160-165°C, jolloin tämä tuote hajosi. Tuote oli homogeenista TLC analyysissä liuotinjärjestelmässä, jossa oli 28 % ammoniakkia:butanolia:etanolia:vettä 5:8:10:7 (tilavuusprosentteina) ja tuotteen Rf (kaksoisanalyysi) oli 0,36. Massaspektri (kenttädesorptio) näytti että peak oli kohdalla m/e 634 (MH+) ja peak oli myös kohdalla m/e 598 (MH+-HC1).

* Pesty etyyliasetaatilla, väkevöidyllä.

'·- f*,

Claims (1)

17 69082 PATENTTIVAATIMUS Analogiamenetelmä yleisen kaavan (I) mukaisen· antibakteerisen ja terapeuttisen vaikutuksen omaavan yhdisteen valmistamiseksi R1 r OH "VtA H0 nh2 r OH t15 "° jossa on vety- tai klooriatomi, tunnettu siitä, että menetelmässä 4',6'-O-bentsylideeni-penta-N-bentsyylioksikarbonyy-li-paromomysiinin 6,3',2'1,5'',3''' ja 4 1 ' ' hydroksiryhmät muutetaan 0-asyyli tai O-bentsoyyliryhmiksi asyloimalla tai bentsoy-loimalla käyttäen vastaavaa anhydridiä pyridiinin läsnäollessa, saatu heksa-O-asyy1i tai bentsoyyli-4',6'-O-bentsylideeni-penta-N-bentsyylikarbonyyliparomomysiini hydrolysoidaan huoneen lämpötilassa etikkahapon läsnäollessa, saadun 6,3',2'',5'’,3''',4'''-heksa-O-asyyli tai bentsoyyli-penta-N-bentsyylioksikarbonyyliparo- momysiinin 6'-hydroksiryhmä muutetaan 6'-O-bentsoyyliryhmäksi \ käyttäen bentsoyylikloridia kuivassa pyridiinissä lämpötilassa 0°C ja (a) saatu yhdiste kloorataan sulfuryylikloridilla kuivassa pyridiinissä siten, että saadaan 4'-deoksi-4'-epi-kloori-johdannainen, joka pelkistetään tributyylitinahydridillä typpiat-mosfäärissä tolueenissa palautusjäähdytyslämpötilassa ja azabisisobutyronitriilin läsnäollessa 4 '-deoksi-johdannaiseksi, joka hydrolysoitaessa natriumalkoholaatilla ja suoritettaessa katalyyttinen hydraus palautusjäähdytystä käyttäen 80 % etanolissa syklohekseenin ja 10 % palladiumhiilen läsnäollessa antaa tuotteeksi 4'-deoksi-paromomysiiniä; tai 18 69082 (b) saatu yhdiste muutetaan vastaavaksi S-metyyli-ditiokarbonaa- tiksi käsittelemällä sitä hii1idisulfidi1la, vahvalla emäksellä ja metyylijodidilla, ja saatu 6,3', 2'', 5'', 3''', 4 ' ' '-heksa-O-asyy1i tai bentsoyy1i-6'-O-bentsoyyli-4'-0Qmetyyli tio)-tiokarbo ny ylij|-penta-N-bentsyy li oksi karbonyylipa-romomysiini pelkistetään tributyy1itinahydridi 11ä typpiat-mosfäärissä tolueenissa palautusjäähdytyslämpötilassa ja azabis-isobutyronitrii1 in läsnäollessa 4'-deoksi-johdannat-seksi, joka hydrolysoitaessa natriumalkoholaatilla ja suoritettaessa katalyyttinen hydraus palautusjäähdytystä käyttäen 80 % etanolissa syklohekseenin ja 10 % palladiumhiilen läsnäollessa antaa tuotteeksi 4'-deoksi-paromomysiiniä; tai (c) saatu yhdiste muutetaan vastaavaksi S-fenyyliditiokarbonaa- tiksi käsittelemällä sitä (fenyy1itio)-tiokarbonyy1iklori-dilla emäksen läsnäollessa, ja saatu 6,3', 2'', 5'', 3''*, 4 ' ' '-heksa-O-asyyli tai bentsoyy1i-6'-0-bentsoyy1i-4'-0Qfe-nyyli t io)-1iokarbonyy1i}-penta-N-bentsyy1ioksikarbonyylipa-ramomysiini pelkistetään tributyylitinahydridillä typpiat-mosfäärissä tolueenissa palautusjäähdytyslämpötilassa ja azabis-isobutyronitriilin läsnäollessa 4'-deoksi-johdannaiseksi, joka hydrolysoitaessa natriumalkoholaatilla ja suoritettaessa katalyyttinen hydraus palautusjäähdytystä käyttäen 80 % etanolissa syklohekseenin ja 10 % palladiumhiilen läsnäollessa antaa tuotteeksi 4'-deoksi-paromomysiiniä; tai (d) saatu yhdiste kloorataan sulfury1ikloridi1la kuivassa pyri-diinissä, näin saatu yhdiste hydrolysoidaan natriumalkoholaatilla, ja saatu 4'-deoksi-4'-epi-kloori-penta-N-bentsyl- oksikarbonyyli-paromomysiini hydrataan 10 % palladiumhiilen läsnäollessa normaalipaineessa 4'-deoksi-4'-epi-kloori-paramomysiiniksi. M 19 PATENTKRAV 69082 Analogiförfarande för framställning av en antibakterisk och en terapeutisk verkan ägande förening enligt den allmänna formeln (1} l!\qh Η0^?ί7ή nh, (I) rQH — 4 Γ .0 ^ QH NH2 l / OH Lnh2 \/ där R^ är en väte- eller kloratom, kännetecknat där-av, att i förfarande ändras hydroxigrupperna 6,3', 2’’, 5’’, 3''' och 4''' i 4',6'-O-bensyliden-penta-N-bensyloxikarbonyl-pa-romomycin tili O-acyl eller O-bensoylgrupper genom acylering eller bensoylering genom användande av motsvarande anhydrid under närvaro av pyridin, det erhillna hexa-O-acyl eller bensoy1-4',6'- O-bensyliden-penta-N-bensylkarbonylparomomycinet hydrolyseras i rumstemperatur under närvaro av ättiksyra, det erhällna 6,3’, 2'', 5'', 3''', 4 ' ' '-heksa-O-acy1 eller bensoy1-penta-N-bensy1- oxikarbonylparomomycinets 6'-hydroxigrupp ändras tili en 6'-0-bensoylgrupp genom användning av bensoylklorid i torrt pyridin vid temperaturen 0eC och (a) den erhällna föreningen kloreras med sulfurylklorid i torrt pyridin sä, att en 4'-deoxi-4'-epi-klor-derivat erhllles, som reduceras med tributyltennhydrid i väteatmosfär i to-luen i refluxnedkylningstemperaturen och under närvaro av azabisisobutyronitril tili 41-deoxi-derivat, som vid hydrolys med natriumalkoholat och katalytisk hydrering under användning av refluxnedkylning vid närvaro av cyklo-hexen och 10 % palladiumkol i 80 % etanol ger som produkt 41—deoxi—paromomycin, eller