FI64187C - FOERFARANDE FOER RENING AV EN PRODUKT BESTAOENDE HUVUDSAKLIGENAV CDNA-FRAGMENT MED SAMMA LAENGD VILKA HAR EN SPECIFIK N UKEOTIDSQUENSE OCH MINST ETT RESTRIKTIONSSTAELLE OCH FOER A NAYS AV PRODUKTENS RENHET - Google Patents
FOERFARANDE FOER RENING AV EN PRODUKT BESTAOENDE HUVUDSAKLIGENAV CDNA-FRAGMENT MED SAMMA LAENGD VILKA HAR EN SPECIFIK N UKEOTIDSQUENSE OCH MINST ETT RESTRIKTIONSSTAELLE OCH FOER A NAYS AV PRODUKTENS RENHET Download PDFInfo
- Publication number
- FI64187C FI64187C FI781676A FI781676A FI64187C FI 64187 C FI64187 C FI 64187C FI 781676 A FI781676 A FI 781676A FI 781676 A FI781676 A FI 781676A FI 64187 C FI64187 C FI 64187C
- Authority
- FI
- Finland
- Prior art keywords
- cdna
- nucleotide sequence
- dna
- fragments
- restriction
- Prior art date
Links
- 239000012634 fragment Substances 0.000 title claims description 93
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 claims description 86
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 75
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 75
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 claims description 74
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 72
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 68
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 claims description 54
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 claims description 17
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 claims description 17
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 12
- 102000002265 Human Growth Hormone Human genes 0.000 claims description 10
- 108010000521 Human Growth Hormone Proteins 0.000 claims description 10
- 239000000854 Human Growth Hormone Substances 0.000 claims description 10
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims description 10
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 claims description 7
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 claims description 7
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 claims description 6
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 claims description 6
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims description 6
- 238000012546 transfer Methods 0.000 claims description 6
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 5
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 claims description 4
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims description 4
- 125000002467 phosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 claims description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 2
- 230000006798 recombination Effects 0.000 claims description 2
- 238000005215 recombination Methods 0.000 claims description 2
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 claims 1
- 229910052770 Uranium Inorganic materials 0.000 claims 1
- 239000003086 colorant Substances 0.000 claims 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 claims 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims 1
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 claims 1
- JFALSRSLKYAFGM-UHFFFAOYSA-N uranium(0) Chemical compound [U] JFALSRSLKYAFGM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 71
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 60
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 54
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 49
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 47
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 30
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 30
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 21
- 102100031780 Endonuclease Human genes 0.000 description 20
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 20
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 19
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 16
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 16
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 14
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 14
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 14
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 14
- 239000000463 material Substances 0.000 description 13
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 12
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 12
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 12
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 12
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 12
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 12
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 11
- 239000000047 product Substances 0.000 description 11
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 10
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 10
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 10
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 10
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 10
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 10
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 9
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 8
- HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N dGTP Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 7
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 7
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 7
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000000211 autoradiogram Methods 0.000 description 6
- AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M caesium chloride Chemical compound [Cl-].[Cs+] AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 102000018146 globin Human genes 0.000 description 6
- 108060003196 globin Proteins 0.000 description 6
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 6
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 6
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 6
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 6
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 5
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 5
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-N dCTP Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](CO[P@](O)(=O)O[P@](O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-N 0.000 description 5
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 5
- 230000003169 placental effect Effects 0.000 description 5
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 5
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 5
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 5
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 5
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 4
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 4
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 4
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 4
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 4
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 4
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 4
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- ZKHQWZAMYRWXGA-UHFFFAOYSA-N Adenosine triphosphate Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1OC(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)C(O)C1O ZKHQWZAMYRWXGA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 3
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 3
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 3
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 3
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 3
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N dTTP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N 0.000 description 3
- 239000000122 growth hormone Substances 0.000 description 3
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 3
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 3
- 210000005059 placental tissue Anatomy 0.000 description 3
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 3
- 241000894007 species Species 0.000 description 3
- UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N triphosphoric acid Chemical compound OP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000713838 Avian myeloblastosis virus Species 0.000 description 2
- 230000004543 DNA replication Effects 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- 241001524679 Escherichia virus M13 Species 0.000 description 2
- 102000018997 Growth Hormone Human genes 0.000 description 2
- 108010051696 Growth Hormone Proteins 0.000 description 2
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 2
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 108010021757 Polynucleotide 5'-Hydroxyl-Kinase Proteins 0.000 description 2
- 102000008422 Polynucleotide 5'-hydroxyl-kinase Human genes 0.000 description 2
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 2
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical compound O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000000376 autoradiography Methods 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 2
- YTRQFSDWAXHJCC-UHFFFAOYSA-N chloroform;phenol Chemical compound ClC(Cl)Cl.OC1=CC=CC=C1 YTRQFSDWAXHJCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 2
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 2
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 2
- DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N ethyl mercaptane Natural products CCS DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 230000006870 function Effects 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- ZJYYHGLJYGJLLN-UHFFFAOYSA-N guanidinium thiocyanate Chemical compound SC#N.NC(N)=N ZJYYHGLJYGJLLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 2
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 description 2
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 2
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 2
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 230000033001 locomotion Effects 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000012856 packing Methods 0.000 description 2
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 2
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 210000002826 placenta Anatomy 0.000 description 2
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 2
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000002264 triphosphate group Chemical class [H]OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])O* 0.000 description 2
- YIJOZSCZCHDKAT-UHFFFAOYSA-N 1-aminopentane-1,3,5-triol Chemical compound NC(O)CC(O)CCO YIJOZSCZCHDKAT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KDELTXNPUXUBMU-UHFFFAOYSA-N 2-[2-[bis(carboxymethyl)amino]ethyl-(carboxymethyl)amino]acetic acid boric acid Chemical compound OB(O)O.OB(O)O.OB(O)O.OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KDELTXNPUXUBMU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ASJSAQIRZKANQN-CRCLSJGQSA-N 2-deoxy-D-ribose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)CC=O ASJSAQIRZKANQN-CRCLSJGQSA-N 0.000 description 1
- ITZMJCSORYKOSI-AJNGGQMLSA-N APGPR Enterostatin Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(=O)N1[C@H](C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(O)=O)CCC1 ITZMJCSORYKOSI-AJNGGQMLSA-N 0.000 description 1
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 1
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- HMFHBZSHGGEWLO-SOOFDHNKSA-N D-ribofuranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H]1O HMFHBZSHGGEWLO-SOOFDHNKSA-N 0.000 description 1
- 230000008836 DNA modification Effects 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 241000701533 Escherichia virus T4 Species 0.000 description 1
- 208000034454 F12-related hereditary angioedema with normal C1Inh Diseases 0.000 description 1
- 108010012003 GGCC-specific type II deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 102100040004 Gamma-glutamylcyclotransferase Human genes 0.000 description 1
- 241001501603 Haemophilus aegyptius Species 0.000 description 1
- 101000886680 Homo sapiens Gamma-glutamylcyclotransferase Proteins 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 102000004160 Phosphoric Monoester Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108090000608 Phosphoric Monoester Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 208000007913 Pituitary Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 102000003946 Prolactin Human genes 0.000 description 1
- 108010057464 Prolactin Proteins 0.000 description 1
- 108091034057 RNA (poly(A)) Proteins 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N Ribose Natural products OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- RZCIEJXAILMSQK-JXOAFFINSA-N TTP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 RZCIEJXAILMSQK-JXOAFFINSA-N 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 241000209140 Triticum Species 0.000 description 1
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 description 1
- CTCBPRXHVPZNHB-VQFZJOCSSA-N [[(2r,3s,4r,5r)-5-(6-aminopurin-9-yl)-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl] phosphono hydrogen phosphate;(2r,3r,4s,5r)-2-(6-aminopurin-9-yl)-5-(hydroxymethyl)oxolane-3,4-diol Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O.C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O CTCBPRXHVPZNHB-VQFZJOCSSA-N 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N alpha-D-Furanose-Ribose Natural products OCC1OC(O)C(O)C1O HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 230000002942 anti-growth Effects 0.000 description 1
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 102000023732 binding proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 1
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- UXTMROKLAAOEQO-UHFFFAOYSA-N chloroform;ethanol Chemical compound CCO.ClC(Cl)Cl UXTMROKLAAOEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000003161 choroid Anatomy 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 239000002131 composite material Substances 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 1
- GYOZYWVXFNDGLU-XLPZGREQSA-N dTMP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 GYOZYWVXFNDGLU-XLPZGREQSA-N 0.000 description 1
- 239000007857 degradation product Substances 0.000 description 1
- 230000001627 detrimental effect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000000945 filler Substances 0.000 description 1
- 238000010359 gene isolation Methods 0.000 description 1
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 1
- 230000008303 genetic mechanism Effects 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-O guanidinium Chemical compound NC(N)=[NH2+] ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 208000016861 hereditary angioedema type 3 Diseases 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 238000005304 joining Methods 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 230000000394 mitotic effect Effects 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 229940046166 oligodeoxynucleotide Drugs 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 239000000813 peptide hormone Substances 0.000 description 1
- 230000002688 persistence Effects 0.000 description 1
- 230000000704 physical effect Effects 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 description 1
- 230000037452 priming Effects 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000009877 rendering Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 229920002477 rna polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 229910052710 silicon Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010703 silicon Substances 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 230000000392 somatic effect Effects 0.000 description 1
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 1
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 description 1
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/61—Growth hormone [GH], i.e. somatotropin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/57518—Placental lactogen; Chorionic somatomammotropin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/62—Insulins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/1096—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA cDNA Synthesis; Subtracted cDNA library construction, e.g. RT, RT-PCR
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Pregnancy & Childbirth (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
r , kuulutusjulkaisu ,ΑΛοΠ JMTq LBJ (11) UTLÄGGNINGSSKRIFT 64187 q (45) n, t,...· i! ’ ί ιλ 1933 ^ ^ ^ (51) Kv.ik3/Int.ci. ' C 12 N 15/00 SUOMI — FINLAND (2.1) PtMnttlhakemut — Pat*ntan*öknlng T81676 (22) Hikemljpilvi — Ansöknlngtdag 26.05*78 (23) AlkupUvi— Glltighetsdag 26.05.(8 (41) Tullut Julkiseksi — Blivlt offentllg 2^.03. 79r, advertisement publication, ΠοΠ JMTq LBJ (11) UTLÄGGNINGSSKRIFT 64187 q (45) n, t, ... · i! ‘Ί ιλ 1933 ^ ^ ^ (51) Kv.ik3 / Int.ci. 'C 12 N 15/00 FINLAND - FINLAND (2.1) PtMnttlhakemut - Pat * ntan * öknlng T81676 (22) Hikemljpilvi - Ansöknlngtdag 26.05 * 78 (23) AlkupUvi— Glltighetsdag 26.05. (8 (41) Become Public - 2 years off .03 79
Patentti- ja rekisterihallitus (44) Nthtivlkslpanon ja kuul.|ulkalsun pvm. — 30.06.83National Board of Patents and Registration (44) Date of issue and hearing | - 30.06.83
Patent- och registerstyrelsen Anaökan utlagd och utl.skrlften publlcerad (32)(33)(31) Pyydetty etuoikeus—Begird prlorltet 23- 09. 77 USA(US ) 836218 (71) The Regents of the University of California, 2200 University Avenue, Berkeley, California 9^720, USA(US) (72) Howard Michael Goodman, San Francisco, California,Patent and Registration Authorities Anaökan utlagd och utl.skrlften publlcerad (32) (33) (31) Claim Requested — Begird prlorltet 23- 09. 77 USA (US) 836218 (71) The Regents of the University of California, 2200 University Avenue, Berkeley, California 9 ^ 720, USA (72) Howard Michael Goodman, San Francisco, California,
Peter Horst Seeburg, San Francisco, California, USA(US),Peter Horst Seeburg, San Francisco, California, USA (US),
John Shine, Curtin, A.C.T., Australia-Australien(AU) (71*) Oy Kolster Ab (5M Menetelmä pääasiallisesti spesifisen nukleotidisekvenssin omaavista, vähintään yhden restriktiokohdan sisältävistä samanpituisista e DNA-fragmenteista muodostuvan tuotteen puhdistamiseksi ja tuotteen puhtauden analysoimiseksi - Förfarande för rening av en produkt best&ende huvudsakligen av cDNA-fragment med samma längd, vilka har en speeifik nukleotidsekvens och minst ett restriktionsställe, och för analys av produktens renhet Tämän keksinnön kohteena on menetelmä pääasiassa spesifisen nukleotidisekvenssin omaavista, vähintään yhden restriktiokohdan sisältävistä samanpituisista cDNA-fragmenteista muodostuvan tuotteen puhdistamiseksi ja tuotteen puhtauden analysoimiseksi, jolloin fragmentit koodaavat ihmisen sikiön suonikalvon somatomammotropiinia tai ihmisen kasvuhormonia tai niiden osia ja soveltuvat rekombinoitavaksi DNA-siirtovektorin kanssa ja siirrettäväksi mikro-organismiin ja jolloin mainittu puhdistettavista cDNA-fragmenteista muodostuva tuote on saatu käsittelemällä pituudeltaan ja nukleotidisekvenssiltään heterogeenista cDNA-populaatiota, jossa ainakin osa cENA-molekyyleistä sisältää ainakin kaksi restriktiokohtaa, ensin yhdellä tai kahdella sopivalla restriktioentsyymillä ja sen jälkeen fraktioimalla syntyneet 2 64187 samanpituiset .cDNA-fragment it erilleen esimerkiksi geeli-elektroforeesia käyttäen ja erottamalla halutun spesifisen nukleo-tidisekvenssin omaavista cDNA-fragmenteista koostuva fraktio.John Shine, Curtin, ACT, Australia-Australien (AU) (71 *) Oy Kolster Ab (5M Method for purifying and analyzing the purity of a product consisting mainly of e-DNA fragments of the same length having at least one restriction site and having a specific nucleotide sequence - Förfarande för rening av en The present invention relates to a method for the purification of product cNAs of at least one restriction site of the same product having at least one restriction site and having the same nucleotide sequence. for analysis of purity, wherein the fragments encode human fetal choroidal somatomammotropin or human growth hormone or parts thereof and are suitable for recombination with a DNA transfer vector and transfer to a microorganism, and wherein said purified The product of avista cDNA fragments is obtained by treating a population of cDNAs heterogeneous in length and nucleotide sequence in which at least a portion of the cENA molecules contain at least two restriction sites, first with one or two suitable restriction enzymes and then fractionating 2,6487 cDNAs of the same length. using electrophoresis and separating a fraction of cDNA fragments having the desired specific nucleotide sequence.
Elävät organismit pystyvät syntetisoimaan mitä erilaisimpia proteiineja ja peptidejä. Useat proteiinit ja peptidit ovat käyttökelpoisia lääketieteessä, maataloudessa tai teollisuudessa. Eräät proteiinit ovat entsyymejä, jotka katalysoivat monimutkaisia kemiallisia reaktioita. Toiset toimivat hormoneina, jotka vaikuttavat eliön kasvuun ja kehitykseen tai kudosten toimintaan lääketieteellisesti merkittävällä tavalla. Tietyillä sideproteiineilla saattaa olla kaupallista merkitystä, kun halutaan eristää ja puhdistaa aineita tai poistaa epäpuhtauksia. Sekä proteiinit, että peptidit koostuvat lineaarisista aminohappoketjuista, ja jälkimmäistä termiä käytetään lyhyistä yksiketjuisista sekvensseistä ja edellistä pitkistä moniketjuisista aineista. Tämän keksinnön sisältämät periaatteet soveltuvat yhtä hyvin proteiineihin kuin peptideihin.Living organisms are able to synthesize a wide variety of proteins and peptides. Several proteins and peptides are useful in medicine, agriculture or industry. Some proteins are enzymes that catalyze complex chemical reactions. Others act as hormones that affect the growth and development of an organism or the function of tissues in a medically significant way. Certain binding proteins may be of commercial importance in isolating and purifying substances or removing impurities. Both proteins and peptides consist of linear amino acid chains, and the latter term is used for short single-chain sequences and the former for long-chain multi-chains. The principles contained in this invention apply equally well to proteins as to peptides.
Proteiinit ja peptidit ovat yleensä suurimolekyylisiä aineita, joilla kullakin on spesifinen aminohapposekvenssi. Pieniä peptidejä lukuunottamatta on proteiinien ja peptidien kemiallinen synteesi usein epäkäytännöllistä, kallista ja aikaavievää ja jopa mahdotonta. Jotta halutulla proteiinilla olisi käytännön merkitystä, se pitää useimmiten ensin eristää organismista, joka valmistaa sitä. Usein on haluttua proteiinia läsnä vain pienenä pitoisuutena. Halutun proteiinin lähdettä on yleensä käytettävissä niin vähän, että proteiinia ei saada tarpeeksi. Näin ollen tietyille proteiineille on tiedossa useita maataloudellisia, teollisia ja lääketieteellisiä sovellutuksia, joita ei ole voitu kehittää edelleen halutun proteiinin tai peptidin riittämättömyydestä johtuen.Proteins and peptides are generally high molecular weight substances, each with a specific amino acid sequence. With the exception of small peptides, chemical synthesis of proteins and peptides is often impractical, expensive, time consuming, and even impossible. In order for a desired protein to have practical significance, it must most often first be isolated from the organism that produces it. Often the desired protein is present in only a small concentration. The source of the desired protein is usually so limited that not enough protein is available. Thus, a number of agricultural, industrial, and medical applications are known for certain proteins that have not been able to be further developed due to the inadequacy of the desired protein or peptide.
Julkaisussa Ann. Rev. Biochem. 44 (1975) 45 (Gefter, Malcolm, L.) on selitetty DNA-replikoinnin periaate, eli DNA:n synteesi solussa, ja on mainittu tarvittavat entsyymit ja proteiinit. Julkaisussa Ann. Rev. Biochem. 44 (1975) 273 (Nathans, D. ja Smith, H.D.) on selitetty restriktioendonukleaaseja ja niiden käyttöä; mm. on mainittu näiden entsyymien luokitus, katkaisukohdat ja analyysimenetelmät, sekä entsyymien käyttö kromosomitutkimuksissa, geenien eristämisessä ja DNA:n kloonauksessa. Julkaisussa Ann. Rev. Biochem. 46 -(1977) 415 (Sinsheimer, R:L.) on selitetty yhdistelmä-DNA-tekniikka; julkaisu koskee mm.In Ann. Rev. Biochem. 44 (1975) 45 (Gefter, Malcolm, L.) describes the principle of DNA replication, i.e. the synthesis of DNA in a cell, and mentions the necessary enzymes and proteins. In Ann. Rev. Biochem. 44 (1975) 273 (Nathans, D. and Smith, H.D.) describe restriction endonucleases and their use; mm. the classification of these enzymes, cleavage sites and methods of analysis, as well as the use of the enzymes in chromosome studies, gene isolation and DNA cloning are mentioned. In Ann. Rev. Biochem. 46 - (1977) 415 (Sinsheimer, R: L.) Describes recombinant DNA technology; the publication concerns e.g.
3 641 87 plasmideja, DNA:n modifiointia, kloonatun DNA:n eristämistä ym.3,641,87 plasmids, DNA modification, isolation of cloned DNA, etc.
Näissä julkaisuissa ei ole selitetty keksinnön mukaista menetelmää nukleotidifragmentin puhdistamiseksi, jolloin ensin eristetään mRNA, sitten valmistetaan cDNA:n fragmentti, joka on oleellisesti puhdas, so. se ei sisällä kontaminoivia cDNA-sekvensse jä. Julkaisussa Ann. Rev. Biochem. 47 (1978) 607 (Wu,R.) on selitetty menetelmä DNA-sekvenssin analysoimiseksi; tämän julkaisun mukaan DNA eristetään ja puhdistetaan gradienttisentrifugoimalla, ja restriktioendonukle-aaseja käytetään DNA:n katkaisemiseksi analysoitavissa oleviin pätkiin.These publications do not describe a method according to the invention for purifying a nucleotide fragment, first isolating the mRNA, then preparing a fragment of the cDNA which is substantially pure, i. it does not contain contaminating cDNA sequences. In Ann. Rev. Biochem. 47 (1978) 607 (Wu, R.) describes a method for analyzing a DNA sequence; according to this publication, DNA is isolated and purified by gradient centrifugation, and restriction endonucleases are used to cleave the DNA into analyteable fragments.
Julkaisussa on myös lyhyesti mainittu DNA:n kloonausta; erään menetelmän mukaan lähdetään suhteellisen puhtaasta mRNA:sta, ja saadaan helposti kloonattavissa oleva cDNA, toisen menetelmän mukaan valmistetaan cDNA mRNA:ien seoksesta. Näissäkään julkaisuissa ei ole esitetty spesifisen cDNA:n eristämistä ja puhdistusta lähtien sellaisesta mRNA:ien seoksesta, jossa haluttua mRNA:a on läsnä vain pieniä määriä, esimerkiksi vain 2 %.The publication also briefly mentions DNA cloning; according to one method, starting from relatively pure mRNA, and obtaining an easily clonable cDNA, according to another method, the cDNA is prepared from a mixture of mRNAs. These publications also do not disclose the isolation and purification of specific cDNA from a mixture of mRNAs in which only small amounts of the desired mRNA are present, for example only 2%.
Julkaisussa Science 196 (1977) 1313-1319 (Ullrich A* et ai.) on selitetty menetelmä cDNA:n puhdistamiseksi. Tällä tunnetulla menetelmällä voitiin kuitenkin puhdistaa vain dominoiva cDNA, sensijaan ei voitu puhdistaa sellaista cDNA:ta , jota esiintyy vain niukasti, ja heterogeenisessä populaatiossa. On yllättävää, että uudella menetelmällä voidaan tällainen minoritetti-cDNA puhdistaa selektiivisesti, jolloin ensimmäistä kertaa saadaan puhtaana ihmisen kasvuhormonia ja ihmisen korionsomatomammotropiinia koodaava DNA-fragmentti.Science 196 (1977) 1313-1319 (Ullrich A * et al.) Describes a method for purifying cDNA. However, only the dominant cDNA could be purified by this known method, whereas cDNA, which is sparse, could not be purified and in a heterogeneous population. Surprisingly, with the new method, such a minority cDNA can be selectively purified to obtain, for the first time, a pure DNA fragment encoding human growth hormone and human chorionic somatic mammotropin.
Viime aikoina kehitetyt menetelmät (ks. esim. FI-hakemus n:o 781 675) antavat mahdollisuuden käyttää nopea- ja runsaskasvuisia mikro-organismeja kaupallisesti hyödyllisien proteiinien ja peptidien syntetisointiin riippumatta siitä, mikä niiden lähde on luonnossa. Näillä menetelmillä voidaan sopivalle mikro-organismille antaa geneettinen kyky syntetisoida sellainen proteiini tai peptidi, joka normaalitapauksessa on jonkun muun organismin valmistama. Menetelmissä käytetään hyväksi sitä periaatetta , joka vallitsee kaikkien elävien organismien geneettisen materiaalin, tavallisesti DNA:n ja organismien syntetisoimien proteiinien välillä. Tämän periaatteen mukaisesti proteiinin aminohapposekvenssi määräytyy DNA:n nuklcoti-disekvenssin perusteella. Kullekin proteiineissa tavallisimmin esiintyvistä 20 aminohaposta on olemassa yksi tai useampia spesifisiä tri-nukleotidisekvenssiryhmiä. Tietyn trinukleotidisekvenssin ja sitä 641 87 4 vastaavan aminohapon välinen yhteys muodostaa geneettisen koodin. Uskotaan, että kaikissa elävissä organismeissa geneettinen koodi on joko sama tai samantapainen. Näin ollen jokaisen proteiinin tai peptidin aminohapposekvenssi määräytyy vastaavasta nukleotidisekvens-sistä tunnetulla tavalla. Lisäksi pystyy periaatteessa mikä tahansa elävä organismi tulkitsemaan tämän nukleotidisekvenssin.Recently developed methods (see, for example, FI application No. 781 675) make it possible to use fast-growing and abundant microorganisms for the synthesis of commercially useful proteins and peptides, regardless of their source in nature. These methods can be used to confer on a suitable microorganism the genetic ability to synthesize a protein or peptide that is normally produced by another organism. The methods utilize the principle that prevails between the genetic material of all living organisms, usually DNA, and proteins synthesized by the organisms. According to this principle, the amino acid sequence of a protein is determined by the nucleotide sequence of the DNA. For each of the 20 amino acids most commonly found in proteins, there are one or more specific groups of trinucleotide sequences. The link between a particular trinucleotide sequence and its corresponding amino acid 641 87 4 forms the genetic code. It is believed that in all living organisms, the genetic code is either the same or similar. Thus, the amino acid sequence of each protein or peptide is determined from the corresponding nucleotide sequence in a known manner. In addition, in principle, any living organism can interpret this nucleotide sequence.
Menetelmä, jolla mikro-organismi saatetaan kykeneväksi syntetisoimaan uutta proteiinia, käsittää kolme päävaihetta:(1) puhdistetaan ja eristetään tietty geeni tai nukleotidisekvenssi, joka sisältää halutun proteiinin aminohapposekvenssin geneettisen informaation, (2) rekombinoidaan eristetty nukleotidisekvenssi sopivan siirtovek-torin kanssa, joka yleensä on bakteriofagin tai plasmidin DNA ja (3) siirretään vektori sopivaan mikro-organismiin ja näin saaduista mikro-organismeista valitaan kanta, joka sisältää halutun geneettisen informaation.The method of rendering a microorganism capable of synthesizing a new protein comprises three main steps: (1) purifying and isolating a particular gene or nucleotide sequence containing the genetic information of the amino acid sequence of the desired protein, (2) recombining the isolated nucleotide sequence with a suitable transfer vector; the bacteriophage or plasmid DNA and (3) transferring the vector to a suitable microorganism and selecting a strain containing the desired genetic information from the microorganisms thus obtained.
Kun edellä pääpiirteissään kuvattu menetelmä halutaan kehittää kaupalliseksi, perustavaa laatua olevat vaikeudet liittyvät ensimmäiseen vaiheeseen eli halutun geneettisen informaation eristämiseen ja puhdistamiseen. Kaikissa elävissä soluissa DNA esiintyy erittäin suurimolekyylisinä nukleotidiketjuina. Solu saattaa sisältää yli 10 000 rakennegeeniä, jotka koodaavat yli 10 000 spesifisen pro-teeiinin aminohapposekvenssiä, ja kunkin geenin sekvenssi voi sisältää monta sataa nukleotidia. Kaikki olemassa olevat sekvenssit koostuvat pääasiassa neljästä eri nukleotidiemäksestä. Nämä ovat adenii-ni (A), guaniini (G), sytosiini (C) ja tyrniini (T). Tiettyjen proteiinien rakennegeenien sekvenssit ovat näin ollen hyvin samanlaisia kemialliselta rakenteeltaan ja fysikaalisilta ominaisuuksiltaan. Yhtä tällaista sekvenssiä ei voida erottaa tavallisilla fysikaalisilla eikä kemiallisilla menetelmillä muista eristetyssä DNA:ssa läsnäolevista sekvensseistä.When the method outlined above is to be developed commercially, the fundamental difficulties relate to the first step, namely the isolation and purification of the desired genetic information. In all living cells, DNA exists as very large molecular nucleotide chains. A cell may contain more than 10,000 structural genes encoding more than 10,000 amino acid sequences of a specific protein, and the sequence of each gene may contain many hundred nucleotides. All existing sequences consist essentially of four different nucleotide bases. These are adenine (A), guanine (G), cytosine (C) and thyrine (T). The sequences of the structural genes of certain proteins are thus very similar in chemical structure and physical properties. One such sequence cannot be distinguished by other physical or chemical methods from other sequences present in the isolated DNA.
DNA:n nukleotidisekvenssi-informaatio muuttuu lähetti-RNA:n avulla proteiinin aminohapposekvenssiksi. Tämän prosessin ensimmäisessä vaiheessa, joka on nimeltään transskriptio, kopioidaan RNA:han se DNA-segmentti, jonka nukleotidisekvenssi spesifioi valmistettavan proteiinin. RNA on samanlainen polynukleotidi kuin DNA paitsi, että deoksiriboosin tilalla on riboosi ja tymiinin tilalla on urasiili. RNA:n nukleotidiemäkset kykenevät asettumaan samanlaisiksi emäs- 5 641 87 pareiksi, jollaisia tiedetään olevan komplementaaristen DNA-säikei-den välillä. A ja U (T) ovat komplementaarisia ja G ja C ovat komplementaarisia. DNA-nukleotidisekvenssin RNA-transskripti on komplementaarinen kopioidun sekvenssin kanssa. Tätä RNArta kutsutaan lähetti RNA:ksi (mRNA), koska se toimii välittäjänä solun geneettisen mekanismin ja proteiineja syntetisoivan mekanismin välillä. Yleensä solussa on tietyllä hetkellä läsnä vain sellaisia mRNA-sekvenssejä, jotka vastaavat sillä hetkellä syntetisoitavia proteiineja. Näin ollen erikoistunut solu, jonka toiminta kohdistuu pääasiassa yhden proteiinin syntetisointiin, sisältää pääasiassa tätä proteiinia vastaavaa RNArta. Tiettyä proteiinia koodaava nukleotidisekvenssi voidaan eristää ja puhdistaa tietyissä tapauksissa siten, että tämän proteiinin valmistukseen erikoistuneista soluista erotetaan kyseinen mRNA.The nucleotide sequence information of DNA is converted to the amino acid sequence of the protein by messenger RNA. In the first step of this process, called transcription, the DNA segment whose nucleotide sequence specifies the protein to be produced is copied into the RNA. RNA is a polynucleotide similar to DNA except that deoxyribose is replaced by ribose and thymine is replaced by uracil. The nucleotide bases of the RNA are capable of settling into similar base pairs known to be between complementary strands of DNA. A and U (T) are complementary and G and C are complementary. The RNA transcript of the DNA nucleotide sequence is complementary to the copied sequence. This RNA is called messenger RNA (mRNA) because it acts as an intermediary between the genetic mechanism of the cell and the mechanism that synthesizes proteins. In general, only mRNA sequences corresponding to the proteins currently being synthesized are present in a cell at a given time. Thus, a specialized cell whose function is primarily to synthesize a single protein contains an RNA that is primarily responsible for that protein. The nucleotide sequence encoding a particular protein can be isolated and purified in certain cases by isolating that mRNA from cells specialized in the production of that protein.
Edellä mainitussa menetelmässä on se heikkous, että sitä voidaan soveltaa vain niihin melko harvinaisiin soluihin, jotka ovat erikoistuneet pääasiassa yhden proteiinin tuottamiseen. Suurinta osaa kaupallisesti mielenkiintoisista proteiineista ei syntetisoida tällaisella erikoistuneella tavalla. Haluttu proteiini saattaa olla yksi noin sadasta eri proteiinista, joita kudoksen solut tai organismi tuottaa tietyllä hetkellä. mRNArn eristysmenetelmä on kuitenkin hyödyllinen siksi, että solussa läsnäolevat RNA-lajit edustavat tavallisesti vain osaa DNA-sekvenssien kokonaismäärästä, ja tällä perusteella voidaan suorittaa alkupuhdistus. Jotta tällaisesta puhdistuksesta olisi hyötyä, tarvitaan menetelmä, jolla pieninä, kuten muutaman prosentin pitoisuuksina esiintyvät sekvenssit voidaan eristää hyvin puhtaina.The disadvantage of the above method is that it can only be applied to those rather rare cells that specialize mainly in the production of a single protein. Most commercially interesting proteins are not synthesized in such a specialized manner. The desired protein may be one of about one hundred different proteins produced by the cells or organism of the tissue at a given time. However, the method of isolating mRNA is useful because the RNA species present in the cell usually represent only a fraction of the total number of DNA sequences, and on this basis, initial purification can be performed. In order for such purification to be useful, a method is needed by which sequences present in small concentrations, such as a few percent, can be isolated in very pure form.
Tämän keksinnön mukaisella menetelmällä voidaan eristää ja puhdistaa nukleotidisekvenssejä, joiden pitoisuus on niinkin alhainen kuin 2 % heterogeenisessä mRNA-sekvenssijoukossa. Menetelmä voidaan lisäksi yhdistää tunnettuihin mRNArn fraktiointimenetelmiin niin, että saadaan eristetyksi ja puhdistetuksi sekvenssejä, joiden pitoisuus on vielä pienempi alunperin esitetyssä RNA-populaa-tiossa.The method of this invention can isolate and purify nucleotide sequences as low as 2% in a heterogeneous set of mRNA sequences. The method can further be combined with known mRNA fractionation methods to isolate and purify sequences that are even lower in the RNA population originally shown.
Keksinnön mukaiselle menetelmälle on tunnusomaista, että a) poistetaan halutun spesifisen nukleotidisekvenssin omaa-vien samanpituisten cDNA-fragmenttien 5'-fosfaattipääteryhmät aika- 6 641 87 lisella fosfataasilla esimerkiksi pH:ssa 7,5 ja n. 60°C:n lämpötilassa n. 10 min:n ajan inkuboiden, b) katkaistaan kohdan a) mukaisesti käsitellyt cDNA-frag-mentit halutun nukleotidisekvenssin sisällä olevasta kohdasta sellaisella spesifisellä restriktioentsyymillä, jota ei ole käytetty käsittelyn aiemmassa vaiheessa, esimerkiksi Hha I, Hpa II taiThe method according to the invention is characterized in that a) the 5 'phosphate end groups of cDNA fragments of the same length having the desired specific nucleotide sequence are removed by phosphatase at a time of, for example, pH 7.5 and a temperature of about 60 ° C. b) cleaving the cDNA fragments treated according to a) from a site within the desired nucleotide sequence with a specific restriction enzyme not used in the previous step of the treatment, for example Hha I, Hpa II or
Pvu II restriktioendonukleaasia käyttäen pH:ssa n. 7,6, inkuboiden n. 37°C:n lämpötilassa n. 2 tuntia, c) fraktioidaan saadut osafragmentit pituuden mukaan esimerkiksi geelielektroforeesia käyttäen, d) otetaan spesifisen nukleotidisekvenssin kaksi osafragment-tia käsittävät fraktiot talteen, e) yhdistetään kohdan d) mukaiset osafragmentit entsymaattisesti toisiinsa kovalenttisidoksin DNA-ligaasin avulla ATP:n läsnäollessa esim. pH:ssa n. 7,6 n. 15°C:n lämpötilassa n. 2 tunnin ajan inkuboiden, f) kohdan e) mukaisesti saatu, pääasiassa spesifisen DNA-sek-venssin omaava cDNA:ta sisältävä tuote fraktioidaan pituuden mukaan esimerkiksi geelielektroforeesia käyttäen, ja g) otetaan kohdan f) mukaisesti saatu, jopa yli 90-%risesti kontaminoivista cDNA-sekvensseistä vapaa, halutun spesifisen nukleotidisekvenssin omaavista cDNA-fragmenteista koostuva tuote talteen.Using restriction enzyme endonuclease Pvu II at a pH of about 7.6, incubating at about 37 ° C for about 2 hours, c) fractionating the resulting subfragments by length, for example using gel electrophoresis, d) recovering fractions comprising two subfragments of a specific nucleotide sequence. , e) enzymatically combining the subfragments of d) with covalently linked DNA ligase in the presence of ATP, e.g. at a pH of about 7.6 at a temperature of about 15 ° C for about 2 hours, incubating in f) e) The product containing the cDNA containing the specific DNA sequence obtained according to f) is fractionated according to length, for example by gel electrophoresis, and g) the cDNA obtained according to f), free from up to 90% of the contaminating cDNA sequences, is taken from the cDNA having the desired specific nucleotide sequence. product consisting of fragments.
7 641877 64187
Seuraavassa taulukossa esitetään käytetyt symbolit ja lyhenteet.The following table shows the symbols and abbreviations used.
Taulukko 2 DNA deoksiribonukleiinihappo RNA ribonukleiinihappo cDNA komplementaarinen DNA (syntetisoitu entsymaattisesti mRNA-sek-venssistä)Table 2 DNA deoxyribonucleic acid RNA ribonucleic acid cDNA complementary DNA (enzymatically synthesized from mRNA sequence)
mRNA lähetti-RNAmRNA messenger RNA
dATP deoksiadenosiinitrifosfaatti dGTP deoksiguanosiinitrifosfaatti dCTP deoksisytidiinitrifosfaatti dTTP tymidiinitrifosfaatti dT^2_2g deoksitymidylaatti (12-18 emästä) HCS ihmisen sikiön suonikalvon somatomammotropiini TCA trikloorietikkahappo HGH ihmisen kasvuhormoni A adeniini T tyrniini G guaniini C sytosiini U urasiilidATP deoxyadenosine triphosphate dGTP deoxyguanosine triphosphate dCTP deoxycytidine triphosphate dTTP thymidine triphosphate dT ^ 2_2g deoxythymidylate (12-18 bases) uricosinase Sicomammotinin
Tris 2-amino-2-hydroksietyyli-l,3-propaanidioli EDTA etyleenidiamiinitetraetikkahappo ATP adenosiinitrifosfaattiTris 2-amino-2-hydroxyethyl-1,3-propanediol EDTA ethylenediaminetetraacetic acid ATP adenosine triphosphate
Hpa H-endonukleaas i, res trikt ioendonukleaasi , joka katkaisee koti- aidassa C CCG (nuoli osoittaa katkaisukohdan)Hpa H-endonuclease i, res trict ioendonuclease that cleaves C CCG in the home fence (arrow indicates cleavage site)
Hae III-endonukleaasifrestriktioendonukleaasi, joka katkaisee kohdassa GG^CCSearch for the III endonuclease diffraction endonuclease that cleaves at GG ^ CC
Hha I-endonukleaasi,restriktioendonukleaasi, joka katkaisee kohdassaHha I endonuclease, a restriction endonuclease that cleaves at
GCG^CGCG ^ C
Hsu I-endonukleaasi, restriktioendonukleaasi, joka katkaisee kohdassaHsu I-endonuclease, a restriction endonuclease that cleaves at
A^AGCTTN AGCTT
Pvu II-endonukleaasi, restriktioendonukleaasi, joka katkaisee kohdassaPvu II endonuclease, a restriction endonuclease that cleaves at
CA^GCTGCA ^ GCTG
Koska DNA:n replikaatiossa ja transskriptiossa vallitsee tunnettu emäsparijärjestelmä, vastaa sen mRNA:n eristäminen, joka sisältää tietyn proteiinin aminohapposekvenssiä koodaavan nukleotidisekvens-sin, saman sekvenssin tai geenin eristämistä itse DNArsta. Jos mRNA trans3kriptoidaan komplementaariseksi DNA:kseon (cDNA), saadaan rekonstruoiduksi DNA-sekvenssi, joka voidaan sopivilla menetelmillä siirtää 8 64187 toisen organismin geneettiseen materiaaliin. Tietyn sekvenssin edellä mainitut komplementaariset muodot ovat näin ollen funktionaali-sesti ekvivalentteja.Because DNA replication and transcription are characterized by a known base pair system, isolating an mRNA that contains a nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of a particular protein, the same sequence, or a gene is equivalent to isolating it from the DNA itself. If the mRNA is transcribed into complementary DNA (cDNA), a DNA sequence can be reconstructed that can be transferred to the genetic material of another organism by appropriate methods. The aforementioned complementary forms of a particular sequence are thus functionally equivalent.
DNA:n ja RNA:n nukleotidiyksiköt ovat liittyneet toisiinsa fosfodiesterisidoksilla, jotka ovat toisen nukleotidisokerin 5'-asemassa ja viereisen nukleotidisokerin 3'-asemassa. Kun tällaiset sidokset muodostetaan uudelleen, saadaan lineaarinen polynukleotidi, joka on polaarinen siten, että toinen pää voidaan erottaa toisesta, 3'-päässä voi olla vapaa hydroksyyliryhmä tai hydroksyyliryhmä voi olla substituoitu fosfaatilla tai jollakin monimutkaisemmalla raken-neyksiköllä. Tilanne on sama 5'-pään kohdalla. Eukaryoottisissa organismeissa eli niissä, joissa on erillinen tuma ja mitoottinen mekanismi, funktionaalisen mRNA:n synteesiin sisältyy tavallisesti poly-adenyylihapon liittyminen mRNA:n 3’-päähän. Tästä syystä mRNA voidaan erottaa muista eukaryoottisesta organismista eristetyistä ENA-tyypeistä pylväskromatografisesti selluloosalla, johon on liitetty polytymidyylihappoa, ks. Aviv, H. ja Leder, P., Proc. Natl. Acad.The nucleotide units of DNA and RNA are joined together by phosphodiester bonds at the 5 'position of the second nucleotide sugar and at the 3' position of the adjacent nucleotide sugar. When such bonds are reconstituted, a linear polynucleotide is obtained that is polar so that one end can be separated from the other, the 3 'end may have a free hydroxyl group, or the hydroxyl group may be substituted with a phosphate or some more complex moiety. The situation is the same at the 5 'end. In eukaryotic organisms, i.e., those with a distinct nucleus and mitotic mechanism, the synthesis of a functional mRNA usually involves the incorporation of a polyadenylic acid at the 3 'end of the mRNA. For this reason, mRNA can be separated from other types of ENA isolated from a eukaryotic organism by column chromatography on cellulose to which polytymidylic acid has been added, cf. Aviv, H. and Leder, P., Proc. Natl. Acad.
Sei. U.S.A. 69, 1408 (1972). Käyttökelpoisia ovat myös muut kromatografiset menetelmät, joissa käytetään hyväksi poly A:n ja kromatografisen täytemateriaalin emäspari-affiniteettia, kun täytemateriaali sisältää oligo-dT:tä, poly-U:ta tai jotakin poly-T:n ja poly-U:n yhdistelmää.Sci. U.S. 69, 1408 (1972). Also useful are other chromatographic methods that utilize the base pair affinity of poly A and the chromatographic packing material when the packing material contains oligo-dT, poly-U, or some combination of poly-T and poly-U.
Käänteistransskriptaasi katalysoi RNA-templaattisäikeen kanssa komplementaarisen DNA:n synteesin RNA-templaatin, primerin, joka voi olla mikä tahansa komplementaarinen 3'-hydroksyylin sisältävä oligo- tai polynukleotidi, ja neljän deoksinukleosiditrifosfaatin (dATP, dGTP, dCTP ja dTTP) läsnäollessa. Reaktio käynnistyy oligo-deoksinukleotidiprimerin ei-kovalenttisella liittymisellä lähelle mRNA:n 3'-päätä ja sen jälkeen liitetään vaiheittain sopivia deoksi-nukleotideja mRNA-nukleotidisekvenssin määrittelemiseksi emäspareik-si kasvavan ketjun 3'-päähän. Tuotteeksi saatua molekyyliä voidaan kuvailla hiusneularakenteeksi, jossa alkuperäisen RNA:n rinnalla on komplmentaarinen DNA vetysilloilla liittyneenä ja osittain toisesta päästä itsensä päälle taittuneena. DNA- ja RNA-säie eivät ole liittyneet toisiinsa kovalenttisesti. Käänteistransskriptaasi kykenee myös katalysoimaan samanlaisen reaktion käyttämällä yksisäikeis-tä DNA-hiusneulaa, jossa päitä yhdistää yksisäikeinen DNA, ks. Aviv, H. ja Leder, P., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 69, 1408 (1978) ja 9 641 87Reverse transcriptase catalyzes the synthesis of DNA complementary to the RNA template strand in the presence of an RNA template, a primer that can be any complementary 3'-hydroxyl-containing oligo- or polynucleotide, and four deoxynucleoside triphosphates (dATP, dGTP), dGTP, dGTP. The reaction is initiated by non-covalent attachment of the oligo-deoxynucleotide primer near the 3 'end of the mRNA and then stepwise coupling of appropriate deoxynucleotides to define the mRNA nucleotide sequence at the 3' end of the base pair. The resulting molecule can be described as a hairpin structure in which, alongside the original RNA, there is complementary DNA joined by hydrogen bridges and partially folded over itself at one end. The DNA and RNA strands are not covalently linked. Reverse transcriptase is also capable of catalyzing a similar reaction using a single-stranded DNA hairpin in which the ends are joined by single-stranded DNA, cf. Aviv, H. and Leder, P., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S. 69, 1408 (1978) and 9,641 87
Efstratiadis, A., Kafatos, F.C., Maxam, A.M. ja Maniatis, T., Cell 7, 279 (1976).Efstratiadis, A., Kafatos, F.C., Maxam, A.M. and Maniatis, T., Cell 7, 279 (1976).
Restriktioendonukleaasit ovat entsyymejä, jotka kykenevät hydrolysoimaan DNA:n fosfodiesterisidoksia ja siten katkaisemaan DNA-säikeen. Jos DNA on suljettu rengas, se muuttuu tämän entsyymin vaikutuksesta lineaariseksi. Restriktioentsyymin pääominaisuus on siinä, että sen katkaisuvaikutus kohdistuu vain sellaiseen kohtaan, jossa on tietty nukleotidisekvenssi. Tällainen sekvenssi on nimeltään restriktioendonukleaasin tunnistuskohta. Restriktioendonukle-aaseja on eristetty useista lähteistä ja ne on tunnistettu restrik-tiokohtiensa nukleotidisekvenssin perusteella. Kaksisäikeistä DNA:ta katkaistessaan eräät restriktioendonukleaasit katkaisevat fosfodiesterisidoksen samasta kohdasta kummassakin säikeessä niin, että syntyy tylppä pää. Toiset puolestaan katalysoivat sellaisten sidosten katkaisun, joita muutama nukleotidi erottaa toisistaan, ja näin muodostuu vapaat yksisäikeiset alueet katkaisukohtaan. Tällaiset yksisäikeiset päät ovat itsekomplementaarisia ja siten kohesii-visiä ja niitä voidaan käyttää katkaistun DNA:n uudelleenkytkentään. Koska tällainen entsyymi katkaisee minkä tahansa DNA:n vain samasta tunnistuskohdasta, syntyy samat kohesiiviset päät, ja tämä antaa mahdollisuuden liittää heterogeenisiä DNA-sekvenssejä toisiinsa, kunhan ne on ensin käsitelty samalla restriktioentSyymillä. Restriktioendonukleaasit nimitetään bakteerikantalähteen mukaan; käytetään sukunimen ensimmäistä kirjainta ja lajinimen kahta ensimmäistä kirjainta, ja mikäli samasta kannasta on saatu enemmän kuin yksi endo-nukleaasi, lisätään vielä roomalainen luku. Esimerkiksi Hae III tarkoittaa yhtä kolmesta Haemophilus aegyptius-restriktioendonukleaa-sista. Nimessä saattaa olla tämän lisäksi muitakin kirjaimia, mikäli täytyy ilmoittaa lisäksi erikoinen isolaatti tai serotyyppi (ks. Roberts, R.J., Crit. Rev. Biochem. 4, 123 (1976)).Restriction endonucleases are enzymes capable of hydrolyzing phosphodiester bonds in DNA and thus cleaving the DNA strand. If the DNA is a closed ring, it becomes linear under the influence of this enzyme. The main feature of a restriction enzyme is that its cleavage effect is limited to a site with a particular nucleotide sequence. Such a sequence is called a restriction endonuclease recognition site. Restriction endonucleases have been isolated from several sources and identified by the nucleotide sequence of their restriction sites. Upon cleavage of double-stranded DNA, some restriction endonucleases cleave the phosphodiester bond at the same site in each strand to form a blunt end. Others, in turn, catalyze the cleavage of bonds separated by a few nucleotides to form free single-stranded regions at the cleavage site. Such single-stranded ends are self-complementary and thus cohesive and can be used to reattach truncated DNA. Because such an enzyme cleaves any DNA from only the same recognition site, the same cohesive ends are created, and this allows heterogeneous DNA sequences to be ligated together as long as they have first been treated with the same restriction enzyme. Restriction endonucleases are named according to the bacterial strain source; the first letter of the surname and the first two letters of the species name are used, and if more than one endo-nuclease has been obtained from the same strain, a further Roman numeral is added. For example, Hae III means one of three Haemophilus aegyptius restriction endonucleases. The name may contain other letters in addition to this, if a special isolate or serotype also needs to be reported (see Roberts, R.J., Crit. Rev. Biochem. 4, 123 (1976)).
On havaittu, että tietyn entsyymin restriktiokohtia on melko harvassa ja ne ovat epätasaisesti jakautuneina. On tutkittava kokeellisesti, esiintyykö tietty restriktiokohta jossakin segmentissä. Kuitenkin eri lähteistä on voitu eristää lukuisa ja yhä kasvava määrä restriktioendonukleaaseja, joilla on toisistaan poikkeava restriktiokohtaspesifisyys, ja näin voidaan olettaa, että esimerkiksi jokin tietty tuhannen nukleotidin sekvenssin sisältää yhden tai useampia restrikt iokoht ta.It has been found that restriction sites for a particular enzyme are quite sparse and unevenly distributed. It must be investigated experimentally whether a particular restriction site exists in any segment. However, it has been possible to isolate a large and growing number of restriction endonucleases with different restriction site specificities from various sources, and thus it can be assumed that, for example, a particular thousand nucleotide sequence contains one or more restriction sites.
10 64187 Tämä keksintö kohdistuu uuteen menetelmään, jolla voidaan puhdistaa halutun nukleotidisekvenssin omaava cDNA, joka on komplementaarinen tietylle mP.NA:lle. Menetelmässä katkaistaan restrik-tioendonukleaasin avulla sellainen cDNA, joka on transskriboitu heterogeenisesta mRNA-seoksesta. Menetelmä ei edellytä RNA:n tarkkaa puhdistamista, mutta sen sijaan siinä käytetään hyväksi RNA:n transskriptiota cDNA:ksi, tämän cDNA:n spesifistä jakamista yhdellä tai kahdella restriktioendonukleaasilla fragmenteiksi ja näiden cDNA-fragmenttien eristämistä pituuden perusteella. Restriktioendo-nukleaaseja käyttämällä vältytään heterogeeniselta koolta ja saadaan samanpituisia DNA-fragmentteja mistä tahansa cDNA:sta, joka sisältää vähintään kaksi restriktiokohtaa. Alunperin heterogeenisesta cDNA-transskriptiopopulaatiosta saadaan samankokoisia fragmentteja, joilla on haluttu sekvenssi. Fragmenttien pituus voi olla useita satoja nukleotideja ja joissakin tapauksissa ne voivat sisältää halutun proteiinin koko rakennegeenin. Fragmentin pituus riippuu restriktiokohtien välillä olevien nukleotidien lukumäärästä, joka tavallisesti on erilainen DNA:n eri kohdissa. Kun erottaminen suoritetaan pituuden perusteella, saadaan homogeenisia frag-menttipopulaatioita, joilla on haluttu sekvenssi. Fragmentit saadaan kooltaan homogeenisina ja nukleotidisekvenssiltään erittäin puhtaina. Tämän keksinnön sisältämillä erotus- ja analysointimenetelmillä on mahdollista erottaa vastaavista xnRNA-lajeista sellaisia fragmentteja, joiden määrä on vähintään 2 % transskriptoitavan RNAai massasta. Jos mRNA puhdistetaan ennen transskriptiota ennestään tunnetuilla RNA:n fraktiointimenetelmillä, saadaan alarajaksi vähemmän kuin 2 % erotetusta kokonais-mRNArsta.64187 This invention relates to a novel method for purifying a cDNA having a desired nucleotide sequence that is complementary to a particular mP.NA. The method uses a restriction endonuclease to cleave a cDNA transcribed from a heterogeneous mRNA mixture. The method does not require precise purification of the RNA, but instead utilizes transcription of the RNA into cDNA, specific division of this cDNA by one or two restriction endonucleases into fragments, and isolation of these cDNA fragments by length. Using restriction endonucleases, heterogeneous size is avoided and DNA fragments of the same length are obtained from any cDNA containing at least two restriction sites. From an initially heterogeneous population of cDNA transcripts, fragments of the same size with the desired sequence are obtained. The fragments can be several hundred nucleotides in length and in some cases may contain the entire structural gene of the desired protein. The length of the fragment depends on the number of nucleotides between the restriction sites, which is usually different at different sites in the DNA. When the separation is performed on the basis of length, homogeneous populations of fragments with the desired sequence are obtained. The fragments are obtained as homogeneous in size and very pure in nucleotide sequence. The separation and analysis methods of this invention make it possible to separate fragments from the corresponding xnRNA species in an amount of at least 2% by weight of the RNAa to be transcribed. If the mRNA is purified prior to transcription by known RNA fractionation methods, a lower limit of less than 2% of the total mRNA isolated is obtained.
Edellä pääpiirteissään selostetulla menetelmällä puhdistettujen spesifisten sekvenssien puhdistusta jatketaan siten, että annetaan toisen restriktioendonukleaasin katkaista haluttu sekvenssi jostakin keskikohdasta. Tämä katkaisu johtaa kahteen rakenteeltaan haluttuun alafragmenttiin, jotka voidaan pituuden perusteella erottaa. Alafragmentit erotetaan katkeamattomista ja spesifisesti katkenneista epäpuhtaussekvensseistä, joiden alkuperäinen koko on ollut käytännöllisesti katsoen sauna. Menetelmä perustuu restriktioendonukleaasin tunnistuskohtien harvinaisuuteen ja satunnaiseen si- 11 641 87 jaintiin, sillä sen vuoksi on erittäin epätodennäköistä, että halutun sekvenssin kanssa alun perin saman pituinen epäpuhtausfrag-mentti katkeaa fragmenteiksi, jotka ovat samanpituisia kuin sekvenssiltään halutut alafragmentit. Kun epäpuhtauksista on päästy eroon, sekvenssiltään halutut alafragmentit voidaan yhdistää toisiinsa tunnetuilla menetelmillä ja näin rekonstruoida alkuperäinen sekvenssi. Kahden alafragmentin liittyminen toisiinsa alkuperäiseen sekvenssiin nähden käänteisesti pitää estää. Tämän keksinnön yhteydessä selostetaan menetelmä, jolla alafragmentit saadaan liitetyksi toisiinsa oikeassa järjestyksessä.Purification of specific sequences purified by the method outlined above is continued by allowing a second restriction endonuclease to cleave the desired sequence from one of the sites. This cleavage results in two subfragments of the desired structure that can be separated by length. The subfragments are separated from unbroken and specifically broken impurity sequences whose original size has been virtually sauna. The method is based on the rarity and random location of restriction endonuclease recognition sites, as it is therefore highly unlikely that an impurity fragment of the same length as the desired sequence will initially be cleaved into fragments of the same length as the desired alpha fragment. Once the impurities have been removed, the subfragments of the desired sequence can be joined together by known methods to reconstruct the original sequence. Joining of the two subfragments to each other in reverse to the original sequence must be prevented. In the context of the present invention, a method is described by which the subfragments are joined together in the correct order.
Edellä selostettua menetelmää voidaan muunnella ja yhdistää sopiviin merkintämenetelmiin niin, että eristettyjen sekvenssien puhtaudesta ja määrästä saadaan tarkat tiedot. Yhdistetyillä menetelmillä on voitu valmistaa tunnettu nukleotidisekvenssi, jonka puhtausaste on yli 99 %.The method described above can be modified and combined with appropriate labeling methods to provide accurate information on the purity and amount of sequences isolated. Combined methods have made it possible to prepare a known nucleotide sequence with a purity of more than 99%.
Kuvatulla menetelmällä eristetty ja puhdistettu cDNA voidaan rekombinoida sopivan siirtovektorin kanssa ja siirtää sopivaan isän-tämikro-organismiin.The cDNA isolated and purified by the method described can be recombined with a suitable transfer vector and transferred to a suitable host microorganism.
Tämän keksinnön mukaisessa menetelmässä käytetään lähtöaineena polyadenyloitua, epäpuhdasta tai osittain puhdistettua lähetti-RNA:ta, jonka sekvenssisisältö ja molekyylikoko voivat olla heterogeeniset. On tärkeätä, että valitaan menetelmän lähtöaineeksi sopiva haluttua mRNAita sisältävä kudos. Valinta tapahtuu usein sen seikan perusteella, että vain erilaistuneen organismin tietyt erikoistuneet kudokset tuottavat mielenkiinnon kohteena olevaa proteiinia. Näin on laita esimerkiksi sellaisten peptidihormonien kuin kasvuhormonin ja ihmisen sikiön suonikalvon somatomammotropiinin kohdalla. Muissa tapauksissa taas voidaan todeta, että monet solu-tyypit tai mikrobilajit voivat toimia halutun raRNArn lähteinä.The method of this invention uses polyadenylated, impure or partially purified messenger RNA as a starting material, which may have heterogeneous sequence content and molecular size. It is important to select a suitable tissue containing the desired mRNAs as the starting material for the method. The choice is often made on the basis that only certain specialized tissues of the differentiated organism produce the protein of interest. This is the case, for example, with peptide hormones such as growth hormone and human fetal choroidal somatomammotropin. In other cases, it can be noted that many cell types or microbial species can serve as sources of the desired raRNA.
Kun RNA on erotettu solusta, voidaan halutut mRNA-sekvens-sit rikastaa käyttämällä esipuhdistuksessa tavanomaisia RNA:n frak-tiointimenetelmiä. Kaikki sellaiset menetelmät ovat käyttökelpoisia, joissa RNA ei hajoa. Erittäin sopivia menetelmiä ovat preparatiivi-nen sedimentointi sakkaroosigradientissa ja geelielektroforeesi.Once the RNA has been separated from the cell, the desired mRNA sequences can be enriched using conventional RNA fractionation techniques for pre-purification. All methods in which RNA is not degraded are useful. Highly suitable methods include preparative sedimentation in a sucrose gradient and gel electrophoresis.
mRNA tulee eristää lähdesoluista sellaisissa olosuhteissa, joissa se ei hajoa. Varsinkin ribonukleaasientsyymien toiminta pitää estää, sillä nämä hajottavat RNA:n nukleotidisekvenssiä hydro- 12 64187 lyyttisesti. Jos yksi sidos hydrolysoituu, kyseinen sekvenssi rikkoutuu ja se fragmentti menetetään, joka sisältää sekvenssin alkuperäisen 5'-pään. FI-patenttihakemuksessa n:o 781675 selostetaan sopivaa menetelmää, jolla ribonukleaasi saadaan inhiboiduksi uuton aikana. Menetelmässä käytetään 4-molaarista guanidiumtiosyanaattia ja 1-molaarista merkaptoetanolia solujenrikkomisvaiheessa. Eristettävän RNA:n hajoamista ribonukleaasin vaikutuksesta voidaan vielä vähentää, jos käytetään matalaa lämpötilaa ja pH:ta, joka on lähellä arvoa 5.mRNA should be isolated from source cells under conditions where it does not degrade. In particular, ribonuclease enzymes must be inhibited because they hydrolytically degrade the nucleotide sequence of RNA. If one bond is hydrolyzed, that sequence is broken and the fragment containing the original 5 'end of the sequence is lost. FI patent application No. 781675 describes a suitable method for inhibiting ribonuclease during extraction. The method uses 4-molar guanidinium thiocyanate and 1-molar mercaptoethanol in the cell disruption step. Degradation of the RNA to be isolated by ribonuclease can be further reduced by using a low temperature and a pH close to 5.
Ennen kuin keksinnön mukaista menetelmää voidaan soveltaa, mRNA täytyy saada puhdistetuksi epäpuhtausproteiineista, DNA:sta, polysakkarideista ja lipideistä. Tähän puhdistukseen käytetään ennestään tunnettuja menetelmiä. Näin saatu RNA sisältää sekä mRNA:ta että muuta RNA:ta.Before the method of the invention can be applied, the mRNA must be purified from impurity proteins, DNA, polysaccharides and lipids. Prior art methods are used for this purification. The RNA thus obtained contains both mRNA and other RNA.
Edullinen eukaryoottisen mRNA:n eristysmenetelmä on pylväs-kromatografia oligo-dT-selluloosan avulla tai jonkun muun oligonuk-leotidisubstituoidun täytemateriaalin avulla, sillä tällöin voidaan käyttää hyväksi vetysidosspesifisyyttä, joka aiheutuu eukaryoottisen mRNA:n 3'-päässä olevasta polyadenyylihaposta.The preferred method for isolating eukaryotic mRNA is column chromatography with oligo-dT cellulose or some other oligonucleotide-substituted filler, as this can take advantage of the hydrogen bond specificity due to the polyad at the 3 'end of the eukaryotic mRNA.
Tämän jälkeen muodostetaan DNA, joka on komplementaarinen eristetyille heterogeenisille mRNA-sekvensseille. Tähän reaktioon valitaan entsyymiksi käänteistransskriptaasi, vaikka periaatteessa voidaan käyttää mitä tahansa sellaista entsyymiä, joka pystyy muodostamaan komplementaarisen DNA-kopion mRNA-templaatille. Reaktio voidaan suorittaa ennestään tunnetuissa olosuhteissa käyttämällä mRNA:ta templaattina ja neljän deoksinukleosiditrifosfaatin seosta (dATP, dGTP, dCTP ja dTTP) DNA-säikeen prekursoreina. On edullista, jos yksi deoksinukleosiditrifosfaatti on merkitty radioisotoopilla, 32 esimerkiksi Λ- P:llä, sillä sen avulla voidaan seurata reaktion kulkua, se toimii merkkinä, kun tuote otetaan talteen esimerkiksi kromatografisen tai elektroforeettisen erotuksen jälkeen ja sen avulla voidaan tehdä kvantitatiivisia arvioita talteenotosta, ks. Efstra-tiadis, A. et. ai., edellä.DNA is then generated that is complementary to the isolated heterogeneous mRNA sequences. Reverse transcriptase is selected as the enzyme for this reaction, although in principle any enzyme capable of making a complementary copy of DNA for an mRNA template can be used. The reaction can be performed under known conditions using mRNA as a template and a mixture of four deoxynucleoside triphosphates (dATP, dGTP, dCTP and dTTP) as DNA strand precursors. It is preferred that one deoxynucleoside triphosphate is labeled with a radioisotope, 32 for example Λ-P, as it can monitor the progress of the reaction, act as a marker when the product is recovered after, for example, chromatographic or electrophoretic separation and allow quantitative estimates of recovery, cf. . Efstra-tiadis, A. et. ai., supra.
Käänteistransskriptaasin avulla valmistetut cDNA-transskrip-tit ovat hieman heterogeenisia mitä tulee 5'-päähän ja 3'-päähän, sillä alku- ja päätepiste mRNA-templaatin suhteen saattaa vaihdella.CDNA transcripts prepared by reverse transcriptase are slightly heterogeneous at the 5 'end and 3' end, as the start and end points for the mRNA template may vary.
5'-pään vaihtelevuuden ajatellaan johtuvan siitä, että synteesin käynnistämisessä käytetty oligo-dT-primeri kykenee kiinnittymään 641 87 13 useihin eri kohtiin mRNA:n polyadenyloidulla alueella. cDNArn synteesi alkaa määrittelemättömästä kohdasta poly-A-alueelta, ja vaih-televa matka poly-A-aluetta transskriptoidaan riippuen oligo-dT-primerin alkuperäisestä liittymiskohdasta. Tältä epämääräisyydeltä voidaan välttyä käyttämällä primeriä, joka sisältää yhden tai kaksi itse RNA-sekvenssin nukleotidia, sillä näin muodostuu primeri, jolla on edullinen ja määritelty liittymiskohta transskriptioreaktion käynnistämisessä.The variability at the 5 'end is thought to be due to the ability of the oligo-dT primer used to initiate the synthesis to bind 641 87 13 at several different sites in the polyadenylated region of the mRNA. cDNA synthesis begins at an unspecified site in the poly-A region, and a variable distance from the poly-A region is transcribed depending on the original junction of the oligo-dT primer. This ambiguity can be avoided by using a primer containing one or two nucleotides of the RNA sequence itself, as this will form a primer with a preferred and defined junction for initiating the transcription reaction.
cDNA-transskriptin 3'-pään epämääräisyys johtuu useista kään-teistransskriptaasin reaktioon vaikuttavista tekijöistä ja RNA-temp-laatin mahdollisesta osittaisesta hajoamisesta. Pituudeltaan maksimaalisten spesifisten cDNA-transskriptien eristämistä voidaan helpottaa suuresti, jos käänteistransskriptaasin reaktio-olosuhteet valitaan siten, että tasapaino asettuu täyspitkien ketjujen synteesin puolelle lyhyiden DNA-ketjujen syntetisoitumisen jäädessä vähemmälle. Linnun myeloblastosis-viruksen käänteistransskriptaasin edulliset reaktio-olosuhteet on esitetty esimerkkien yhteydessä. Reaktio-lämpötila, suolakonsentraatio, entsyymimäärä, primerin ja teraplaa-tin konsentraatioiden suhde ja reaktioaika ovat parametreja, joita muuttamalla voidaan vaikuttaa siihen, että syntyy mahdollisimman paljon samanlaisia DNA-transskripteja.The ambiguity of the 3 'end of the cDNA transcript is due to several factors influencing the reverse transcriptase reaction and the possible partial degradation of the RNA template. Isolation of cDNA transcripts of maximum length can be greatly facilitated if the reverse transcriptase reaction conditions are chosen so that the equilibrium is on the side of synthesis of full-length strands with less synthesis of short strands of DNA. Preferred reaction conditions for avian myeloblastosis virus reverse transcriptase are set forth in the Examples. Reaction temperature, salt concentration, amount of enzyme, ratio of primer to therapist concentrations, and reaction time are parameters that can be altered to effect the generation of as many similar DNA transcripts as possible.
Lämpötila ja suolakonsentraatio valitaan siten, että oligo-dT-primerin ja RNA-templaatin polyadenyloidun osan välinen spesifinen emäsparimuodostus saadaan tapahtumaan. Oikein valituissa olosuhteissa primeri kykenee sitoutumaan RNA-templaatin polyadenyloi-tuun osaan ja vältytään oleellisesti sellaisilta ei-spesifisiltä käyntiinpanoreaktioilta, jotka johtuvat primerin sitoutumisesta muihin templaatin kohtiin, kuten lyhyihin A-pitoisiin sekvensseihin. Lämpötilan ja suolan vaikutukset ovat riippuvaisia toisistaan. Korkeat lämpötilat ja pienet suolakonsentraatiot vähentävät spesifisen emäsparivuorovaikutuksen pysyvyyttä. Reaktioaika pidetään mahdollisimman lyhyenä, jotta vältyttäisiin ei-spesifisiltä käynnistymisiltä ja hajoaminen jäisi mahdollisimman vähäiseksi. Reaktioaika ja lämpötila ovat toisistaan riippuvaisia siten, että matala lämpötila vaatii pitemmän reaktioajan. 42°C:ssa on 1 - 10 minuutin välillä oleva reaktioaika sopiva. Primeriä pitäisi olla läsnä 50 - 500-kertai-nen molaarinen ylimäärä RNA-templaattiin verrattuna ja entsyymiä pitäisi olla samansuuruinen ylimäärä RNA-templaattiin verrattuna. Entsyymi- 14 64187 ja primeriylimäärä edesauttavat reaktion käynnistymistä ja cDNA-ketjun kasvua siten, että lyhyen reaktioajan kuluessa muodostuu tehokkaasti pitkäketjuisia cDNA-transskripteja.The temperature and salt concentration are selected so that specific base pair formation between the oligo-dT primer and the polyadenylated portion of the RNA template occurs. Under properly selected conditions, the primer is capable of binding to the polyadenylated portion of the RNA template and substantially avoiding non-specific priming reactions due to binding of the primer to other sites in the template, such as short A-containing sequences. The effects of temperature and salt are interdependent. High temperatures and low salt concentrations reduce the persistence of the specific base pair interaction. The reaction time is kept as short as possible to avoid non-specific starts and to minimize decomposition. The reaction time and temperature are interdependent, so that a low temperature requires a longer reaction time. At 42 ° C, a reaction time of 1 to 10 minutes is suitable. The primer should be present in a 50- to 500-fold molar excess over the RNA template and the enzyme should be present in the same excess over the RNA template. Enzyme 14 64187 and an excess of primer promote the initiation of the reaction and the growth of the cDNA strand so that long-chain cDNA transcripts are efficiently formed within a short reaction time.
Usein on mahdollista suorittaa tämän keksinnön mukaisen puhdistusmenetelmän loppuosa käyttämällä mRNA:sta transskriptoitu-ja yksisäikeisiä cDNA-sekvenssejä. Siinä tapauksessa, että haluttu restriktioentsyymi katkaisee vain kaksisäikeistä DNA:ta, voidaan kaksisäikeinen DNA syntetisoida käyttämällä templaattina edellä kuvatulla tavalla valmistettua cDNA:ta ja entsyymeinä DNA-polymeraa-sia, kuten käänteistransskriptaasia, ja yksisäikeistä DNA:ta hydrolysoivaa nukleaasia. Kaksisäikeisen DNA:n valmistusta tällä tavalla on selostettu kirjallisuudessa, ks. esim. Ullrich, A., Shine, J., Chirwin, J., Pictet, R., Tischer, E., Rutter, W.J. ja Godman, H.H., Science 196, 131 3 (1977) .It is often possible to perform the remainder of the purification method of this invention using mDNA transcribed and single-stranded cDNA sequences. In the event that the desired restriction enzyme cleaves only double-stranded DNA, double-stranded DNA can be synthesized using cDNA prepared as described above as a template and DNA polymerase such as reverse transcriptase and single-stranded DNA hydrolyzing nuclease as enzymes. The preparation of double-stranded DNA in this way has been described in the literature, cf. e.g., Ullrich, A., Shine, J., Chirwin, J., Pictet, R., Tischer, E., Rutter, W.J. and Godman, H.H., Science 196, 131 3 (1977).
Heterogeenisistä mRNA-sekvensseistä transskriptoitu heterogeeninen cDNA käsitellään sen jälkeen yhdellä tai kahdella restrik-tioendonukleaasilla. Endonukleaasin valinta riippuu ensi sijassa siitä, mitä entsyymin restriktiokohtia eristettävä cDNA-sekvenssi sisältää. Menetelmä riippuu kahden tällaisen kohdan olemassaolosta.Heterogeneous cDNA transcribed from heterogeneous mRNA sequences is then treated with one or two restriction endonucleases. The choice of endonuclease depends primarily on which restriction sites of the enzyme are contained in the cDNA sequence to be isolated. The method depends on the existence of two such points.
Yksi entsyymi riittää, jos kohdat ovat identtisiä. Haluttu sekvenssi katkaistaan kummastakin kohdasta ja muodostuu pituudeltaan homogeeninen molekyyli- eli fragmenttipopulaatio, jolla on haluttu sekvenssi ja homogeeninen pituus, ainakin halutun cDNA-sekvenssin kohdassa. Jos restriktiokohdat poikkeavat toisistaan, tarvitaan haluttujen, pituudeltaan homogeenisten fragmenttien valmistamiseen kaksi entsyymiä.One enzyme is sufficient if the sites are identical. The desired sequence is cleaved at both sites and a population of molecules or fragments of homogeneous length with the desired sequence and homogeneous length is formed, at least at the site of the desired cDNA sequence. If the restriction sites differ, two enzymes are required to produce the desired homogeneous fragments.
Koko haluttua proteiinia tai vain osaa siitä koodaavan nuk-leotidisekvenssifragmentin valmistukseen tarvittava restriktioentsyymi (tai restriktioentsyymit) pitää valita kokeellisesti. Jos halutun proteiinin aminihapposekvenssi tunnetaan, on mahdollista verrata keskenään restriktioendonukleaasin katkaisemien, pituudeltaan homogeenisten nukleotidifragmenttien nukleotidisekvenssiä ja sen koodaamaa aminohapposekvenssiä, sillä tunnettu geneettinen koodi on yhteinen kaikille elämänmuodoille. Halutun proteiinin täydellinen aminohapposekvenssi ei ole tarpeen, sillä osittaisen sekvenssin perusteella voidaan tehdä verrattain tarkka identifiointi. Jos halutun proteiinin aminohapposekvenssiä ei tunneta, restriktioendonukleaasin avulla valmistettuja pituudeltaan homogeenisia polynukleo- 64187 15 tideja voidaan käyttää näytteinä, joiden avulla voidaan syntetisoida proteiini sopivalla in vitro-menetelmällä ja identifioida se. Vaihtoehtoisesti voidaan mRNA puhdistaa affiniteettikromatografises-ti. Alaan perehtyneiden tiedossa saattaa olla muita tähän tarkoitukseen sopivia menetelmiä.The restriction enzyme (or enzymes) required to produce all or part of the nucleotide sequence fragment encoding the desired protein must be selected experimentally. If the amino acid sequence of the desired protein is known, it is possible to compare the nucleotide sequence of restriction endonuclease-cut nucleotide fragments of homogeneous length with the amino acid sequence encoded by it, since the known genetic code is common to all life forms. The complete amino acid sequence of the desired protein is not necessary, as a relatively accurate identification can be made based on the partial sequence. If the amino acid sequence of the desired protein is not known, homogenous polynucleotides of restriction endonuclease can be used as samples to synthesize and identify the protein by a suitable in vitro method. Alternatively, the mRNA can be purified by affinity chromatography. Other methods suitable for this purpose may be known to those skilled in the art.
Käyttökelpoisten restriktioentsyymien lukumäärä riippuu siitä, käytetäänkö yksisäikeistä vai kaksisäikeistä cDNArta. Edullisia entsyymejä ovat ne, joiden vaikutus kohdistuu siihen yksisäikeiseen DNA:han, joka on mRNArn käänteisen transskription välitön reaktio-tuote. Tällä hetkellä tunnetaan vain eräitä sellaisia restriktio-endonukleaaseja, joiden vaikutus kohdistuu yksisäikeiseen DNA:han, esimerkiksi Hae III ja Hha I.The number of restriction enzymes useful depends on whether single-stranded or double-stranded cDNA is used. Preferred enzymes are those that act on the single-stranded DNA, which is the direct reaction product of mRNA reverse transcription. Currently, only a few restriction endonucleases are known to act on single-stranded DNA, such as Hae III and Hha I.
Restriktioendonukleaasikäsittelyä varten valmistettava cDNACDNA for restriction endonuclease treatment
voidaan merkitä radioaktiivisesti niin, että se voidaan tunnistaa myöhempien erotusvaiheiden jälkeen. On edullista sisällyttää radio- 32 aktiivinen merkki, kuten O- P, yhteen neljästä deoksinukleosidi-trifosfaattiprekursorista. Suurin aktiivisuus saadaan, jos radioaktiivisen prekursorin väkevyys on suuri ei-radioaktiivisen osan väkevyyteen verrattuna. Jokaisen deoksinukleosiditrifosfaatin kokonais-väkevyyden pitäisi kuitenkin olla yli 30 μ mol/1, jotta käänteis-transskriptaasin katalysoimassa reaktiossa saavutettaisiin mahdollisimman pitkä cDNA, ks. Efstratiadis, A., Maniatis, T., Kafatos, F.C.,can be radiolabeled so that it can be identified after subsequent separation steps. It is preferred to include a radioactive label, such as O-P, in one of the four deoxynucleoside triphosphate precursors. The highest activity is obtained if the concentration of the radioactive precursor is high compared to the concentration of the non-radioactive part. However, the total concentration of each deoxynucleoside triphosphate should be greater than 30 μ mol / l in order to achieve the longest possible cDNA in the reverse transcriptase catalyzed reaction, cf. Efstratiadis, A., Maniatis, T., Kafatos, F.C.,
Jeffrey, A. ja Vournakis, J. N., Cell 4, 367 (1975). cDNA:n nukleo- 32 tidisekvenssin määritystä varten on 5'-päät hyvä merkitä P:llä käyttämällä hyväksi polynukleotidikinaasin katalysoimaa reaktiota, ks. Maxam, A.M. ja Gilbert, W., Proc. Natl. Acad, Sei. U.S.A. 74, 560 (1977).Jeffrey, A. and Vournakis, J. N., Cell 4, 367 (1975). For nucleotide sequencing of the cDNA, it is a good idea to label the 5 'ends with P using a polynucleotide kinase catalyzed reaction, cf. Maxam, A.M. and Gilbert, W., Proc. Natl. Acad, Sci. U.S. 74, 560 (1977).
Fragmentit, jotka ovat syntyneet restriktioentsyymin vaikutuksesta tai kahden restriktioentsyymin yhdistelmän vaikutuksesta, voidaan erottaa toisistaan ja heterodispersseistä sekvensseistä, joissa ei ole tunnistamiskohtaa, niiden pituuden perusteella. Tämä voidaan tehdä elektroforeettisilla menetelmillä ja sedimentointi-menetelmillä ultrasentrifugia käyttäen. Geelielektroforeesi on asetettava etusijalle, sillä sen avulla saavutetaan paras resoluutio polynukleotidin pituuden perusteella. Lisäksi menetelmällä on helppo saada erotetut aineet talteen kvantitatiivisesti. Edullisia geeli-elektroforeesimenetelmiä on selostettu seuraavissa julkaisuissa: Dingman, C.W. ja Peacock, A.C., Biochemistry 7, 659 (1968) ja Maniatis, T., Jeffrey, A., ja van de Sande, H. Biochemistry 14, 3787 (1975) .Fragments generated by a restriction enzyme or a combination of two restriction enzymes can be distinguished from each other and from heterodisperse sequences without a recognition site by their length. This can be done by electrophoretic methods and sedimentation methods using an ultracentrifuge. Gel electrophoresis must be given priority as it provides the best resolution based on the length of the polynucleotide. In addition, the method makes it easy to recover the separated substances quantitatively. Preferred gel electrophoresis methods are described in Dingman, C.W. and Peacock, A.C., Biochemistry 7, 659 (1968) and Maniatis, T., Jeffrey, A., and van de Sande, H. Biochemistry 14, 3787 (1975).
1616
6418 V6418 V
Ennen restriktioendonukleaasikäsittelyä ovat useimmista lähteistä saadut cDNA-transskriptit pituudeltaan heterodisperssejä. Kun sopivasti valitun restriktioendonukleaasin tai restriktioendonukle-aasiparin annetaan vaikuttaa polynukleotidiketjuihin, jotka sisältävät halutun sekvenssin, ketju katkeaa vastaavista restriktiokohdis-ta, ja saadaan yhtä pitkiä polynukleot idifragnentte ja. Geelielektrofo-reesissa nämä havaitaan selvästi erottuvina viivoina. Restriktiokoh-tien läsnäolosta tai puuttumisesta riippuen voidaan myös muista sekvensseistä saada erillisiä viivoja, joiden sisältämien sekvenssien pituudet kuitenkin todennäköisesti poikkeavat halutun sekvenssin pituudesta. Näin ollen restriktioendonukleaasin vaikutuksen seurauksena saadaan geelielek.troforees issa esiin yksi tai useampia erill» s iä viivoja ja loput cDMA:sta jää heterodisperssiksi. Kun suurin osa läsnäolevista polynukleotid.isekvensseistä on haluttua cDNA:ta, saadaan elektroforeesin tuloksena yksi ainoa cDNA-viiva.Prior to restriction endonuclease treatment, cDNA transcripts from most sources are heterodisperse in length. When an appropriately selected restriction endonuclease or restriction endonuclease pair is allowed to act on polynucleotide chains containing the desired sequence, the chain is cleaved at the corresponding restriction sites to give polynucleotide idifragments of equal length. In gel electrophoresis, these are observed as distinct lines. Depending on the presence or absence of restriction sites, separate lines may also be obtained from other sequences, however, the lengths of the sequences contained in them are likely to differ from the length of the desired sequence. Thus, the effect of restriction endonuclease results in gel electrophoresis showing one or more distinct lines and leaving the remainder of the cDMA heterodisperse. When most of the polynucleotide sequences present are the desired cDNA, electrophoresis results in a single cDNA line.
Vaikka onkin epätodennäköistä, että restriktioentsyymit katkaisevat kaksi erilaista sekvenssiä siten, että syntyy käytännöllisesti katsoen samanpituisia fragmentteja, on kuitenkin toivottavaa, että tietynpituisten fragmenttien puhtaus voidaan jollakin menetelmällä varmistaa. Elektroforeesiviivan sekvenssianalyysillä voidaan ilmaista epäpuhtaudet, joita on 10 % tai sitä enemmän kaistan materiaalissa. Niinpä on kehitetty menetelmä, jolla voidaan ilmaista e-dellä mainittua pienemmätkin epäpuhtaudet, ja menetelmä perustuu samoihin seikkoihin, kuin edellä kuvattu erotusmenetelmä. Menetelmä edellyttää sitä, että haluttu nukleotidisekvenssifragmentti sisältää sellaisen restriktioendonukleaasin restriktiokohdan, jota ei ole käytetty ensimmäisessä erotuksessa. Kun elektroforeesiviivasta eluoi-tu polynukleotidimateriaali käsitellään sellaisella restriktioendo-nukleaasilla, joka pystyy katkaisemaan halutun sekvenssin sisäisesti, saadaan kaksi alafragmenttia, jotka hyvin todennäköisesti ovat eripituisia. Elektroforeesissa nämä alafragmentit muodostavat pituuttaan vastaaviin kohtiin kaksi erillistä viivaa, joiden sisältämien fragmenttien pituuksien summa on yhtä suuri kuin polynukleotidin pituus ennen katkaisua. Alkuperäisen viivan sisältämien epäpuhtauksien, joihin restriktioentsyymi ei vaikuta, voidaan osoittaa kulkeutuvan alkuperäiseen kohtaan. Epäpuhtaudet, joissa on yksi tai useampia res-triktiokohtia, hajoavat kahdeksi tai useammaksi alafraqmcntiksi. Koska restriktiokohtien sijaintia pidetään satunnaisena, on hyvin epätodennäköistä, että epäpuhtauksista syntyy samankokoisia alafragmentte-ja kuin halutusta sekvenssistä. Minkä tahansa viivan sisältämä radio- 64187 17 aktiivisesti merkityn polynukleotidin määrä voidaan mitata kvantitatiivisesti radioaktiivisuusmittauksella tai millä tahansa muulla sopivalla menetelmällä. Halutun sekvenssin fragmenttien kvantitatiivinen mitta saadaan vertaamalla halutun sekvenssin alafragment-tien kaistojen ainemääriä kokonaisainemäärään.Although it is unlikely that restriction enzymes will cleave two different sequences to produce fragments of substantially the same length, it is desirable that the purity of fragments of a certain length be ensured by some method. Sequence analysis of the electrophoresis line can detect impurities of 10% or more in the band material. Thus, a method has been developed which can express impurities even smaller than mentioned by e, and the method is based on the same factors as the separation method described above. The method requires that the desired nucleotide sequence fragment contain a restriction endonuclease restriction site that has not been used in the first separation. When the polynucleotide material eluted from the electrophoresis line is treated with a restriction endonuclease capable of cleaving the desired sequence internally, two subfragments are obtained which are very likely to be of different lengths. In electrophoresis, these subfragments form two distinct lines at their respective positions, the sum of the lengths of the fragments contained being equal to the length of the polynucleotide before cleavage. Impurities in the original line that are not affected by the restriction enzyme can be shown to migrate to the original site. Impurities with one or more restriction sites degrade into two or more subfractions. Since the location of the restriction sites is considered random, it is very unlikely that the impurities will result in subfragments of the same size as the desired sequence. The amount of radiolabeled polynucleotide contained in any line can be quantified by radioactivity measurement or any other suitable method. A quantitative measure of fragments of a desired sequence is obtained by comparing the amounts of material in the bands of the sub-fragment pathways of the desired sequence to the total amount of material.
Edellä selostetun erotuksen jälkeen haluttu sekvenssi voidaan rekonstruoida. Tähän tarkoitukseen sopii DNA-ligaasi, joka katalysoi DNA-fragmenttien päiden liittymisen toisiinsa. Halutun sekvenssin alafragmentit voidaan eluoida erikseen geelielektroforeesi-viivoista ja yhdistää sopivissa olosuhteissa DNA-ligaasin läsnäollessa, ks. Sgaramella, A. Van de Sande, J.H. ja Khorana, H.G., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 67, 1468 (1970). Jos yhdistettävät sekvenssit eivät ole tylppäpäisiä, voidaan käyttää E. colin ligaasia, ks. Modrich, P. ja Lehman, I.R., J. Biol. Chem. 245, 3626 (1970).After the separation described above, the desired sequence can be reconstructed. A DNA ligase that catalyzes the annealing of the ends of DNA fragments is suitable for this purpose. Subfragments of the desired sequence can be eluted separately from the gel electrophoresis lines and pooled under appropriate conditions in the presence of DNA ligase, cf. Sgaramella, A. Van de Sande, J.H. and Khorana, H.G., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S. 67, 1468 (1970). If the sequences to be joined are not blunt-ended, E. coli ligase can be used, cf. Modrich, P. and Lehman, I.R., J. Biol. Chem. 245, 3626 (1970).
Alkuperäisen sekvenssin rekonstruointi lähtien restriktio-endonukleaasikäsittelyssä syntyneistä alafragmenteista paranee huomattavasti, jos väärien sekvenssien muodostuminen saadaan estetyksi. Haitalliselta lopputulokselta vältytään, jos halutun sekvenssin sisältävä, pituudeltaan homogeeninen cDNA-fragmentti käsitellään ennen restriktioendonukleaasikäsittelyä sellaisella reagenssilla, joka pystyy poistamaan 5'-päätefosfaattiryhmät cDNA:sta. Alkalinen fosfataasi on edullinen entsyymi tähän tarkoitukseen. DNA-ligaasi pystyy katalysoimaan katkenneiden fragmenttien liittymisen toisiinsa vain siinä tapauksessa, että 5'-päätefosfaattiryhmä on läsnä.Reconstruction of the original sequence from the subfragments generated by restriction endonuclease treatment is greatly improved if the formation of false sequences is prevented. A detrimental outcome is avoided if a homogeneous length cDNA fragment containing the desired sequence is treated prior to restriction endonuclease treatment with a reagent capable of removing 5 'terminal phosphate groups from the cDNA. Alkaline phosphatase is a preferred enzyme for this purpose. DNA ligase is only able to catalyze the association of truncated fragments with each other if a 5 'terminal phosphate group is present.
Näin ollen sellaisia päitä ei voida yhdistää, joissa ei ole 5'-pää-tefosfaattia. DNA-alafragmentit voidaan liittää vain sellaisiin päihin, jotka sisältävät 5'-fosfaatin, joka on syntynyt restriktioendo-nukleaasin katkaistessa erotettuja DNA-fragmentteja. Tätä menetelmää on selostettu yksityiskohtaisesti FI-patenttihakemuksessa n:o 781675.Thus, ends without a 5 'end-phosphate cannot be joined. DNA subfragments can only be ligated to ends that contain 5 'phosphate generated by cleavage of separated DNA fragments by restriction endonuclease. This method is described in detail in FI patent application No. 781675.
Käytetyissä olosuhteissa on suurin osa cDNA-transskripteis-tä johdettu siitä mRNA-alueesta, joka sisältää mRNA-templaatin 5'-pään käyttämällä tässä templaatissa primerinä fragmenttia, joka on saatu restriktioendonukleaasin katalysoimassa katkaisussa. Tällä tavalla voidaan edellä kuvatulla menetelmällä saada sekä sellaisia fragmentteja, jotka sisältävät vain osan halutun proteiinin koodaa-vasta nukleotidisekvenssistä, että koko nukleotidisekvenssi.Under the conditions used, most of the cDNA transcripts are derived from the mRNA region containing the 5 'end of the mRNA template, using as a primer in this template the fragment obtained by restriction endonuclease-catalyzed cleavage. In this way, both fragments containing only a portion of the nucleotide sequence encoding the desired protein and the entire nucleotide sequence can be obtained by the method described above.
18 6418718 64187
Ihmisen geenien kloonauksessa on puhdistusmenetelmä erittäin tärkeä, sillä vallitsevien määräysten mukaan ihmisen geeni tulee ennen rekombinointia DNA:n kanssa ja sen siirtämistä bakteeriin puhdistaa erittäin huolellisesti, ks. USA:n "Federal Register", Voi. 41, n:o 131, 1967-07-07, ss. 27902 - 27943. Tämän keksinnön mukaisella menetelmällä on onnistuttu tuottamaan riittävän puhtaita ihmisen geenejä, jotka sisältävät pääosan ihmisen sikiön suonikalvon somatomammotropiinia tai ihmisen kasvuhormonia koodaavasta rakenteesta. Edellä kuvatulla menetelmällä eristetty ja puhdistettu ihmisen geneettinen materiaali voidaan rekombinoida plasmideihin tai muihin siirtovektoreihin.In the cloning of human genes, the purification method is very important, as the prevailing regulations state that the human gene must be purified very carefully before recombination with DNA and its transfer into the bacterium, cf. U.S. Federal Register, Vol. 41, No. 131, 7 July 1967, p. 27902-27943. The method of this invention has succeeded in producing sufficiently pure human genes that contain a major portion of the structure encoding human fetal choroidal somatomammotropin or human growth hormone. Human genetic material isolated and purified by the method described above can be recombined into plasmids or other transfer vectors.
Edellä kuvatuilla puhdistus- ja analyysimenetelmillä on voitu eristää suurin osa ihmisen sikiön suonikalvon somatomammotropii-nin rakennegeenin nukleotidisekvenssistä, jolloin puhtausaste on ollut yli 99 %. Ihmisen kasvuhormonin rakennegeeni on eristetty verrattain puhtaana. On syntetisoitu uusia plasmideja, jotka sisältävät ihmisen sikiön suonikalvon somatomammotropiinin tai ihmisen kasvuhormonin eristetyn sekvenssin. On valmistettu uusia mikro-organismeja, joiden geneettisen rakenteen osana on ihmisen sikiön suoni-kalvon somatomammotropiinin tai ihmisen kasvuhormonin eristetty sekvenssi .The purification and analysis methods described above have been able to isolate most of the nucleotide sequence of the human fetal choroidal somatomammotropin structural gene with a purity of greater than 99%. The structural gene for human growth hormone has been isolated relatively pure. Novel plasmids have been synthesized that contain the isolated sequence of human fetal choroidal somatomammotropin or human growth hormone. Novel microorganisms have been prepared whose genetic structure includes an isolated sequence of human fetal vascular membrane somatomammotropin or human growth hormone.
Liitteenä olevilla kuvilla ja piirroksilla halutaan valaista tämän keksinnön sisältämiä esimerkkejä.The accompanying drawings and drawings are intended to illustrate the examples contained in this invention.
Kuvio 1 esittää autoradiogrämmiä geelielektroforeesisarjasta, 32 joka on suoritettu P:llä merkitylle cDNA:lle, ja jota selostetaan yksityiskohtaisesti esimerkissä 1.Figure 1 shows an autoradiogram of a series of gel electrophoresis 32 performed on P-labeled cDNA, described in detail in Example 1.
Kuvio 2 on kaavioesitys ihmisen sikiön suonikalvon somatomammotropiinin nukleotidisekvenssikoodista ja siinä näkyvät eri restriktiokohtien suhteelliset sijainnit, kuten esimerkissä 1 selostetaan yksityiskohtaisesti.Figure 2 is a schematic representation of the nucleotide sequence code of human fetal choroidal somatomammotropin and shows the relative locations of the various restriction sites, as described in detail in Example 1.
3232
Kuvio 3 on autoradiogrammi P:llä merkityllä cDNA:lla tehdyistä geelielektroforeeseista (ks. esimerkki 2).Figure 3 is an autoradiogram of gel electrophoresis performed with P-labeled cDNA (see Example 2).
3232
Kuviot 4 ja 5 ovat autoradiogrammeja P:llä merkityllä cDNA:lla tehdyistä geelielektroforeeseista (ks. esimerkki 3).Figures 4 and 5 are autoradiograms of gel electrophoresis performed with P-labeled cDNA (see Example 3).
Esimerkki 1 Tässä kuvataan tietyn cDNA-sekvenssin yleistä erotusmenetelmää ottamalla esimerkiksi ihmisen sikiön suonikalvon somatomammotropiinia koodaavan alueen sekvenssiosan erottaminen Istukkakudosuut-teestä.Example 1 A general method of separating a particular cDNA sequence is described herein, for example, by separating the sequence portion of the somatomammotropin coding region of the human fetal choroid from a placental tissue extract.
19 641 87 mRNA:n uuttaminen istukoista.Extraction of 19,641 87 mRNA from placenta.
Keisarinleikkauksessa saadut ihmisen täysiaikaiset istukat jäähdytettiin nopeasti nestemäisessä typessä ja säilytettiin -60°C:ssa. Kokonais-RNA:n uuttamiseksi 40 g jäähdytettyä istukkakudosta hienonnettiin ja ja liuotettiin 0°C:ssa 140 ml:aan vastaval-mistettua liuosta# joka sisälsi 7 mol/1 guanidium-HCl:ää (Cox, R.A., Methods in Enzymology 12, 120 (1968), 20 mmol/1 tris-HCl (pH 7,5), 1 mmol/1 EDTA ja 1 % sarkosyyliä (Ciba-Geigy Corp., Greensboro, N.C.). Tämän jälkeen kutakin ml:aa liuosta kohti lisättiin 0,5 g CsCl, ja syntynyttä tummanruskeaa liuosta kuumennettiin 5 minuuttia 65°C:ssa, jäähdytettiin nopeasti jäällä ja kerrostettiin nitrosellu-loosaputkissa (2,54 x 8,89 cm), joiden pohjalla oli 5 ml liuosta, joka sisälsi 5,7 mol/1 CsCl, 10 mmol/1 tris-HCl (pH 7,5) ja 1 mmol/1 EDTA, sentrifugoimalla 16 tuntia 15°C:ssa nopeudella 27 000 r/min SW27-roottorilla (Beckman Instruments Corp., Fullerton. California), ks. Clisin, V., Crkvenjakov, R.ja Ryus, C., Biochem 13, 2633 (1974). Sentrifugoinnin jälkeen putkien sisällöt dekantoitiin, putket kuivattiin ja alimpana puolen cm:n RNA-hiukkasia sisältävä kerros leikattiin irti partaterällä. Aine liuotettiin 20 ml:aan liuosta, jossa oli 10 mmol/1 tris-HCl (pH 7,5), 1 mmol/1 EDTA, 5 % sarkosyyliä ja 5 % fenolia steriilissä Erlenmeyer-pullossa. Tämän jälkeen liuokseen lisättiin NaCl pitoisuudeksi 0,1 mol/1 ja sen jälkeen ravisteltiin voimakkaasti 40 ml:n kanssa seosta, joka sisälsi 50 % fenolia ja 50 % kloroformia. RNA saostettiin vesifaasista etanolilla natrium-asetaatin (0,2 mol/1, pH 5,5) läsnäollessa. RNA-tuote pestiin 95-% etanolilla, kuivattiin ja liuotettiin steriiliin veteen. Tavallisesti 40 g:sta istukkakudosta saatiin noin 30 mg RNA:ta, ja tästä taas noin 300 /ag polyadenyloitua RNA:ta, kun kromatografoitiin kahdesti oligo-dT-selluloosalla (ks. Aviv ja Leder, edellä).Full-time human placenta obtained by caesarean section was rapidly cooled in liquid nitrogen and stored at -60 ° C. To extract total RNA, 40 g of chilled placental tissue was minced and dissolved at 140 ° C in 140 ml of freshly prepared solution # containing 7 M guanidinium HCl (Cox, RA, Methods in Enzymology 12, 120 (1968), 20 mM Tris-HCl (pH 7.5), 1 mM EDTA, and 1% sarcosyl (Ciba-Geigy Corp., Greensboro, NC). 5 g of CsCl, and the resulting dark brown solution was heated for 5 minutes at 65 ° C, rapidly cooled with ice and layered in nitrocellulose tubes (2.54 x 8.89 cm) based on 5 ml of a solution containing 5.7 mol / ml. 1 CsCl, 10 mmol / l Tris-HCl (pH 7.5) and 1 mmol / l EDTA, centrifuged for 16 hours at 15 ° C at 27,000 rpm on a SW27 rotor (Beckman Instruments Corp., Fullerton, CA) see after Clisin, V., Crkvenjakov, R.ja Ryus, C., Biochem, 13, 2633 (1974), centrifugation, dried tubes are decanted, tubes, and the bottom half cm.. an RNA-containing layer was cut into particles off the razor blade. The substance was dissolved in 20 ml of a solution of 10 mM Tris-HCl (pH 7.5), 1 mM EDTA, 5% sarcosyl and 5% phenol in a sterile Erlenmeyer flask. NaCl was then added to the solution to a concentration of 0.1 mol / L, and then a mixture containing 50% phenol and 50% chloroform was shaken vigorously with 40 ml. RNA was precipitated from the aqueous phase with ethanol in the presence of sodium acetate (0.2 mol / L, pH 5.5). The RNA product was washed with 95% ethanol, dried and dissolved in sterile water. Usually, about 30 mg of RNA was obtained from 40 g of placental tissue, and again about 300 mg of polyadenylated RNA when chromatographed twice with oligo-dT cellulose (see Aviv and Leder, supra).
cDNA-synteesl♦cDNA synteesl ♦
Analyyttiset reaktiot suoritettiin 5 pl:ssa liuosta, joka sisälsi 50 mraol/1 tris-HCl (pH 8,3), 0,1 mmol/1 EDTA, 7 mmol/1 MgCl2, 20 mmol/1 KC1, 10 mmol/1 /^-merkaptoetanolia, 40 iumol/1 dCTP (50 000 32 laskinyksikköä/min/pmol P), dGTP, dATP ja dTTP (500 pmol/l kutakin), 100 μg/ml polyadenyloitua RNA:ta, 20 jjg/ml oligo-dT^21g (toimittaja Collaborative Research, Waltham, Mass.), ja 100 yksikköä/ml linnun myeloblastosis-viruksen käänteistransskriptaasia. Tätä entsyymiä toimittaa D.J. Beard, Life Science Incorporated, St. Petersburg, Florida, joka valmistaa entsyymiä National Institutes of 20 641 87Analytical reactions were performed in 5 μl of a solution containing 50 mol / l Tris-HCl (pH 8.3), 0.1 mmol / l EDTA, 7 mmol / l MgCl 2, 20 mmol / l KCl, 10 mmol / l β-mercaptoethanol, 40 μmol / l dCTP (50,000 32 computing units / min / pmol P), dGTP, dATP and dTTP (500 pmol / l each), 100 μg / ml polyadenylated RNA, 20 μg / ml oligo-dT ^ 21g (supplied by Collaborative Research, Waltham, Mass.), And 100 units / ml avian myeloblastosis virus reverse transcriptase. This enzyme is supplied by D.J. Beard, Life Science Incorporated, St. Petersburg, Florida, which manufactures the enzyme National Institutes of 20,641 87
Health'in kanssa tekemällään sopimuksella seuraavalla menetelmällä: Kacian, D.L. ja Spiegelman, S., Methods in Enzymology 29, L.Health with the following method: Kacian, D.L. and Spiegelman, S., Methods in Enzymology 29, L.
Grossman ja K. Moldaye, eds. Academic Press, N.Y. (1974), s. 150.Grossman and K. Moldaye, eds., Academic Press, N.Y. (1974), p. 150.
oo
Reaktiot aloitettiin lisäämällä entsyymi 0 C:ssa ja synteesi kesti 6 minuuttia 42°C:ssa. Näissä olosuhteissa noin 106 laskinyksikköä/ 32 min P saatiin sisällytetyksi TCArlla saostuvaan materiaaliin, ja kukin pg RNA:ta antoi noin 50 ng cDNA. Jotta sekvenssianalyysiä varten olisi saatu riittävästi cDNA:ta, reaktiotilavuus nostettiin 100 pg:aan ja dCTP-väkevyys 250 pmol/l:ksi (ominaisaktiivisuus 500 32 laskinyksikköä/min/pmol P). Näissä olosuhteissa saatiin cDNArhan 32 sisällytetyksi noin 200 000 1/min P:llä merkittyä cDTPrtä. Restriktioendonukleaasikäslttely.Reactions were initiated by the addition of enzyme at 0 ° C and synthesis lasted 6 minutes at 42 ° C. Under these conditions, about 106 counter units / 32 min P were incorporated into the TCA-precipitated material, and each pg of RNA yielded about 50 ng of cDNA. In order to obtain sufficient cDNA for sequence analysis, the reaction volume was increased to 100 pg and the dCTP concentration to 250 pmol / L (specific activity 500 32 counter units / min / pmol P). Under these conditions, about 200,000 1 / min of P-labeled cDTPs were incorporated into cDNA 32. Restriktioendonukleaasikäslttely.
Restriktioendonukleaasikäsittelyä varten analyyttiset reaktiot pysäytettiin siten, että lisättiin 20 μΐ jääkylmää vettä, keitettiin 2 minuuttia, jäähdytettiin nopeasti jäällä ja lisättiin sen verran magnesiumkloridia, että pitoisuudeksi tuli 7 mmol/1. Näytteitä (5 μΐ, noin 2 x 10^ 1/min) käsiteltiin ylimäärällä restrik-tioendonukleaasia Hae III (voidaan myös käyttää Hha I tai Hae III:n ja Hha l:n seosta, ks. kuvio 1) 1 tunti 37°C:ssa. Hae III valmistettiin seuraavalla menetelmällä: Middleton, J.H., Edgell, M.H. ja Hutchinson, C. A. Ill, J. Virol. 10, 42 (1972). New England Bio-Labs, Berverly, Mass., toimitti entsyymit Hha I ja Hpa II. Viimeksimainittu toimittaa myös entsyymiä Hae III. Koetulosten perusteella käytettiin entsyymiä enemmän kuin mitä tarvitaan resktriktio-sensitiivisen DNA:n täydelliseen käsittelyyn identtisissä reaktio-olosuhteissa. Reaktiot pysäytettiin lisäämällä 5 μΐ liuosta, joka sisälsi 20 mmol/1 EDTA, 20 % sakkaroosia ja 0,05 % bromifenolisi-nistä, ja kuumentamalla 1 minuutti 100°C:ssa, ja sen jälkeen suoritettiin analyysi polyakryyliamidigeelielektroforeesilla. Tuotteet erotettiin polyakryyliamidiyhdistelmälevygeelillä (4,5 % - 10 %) tris-boraatti-EDTA-puskurissa (2,5 tuntia, 150 V) (ks. Dingman, C. W. ja Peacock, A. C., edellä) ja visualisoitiin autoradiografi-sesti kuivasta geelistä.For the restriction endonuclease treatment, the analytical reactions were stopped by adding 20 μΐ of ice-cold water, boiling for 2 minutes, rapidly cooling with ice, and adding magnesium chloride to a concentration of 7 mmol / l. Samples (5 μΐ, approximately 2 x 10 ^ 1 / min) were treated with an excess of restriction endonuclease Hae III (Hha I or a mixture of Hae III and Hha 1 can also be used, see Figure 1) for 1 hour at 37 ° C: in. Search III was prepared by the following method: Middleton, J.H., Edgell, M.H. and Hutchinson, C. A. Ill., J. Virol. 10, 42 (1972). The enzymes Hha I and Hpa II were supplied by New England Bio-Labs, Berverly, Mass. The latter also supplies the enzyme Hae III. Based on the experimental results, more enzyme was used than is required for complete processing of restriction-sensitive DNA under identical reaction conditions. Reactions were stopped by the addition of 5 μΐ of a solution containing 20 mmol / l EDTA, 20% sucrose and 0.05% bromophenolizine and heating for 1 minute at 100 ° C, followed by analysis by polyacrylamide gel electrophoresis. The products were separated on a polyacrylamide composite plate gel (4.5% to 10%) in tris-borate-EDTA buffer (2.5 hours, 150 V) (see Dingman, C. W. and Peacock, A. C., supra) and visualized autoradiographically on a dry gel.
641 87 21641 87 21
Kuviossa 1 nähdään geelielektroforeesi- ja autoradiografia-32 tulokset P:llä merkitystä cDNAista, ]oka on valmistettu edellä kuvatulla tavalla. Näytetäplät kulkeutuivat alkupisteestään elekt-roforeettisesti ensin 4,5-% akryyliamidin ja sitten 10-% akryyli-amidin läpi. Kuvan vasemmassa laidassa oleva viiva osoittaa kahden geelialueen välistä rajaa. Kaista A edustaa koko cDNA-transskrip-tin elektroforeettista liikkuvuutta. Kaista B esittää Hha I-ent-syymillä käsitellyn cDNA:n liikkuvuutta. Kaista C esittää Hae III-entsyymillä käsitellyn cDNA:n liikkuvuutta. Kaista D esittää sekä Hha I-entsyymillä, että Hae III-entsyymillä käsitellyn cDNA:n liikkumista. Kaista E esittää sen materiaalin elektroforeettista liikkumista, jonka viiva on voimakkain kaistassa C. Kaista F esittää kaistan C voimakkaimmasta viivasta eristetyn materiaalin liikkuvuutta, kun se on ensin käsitelty Hha I-entsyymillä. Kokostandar- dina käytettiin yksisäikeistä fagin M13 DNA:ta, jonka 5'-pää oli 32 merkitty P:llä, ja joka oli katkaistu Hae III-entsyymillä (Ho-riuchi, K. ja Zinder, N.D., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 72, 2555 (1975) ja sen liikkuvuus näkyy kaistassa G. Näiden DNA-fragment-tien nukleotidisekvenssien keskimääräiset pituudet on merkitty numeroilla oikealle.Figure 1 shows the results of gel electrophoresis and autoradiography of 32 P-labeled cDNAs prepared as described above. The sample spots passed electrophoretically from their starting point first through 4.5% acrylamide and then 10% acrylamide. The line on the left side of the image shows the boundary between the two gel areas. Lane A represents the electrophoretic mobility of the entire cDNA transcript. Lane B shows the mobility of cDNA treated with Hha I-ent enzyme. Lane C shows the mobility of cDNA treated with Hae III. Lane D shows the movement of cDNA treated with both Hha I and Hae III. Lane E shows the electrophoretic movement of the material with the strongest line in lane C. Lane F shows the mobility of the material isolated from the strongest line in lane C after first treatment with Hha I. Single-stranded phage M13 DNA with a 32 'P label at the 5' end and digested with Hae III (Houriuchi, K. and Zinder, ND, Proc. Natl. Acad. Sci.) Was used as the size standard. USA 72, 2555 (1975) and its mobility is shown in lane G. The average lengths of the nucleotide sequences of these DNA fragments are numbered to the right.
Kaistan A tuloksesta voidaan todeta, että täysiaikaisen istukan mRNA:n cDNA-transskripti on heterodisperssi. Käsittely entsyymillä Hha I, kaista B, tai entsyymillä Hae III, kaista C, johtaa tietynpituisten polynukleotidien kasautumiseen. Tällaisten erillisten viivojen syntyminen todistaa sitä, että heterogeenisessa cDNA-transskriptiopopulaatiossa on läsnä useampana kappaleena vähintään yhtä sekvenssiä, jossa on kaksi Hha I:n ja Hae III:n tunnistamiskohtaa. Hha I-käsittely tuottaa fragmentin, jonka pituus on noin 470 nukleotidia, ja Hae III-käsittely tuottaa fragmentin, jonka pituus on noin 550 nukleotidia. Käsittely molemmilla entsyymeillä tuottaa kolme fragmenttia, joiden pituudet ovat 90 nukleotidia (A), 460 nukleotidia (B) ja noin 10 nukleotidia (C). Pienen kokonsa vuoksi fragmentti C kulkeutuu pois geeliltä kuvan 1 olosuhteissa. 10-% ja 4,5-% geelin rajalla oleva viiva edustaa heterogeenista materiaalia, joka on liian suurikokoista siirtyäkseen 10-prosenttiseen geeliin ja joka kerääntyy sen vuoksi rajalle. Kaistan D vi ivoi.sl a päätellen näyttäisivät fragment i t Λ ja H oJcvan I ähl Γ» isin samasl.j cPNA-rnol el-.yyl i s t ä . Tämä johf-o-päätös varmistettiin e iuoimal i a geo ) Isiä suurempi Maol Π - fragment, t. i , joka liikkui kaistalla E näkyvällä tavalla, ja käsittelemällä se entsyymillä Hhal. Tämä käsittely tuotti kaksi fragmenttia, joiden liikkuvuus oli sama kuin niillä, jotka saatiin käsiteltäessä joko cDNA samanaikaisesti HaeIII:lla ja Hhalrllä, kuten voidaan havaita vertaamalla kaistoja D ja F. Koko cDNArn hajoamistuotteessa, kaista D, autoradiografinen densiteetti, joka on viivan sisältämän kokonaisra-dioaktiivisuuden mitta, on suurempi fragmentilla A kuin fragmentilla B, vaikka koon perusteella voitaisiin olettaa päinvastaista. Tämän havainnon perusteella voidaan arvioida, että fraementti A on trans-skriptoitu lähempänä mRNA:n 3'-päätä kuin fragmentti B.From the result of lane A, it can be concluded that the cDNA transcript of the full-time placental mRNA is heterodisperse. Treatment with Hha I, lane B, or Hae III, lane C, results in the accumulation of polynucleotides of a certain length. The emergence of such distinct lines proves that at least one sequence with two Hha I and Hae III recognition sites is present in multiple copies in a heterogeneous cDNA transcription population. Hha I treatment yields a fragment of about 470 nucleotides in length, and Hae III treatment yields a fragment of about 550 nucleotides in length. Treatment with both enzymes yields three fragments of 90 nucleotides (A), 460 nucleotides (B), and about 10 nucleotides (C) in length. Due to its small size, fragment C migrates away from the gel under the conditions of Figure 1. The line at the 10% and 4.5% gel boundaries represents a heterogeneous material that is too large to migrate to the 10% gel and therefore accumulates at the boundary. Judging by the band D vi ivoi.sl a, the fragment i t Λ and H oJcvan I ähl Γ »would appear at the same time as the cPNA-rnol el-. This johf-o decision was confirmed e iuoimal i a geo) A larger Maol Π fragment, i.e. moving in lane E in a visible way, and treating it with the enzyme Hhal. This treatment yielded two fragments with the same mobility as those obtained by treating either the cDNA simultaneously with HaeIII and Hhalr, as can be seen by comparing lanes D and F. The total cDNA in the degradation product, lane D, is the autoradiographic density of the total line the measure of dioactivity is greater for fragment A than for fragment B, although size could suggest otherwise. Based on this finding, it can be estimated that fragment A is transcribed closer to the 3 'end of the mRNA than fragment B.
Kuva 2 on kaavioesitys cDNA-molekyylistä ja Haelll- ja Hhal- restriktiokohdat näkyvät siinä suhteessa toisiinsa. Samasta cDNA-mo-lekyylistä johdetut DNA-fragmentit A ja B luokiteltiin suhteellisen intensiteettinsä mukaan, joka oli saatu kuvan 1 kaistan D autoradio-grammista. Fragmentin C olemassaolo pääteltiin kuvan 1 kaistoissa B ja D olevan viivan erilaisesta elektroforeettLsesta liikkuvuudesta. DNA-fragmentin A koko tunnetaan tarkoin nukleotidisekvenssimäärityk-sen perusteella, ks. Maxam, A. ja Gilbert, W. edellä. DNA-fragmentin B koko määritettiin vertaamalla kuvan 1 kaistan G Ml3-DNA-kokomerk-keihin.Figure 2 is a schematic representation of the cDNA molecule and the HaellI and Hhal restriction sites are shown in relation to each other. DNA fragments A and B derived from the same cDNA molecule were classified according to their relative intensities obtained from the autoradiogram of lane D in Figure 1. The existence of fragment C was inferred from the different electrophoretic mobility of the line in lanes B and D of Figure 1. The size of DNA fragment A is well known by nucleotide sequencing, cf. Maxam, A. and Gilbert, W. supra. The size of DNA fragment B was determined by comparison to the M13 DNA size markers in lane G of Figure 1.
Nukleotidisekvenssit DNA-fragmentille A ja osalle fragmentin B 5'-päätä määritettiin Maxamin ja Gilbertin menetelmällä, ks. edellä. Koska ihmisen sikiön suonikalvon somatomammotropiinin aminohappo-sekvenssi tunnetaan, voitiin näiden kahden fragmentin nukleotidisek-venssejä verrata aminohapposekvenssiin tunnetun geneettisen koodin perusteella. Vertailun perusteella voitiin todeta, että sekvenssit todella koodasivat ihmisen sikiön suonikalvon somatomammotropiinin osia ja tämä vahvisti myös kuvassa 2 esitettyä fragmenttiaärjestystä.Nucleotide sequences for DNA fragment A and a portion of the 5 'end of fragment B were determined by the method of Maxam and Gilbert, cf. above. Because the amino acid sequence of human fetal choroidal somatomammotropin is known, the nucleotide sequences of the two fragments could be compared to the amino acid sequence based on a known genetic code. By comparison, it could be concluded that the sequences actually encoded portions of human fetal choroidal somatomammotropin, and this also confirmed the fragment sequence shown in Figure 2.
Esimerkki 2Example 2
Seuraavassa kuvatulla rekonstruointikokeella osoitetaan, kuinka tämän keksinnön mukaisella menetelmällä voidaan puhdistaa haluttu nukleotidisekvenssi, jota on alunperin vain pieni määrä koko nukleo-tidisekvenssipopulaatiossa. Koostumukseltaan tunnettuja RNA-seoksia, jotka sisältävät puhdistettua rotan globiinin RNArta ja ihmisen 23 6 4 1 87 polyadenyloitua istukan RNA:ta, käytettiin käänteistransskriptaa-. 3 2 sm templaatteina P-dCTP:n läsnäollessa (lopullinen ominaisak-tiivisuus 10^ laskinyksikköä/min/pmol. cDNA-tuotteet katkaistiin Haelll-endonukleaasilia ja fragmentit erotettiin toisistaan polyak-ryyliamidiyhdistelmägeelilevyillä (4,5 % - 10 %). cDNA-fragmentit visualisoitiin suorittamalla autoradiografia kuivatuille geeleille.The following reconstruction experiment demonstrates how the method of the present invention can purify a desired nucleotide sequence that is initially only a small amount in the entire nucleotide sequence population. RNA mixtures of known composition containing purified rat globin RNA and human 23 6 4 1 87 polyadenylated placental RNA were used for reverse transcription. 3 2 μm as templates in the presence of β-dCTP (final specific activity 10 μg counting units / min / pmol. The cDNA products were digested with HaellI endonuclease and the fragments were separated on polyacrylamide recombinant gel plates (4.5% to 10%). CDNA fragments). visualized by performing autoradiography on dried gels.
Koetulokset on esitetty kuvassa 3. Geelielektroforeesi suoritettiin oleellisilta osiltaan esimerkissä 1 kuvatulla tavalla. Kaistoilla A ja H on ajettu kokoa ilmaisevat merkit, jotka on valmistettu katkaisemalla fagin Ml3 DNA Haelll-endonukleaasilla ja merkit- 3 2 semällä näin saatujen fragmenttien 5'-päät P:llä. Näiden DNA-fragmenttien nukleotidisekvenssien keskimääräiset pituudet on merkitty numeroilla vasemmalle puolelle. Kaistoilla B-G on elektroforee-sikuviot, jotka on saatu käynnistämällä edellämainitut reaktiot seoksilla, jotka sisälsivät globiinin RNA:ta ja istukan RNA:ta seuraa-vassa taulukossa esitetyissä suhteissa.The experimental results are shown in Figure 3. Gel electrophoresis was performed essentially as described in Example 1. Lanes A and H are run with size tags prepared by digesting phage M13 DNA with HaellI endonuclease and labeling the 5 'ends of the fragments thus obtained with P. The average lengths of the nucleotide sequences of these DNA fragments are indicated by numbers on the left. Lanes B-G have electrophoretic patterns obtained by initiating the above reactions with mixtures containing globin RNA and placental RNA in the ratios shown in the following table.
Globiinin RNA Istukan RNAGlobin RNA Placental RNA
Kaista ng ng B 300 0 C 60 240 D 30 270 E 15 285 F 7,5 292,5 G 0 300Lane ng ng B 300 0 C 60 240 D 30 270 E 15 285 F 7.5 292.5 G 0 300
Voidaan havaita, että 320 nukleotidia sisältävä Haelll-frag-mentti on peräisin globiinin cDNArsta. Globiinin cDNA-transskripti voidaan vielä havaita, vaikka globiinin RNArta on koko RNArssa läsnä vain 2-5 %. (Jos eristetyssä RNA-seoksessa on haluttua RNA-laa-tua niin vähän, ettei tämä analyysimenetelmä sovi , voidaan suorittaa esipuhdistus jollakin tunnetulla RNA:n puhdistusmenetelmällä niin, että halutun RNA-laadun pitoisuudeksi tulee noin 2-5 %).It can be seen that the 320 nucleotide HaellI fragment is derived from globin cDNA. The cDNA transcript of the globin can still be detected, although only 2-5% of the globin RNA is present in the total RNA. (If there is so little desired RNA quality in the isolated RNA mixture that this method of analysis is not suitable, pre-purification can be performed by any known RNA purification method to a concentration of about 2-5% of the desired RNA quality).
Esimerkki 3 Tämä esimerkki sisältää sellaisen nukleotidisekvenssifragmen-tin puhdistuksen, joka sisältää noin 550 emäsparia, jotka koodaavat osaa ihmisen sikiön suonikalvon somatomammotropiinista, ja menetelmän, jolla voidaan määrittää eristetyn sekvenssin puhtaus. Puhdiste-tun fragmentin puhtausasteeksi saatiin yli 99 %.Example 3 This example includes purification of a nucleotide sequence fragment containing about 550 base pairs encoding a portion of human fetal choroidal somatomammotropin and a method for determining the purity of the isolated sequence. The purity of the purified fragment was over 99%.
64187 2464187 24
Ihmisen sikiön suonikalvon somatomammotropiinln komplementaarisen DNA:n puhdistusPurification of human fetal choroidal somatomammotropin complementary DNA
Esimerkissä 1 kuvatulla tavalla erotettu polyadenyloitu istukan RNA rikastettiin ihmisen sikiön suonikalvon somatomammotro-piinin mRNA:n suhteen sentrifugoimalla 4°C:ssa 16 tuntia 25 000 r/min Beckman Instruments-ultrasentrifugin SW27-roottorissa sakka-roosigradientissa (5 - 20 % paino/tilav.). Gradientin 11S - 14S-alue otettiin talteen ja 100 pg tästä RNA:sta käytettiin kaksisäi-keisen cDNA:n syntetisointiin (ks. Ullrich, A. et ai., edellä). Toisen säikeen synteesi pysäytettiin uuttamalla reaktioseos tilavuudellaan etanolia -70°C:ssa. CDNA hajotettiin 50 ^ulrssa liuosta, joka sisälsi 6 mmol/1 tris-HCl (pH 7,5), 6 mmol/1 MgC^ ja 6 mmol/1 /Ä-merkaptoetanolia, 2 yksiköllä Hae III-entsyymiä 37°C:ssa 2 tunnin aikana ja sen jälkeen lisättiin 0,1 yksikköä bakteeriperäistä alkalista fosfataasia (BAPF-tyyppi, Worthington Biochem. Corp., Freehold, N. J., yksikkö on tuottajan määrittelemä), jonka annettiin vaikuttaa 10 minuuttia 60°C:ssa. Tämän jälkeen reaktioseos uutettiin yhtä suurella tilavuudella fenolin kyllästettyä klorofor-miliuosta. DNA saostettiin kahdella tilavuudella etanolia -70°C:ssa ja liuotettiin 20 jiliaan liuosta, joka sisälsi 10 mmol/1 tris-HCl (pH 8) ja 1 mmol/1 EDTA, ja sen jälkeen suoritettiin elektroforeesi polyakryyriamidigeelillä (6 % paino/tilav.). Kuviossa 4 (F) on edellä mainitun reaktioseoksen elektroforeesikuvio, jossa näkyy yksi viiva, joka vastaa noin 550 emäsparin nukleotidisekvenssiä. Kun 550 parin fragmentti leikattiin irti geelistä ja eluoitiin elektro-foreettisesti, saatiin kuviossa 4 (E) näkyvä tulos.The polyadenylated placental RNA isolated as described in Example 1 was enriched for human fetal choroidal somatomammotropin mRNA by centrifugation at 25,000 rpm for 16 hours in a Beckman Instruments ultracentrifuge SW27 rotor at a sucrose gradient (5-20% w / v). .). The 11S to 14S region of the gradient was recovered and 100 pg of this RNA was used to synthesize double-stranded cDNA (see Ullrich, A. et al., Supra). The synthesis of the second strand was stopped by extracting the reaction mixture with a volume of ethanol at -70 ° C. The CDNA was digested in 50 μl of a solution containing 6 mmol / l tris-HCl (pH 7.5), 6 mmol / l MgCl 2 and 6 mmol / l N-mercaptoethanol with 2 units of Hae III enzyme at 37 ° C. During 2 hours and thereafter, 0.1 units of bacterial alkaline phosphatase (BAPF type, Worthington Biochem. Corp., Freehold, NJ, unit as defined by the manufacturer) was added and allowed to act for 10 minutes at 60 ° C. The reaction mixture was then extracted with an equal volume of saturated chloroform of phenol. The DNA was precipitated with two volumes of ethanol at -70 ° C and dissolved in 20 μl of a solution containing 10 mmol / l Tris-HCl (pH 8) and 1 mmol / l EDTA, followed by electrophoresis on a polyacrylamide gel (6% w / v). ). Figure 4 (F) is an electrophoretic pattern of the above reaction mixture showing a single line corresponding to a nucleotide sequence of about 550 base pairs. When a 550 pair fragment was excised from the gel and eluted electrophoretically, the result shown in Figure 4 (E) was obtained.
Kuviossa 4 (E) näkyvää 550 emäsparia vastaavaa materiaalia käsiteltiin 2 tuntia 37°C:ssa 4 yksiköllä Hha I-endonukleaasia 50 pl:ssa samaa puskuria, jota käytettiin Hae III-endonukleaasikäsit-telyssä. Sen jälkeen uutettiin etanoli-kloroformiseoksella, saostettiin etanolilla ja hajoamistuotteet erotettiin elektroforeetti-sesti polyakryyliamidigeelillä (6 % paino/tilav.). Tulos nähdään kuviossa 4 (D).The material corresponding to 550 base pairs shown in Figure 4 (E) was treated for 2 hours at 37 ° C with 4 units of Hha I endonuclease in 50 of the same buffer used in the Hae III endonuclease treatment. It was then extracted with ethanol-chloroform, precipitated with ethanol and the decomposition products were separated electrophoretically on a polyacrylamide gel (6% w / v). The result is seen in Figure 4 (D).
Molemmat fraktiot eluoitiin elektroforeettisesti ja liitettiin toisiinsa inkuboimalla 2 tuntia 15°C:ssa 20 jul:ssa seosta, joka sisälsi 66 romol/i tris-HCl (pH 7,6), 6 mmol/1 MgC^r 15 mmol/1 25 64187 ditiotreitolia, 1 mmol/1 ATP ja 20 pg/ml T4 DNA-ligaasia. Tämän jälkeen reaktioseos laimennettiin 200 piiksi 0,1-m natriumkloridi-liuoksella, uutettiin yhdellä tilavuudellaan fenoli-kloroformiseos-ta ja DNA saostettiin 2 tilavuudella etanolia. Tuote suspendoitiin 20 plraan liuosta, joka sisälsi 10 mmol/1 tris-HCl (pH 8), ja 1mM EDTA, ja erotettiin elektroforeettisesti polyakryyliamidigeelillä (6 % paino/tilav.) Tulos näkyy kuviossa 4 (C). Kuvion 4 (C) elekt-roforeesikuviosta voidaan havaita, että 550 nukleotidin fragmentti saatiin rekonstruoiduksi ligaasikäsittelyllä. Alkalinen-fosfa-taasi-esikäsittelyllä varmistettiin se, että Hha I-fragmentit liittyivät toisiinsa oikein päin alkuperäiseksi 550 nukleotidin segmentiksi. Kuviossa 4 (C) näkyvät lisäviivat johtuvat Hha I-fragment-tien välisestä dimeerimuodostuksesta, jota ei voida estää alkali-nen-fosfataasikäsittelyllä.Both fractions were eluted electrophoretically and pooled by incubation for 2 hours at 15 ° C in 20 μl of a mixture of 66 romol / l Tris-HCl (pH 7.6), 6 mmol / l MgCl 2 15 mmol / l 64187 dithiothreitol, 1 mmol / l ATP and 20 pg / ml T4 DNA ligase. The reaction mixture was then diluted to 200 silicon with 0.1 M sodium chloride solution, extracted with one volume of phenol-chloroform mixture, and the DNA was precipitated with 2 volumes of ethanol. The product was suspended in 20 μl of a solution containing 10 mmol / l Tris-HCl (pH 8) and 1 mM EDTA and separated electrophoretically on a polyacrylamide gel (6% w / v). The result is shown in Figure 4 (C). It can be seen from the electrophoresis pattern of Figure 4 (C) that a 550 nucleotide fragment was reconstructed by ligase treatment. Alkaline-phosphatase pretreatment confirmed that the Hha I fragments were correctly aligned to the original 550 nucleotide segment. The additional lines shown in Figure 4 (C) are due to dimer formation between the Hha I fragment pathways, which cannot be prevented by alkaline phosphatase treatment.
Rekonstruoitu 550 nukleotidin fragmentti leikattiin irti geelistä ja eluoitiin elektroforeettisesti. Eluoidun materiaalin elektroforeesikuvio on kuviossa 4 (B). Kuviossa 4 (A) on koko- 32 standardin elektroforeesikuvio, joka saatiin P:llä merkitystä kaksisäikeisen M13-DNA:n Hae III-pilkkoutumistuotteesta. Elektro-foreettiset analyysit suoritettiin polyakryyliaraidigeelissä (6 % paino/tilav. 2 tunnin aikana 100 V jännitteessä liuoksessa, joka sisälsi 50 mmol/1 tris-boraattia (pH 8) ja 1 mmol/1 EDTA. Elektroforeesin jälkeen geeli kuivattiin ja autoradiogrammit valmistettiin kuvaamalla Kodak NS2T-röntgenfilmille.The reconstructed 550 nucleotide fragment was excised from the gel and eluted electrophoretically. The electrophoresis pattern of the eluted material is shown in Figure 4 (B). Figure 4 (A) is a size 32 electrophoresis pattern obtained from the Hae III cleavage product of P-labeled double-stranded M13 DNA. Electrophoretic analyzes were performed on a polyacrylic strip gel (6% w / v for 2 hours at 100 V in a solution containing 50 mmol / l tris-borate (pH 8) and 1 mmol / l EDTA. After electrophoresis, the gel was dried and autoradiograms were prepared by imaging Kodak NS2T-X-ray film.
Ihmisen sikiön suonikalvon somatomammotropiinin cDNArn rekonstruoidun 550 nukleotidia sisältävän fragmentin puhtaus. Eristetyt rekonstruoidut ihmisen sikiön suonikalvon somatomammotropiinin cDNA:n Hae III-fragmentit merkittiin 5'-päästään 32 P:llä käyttäen apuna polynukleotidikinaasia, joka oli saatu bak-teriofagi-T4sllä infektoidusta E. colista seuraavalla menetelmällä: Panet, A. et ai., Biochemistry 12, 5045 (1973). P-L Biochemical, Milwaukee, Wisconsin, toimittaa myös polynukleotidikinaasia. Sen jälkeen fragmenttia käsiteltiin 2 tuntia 37°C:ssa joko Hha I:llä tai Hpa 11:11a 50 pl:ssa liuosta, jossa oli 6 mmol/1 tris-HCl (pH 7,6), 6 mmol/1 MgC^ ja 6 mmol/1 /5-merkaptoetanolia. Sen jälkeen reaktioseos uutettiin tilavuudellansa fenoli-kloroformiseosta, DNA saostettiin 2 tilavuudella etanolia -70°C:ssa, suspendoitiin 20 64187 26 pl:aan liuosta, jossa oli 10 mmol/1 tris-HCl (pH 8) ja 1mM EDTA, suoritettiin elektroforeesi ja geeli kuvattiin röntgenfilmille edellä kuvatulla tavalla niin, että merkityt fragmentit saatiin visualisoiduiksi .Purity of the reconstructed 550 nucleotide fragment of human fetal choroidal somatomammotropin cDNA. Isolated reconstituted Hae III fragments of human fetal choroidal somatomammotropin cDNA were labeled at the 5 'end with 32 P using a polynucleotide kinase obtained from bacteriophage-T4 infected E. coli by the following method: Panet, A. et al., Biochem 12, 5045 (1973). P-L Biochemical, Milwaukee, Wisconsin, also supplies polynucleotide kinase. The fragment was then treated for 2 hours at 37 ° C with either Hha I or Hpa 11 in 50 μl of a solution of 6 mmol / l Tris-HCl (pH 7.6), 6 mmol / l MgCl 2 and 6 mmol / 1/5-mercaptoethanol. The reaction mixture was then extracted with a volume of phenol-chloroform, the DNA was precipitated with 2 volumes of ethanol at -70 ° C, suspended in 26 μl of a solution of 10 mM Tris-HCl (pH 8) and 1 mM EDTA, electrophoresed and the gel was imaged on X-ray film as described above so that the labeled fragments were visualized.
Tulokset on esitetty kuviossa 5. Kuviot 5 (B) ja 5 (E) esittävät 550 nukleotidin fragmentille tehtyjä rinnakkaisajoja ennen restriktioentsyymikäsittelyä. Kuvio 5 (C) esittää Hha I-katkaisua ja kuvio 5 (D) Hpa II-katkaisua.The results are shown in Figure 5. Figures 5 (B) and 5 (E) show parallel runs performed on a 550 nucleotide fragment prior to restriction enzyme treatment. Figure 5 (C) shows Hha I cleavage and Figure 5 (D) shows Hpa II cleavage.
550 nukleotidin fragmentin puhtaus mitattiin siten, että restriktioentsyymin katkaisutuotteiden autoradiogrammi skannattiin ja fragmenttiviivojen radioaktiivisuusjakautuma tulkittiin kvatita-tiivisesti. Mittaukset osoittavat, että ihmisen sikiön suonikalvon somatomammotropiinin cDNArn rekonstruoidun Hae III-fragmentin puhdistuksessa saavutettiin yli 99 % puhtausaste.The purity of the 550 nucleotide fragment was measured by scanning the autoradiogram of restriction enzyme cleavage products and interpreting the radioactivity distribution of the fragment lines quantitatively. Measurements show that purification of the reconstituted Hae III fragment of human fetal choroidal somatomammotropin cDNA achieved greater than 99% purity.
Esimerkki 4 Tässä esimerkissä puhdistetaan sellainen DNA, jonka nukleo-tidisekvenssi sisältää suurimman osan ihmisen kasvuhormonia koodista. Ihmisen kasvuhormonin DNA puhdistettiin samalla tavalla kuin ihmisen sikiön suonikalvon somatomammotropiinin DNA (ks. esimerkki 3) .Example 4 In this example, DNA whose nucleotide sequence contains most of the human growth hormone code is purified. Human growth hormone DNA was purified in the same manner as human fetal choroidal somatomammotropin DNA (see Example 3).
Viisi hyvänlaatuista ihmisen aivolisäkekasvainta, jotka oli leikkauksen jälkeen jäähdytetty nopeasti nestemäisessä typessä, ja jotka painoivat 0,4 - 1,5 g kukin, sulatettiin ja homogenoitiin 4°C:ssa liuoksessa, joka sisälsi 4 mol/1 guanidiumtiosyanaattia ja 1 mol/1 merkaptoetanolia, ja jonka pH oli 5,0. Homogenaatti kerrostettiin 1,2 ml:aan liuosta, joka sisälsi 5,7 mol/1 CsCl ja 100 mmol/1 EDTA, ja sentrifugoitiin 15°C:ssa 18 tuntia nopeudella 37 000 r/min Beckman-ultrasentrifugin SW50.1-roottorissa (Beckman Instrument Company, Fullerton, California). RNA kulkeutui putken pohjaan. Jatkopuhdistus tapahtui esimerkeissä 1 ja 3 kuvatulla menetelmällä käyttämällä oligo-dT-pylvästä ja sakkaroosigradienttisedimentointia. Noin 10 % näin erotetusta RNA:sta koodasi kasvuhormonia, päätellen radioaktiivisen aminohappo-prekursorin sisällyttämisestä vehnäalki-osta johdetulla antikasvuhorraonilla saostuvaan materiaaliin solutto-massa translaatiosysteemissä (ks. Roberts, B.E. ja Patterson, B. M., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 70, 2330 (1973)). Yksisäikeinen ja 641 87 27 kaksisäikeinen DNA synstetisoitiin esimerkissä 3 kuvatulla tavalla. Sitten ihmisen kasvuhormonin cDNA käsiteltiin restriktioendonukleaa-silla Hae III ja alkalisella fosfataasilla esimerkissä 3 kuvatulla tavalla ja sen jälkeen fraktioitiin geelielektroforeesilla. 550 nukleotidin pituutta vastaavasta kohdasta löytyi selvä viiva, joka erotettiin jatkopuhdistusta varten.Five benign human pituitary tumors, postoperatively rapidly cooled in liquid nitrogen and weighing 0.4 to 1.5 g each, were thawed and homogenized at 4 ° C in a solution containing 4 mol / l guanidinium thiocyanate and 1 mol / l mercaptoethanol. , and having a pH of 5.0. The homogenate was layered in 1.2 ml of a solution containing 5.7 mol / l CsCl and 100 mmol / l EDTA and centrifuged at 15 ° C for 18 hours at 37,000 rpm in a SW50.1 rotor of a Beckman ultracentrifuge ( Beckman Instrument Company, Fullerton, California). RNA migrated to the bottom of the tube. Further purification was performed by the method described in Examples 1 and 3 using an oligo-dT column and sucrose gradient sedimentation. Approximately 10% of the RNA thus separated encoded growth hormone, judging from the incorporation of a radioactive amino acid precursor into wheat germ-derived anti-growth hormone precipitating material in a cell-free translation system (see Roberts, BE and Patterson, BM, Proc. Natl. Acad. Sci. Sci. 2330 (1973)). Single-stranded and 641 87 27 double-stranded DNA were synthesized as described in Example 3. The human growth hormone cDNA was then treated with restriction endonuclease Hae III and alkaline phosphatase as described in Example 3 and then fractionated by gel electrophoresis. A clear line was found at the site corresponding to a length of 550 nucleotides, which was separated for further purification.
Jatkopuhdistuksessa käytettiin edellä kuvattuja menetelmiä, joilla DNA jaettiin alafragmentteihin, jotka puhdistettiin erikseen ja sen jälkeen yhdistettiin toisiinsa, paitsi että ihmisen kasvuhormonin yhteydessä käytettiin restriktioendonukleaasia Pvu II, jolla saatiin kaksi alafragmenttia; toisen pituus oli noin 490 nukleotidia ja toisen noin 60 nukleotidia. Kaikkia tässä käytettyjä restriktioentsyymejä toimittaa New England Biolabs, Beverly, Massachusetts. Uudelleen yhteenliitetyn noin 550 emäsparin pituisen tuotteen puhtausaste oli yli 99 %, mikä todettiin suorittamalla sen jako alafragmentteihin neljällä eri endonukleaasisysteemillä.Further purification used the methods described above, in which DNA was split into subfragments, which were purified separately and then combined, except that the restriction endonuclease Pvu II was used in conjunction with human growth hormone to obtain two subfragments; one was about 490 nucleotides in length and the other was about 60 nucleotides. All restriction enzymes used herein are supplied by New England Biolabs, Beverly, Massachusetts. The recombinant product, approximately 550 bp in length, was greater than 99% pure, as determined by subdivision into four different endonuclease systems.
Claims (1)
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FI811757A FI811757L (en) | 1977-09-23 | 1981-06-05 | FOERFARANDE FOER FRAMSTAELLNING AV EN MICROORGANISM OCH MICROORGANISM INNEHAOLLANDE HUMANT TILLVAEXTHORMON |
| FI811756A FI811756L (en) | 1977-09-23 | 1981-06-05 | FOERFARANDE FOER FRAMSTAELLNING AV EN MICROORGANISM OCH MICROORGANISM INNEHAOLLANDE HUMANT KORIONSOMATOMAMMOTROPIN |
| FI811754A FI68261C (en) | 1977-09-23 | 1981-06-05 | FOERFARANDE FOER FRAMSTAELLNING AV EN REKOMBINATIONS-DNA-MOLEKYL VILKEN HAR EN HUMANT |
| FI811755A FI811755L (en) | 1977-09-23 | 1981-06-05 | FOERFARANDE FOER FRAMSTAELLNING AV EN OEVERFOERINGSVEKTOR OCH OEVERFOERINGSVEKTOR INNEHAOLLANDE HUMANT TILLVAEXTHORMON |
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US83621877A | 1977-09-23 | 1977-09-23 | |
| US83621877 | 1977-09-23 |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FI781676A FI781676A (en) | 1979-03-24 |
| FI64187B FI64187B (en) | 1983-06-30 |
| FI64187C true FI64187C (en) | 1983-10-10 |
Family
ID=25271469
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FI781676A FI64187C (en) | 1977-09-23 | 1978-05-26 | FOERFARANDE FOER RENING AV EN PRODUKT BESTAOENDE HUVUDSAKLIGENAV CDNA-FRAGMENT MED SAMMA LAENGD VILKA HAR EN SPECIFIK N UKEOTIDSQUENSE OCH MINST ETT RESTRIKTIONSSTAELLE OCH FOER A NAYS AV PRODUKTENS RENHET |
Country Status (25)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS5448775A (en) |
| AT (2) | AT369386B (en) |
| AU (1) | AU519528B2 (en) |
| BE (1) | BE868853A (en) |
| CS (1) | CS235069B2 (en) |
| DD (2) | DD153393A5 (en) |
| DE (1) | DE2825595A1 (en) |
| DK (1) | DK233378A (en) |
| ES (1) | ES470340A1 (en) |
| FI (1) | FI64187C (en) |
| FR (1) | FR2404013A1 (en) |
| GB (1) | GB1568047A (en) |
| GR (1) | GR73558B (en) |
| IE (1) | IE47332B1 (en) |
| IL (1) | IL54791A (en) |
| IT (1) | IT1098340B (en) |
| LU (1) | LU79938A1 (en) |
| NL (1) | NL7806358A (en) |
| NZ (1) | NZ187342A (en) |
| PL (1) | PL209748A1 (en) |
| PT (1) | PT68127A (en) |
| RO (2) | RO78407A (en) |
| SE (3) | SE7806087L (en) |
| YU (1) | YU214378A (en) |
| ZA (1) | ZA782933B (en) |
Families Citing this family (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| BR7807290A (en) * | 1977-11-08 | 1979-06-12 | Genentech Inc | PLASMIDEO, PROCESS FOR THE PRODUCTION OF A SPECIFIC POLYPEPTIDE CLONAL VEHICLE, TRANSFORMING BACTERIAL CULTURE, PROCESS TO PRODUCE AN IMMUNOGENIC SUBSTANCE, PROCESS TO PREPARE A STRUCTURAL, AND POLYDESOXIRRIBONUCLEOTIDE GENE |
| US6297355B1 (en) | 1978-12-22 | 2001-10-02 | Biogen, Inc. | Polypeptides displaying HBV antigenicity or hbv antigen specificity |
| ZA802992B (en) * | 1979-06-01 | 1981-10-28 | Univ California | Human pre-growth hormone |
| US4342832A (en) * | 1979-07-05 | 1982-08-03 | Genentech, Inc. | Method of constructing a replicable cloning vehicle having quasi-synthetic genes |
| US6835557B1 (en) | 1980-01-08 | 2004-12-28 | Biogen, Inc. | DNA sequences, recombinant DNA molecules and processes for producing human interferon-like polypeptides |
| US4530901A (en) * | 1980-01-08 | 1985-07-23 | Biogen N.V. | Recombinant DNA molecules and their use in producing human interferon-like polypeptides |
| IL59690A (en) | 1980-03-24 | 1983-11-30 | Yeda Res & Dev | Production of bovine growth hormone by microorganisms and modified microorganisms adapted to produce it |
| DE3177213D1 (en) | 1980-04-03 | 1990-10-18 | Biogen Inc | DNA SEQUENCES, RECOMBINANT DNA MOLECULES AND METHOD FOR PRODUCING THE HUMAN FIBROBLAST INTERFERON. |
| US4338397A (en) | 1980-04-11 | 1982-07-06 | President And Fellows Of Harvard College | Mature protein synthesis |
| CH659826A5 (en) * | 1981-06-02 | 1987-02-27 | Wakunaga Yakuhin Kk | PROCESS FOR OBTAINING A MICROORGANISM TRANSFORMED BY A PLASMID COMPRISING A GENE OF 27-DESAMIDOSECRETINE STRUCTURE. |
| US5670371A (en) * | 1983-07-15 | 1997-09-23 | Bio-Technology General Corp. | Bacterial expression of superoxide dismutase |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| NZ187300A (en) * | 1977-05-27 | 1982-08-17 | Univ California | Dna transfer vector and micro-organism modified to contain a nucleotide sequence equivalent to the gene of a higher organism |
| IE47889B1 (en) * | 1977-11-08 | 1984-07-11 | Genentech Inc | Synthetic dna and process tehrefor |
-
1978
- 1978-05-22 ZA ZA00782933A patent/ZA782933B/en unknown
- 1978-05-23 NZ NZ187342A patent/NZ187342A/en unknown
- 1978-05-23 GR GR56310A patent/GR73558B/el unknown
- 1978-05-25 GB GB22418/78A patent/GB1568047A/en not_active Expired
- 1978-05-25 AU AU36489/78A patent/AU519528B2/en not_active Expired
- 1978-05-26 DK DK233378A patent/DK233378A/en not_active Application Discontinuation
- 1978-05-26 IL IL54791A patent/IL54791A/en unknown
- 1978-05-26 FI FI781676A patent/FI64187C/en not_active IP Right Cessation
- 1978-05-26 IE IE1054/78A patent/IE47332B1/en unknown
- 1978-05-26 SE SE7806087A patent/SE7806087L/en unknown
- 1978-05-27 RO RO7894192A patent/RO78407A/en unknown
- 1978-05-27 RO RO78105866A patent/RO80006A/en unknown
- 1978-05-30 ES ES470340A patent/ES470340A1/en not_active Expired
- 1978-06-01 PT PT68127A patent/PT68127A/en unknown
- 1978-06-05 JP JP6756678A patent/JPS5448775A/en active Pending
- 1978-06-07 CS CS783704A patent/CS235069B2/en unknown
- 1978-06-10 DE DE19782825595 patent/DE2825595A1/en not_active Withdrawn
- 1978-06-12 NL NL7806358A patent/NL7806358A/en not_active Application Discontinuation
- 1978-06-16 IT IT24641/78A patent/IT1098340B/en active
- 1978-06-22 AT AT0456678A patent/AT369386B/en not_active IP Right Cessation
- 1978-07-03 DD DD78224374A patent/DD153393A5/en unknown
- 1978-07-03 DD DD78206482A patent/DD145917A5/en unknown
- 1978-07-04 FR FR7819901A patent/FR2404013A1/en active Granted
- 1978-07-07 BE BE189169A patent/BE868853A/en not_active IP Right Cessation
- 1978-07-07 LU LU79938A patent/LU79938A1/xx unknown
- 1978-09-11 YU YU02143/78A patent/YU214378A/en unknown
- 1978-09-21 PL PL20974878A patent/PL209748A1/xx unknown
-
1981
- 1981-06-03 AT AT0248881A patent/AT375673B/en not_active IP Right Cessation
-
1983
- 1983-09-23 SE SE8305163A patent/SE8305163D0/en not_active Application Discontinuation
- 1983-09-23 SE SE8305162A patent/SE8305162D0/en not_active Application Discontinuation
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US4363877A (en) | Recombinant DNA transfer vectors | |
| Cobianchi et al. | Structure of rodent helix-destabilizing protein revealed by cDNA cloning. | |
| Hauswirth et al. | Length heterogeneity of a conserved displacement-loop sequence in human mitochondrial DNA | |
| Chen et al. | A specific quadrilateral synthesized from DNA branched junctions | |
| KR860001515B1 (en) | Process of replication and translation of human pre-growth hormone | |
| FI64640B (en) | FOERFARANDE FOER FRAMSTAELLNING AV EN KOMBINATIONS-DNA-MOLEKYLSOM INNEHAOLLER EN FOER INSULIN KODANDE NUCLEOTIDSEKVENS HOCSOM KAN ANVAENDAS VID FRAMSTAELLNING AV EN INSULIN PRODU RCENDE MICROORGANISM | |
| US4416988A (en) | Detection and isolation of enkephalin mRNA using a synthetic oligodeoxynucleotide | |
| EA004327B1 (en) | Method for amplifying nucleic acid sequence | |
| Bruenn et al. | Yeast viral double-stranded RNAs have heterogeneous 3′ termini | |
| EP0067213A1 (en) | Method for cloning genes | |
| FI64187C (en) | FOERFARANDE FOER RENING AV EN PRODUKT BESTAOENDE HUVUDSAKLIGENAV CDNA-FRAGMENT MED SAMMA LAENGD VILKA HAR EN SPECIFIK N UKEOTIDSQUENSE OCH MINST ETT RESTRIKTIONSSTAELLE OCH FOER A NAYS AV PRODUKTENS RENHET | |
| Ilgen et al. | Isolation and characterization of large transfer ribonucleic acid precursors from Escherichia coli. | |
| US4407948A (en) | Purification of nucleotide sequences suitable for expression in bacteria | |
| US4283489A (en) | Purification of nucleotide sequences suitable for expression in bacteria | |
| EP1007730A1 (en) | METHODS FOR IDENTIFICATION AND ISOLATION OF SPECIFIC NUCLEOTIDE SEQUENCES IN cDNA AND GENOMIC DNA | |
| Cashman et al. | Transcription of bacteriophage fl. The major in vivo RNAs. | |
| TWI316964B (en) | ||
| US4447538A (en) | Microorganism containing gene for human chorionic somatomammotropin | |
| Drahovsky et al. | Distribution pattern and enzymic hypermethylation of inverted repetitive DNA sequences in P815 mastocytoma cells | |
| Wu et al. | Synthetic oligodeoxynucleotides for analyses of DNA structure and function | |
| US4358586A (en) | Detection and isolation of endorphin mRNA using a synthetic oligodeoxynucleotide | |
| Hänni et al. | Molecular typing of Neolithic human bones | |
| CN109266628A (en) | A kind of Taq DNA polymerase and its application of fusion | |
| FI68261C (en) | FOERFARANDE FOER FRAMSTAELLNING AV EN REKOMBINATIONS-DNA-MOLEKYL VILKEN HAR EN HUMANT | |
| Dhar et al. | Nucleotide sequence of the DNA encoding the 5'-terminal sequences of simian virus 40 late mRNA. |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM | Patent lapsed |
Owner name: THE REGENTS OF THE UNIVERSITY OF |