FI63064B - Foerfarande foer fluorometrisk bestaemning av aktiviteten av fettspjaelkande enzymer och medel foer att genomfoera foerfarandet - Google Patents
Foerfarande foer fluorometrisk bestaemning av aktiviteten av fettspjaelkande enzymer och medel foer att genomfoera foerfarandet Download PDFInfo
- Publication number
- FI63064B FI63064B FI810616A FI810616A FI63064B FI 63064 B FI63064 B FI 63064B FI 810616 A FI810616 A FI 810616A FI 810616 A FI810616 A FI 810616A FI 63064 B FI63064 B FI 63064B
- Authority
- FI
- Finland
- Prior art keywords
- group
- fluorescent
- groups
- acyl
- compound
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/61—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving triglycerides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2334/00—O-linked chromogens for determinations of hydrolase enzymes, e.g. glycosidases, phosphatases, esterases
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
- G01N2333/914—Hydrolases (3)
- G01N2333/916—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1), e.g. phosphatases (3.1.3), phospholipases C or phospholipases D (3.1.4)
- G01N2333/918—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
1 63064
Menetelmä rasvoja hajottavien entsyymien aktiivisuuden määrittämiseksi fluorometrisesti ja aine menetelmän suorittamista varten - Förfarande för fluorometrisk bestämning av aktiviteten av fettspjälkande enzymer och 5 medel för att genomföra förfarandet
Esillä oleva keksintö koskee kliinis-analyyttistä määritysmenetelmää, jossa perusteena on fluoresenssin intensiteetissä tapahtuvat muutokset. Eräs tällainen on lipaasien ja fosfolipaasien, erityisesti fosfolipaasi A2:n määrittämi-10 nen seerumista. Lipaasit ovat entsyymejä, jotka pilkkovat triasyyliglyseroleja vapaiksi rasvahapoiksi, glyserideiksi ja glyseroliksi. Lipaasit eroavat toisistaan mm. stereospe-sifiteettinsä suhteen, ja joillakin lipaaseilla on kyky erottaa sn-triasyyliglyserolin 1 ja 3 asemien rasvahapot 15 toisistaan. Fosfolipaasi A2 pilkkoo fosfolipidien 2-asemassa fosforyyliryhmään nähden olevan rasvahapon, jolloin lopputuotteena syntyy lysofosfolipidi ja vapaa rasvahappo.
Kliinisen kemian kannalta tärkeä on haimasta normaali-olosuhteissa ruoansulatuskanavaan erittyvä lipaasi ja fosfo-20 lipaasi. Mm. haimatulehduksessa nämä entsyymit kuitenkin vapautuvat verenkiertoon, jolloin plasmasta mitattavalla ent-syymiaktiviteetilla on diangnostista merkitystä.
Seerumi lipaasiaktiviteetin mittaamiseksi on aikaisemmin ehdotettu fluorimetristä menetelmää käyttäen entsyymi-25 substraattina fluorescein-johdannaisia (FR-pat. 7600M, CA, Voi. 75, (1971), 105296c, CA, Voi. 70 (1969) 64514y). Tunnetaan myös menetelmä, jossa annetaan seerumin reagoida tri-glyseridiemulsion kanssa, jonka jälkeen määritetään vapautuneet rasvahapot, useimmiten titrimetrisesti. Menetelmä on 30 työläs, epäherkkä ja toistettavuus on huono. Kolmas tunnettu menetelmä on nefelometrinen, jossa seurataan substraattina toimivan triglyseridiemulsion aiheuttaman valon sironnan vähenemistä ajan funktiona, lipaasin hajottaessa emulsiopar-tikkeleita. Menetelmä on kohtalaisen herkkä, muttei kovin 35 toistettava. Lisäksi seerumin endogeeniset triglyseridit 63064 häiritsevät erittäin voimakkaasti määritystä/ eikä lipeemi-sistä näytteistä voida nefelometrisesti saada luotettavaa lipaasimääritystä.
Fosfolipaasien määritysmenetelmät ovat perustuneet ra- 5 dioaktiivisen substraatin käyttöön, jolloin esim. 2-aseman 14 3 rasvahappoon sisällytetään C- tai H-atomeja ja mitataan fosfolipaasi A2:n pilkkoaman radioaktiivisen rasvahapon radioaktiivisuuden määrä. Menetelmä on kuitenkin hankala monivaiheisuutensa takia ja siihen vaaditaan erikoislaitteita 10 mm. nestetuikelaskija.
Esillä oleva keksintö kohdistuu fluorometriseen määritysmenetelmään, jossa käytetään lipidi- tai fosfolipidiyh-disteitä sisältäviä substraatteja, joihin yhdisteisiin on liitetty fluoresoivia ryhmiä, ja mahdollisesti myös nk. sam-15 muttajaryhmiä, ja joissa mitataan entsyymireaktion aiheuttama muutos substraatin fluoresenssin intensiteetissä. Menetelmän avulla voidaan fluoresenssispektrofotometrillä suoraan ilman hankalia separointivaiheita määrittää esim. seeruminäytteen lipaasi- ja fosfolipaasiaktivitetti, mikä te-20 kee menetelmän erityisen edulliseksi sairaalalaboratoriokäyt-töä varten.
Keksinnön kohteena on näin ollen menetelmä rasvoja hajottavien entsyymien aktiivisuuden määrittämiseksi fluoro-metrisesti kyseistä entsyymiä sisältävistä näytteistä, jossa 25 menetelmässä entsyymiä sisältävä näyte yhdistetään substraatin kanssa, joka sisältää määritettävän entsyymin kanssa reagoivaa fluoresoivalla ryhmällä substituoitua yhdistettä, substraatti eksitoidaan ko. fluoresoivan ryhmän ominaisella heräteaallonpituudella ja määritetään entsyymin aiheuttama 30 muutos substraatin fluoresenssin intensiteetissä aikayksikössä ko. ryhmän ominaisella emissioaallonpituudella, mikä muutosnopeus on suoraan verrannollinen näytteen sisältämän entsyymin aktiviteettiin, jolloin yhdisteen kaava on R1-0-CH~ 2 1 1
R -0-CH
3 ' R -0-CH2 3 63064 jossa 12 3 a) ainakin kaksi ryhmistä R , R ja R tarkoittaa 3-36 hiili-atomia sisältävää, tyydytettyä tai tyydyttämätöntä asyyli-ryhmää,jai kolmas näistä voi tarkoittaa myös vetyä tai 3-36 5 hiiliatomia sisältävää tyydytettyä tai tyydyttämätöntä al-kyyliryhmää, tai 2 3
b) toinen ryhmistä R ja R tarkoittaa fosforyyliryhmää O
II
- P - OR, jossa R tarkoittaa vetyä, etanoliamiinia, etylee-10 OH
niglykolia, koliinia, glyserolia tai seriiniä, ja toinen, sa- momkuxn R tarkoittaa edellä määriteltyä asyyli- tai alkyy- liryhmää, kuitenkin siten, että fosforyyliryhmään nähden 2- asemassa oleva hiiliatomi voi sisältää vain asyyliryhmän, ja 1 2 15 jolloin yhdisteessä I asyyli- tai alkyyliryhmistä R , R ja 3 R kulloinkin ainakin yksi on substituoitu fluoresoivalla ryhmällä, ja muista näistä ryhmistä toinen tai mahdollisesti molemmat voivat olla substituoituja fluoresenssin sammuttavalla ryhmällä. Käytettäessä yhdistettä, jossa on kaksi fluo-20 resoivaa ryhmää,fluresenssiä mahdollisesti herkistetään liittämällä toiseen fluoresoivaan ryhmään elektroneja luovuttavia ryhmiä ja toiseen elektroneja vetäviä ryhmiä.
Fluoresoiva ryhmä voi olla pyreeni, tetraseeni, antra-seeni, fenantreeni, naftaleeni, kumaroni, kumariini, akridii-25 ni, bentsokarbatsoni, aminonaftaleenisulfonihappo, mono-, di- tai trijodibentseeni, peryleeni, fenyylioksadiatsoli, difenyyliok-satsoli, alloksatsiini, stilbeeni, dibentsofuraani, fluoreeni, fluorenoni, oksopiperatsiini, p-kinoni, metyyliumbelliferoni, fenatsiini, fenyyli-indoli, kinoliini, dietyylianiliini, feno-30 li, difenyyliasetyleeni, bentsotiofeeni, pyrimidiini, ksantoni, tiokarbosyanidi, 1,3,5,7- dekatetraeeni.
Edullinen fluoresoiva ryhmä on pyreeni hyvin karakterisoitujen fluoresenssi-ominaisuuksiensa ansiosta.
Fluoresenssi-ilmiön herkistämiseksi voidaan käyttää elek-35 troneja luovuttavina ryhminä esim* metyyli-, metoksi-, hydrok-syyli- tai dimetyyliaminoryhmiä, ja elektroneja vetävinä ryhminä esim. syano- ja nitroryhmiä.
63064 4
Sammuttajana käytetään edullisesti halogeenia, kuten bromia, jodia tai klooria tai halogeenisubstituoituja ryhmiä, kuten halogeenisubstituoituja fenyyliryhmiä.
Kaavan I mukaisten yhdisteiden ensimmäisen alaryhmän 5 a) muodostavat siis lipaasimääritykseen käyttökelpoiset tri-asyyli-, diasyyli-monoalkyyli- vastaavasti diasyyliglysero-lit, jolloin ainakin yksi asyyli- tai alkyyliryhmistä on substituoitu fluoresoivalla ryhmällä, ja joissa muista näistä ryhmistä toinen tai molemmat, mahdollisesti voivat olla 10 substituoituja fluoresenssin sammuttavalla ryhmällä.
Näistä mainittakoon erityisesti kaavan I mukaiset tri-asyyliglyserolit, jotka mielivaltaisessa asemassa sisältävät yhden, kaksi tai kolme fluoresoivaa ryhmää, edullisesti pyreeniryhmää, sekä 1,3-diasyvli-2-alkyyli-sn-glyserolit, 1 5 jotka ovat substituoidut fluoresoivilla ryhmillä triasyyli-glyseroliyhdisteitä vastaavasti.
Tähän ryhmään kuuluvia käyttökelpoisia "sisäisesti sammutettuja" yhdisteitä ovat esimerkiksi 2-asemassa fluoresoivan ryhmän sisältävät triasyyli- tai 1,3-diasyyli-2-al-20 kyyli-sn-glyserolit, jolloin sammuttajaryhmä, edullisesti bromiryhmä on 1- ja/tai 3-asemassa.
Toisen alaryhmän b) muodostavat fosfolipaasi A2:n määritykseen sopivat fosfolipidi-yhdisteet, joiden kaavat ovat R1 - O - CH2 Rl - O - CH2
I f K
R2 - O - CH H-C-O-P-OR
O , I tl t H2C - o - p - or r3 - O - CH2 oh
OH
Ia Ib 2 1 jolloin kaavassa Ia ryhmä R , ja kaavassa Ib ryhmä R on 25 edellä määritelty asyyli, ja jolloin ainakin toinen ryhmis- 12 13 tä R ja R , vastaavasti R ja R , sisältää fluoresoivan ryhmän, ja toinen mahdollisesti fluoresenssin sammuttavan „ v. ryhmän.
Näistä mainittakoon erityisesti kaavan Ia mukaiset 5 63064 1,2-diasyyli- tai 1-alkyyli-2-asyyli-yhdisteet, joissa toinen tai molemmat ryhmät asemissa 1 ja 2 sisältävät fluoresoivan ryhmän. Edullinen yhdiste on myös sellainen jossa fluoresoiva ryhmä on sammutettu bromi-, jodiatomilla tai muulla ha-5 logeenipitoisella ryhmällä.
Erityisen edullisia yhdisteitä ovat seuraavat.
I. 1-oleoyyli-2-(4-(3-pyrenyyli)-buturoyyli)-3-oleoyyli-sn-glyseroli II. 1-(6-bromiheksanoyyli)-2-(4-(3-pyrenyyli)-buturoyyli)- 3-oleoyyli-sn-glyseroli III. 1-(4-(3-pyrenyyli)-buturoyyli)-2-(6-bromiheksanoyyli)- 3-oleoyyli-sn-glyseroli IV. 1-(4-(2-antroyyli)-buturoyyli)-2-(6-bromiheksanoyyli)- 3-oleoyyli-sn-glyseroli V. 1,2-di-(4-(3-pyrenyyli)-buturoyyli)-sn-glysero-sn-3-fosforyyliglyseroli VI. 1-(4-(3-pyrenyyli)-buturoyyli)-2-(6-bromiheksanoyyli)-sn-glysero-3-fosforyyliglyseroli VII. 1-(4-(3-pyrenyyli)-buturoyyli)-2-(6-bromiheksanoyyli)-sn-glysero-3-fosforyylietyleeniglykoli VIII. 1-(heksatriakontanyyli)-2-(4-(3-pyrenyyli)-buturoyyli)-sn-glysero-3-fosforyyliglyseroli IX. 1-(6-bromiheksanoyyli)-2-(4-(3-pyrenyyli)-buturoyyli)-sn-glysero-3-fosforyylikoliini X. 1-(4-(2-antroyyli)-buturoyyli)-2-(6-bromiheksanoyyli)-sn-glysero-fosforyyliglyseroli XI. 1-(10-(2-antroyyli)-dekanoyyli)-2-(10-(3,5-dibromi-4-metoksifenyyli)-dekanoyyli)-sn-glysero-fosforyyliglyseroli XII. 1-(10-(2-antroyyli)-dekanoyyli)-3-linoleyyli-sn-glysero- li-2-fosforyylikoliini 6 6 30 6 4 XIII. 1-(1 O-(3-pyrenyyli)-dekanoyyli)-3-(12-bromidodekanoyy-li)-sn-glyseroli-2-fosforyylikoliini XIV. 1,2-di-(4-(3-pyrenyyli)-buturoyyli)-sn-glyseroli XV. 1-(4-(3-pyrenyyli)-buturoyyli)-2-(6-bromiheksanoyyli)-sn-glyseroli XVI. 1-(6-bromiheksanoyyli)-2-(4-(3-pyrenyyli)-buturoyyli)-sn-glyseroli.
Kun menetelmässä käytetään yhdistettä jossa on yksi ainoa fluoresoiva ryhmä, tällainen yhdiste muodostaa öljyyn emulsioituna, jolloin yksittäiset yhdistemo-lekyylit ovat pakkautuneet lähekkäin, nk. intermolekulaari-5 sen dimeerin, eli eksimeerin, joka säteilytettäessä ko. fluoresoivan ryhmän heräteaallonpituudella fluoresoi tälle ryhmälle ominaisella eksimeeriaallonpituudella. Kun tällaista yhdistettä sisältävä substraatti reagoi entsyymin kanssa muodostuu hydrolyysin kautta, entsyymistä ja yhdisteestä riip-10 puen, hajoamistuotteina vapaita rasvahappoja sekä mono- tai disubstituoituja glyseroleja tai vastaavasti lysofosfolipi-dejä, jotka poistuvat emulsiopartikkeleista, jolloin fluoresoivien ryhmien intermolekulaarinen vuorovaikutus häviää ja vastaavasti eksimeerin fluoresenssi-intensiteetti heikkenee 15 samalla kun fluoresoivasta vapaasta rasvahaposta tai fluore-voivasta glyserolituotteesta peräisin olevan monomeerifluo-resenssin intensiteetti kasvaa.
Esimerkiksi edellä mainittu yhdiste I, 1-oleoyyli-2-(4-(3-pyrenyyli)-buturoyyli)-3-oleoyyli-sn-glyseroli, muodos-20 taa öljyyn emulsioituna intermolekulaarisen eksimeerin, joka säteilytettäessä heräteaallonpituudella noin 320-345 nm fluoresoi pyreenin eksimeeriaallonpituudella noin 470 nm. Kun tällaisen emulsion annetaan reagoida haiman lipaasin kanssa muodostuu, koska haiman lipaasilla ei ole stereospe-25 sifiteettiä, kaksi vapaata rasvahappoa ja 2-(4-(3-pyrenyyli)-buturoyyli)-glyserolia. Entsyymireaktion tuloksena siis ek-simeerifluoresenssi heikkenee ja monomeeri-fluoresenssi vas- 7 63064 taavasti kasvaa. Fluoresenssi-intensiteetin muutosta voidaan seurata joko pyreenin eksimeeriaallonpituudella noin 470 nm tai sen monomeeriaallonpituudella noin 390-400 nm, ja intensiteetin muutosnopeus on suoraan verrannollinen entsyymin 5 vaikutuksesta hajonneeseen määrään fluoresoivaa yhdistettä, eli entsymaattiseen aktiviteettiin.
Vahvasti fluoresoiva intramolekulaarinen eksimeeri muodostuu taas sellaisten yhdisteiden ollessa kysymyksessä, joissa samassa molekyylissä on kaksi tai 10 kolme fluoresoivaa ryhmää. Entsymaattisen reaktion tuloksena näiden fluoresoivien ryhmien välinen vuorovaikutus vähitellen häviää jolloin eksimeerifluoresenssin intensiteetti heikkenee ja monomeerin fluoresenssi vastaavasti kasvaa. Käytettäessä esimerkiksi substraatissa yhdistettä V, 1,2-15 di(4-(3-pyrenyyli)-buturoyyli)-sn-glysero-sn-3-fosforyyli-glyserolia, hydrolysoituu 2-asemassa oleva rasvahappoketju irti fosfolipaasin A2 vaikutuksesta, reaktiotuotteena muodostuu fluoresoiva vapaa rasvahappo ja fluoresoiva pyreeni-rasvahappofosfatidi. Entsyymireaktion tuloksena siis pyree-20 nin eksimeerifluoresenssi aallonpituudella noin 470 nm heikkenee ja sen monomeerifluoresenssi aallonpituudella noin 400 nm kasvaa, ja fluoresenssi-intensiteetin muutosnopeus on verrannollinen hydrolyysin määrään. Seuraamalla esimerkiksi aallonpituudella 470 nm fluoresenssi-intensiteetin 25 muutosnopeutta voidaan määrittää kuinka paljon fluoresoivaa yhdistettä on hajonnut aikayksikössä, joka taas riippuu ent-symaattisesta aktiviteetista.
Entsyymiaktiviteetti voidaan määrittää myös käyttämällä keksinnön mukaisesti yhdistettä joka sisältää sekä fluore-30 soivan että sisäisen fluoresenssin sammuttavan ryhmän tai ryhmiä, erityisesti bromiatomeja. Entsyymireaktion tuloksena joko fluoresoivan ryhmän tai sen sammuttajaryhmän sisältävä rasvahappo pilkkoutuu irti ja syntyy fluoresoiva rasvahappo tai fluoresoiva glyseroliyhdiste joka fluoresoi mo-35 nomeeriaallonpituudella. Sammutuksen vähenemisestä aiheutet- 8 63064 tua intensiteetin kasvua lisää vielä sama ilmiö kuin käytettäessä vain yhden fluoresoivan ryhmän sisältävää yhdistettä. Menetelmä voidaan suorittaa myös käyttämällä öljyyn emulsioitua substraattia, jossa on sekä fluoresoivan ryhmän 5 sisältävää yhdistettä että vastaavaa yhdistettä, joka sisältää fluoresenssin sammuttavan ryhmän, öljyssä nämä yhdisteet ovat pakotetut lähekkäin muodostaen nk. sisäisesti sammutetun makromolekyylin, joka entsyymireaktion tuloksena hajoaa monomeeriaallonpituudella fluoresoiviksi tuotteiksi.
10 Kaikissa tapauksissa menetelmä kalibroidaan liuoksil la, jotka sisältävät tunnetut määrät fluoresoivaa yhdistettä.
Keksintö koskee myös keksinnön mukaisen menetelmän suorittamiseksi käyttökelpoisia, erityisesti kaavan I mukaisia uusia yhdisteitä.
15 Keksinnön mukaiset yhdisteet voidaan valmistaa (M.
Kates, Methods in Membrane Biology, Voi 8, 1977, Plenum Pubi. Corp. s. 219-290) esimerkiksi liittämällä glyseroliin tai varsinkin D-mannitoliin halutut asyyli- ja/tai alkyyli-substituentit, jotka mahdollisesti sisältävät fluoresoivia 20 tai sammuttajaryhmiä. Substituoitu D-mannitoli pilkotaan sen jälkeen ja pelkistetään vastaavaksi glyseroliksi. Näin saatu substituoitu glyseroli voidaan esteröidä tai eette-röidä edelleen vapaassa asemasssan, esim. fosforyyliryhmän tai sen johdannaisen liittämiseksi halutun yhdisteen val-25 mistamiseksi.
Eräs edullinen tapa valmistaa 1,2-diasyyli-sn-glyse-rolijohdannaisia on selitetty FI-kuulutusjulkaisussa 60 700. Tällaiseen yhdisteeseen voidaan fosforyyli-glyseroliryhmä liittää saattamalla 1,2-diasyyliglyseroli reagoimaan fosfo-30 rloksikloridin kanssa trietyyliamiinin läsnäollessa. Saatu tuote saatetaan sitten reagoimaan 1-trityyli-sn-glysero-lin kanssa trietyyliamiinin läsnäollessa ja vapautetaan fosforyyliglyserolin hydroksiryhmät. Julkaisussa Eibl. H., Proc.Natl.Acad.Sci., 75 (1978), s. 40-74 on selitetty mene-35 telmä fosforyyli-etanoliamiinin ja -koliinin liittämiseksi.
9 63064
Seuraavat esimerkit havainnollistavat keksintöä. Esimerkki 1: Määritettiin fosfolipaasi Aj-aktiviteetti käyttämällä seuraavaa fosfolipidisubstraattia, joka 2,90 ml:ssa sisäl-5 tää 1 mM dioleoyylifosfatidyyliglyserolia 1 nM 1,2-di-(4-(3-pyrenyyli)-buturoyyli)-sn-glysero-sn-3- fosforyyliglyserolia 2 mM CaCl2 10 2 mM kolattia 50 mM tris-HCl, pH 7,4.
Fluoresenssi mitattiin käyttämällä Perkin-Elmer fluo-resenssispektrofotometriä, eksitaatiorako 3 nm, emissiora-ko 6 nm, eksitaatioaallonpituus 320 nm, emissioaallonpituus 15 470 nm. Mitattiin ensin perustaso ja lisättiin 100 yl kob ran myrkyn fosfolipaasia A2 sisältävää näytettä substraat-tiseokseen. Seurattiin fluoresenssin intensiteetin vähenemistä ajan funktiona eksimeeriaallonpituudella 470 nm piirturia käyttäen. Esimerkiksi 10 %:nen väheneminen fluo-20 resenssin intensiteetissä 10 minuutissa tarkoittaa sitä, että 100 yl näytettä sisältää fosfolipaasia Aj niin paljon, että se on hydrolysoinut 10 % substraatin kokonaisfosfoli-pidistä eli noin 0,1 mM = 100 yM fosfolipidiä 10 minuutissa, jolloin aktiviteetti näytteessä vastaa 100 yM vapaata 25 rasvahappoa/min ja ml.
Vaihtamalla fluorimetrin herkkyystasoa voidaan määrittää hydrolyysiaste näytteistä, joiden aktiviteetti vaih-telee välillä 1 nM - 100 yM vapaata rasvahappoa/min ja ml. Kun saatuja 6 30 6 4 10 tuloksia verrattiin arvoihin jotka saatiin käyttämällä radioaktiivista substraattia, saatiin kuvion 1 mukainen kuva, josta nähdään että molemmilla menetelmillä saadut tulokset ovat yhtäpitävät.
5 Esimerkki 2: Määritettiin lipaasiaktiviteetti käyttämällä seuraavaa lipidisubstraattia 1,00 ml liuosta joka sisältää 50 μΐ oliiviöljyä 10 5 yl etanolia (=0,5%) 1 yg 1-oleoyyli-2-(4-(3-pyrenyyli)-buturoyyli)-3-oleoyyli- sn-glyserolia 5 mM Na-deoksikolaattia 50 mM tris-HCl, pH 8,4 15 Fluoresenssi mitattiin käyttämällä piirturiin kytkettyä fluoresenssi-spektrofotometriä, eksitaatiorako 20 nm, emis-siorako 20 nm, eksitaatioaallonpituus 343 nm. Emissiota seurattiin aallonpituudella 400 nm. Mitattiin ensin perustaso ja lisättiin sitten 50 yl lipaasia sisältävää näytettä ja 20 seurattiin fluoresenssin intensiteetin kasvaa monomeeriaal-lonpituudella n. 400 nm aikayksikössä. Oheisessa kuviossa 2 on esitetty fluoresenssi-intensiteetti Im, mitattu mono-meeriaallonpituudella 400 nm,ajan funktiona. Fluoresoivana yhdisteenä käytettiin 1-oleoyyli-2-(4-(3-pyrenyyli)-buturo- 25 yyli)-3-oleoyyli-sn-glyserolia , ja seeruminäytteenä sekä normaalia että patologista seerumia. Reaktio pysäytettiin bent-seeniboronaatilla.
Esimerkki 2 voidaan suorittaa vastaavalla tavalla mutta käyttämällä sisäisesti sammutettuna yhdisteenä 1 yg 1-(6-bromiheksanoyyli)-2-(4-(3-pyrenyyli)-buturoyyli)-3-oleo-yyli-sn-glyserolia ja mittaamalla fluoresenssi-intensitee-30 tin kasvu aikayksikössä kuten edellä.
Sisäisesti sammutetun yhdisteen asemesta voidaan käyt- ··' ..
11 63064 tää samanlaisessa koejärjestelmässä yhdistelmänä 1 ug 1-oleo-yyli-2-(4-(3-pyrenyyli)-buturoyyli)-3-oleoyyli-sn-glyserolia sekä 1 pg 1-oleoyyli-2-(6-bromiheksanoyyli)-3-oleoyyli-sn-glyserolia, joka Öljyssä muodostaa sisäisesti sammutetun 5 makromolekyylin. Fluoresenssi-intensiteetin kasvu aikayksi kössä entsyymin lisäämisen jälkeen mitataan kuten edellä.
Esimerkki 3; Määritettiin fosfolipaasi A2~aktiviteetti käyttämällä substraattia joka 2,0 ml:ssa sisältää 10 0,5 mM CaCl2 0,1 mM kananmuna-lesitiiniä 0,25 mM Na-deoksikolaattia 0,2 mM kolaattia 0,1 % (p-/til.) naudan seerumialbumiinia 15 50 mM tris-HCl, pH 7,0 40 yg fluoresoivaa fosfolipidiä
Fosfolipidinä voidaan käyttää seuraavia yhdisteitä: a) 1-(4-(3-pyrenyyli)-buturoyyli)-2-(6-bromiheksanoyyli)-sn-glysero-3-fosforyyliglyseroli 20 b) 1-(4-(3-pyrenyyli)-buturoyyli)-2-(6-bromiheksanoyyli)- sn-glysero-fosforyylietyleeniglykoli c) 1 - (heksatriakontanyyli) -2-(4-(3-pyrenyyli) -buturoyyli) -sn-glysero-3-fosforyyliglyseroli d) 1-(6-bromiheksanoyyli)-2-(4-(3-pyrenyyli)-buturoyyli) -sn- 25 glysero-3-fosforyylikoliini e) 1-(4-(2-antroyyli)-buturoyyli)-2-(6-bromiheksanoyyli)-sn-glysero-3-fosforyyliglyseroli f) 1-(10-(2-antroyyli)-dekanoyyli)-2-(10-(3,5-dibromi-4-me-toksifenyyli)-dekanoyyli)-sn-glysero-3-fosforyyliglysero- 30 li g) 1-(10-(2-antroyyli)-dekanoyyli)-3-linoleyyli-sn-glysero-li-2-fosforyylikoliini h) 1-(10-(3-pyrenyyli)-dekanoyyli)-3-(12-bromidodekanoyyli)-"snxglyseroli-2-fosforyylikoliini 1 2 63064
Lesitiini ja fluoresoiva yhdiste kuivattiin liuotinva-paaksi typpivirrassa. Sen jälkeen lisättiin Na-deoksikolaat-ti ja saatu seos ääniaaltosekoitettiin Branson-ääniaaltose-koittimella, mikrokärki asennossa 4. Sen jälkeen lisättiin 5 naudanseerumi-albumiini puskuriin liuotettuna. Substraatti oli pysyvä useita päiviä edellyttäen että siihen lisättiin 0,1 mM NaN^ mikrobikasvun estämiseksi.
2,0 ml:aan substraattia lisättiin 200 μΐ seerumia. Sekoittamisen jälkeen liuos siirrettiin kyvettiin. Hämmentämis-10 tä ei tarvita mikäli käytetään emulgoituja substraatteja.
Fluoresenssimuutokset mitattiin käyttämällä Kontron SFM-23 spektrofluorimetriä joka on varustettu magneettisesti sekoitettavalla kennolla (1,0 x 1,0 x 0,5 cm). Lämpötila säädettiin kryostaatilla 37°C:seen mittauksen ajaksi. Fluo-15 resenssisignaali syötettiin piirturiin. Eksitaatioaallonpi-tuus oli 343 nm pyrenyylin sisältäville yhdisteille ja 370 nm antroyyliryhmän sisältäville yhdisteille.ja muutoksia monomeerifluoresenssissa seurattiin aallonpituudella 400 nm vastaavasti 450 nm.
20 Esimerkki 4: Määritettiin lipaasiaktiviteetti käyttämällä substraattia joka 2,0 ml:ssa sisälsi 0,005 mM tributyriiniä 0,15 M NaCl 25 0,03% (til./til.) Span 80 ) 0,01% Tween 80 j detergenttejä 50 mM tris-HCl, pH 8,4 4,35 yg fluoresoivaa asyyliglyserolia.
Asyyliglyserolina voidaan käyttää 30 a) 1-(4-(3-pyrenyyli)-buturoyyli)-2-(6-bromlheksanoyyli)- 3-oleoyyli-sn-glyserolia b) 1-(4-(2-antroyyli)-buturoyyli)-2-(6-bromiheksanoyyli)- 3-oleoyyli-sn-glyserolia.
Claims (6)
1. Menetelmä rasvoja hajottavien entsyymien aktiivisuuden määrittämiseksi fluorometrisesti kyseistä entsyymiä 15 sisältävistä näytteistä, jossa menetelmässä entsyymiä sisäl- tävä näyte yhdistetään substraatin kanssa, joka si- __ sältää määritettävän entsyymin kanssa reagoivaa, fluoresoivalla ryhmällä substituoitua yhdistettä, substraatti eksi-toidaan ko. fluoresoivan ryhmän ominaisella heräteaallon-20 pituudella ja määritetään entsyymin aiheuttama muutos substraatin fluoresenssin intensiteetissä aikayksikössä ko. ryhmän ominaisella emissioaallonpituudella, mikä muutosnopeus on suoraan verrannollinen näytteen sisältämän entsyymin aktiviteettiin, tunnettu siitä, että yhdisteen 25 kaava on R1-0-CH, 2 ' ^ R -O-CH I r3-o-ch2 jossa a) ainakin kaksi ryhmistä R^, R^ ja R3 tarkoittaa 3-36 hiiliatomia sisältävää tyydytettyä tai tyydyttämätöntä asyyli-ryhmää, ja kolmas näistä voi tarkoittaa myös vetyä tai 3-36 30 hiiliatomia sisältävää tyydytettyä tai tyydyttämätöntä al-kyyliryhmää, tai 2 3 b) toinen ryhmistä R ja R tarkoittaa fosforyyliryhmää 14 6 30 6 4 o tl - P - OR , jossa R tarkoittaa vetyä, etanoliamiinia, ety-OH ' leeniglykolia, koliinia, glyserolia tai seriiniä, ja toinen, 1 sekä ryhmä R , tarkoittaa edellä määriteltyä asyyli- tai alkyyliryhmää, kuitenkin siten, että fosforyyliryhmään näh- 5 den 2-asemassa oleva hiiliatomi voi sisältää vain asyyli- ryhmän, ja jolloin yhdisteessä I asyyli- tai alkyyliryhmis-12 3 tä R , R ja R kulloinkin ainakin yksi on substituoitu fluoresoivalla ryhmällä, ja muista näistä ryhmistä toinen tai mahdollisesti molemmat voivat olla substituoituja fluo-10 resenssin sammuttavalla ryhmällä, ja että käytettäessä yhdistettä, jossa on kaksi fluoresoivaa ryhmää, fluoresenssia mahdollisesti herkistetään liittämällä toiseen fluoresoivaan ryhmään elektroneja luovuttavia ryhmiä ja toiseen elektroneja vetäviä ryhmiä.
2. Förfarande enligt patentkravet 1, kSnne-t e c k n a t dSrav, att sisom fluorescerande grupp an-30 vSndes pyrengrupper, varvid substratet exciteras pi en vig-lSngd av ca 320-345 nm, och fluorescensintensitetens förSnd-ringshastighet bestSmmes pi pyrenets monomervaglSngd,ca 63064 390-400 nm, eller dess eximervAglängd, ca 470 nm.
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tun nettu siitä, että fluoresoivana ryhmänä käytetään py-reeniryhmiä, jolloin substraatti eksitoidaan aallonpituudella noin 320-345 nm, ja fluoresenssi-intensiteettimuutos-nopeus määritetään joko pyreenin monomeeriaallonpituudella 20 noin 390-400 nm tai sen eksimeeriaallonpituudella noin 470 nm.
3. Förfarande enligt patentkravet 1 eller 2, k ä n -netecknat därav, att sAsom fluorescenssläckare an-vändes halogen, sAsom brom eller jod. 5 4. Förfarande enligt patentkravet 1, känneteck- n a t därav, att sAsom förening med formeln I användes 1-oleoyl-2-(4-(3-pyrenyl)-buturoyl)-3-oleoyl-sn-glycerol.
3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että fluoresenssin sammuttajana käytetään halogeenia, kuten bromia tai jodia.
4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tun nettu siitä, että kaavan I mukaisena yhdisteenä käytetään 1-oleoyyli-2-(4-(3-pyrenyyli)-buturoyyli)-3-oleoyyli-sn-glyserolia.
5. Förfarande enligt patentkravet 1, känneteck-n a t därav, att sAsom förening med formeln I användes 10 1,2-di-(4-(3-pyrenyl)-buturoyl)-sn-glycero-sn-3-fosforyl- glycerol.
5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, t u n -30 n e t t u siitä, että kaavan I mukaisena yhdisteenä käytetään 1,2-di-(4-(3-pyrenyyli)-buturoyyli)-sn-glysero-sn-3-fosforyyliglyserolia.
6. Patenttivaatimuksen 1 mukaisen menetelmän suorit- 15 63064 tamista varten tarkoitettu yhdiste/ tunnettu siitä/ että sen kaava on R^O-CH, 2 1 * R -O-CH I 3 1 R -0-CH2 jossa 12 3 a) ainakin kaksi ryhmistä R , R ja R tarkoittaa 3-36 hii-5 liatomia sisältävää tyydytettyä tai tyydyttämätöntä asyyli- ryhmää/ ja kolmas näistä voi tarkoittaa myös vetyä tai 3-36 hiiliatomia sisältävää tyydytettyä tai tyydyttämätöntä alkyyliryhmää, tai 2 3 b) toinen ryhmistä R ja R tarkoittaa fosforyyliryhmää O II
10. P - OR, jossa R tarkoittaa vetyä, etanoliamiinia, etylee- OH niglykolia, koliinia, glyserolia tai seriiniä, ja toinen, sekä ryhmä R , tarkoittaa edellä määriteltyä asyyli- tai alkyyliryhmää, kuitenkin siten, että fosforyyliryhmään nähden 2-asemassa oleva hiiliatomi voi sisältää vain asyyli- 15 ryhmän, ja jolloin yhdisteessä I asyyli- tai alkyyliryhmis-12 3 tä R , R ja R kulloinkin ainakin yksi on substituoitu fluoresoivalla ryhmällä, ja muista näistä ryhmistä toinen tai mahdollisesti molemmat voivat olla substituoituja fluoresenssin sammuttavalla ryhmällä, ja että käytettäessä yh-20 distettä, jossa on kaksi fluoresoivaa ryhmää, fluoresenssiä mahdollisesti herkistetään liittämällä toiseen fluoresoivaan ryhmään elektroneja luovuttavia ryhmiä ja toiseen elektroneja vetäviä ryhmiä. Patentkrav; 25 1· Förfarande för fluorometrisk bestämning av aktivi- teten av fettspjälkande enzymer i prov innehällande dylika \ enzymer, i vilket förfarande provet som innehäller enzymer förenas med ett substrat innehällande en förening, som är substituerad med en fluorescerande grupp ooh 63064 16 som reagerar med det enzym som skall bestSmmas, substratet exciteras pä den ifragavarande fluorescerande gruppens exci-teringsvaglängd och den av enzymet förorsakade förändringen i substratets fluorescensintensitet per tidsenhet bestämmes 5 pi ifragavarande grupps specifika emissionsviglängd/ vilken förändringshastighet är direkt proportionell mot enzymakti-viteten i provet, kännetecknat därav, att färeningen uppvisar fontein R1 -0-CH0 2 ' 1 R -O-CH I r3-o-ch2 i vilken 12 3 a) atminstone tva av grupperna R , R och R betecknar en 10 mättad eller omättad acylgrupp med 3-36 kolatomer, och den tredje kan beteckna Sven vSte eller en mSttad eller omättad alkylgrupp med 3-36 kolatomer, eller 2 3 b) den ena av grupperna R och R betecknar en fosforyl- 0 II grupp med formeln - P - OR, i vilken R betecknar väte, eta- OH 15 nolamin, etylenglykol, kolin, glycerol eller serin, och den andra, ävensom R , betecknar en ovan definierad acyl- eller alkylgrupp, dock sa att kolatomen i 2-ställningen i förhil-lande till fosforylgruppen kan innehilla endast en acylgrupp, och varvid i föreningen I alltid itminstone en av 12 3 20 acyl- eller alkylgrupperna R , R och R Sr substituerad med en fluorescerande grupp, och ytterligare en av eller eventuellt de bida övriga grupperna kan vara substituerade med en fluorescensslSckande grupp, och att vid anvSndning av en förening som innehäller tvi fluorescerande grupper, 25. luorescensen, om si önskas , sensibiliseras genera att i den ena gruppen införa elektronavgivande grupper och i den andra elektronattraherande grupper.
6. Förening för att genomföra förfarandet enligt patentkravet 1, kännetecknat därav, att den har formeln R -0-CH_ 2 ' ^ R -O-CH I 3 ' R -0-CH2 15. vilken 12 3 a) Atminstone tv A av grupperna R , R och R betecknar en mättad eller omättad acylgrupp med 3-36 kolatomer, och den tredje kan beteckna även väte eller en mättad eller omättad alkylgrupp med 3-36 kolatomer, eller 2 3 20 b) den ena av grupperna R och R betecknar en fosforylgrupp O n med formeln - P - OR, i vilken R betecknar väte, etanolamin, OH etylenglykol, kolin, glycerol eller serin, och den andra, ävensom R , betecknar en ovan definierad acyl- eller alkylgrupp, dock sA att kolatomen i 2-ställningen i förhAllande 25 tili fosforylgruppen kan innehAlla endast en acylgrupp, och varvid i föreningen I alltid Atminstone en av acyl- eller 12 3 alkylgrupperna R , R och R är substituerad med en fluore-scerande grupp, och ytterligare en av eller eventuellt de bada övriga grupperna kan vara substituerade med eri fluore-30 scenssläckande grupp, och att vid användning av en förening som innehAller tvA fluorescerande grupper, fluorescensen, om s A önskas, sensibiliseras genctn att i den ena gruppen införa elektronavgivande grupper och i den andra elektronattrahe-rande. grupper. s
Priority Applications (6)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FI810616A FI63064C (fi) | 1980-04-09 | 1981-02-27 | Foerfarande foer fluorometrisk bestaemning av aktiviteten av fettspjaelkande enzymer och medel foer att genomfoera foerfarandet |
| DE8181102650T DE3166904D1 (en) | 1980-04-09 | 1981-04-08 | Method of fluorometrically measuring the activity of fat-degrading enzymes and means for carrying out the method |
| CA000374931A CA1154453A (en) | 1980-04-09 | 1981-04-08 | Method of fluorometrically measuring the activity of fat-degrading enzymes and means for carrying out the method |
| EP81102650A EP0037583B1 (en) | 1980-04-09 | 1981-04-08 | Method of fluorometrically measuring the activity of fat-degrading enzymes and means for carrying out the method |
| AT81102650T ATE10112T1 (de) | 1980-04-09 | 1981-04-08 | Verfahren zur fluorimetrischen bestimmung der aktivitaet von fettspaltenden enzymen und mittel zur durchfuehrung dieses verfahrens. |
| US06/582,527 US4668623A (en) | 1980-04-09 | 1984-02-22 | Method of fluorometrically measuring the activity of fat-degrading enzymes |
Applications Claiming Priority (6)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FI801117 | 1980-04-09 | ||
| FI801117A FI801117A (fi) | 1980-04-09 | 1980-04-09 | Fluorometrisk bestaemning av aktiviteten av fettspjaelkande entzym |
| FI801258 | 1980-04-18 | ||
| FI801258 | 1980-04-18 | ||
| FI810616 | 1981-02-27 | ||
| FI810616A FI63064C (fi) | 1980-04-09 | 1981-02-27 | Foerfarande foer fluorometrisk bestaemning av aktiviteten av fettspjaelkande enzymer och medel foer att genomfoera foerfarandet |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FI810616L FI810616L (fi) | 1981-10-10 |
| FI63064B true FI63064B (fi) | 1982-12-31 |
| FI63064C FI63064C (fi) | 1983-04-11 |
Family
ID=27241036
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FI810616A FI63064C (fi) | 1980-04-09 | 1981-02-27 | Foerfarande foer fluorometrisk bestaemning av aktiviteten av fettspjaelkande enzymer och medel foer att genomfoera foerfarandet |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4668623A (fi) |
| EP (1) | EP0037583B1 (fi) |
| CA (1) | CA1154453A (fi) |
| DE (1) | DE3166904D1 (fi) |
| FI (1) | FI63064C (fi) |
Families Citing this family (23)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5991898A (ja) * | 1982-11-19 | 1984-05-26 | Toyo Jozo Co Ltd | リパ−ゼ活性測定用組成物 |
| DE3614647A1 (de) * | 1986-04-30 | 1987-11-05 | Euratom | 7-phenylessigsaeure-4-alkyl-coumarinylamide, verfahren zu ihrer herstellung sowie ihre verwendung in verfahren zur fluorometrischen bestimmung der aktivitaet von hydrolasen, insbesondere von penicillin-g-acylase |
| ATE159760T1 (de) * | 1988-07-08 | 1997-11-15 | Jbl Scient Inc | Herstellung und verwendung von fluoreszierenden benzothiazolderivaten |
| US5308766A (en) * | 1989-08-29 | 1994-05-03 | The Regents Of The University Of California | Hydrolytic enzyme inhibitors/inactivators and methods for using same |
| DE69029269T2 (de) * | 1989-08-29 | 1997-05-28 | The Regents Of The University Of California, Berkeley, Calif. | Neue inhibitoren für hydrolytische enzyme und substrate und bestimmungsverfahren, selbige einschliessende verfahren und testsätze |
| US5352673A (en) * | 1989-08-29 | 1994-10-04 | Dennis Edward A | Prodrugs |
| ATA102994A (de) * | 1994-05-19 | 1995-03-15 | Hermetter Albin Dr | Fluoreszenzbestimmung der aktivität lipolytischer enzyme |
| US5567596A (en) * | 1994-12-29 | 1996-10-22 | Research Foundation Of State University Of New York | Rapid assay of activators and inhibitors of clotting |
| GB9525403D0 (en) * | 1995-12-13 | 1996-02-14 | Univ Sunderland | Method for monitoring enzymes |
| US5908751A (en) * | 1996-04-26 | 1999-06-01 | Toyo Ink Mfg. Co., Ltd. | Method for detecting and/or determining ATP from microorganism cells in a sample |
| US6066446A (en) * | 1997-12-19 | 2000-05-23 | Nen Life Science Products, Inc. | Assay member and method for its manufacture |
| US5972595A (en) * | 1997-12-19 | 1999-10-26 | Nen Life Science Products, Inc. | Enzyme assay using a solid phase substrate |
| DE19919634C2 (de) * | 1999-04-30 | 2001-06-07 | Aventis Pharma Gmbh | Test zur Bestimmung der Integrität komplexer Phospholipid/Lipid-Strukturen mit Hilfe synthetischer fluoreszenz-markierter Acylglyceride und dessen Anwendung zur Bestimmung der Aktivität von Lipasen |
| JP4111669B2 (ja) | 1999-11-30 | 2008-07-02 | シャープ株式会社 | シート製造方法、シートおよび太陽電池 |
| AU2003215175A1 (en) * | 2002-02-13 | 2003-09-04 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Fluorescent phospholipase assay, phospholipase a2 inhibitor and stimulator, and the use thereof |
| US7968306B2 (en) | 2002-02-13 | 2011-06-28 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Method for measuring activity of a specific fraction of albumin |
| ATE412641T1 (de) * | 2002-03-27 | 2008-11-15 | Fujifilm Corp | Iodierte triglycerid-derivate |
| WO2005005977A2 (en) * | 2003-06-30 | 2005-01-20 | Applera Corporation | Fluorescent phospholipase assays and compositions |
| EP1690089A1 (en) * | 2003-11-26 | 2006-08-16 | Applera Corporation | Fluorogenic homogeneous binding assay methods and compostions |
| AU2004305039A1 (en) * | 2003-12-12 | 2005-07-07 | Qtl Biosystems Llc | Metal ion mediated fluorescence superquenching assays, kits and reagents |
| CA2654743C (en) * | 2005-07-27 | 2015-04-07 | Technische Universitaet Graz | Oxidised phospholipids comprising a fluorophore moiety and use in the determination of the presence of enzymes having antiatherogenetic activity |
| RU2517746C1 (ru) * | 2012-11-22 | 2014-05-27 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук (ИБХ РАН) | Флуоресцентный зонд и тест-система для определения активности фосфолипазы а2 |
| CN103242474B (zh) * | 2013-05-08 | 2015-04-29 | 南京大学 | 磷酰胆碱结构修饰的苝酰亚胺衍生物及其制备方法 |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CH524994A (de) * | 1967-04-14 | 1972-07-15 | Meyer Bertenrath Juergen Dr Dr | Mittel zur Bestimmung von Pankreas-Enzymen in Körperflüssigkeiten |
| US3741876A (en) * | 1970-08-06 | 1973-06-26 | Mason Res Inst Inc | Method of measuring enzyme reaction rates |
| US3986930A (en) * | 1974-05-28 | 1976-10-19 | Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd. | Lipase activity determining method and reagent |
| US4261968A (en) * | 1979-05-10 | 1981-04-14 | Syva Company | Fluorescence quenching with immunological pairs in immunoassays |
| FI60700C (fi) * | 1980-04-09 | 1982-03-10 | Ksv Chemicals Oy | Foerfarande foer framstaellning av 1,2-diacyl-sn-glyceroler |
-
1981
- 1981-02-27 FI FI810616A patent/FI63064C/fi not_active IP Right Cessation
- 1981-04-08 DE DE8181102650T patent/DE3166904D1/de not_active Expired
- 1981-04-08 CA CA000374931A patent/CA1154453A/en not_active Expired
- 1981-04-08 EP EP81102650A patent/EP0037583B1/en not_active Expired
-
1984
- 1984-02-22 US US06/582,527 patent/US4668623A/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| FI810616L (fi) | 1981-10-10 |
| EP0037583B1 (en) | 1984-10-31 |
| EP0037583A1 (en) | 1981-10-14 |
| FI63064C (fi) | 1983-04-11 |
| US4668623A (en) | 1987-05-26 |
| CA1154453A (en) | 1983-09-27 |
| DE3166904D1 (en) | 1984-12-06 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| FI63064B (fi) | Foerfarande foer fluorometrisk bestaemning av aktiviteten av fettspjaelkande enzymer och medel foer att genomfoera foerfarandet | |
| JP3413144B2 (ja) | 蛍光性ベンゾチアゾール誘導体の製法及び用途 | |
| Reynolds et al. | 1-Hexadecyl-2-arachidonoylthio-2-deoxy-sn-glycero-3-phosphorylcholine as a substrate for the microtiterplate assay of human cytosolic phospholipase A2 | |
| EP0970239B1 (en) | Detection of microbial metabolites | |
| Thuren et al. | Fluorometric assay for phospholipase A2 in serum. | |
| Hendrickson et al. | Continuous fluorometric assay of phospholipase A2 with pyrene-labeled lecithin as a substrate | |
| Bayburt et al. | Continuous, vesicle-based fluorimetric assays of 14-and 85-kDa phospholipases A2 | |
| JP4163506B2 (ja) | 細菌代謝産物の検出 | |
| US20110312008A1 (en) | Enzymatic Assay for the Quantitative Determination of Phospholipase A1 or A2 Activity in a Sample | |
| US4962024A (en) | Signal enhancement in assay for an enzyme | |
| US5512429A (en) | Assay for enzyme activity | |
| Zandonella et al. | Enantiomeric perylene‐glycerolipids as fluorogenic substrates for a dual wavelength assay of lipase activity and stereoselectivity | |
| US4777269A (en) | 7-Phenylacetic acid-4-alkyl-coumarinyl amides useful in fluorometric determination of the activity of hydrolases | |
| AU720542B2 (en) | Improved chemiluminescent 1,2-dioxetanes | |
| Wolf et al. | A sensitive assay of phospholipase using the fluorescent probe 2-parinaroyllecithin | |
| WO1997014954A9 (en) | Improved chemiluminescent 1,2-dioxetanes | |
| EP0493426B1 (en) | Assay for enzyme activity | |
| Blanchard et al. | A fluorescence-based assay for human type II phospholipase A2 | |
| Moreau | An evaluation of NBD-phospholipids as substrates for the measurement of phospholipase and lipase activities | |
| CA2751962A1 (en) | Enzymatic assay for the quantitative determination of phospholipase a1 or a2 activity in a sample | |
| US8512971B2 (en) | Compounds and methods of use thereof for assaying lysophospholipase D activity | |
| Yu et al. | Carbonothioate phospholipids as substrate for a spectrophotometric assay of phospholipase A2 | |
| RU2517746C1 (ru) | Флуоресцентный зонд и тест-система для определения активности фосфолипазы а2 | |
| Ellingson et al. | Comparison of the hydrolysis of phosphatidylethanolamine and phosphatidyl (N-acyl) ethanolamine in Dictyostelium discoideum amoebae | |
| RU2517538C1 (ru) | Фосфолипидный флуоресцентный зонд и тест-система для определения активности фосфолипазы а2 в сыворотке крови |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM | Patent lapsed |
Owner name: KSV-CHEMICALS OY |