FI57783C - FOERFARANDE FOER BESTAEMNING AV KOLESTEROL - Google Patents
FOERFARANDE FOER BESTAEMNING AV KOLESTEROL Download PDFInfo
- Publication number
- FI57783C FI57783C FI941/74A FI94174A FI57783C FI 57783 C FI57783 C FI 57783C FI 941/74 A FI941/74 A FI 941/74A FI 94174 A FI94174 A FI 94174A FI 57783 C FI57783 C FI 57783C
- Authority
- FI
- Finland
- Prior art keywords
- cholesterol
- spec
- streptomyces
- candida
- determining
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
- C12N9/18—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/60—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving cholesterol
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/8215—Microorganisms
- Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
- Y10S435/827—Actinoplanes
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/8215—Microorganisms
- Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
- Y10S435/886—Streptomyces
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/8215—Microorganisms
- Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
- Y10S435/886—Streptomyces
- Y10S435/893—Streptomyces chartreusis
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/8215—Microorganisms
- Y10S435/911—Microorganisms using fungi
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/8215—Microorganisms
- Y10S435/911—Microorganisms using fungi
- Y10S435/913—Aspergillus
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/8215—Microorganisms
- Y10S435/911—Microorganisms using fungi
- Y10S435/921—Candida
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/8215—Microorganisms
- Y10S435/911—Microorganisms using fungi
- Y10S435/921—Candida
- Y10S435/922—Candida albicans
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/8215—Microorganisms
- Y10S435/911—Microorganisms using fungi
- Y10S435/933—Penicillium
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
1--.---- Γβ1 KUULUTUSJULICAISU £-0,70-7 jSK -M ^UTLÄCGNINGSSKRIFT 5 77831 --.---- Γβ1 ADVERTISING PUBLIC £ -0.70-7 jSK -M ^ UTLÄCGNINGSSKRIFT 5 7783
c Patirnlti rayutii'ii tty i'O 10 . voOc Patirnlti rayutii'ii tty i'O 10. VOO
Patent-seddelat ---- (51) Ky.ik.Va.3 C 12 Q 1/60, G 01 N 33/92Patent applications ---- (51) Ky.ik.Va.3 C 12 Q 1/60, G 01 N 33/92
SUOMI —FINLAND (21) P»MMtJhtk«rw*-f*»t*nen«eki»»nl 9J+1MFINLAND —FINLAND (21) P »MMtJhtk« rw * -f * »t * nen« eki »» nl 9J + 1M
(22) Hslnffliiptlvt—AiN»knmpd« 27.03-71* (23) Alkvpaivl—GiMglMttda| 27-03-7^ (41) Tuikit {ulkMui — BIMt effmtllf 29.09.7k(22) Hslnffliiptlvt — AiN »knmpd« 27.03-71 * (23) Alkvpaivl — GiMglMttda | 27-03-7 ^ (41) Tuikit {ulkMui - BIMt effmtllf 29.09.7k
Htmttl. I» r«kl>tTih»llltOT ,.k*U*Um ,«n.-Htmttl. I »r« kl> tTih »llltOT, .k * U * Um,« n.-
Patent- och regicteratyrelMn ' ' AmMcm utiagdoch utUkrifne pubMcwad 30.06.80 (32)(33)(31) P)74«t*y «*»oilw»«—Begird priority 28.03*73 - 03.0U.73 Saksan Liittotasavalta-Förbunds- republiken Tyskland(DE) P 2315501.3, p 2316637.2 * (71) Boehringer Mannheim GmbH., Sandhofer Strasse 112-132, D-6800 Mannheim-Patent- och regicteratyrelMn '' AmMcm utiagdoch utUkrifne pubMcwad 30.06.80 (32) (33) (31) P) 74 «t * y« * »oilw» «- Begird priority 28.03 * 73 - 03.0U.73 Federal Republic of Germany-Förbunds - Republic of Germany (DE) P 2315501.3, p 2316637.2 * (71) Boehringer Mannheim GmbH., Sandhofer Strasse 112-132, D-6800 Mannheim-
Waldhof, Saksan Liittotasavalta-Förbundsrepubliken Tyskland(DE) (72) Klaus Beaucamp, Tutzing/Obb., Hans Mollering, Tutzing/Obb., Gunter Lang, Tutzing/Obb., Wolfgang Gruber, Tutzing/Obb., Peter Roeschlau, Tutzing/Obb., Saksan Liittotasavalta-Förbundsrepubliken Tyskland(LE) (7U) Berggren Oy Ab (5U) Menetelmä kolesterolin määrittämiseksi - Förfarande för bestämning av kolesterolWaldhof, Federal Republic of Germany Förbundsrepubliken Tyskland (DE) (72) Klaus Beaucamp, Tutzing / Obb., Hans Mollering, Tutzing / Obb., Gunter Lang, Tutzing / Obb., Wolfgang Gruber, Tutzing / Obb., Peter Roeschlau, Tutzing / Obb., Federal Republic of Germany Förbundsrepubliken Tyskland (LE) (7U) Berggren Oy Ab (5U) Method for the determination of cholesterol - Förfarande för bestämning av cholesterol
Esillä oleva keksintö koskee menetelmää kolesterolin määrittämiseksi ja tällöin joko kokonaiskolesterolin tai sitoutuneen kolesterolin määrittämistä.The present invention relates to a method for the determination of cholesterol and thus to the determination of either total cholesterol or bound cholesterol.
Kolesteroli esiintyy biologisessa materiaalissa, kuten esim. seerumissa yms., osittain vapaassa muodossa ja osittain sitoutuneessa muodossa esterinä. Sitoutuneen kolesterolin tai kokonaiskolesterolin määrittämiseksi on tarpeellista vapauttaa ensin sitoutu- - neessa muodossa oleva kolesteroli. Tämä on tapahtunut tähän asti saippuoimalla aikalisissä olosuhteissa käyttäen esim. alkoholipitoista kalilipeää. Saippuoimisen jälkeen voidaan vapautettu kolesteroli määrittää jollain tunnetulla menetelmällä joko kemiallisesti tai entsymaattisesti. Kemiallinen määritys voi tapahtua esim. Liebermann-Burchard-menetelmällä, ja entsymaattinen määritys voidaan suorittaa käyttäen kolesterolioksidaasia, kolesterolidehydrogenaa-sia tai kolesterolidehydraasia. Koska tunnetusti yksittäisillä ko-lesteroliesterillä sekä myös vapaalla kolesterolilla on kemiallisissa määritysmenetelmissä erilaiset ekstinktiokertoimet, on tarpeellista, että kolesteroliesteri muutetaan alkalisen hydrolyy- sin avulla vapaaksi kolesteroliksi.Cholesterol is present in biological material, such as serum and the like, in a partially free form and in a partially bound form as an ester. In order to determine bound cholesterol or total cholesterol, it is necessary to first release the cholesterol in bound form. This has hitherto been done by saponification under temporal conditions using, for example, alcoholic potassium liquor. After saponification, the released cholesterol can be determined by any known method, either chemically or enzymatically. The chemical assay can be performed, e.g., by the Liebermann-Burchard method, and the enzymatic assay can be performed using cholesterol oxidase, cholesterol dehydrogenase, or cholesterol dehydrase. Since it is known that individual cholesterol esters as well as free cholesterol have different extinction coefficients in chemical assays, it is necessary that the cholesterol ester be converted to free cholesterol by alkaline hydrolysis.
5778357783
Joka tapauksessa on alkalinen sitoutuneen kolesterolin saippuoiminen häiritsevä ja aikaa vaativa menetelmän vaihe. Tämän lisäksi on otettava huomioon, että käytetyt suhteellisen voimaakkaat rea-genssit voivat aiheuttaa kolesterolin hajoamisen. Tällaisen hajoamisen ja väärien analyysitulosten estämiseksi on hydrolyysi suoritettava suhteellisen lievissä olosuhteissa, joka taas puolestaan pidentää haitallisesti määritykseen tarvittavaa aikaa.In any case, alkaline saponification of bound cholesterol is a disruptive and time consuming step in the process. In addition, it must be borne in mind that the relatively strong reagents used can cause cholesterol to decompose. To prevent such degradation and erroneous analytical results, the hydrolysis must be performed under relatively mild conditions, which in turn adversely prolongs the time required for the determination.
Erittäin haitallinen on kolesterolin alkalinen vapauttaminen silloin, kun kolesterolin määrityksen yhteydessä on käytettävä edullisempia entsymaattisia menetelmiä. Koska entsyymit tulevat tunnetusti inaktiivisiksi voimaakkaasti alkalisessa väliaineessa, on hydrolysaatti saatettava happoa lisäämällä pH-arvoon 5-8 ennen ent-symaattisen määrityksen suorittamista. Kaikki tämä aiheuttaa sen, että kokonaiskolesterolinpitoisuuden ja sitoutuneen kolesterolipitoisuuden määritys kestää yhä pidemmän ajan ja vaatii paljon työtä.Alkaline release of cholesterol is very detrimental when more favorable enzymatic methods have to be used in the determination of cholesterol. Since the enzymes are known to become strongly inactive in an alkaline medium, the hydrolyzate must be brought to pH 5-8 by adding acid before performing the enzymatic assay. All of this causes the determination of total cholesterol and bound cholesterol to take longer and longer and requires a lot of work.
Esillä olevan keksinnön tehtävänä on tämän johdosta aikaansaada sellainen menetelmä kokonaiskolesterolin tai sitoutuneen kolesterolin määrittämiseksi, jonka avulla vältetään edellä mainitut haitat.It is therefore an object of the present invention to provide a method for the determination of total cholesterol or bound cholesterol which avoids the above-mentioned disadvantages.
Keksinnön mukaisesti voidaan tämä toteuttaa menetelmällä kokonaiskolesterolin tai sitoutuneen kolesterolin määrittämiseksi vapauttamalla sitoutunut kolesteroli ja määrittämällä tämän jälkeen vapautunut kolesteroli tunnetuilla menetelmillä, jolle menetelmälle on luonteenomaista se, että sitoutunut kolesteroli vapautetaan mikro-organismista saadun kolesteroliesteraasin avulla.According to the invention, this can be carried out by a method for determining total cholesterol or bound cholesterol by releasing bound cholesterol and then determining the released cholesterol by known methods, which method is characterized in that bound cholesterol is released by cholesterol esterase obtained from a microorganism.
On todettu, että kolesteroliesteraasin avulla voidaan toteuttaa nopea ja kvantitatiivinen sitoutuneen kolesterolin saippuoiminen. Tämä menetelmä on erittäin edullinen varsinkin silloin, kun vapautetun kolesterolin määritys tapahtuu entsymaattisesti esim. käyttäen kolesterolioksidaasia tai kolesterolidehydraasia. Tässä tapauksessa mahdollistaa keksinnön mukainen menetelmä kolesterolin täys-entsymaattisen määrityksen ja muodostaa täten ratkaisevan parannuksen lääketieteelliseen rutiinidiagnostiikkaan sekä menetelmän helpon soveltamisen automaattisten analyysien suorittamiseen.It has been found that cholesterol esterase can be used to rapidly and quantitatively saponify bound cholesterol. This method is very advantageous, especially when the determination of the released cholesterol is carried out enzymatically, e.g. using cholesterol oxidase or cholesterol dehydrase. In this case, the method according to the invention enables the full enzymatic determination of cholesterol and thus constitutes a decisive improvement in routine medical diagnostics as well as the easy application of the method for performing automated analyzes.
Aikaisemmin on ollut jo tunnettua, että haimassa, maksassa ja Nocardia restrictuksessa esiintyy kolesteroliesteraasivaikutus. Tästä ei kuitenkaan ole voitu päätellä, että tällainen entsyymi kykenisi aikaansaamaan nopean ja täydellisen kolesteroliestereiöen saip-puoitumisen kvantitatiivisen analyysimenetelmän puitteissa sillä todetut lohkeamistuotteet eivät olleet kvantitatiivisia vaan saavutti- 3 57783 vat korkeintaan arvon 80 % (Biochimica et Biophysica Acta 270 (1972) 156-166). Edelleen esiintyy sitoutunut kolesteroli biologisessa materiaalissa hyvin erilaisten happojen estereiden muodossa. Analyysimenetelmän käyttökelpoisuuden kannalta on edellytyksenä se, että kaikki esiintyvät esterit hajoavat kvantitatiivisesti suunnilleen samalla nopeudella ja samalla helppoudella. Näiden entsyymien tunnettujen ominaisuuksien perusteella on yllättävää, että kdlesterolies-teraasi kykenee lohkaisemaan kvantitatiivisesti kaikki esiintyvät ko-lesteriiniesterit erittäin lyhyen ajan kuluessa. Tämä on yllättävää erikoisesti myös sen johdosta, koska on ollut tunnettua, että tunnet-tuja kolesteroliesteraaseja käytettäessä on esiintynyt huomattavia eroavaisuuksia niiden tehokkuudessa erilaisten kolesteroliesterien suhteen.It has previously been known that cholesterol esterase activity occurs in the pancreas, liver, and Nocardia restrictus. However, it has not been possible to conclude from this that such an enzyme would be able to achieve rapid and complete saponification of the cholesterol ester in the quantitative analysis method, as the cleavage products found were not quantitative but reached up to 80% (Biochimica et Biophysica) ). Bound cholesterol is still present in biological material in the form of esters of very different acids. A prerequisite for the usefulness of the analytical method is that all the esters present are quantitatively degraded at approximately the same rate and with the same ease. Given the known properties of these enzymes, it is surprising that kdlesteroliesase is capable of quantitatively cleaving all cholesterol esters present in a very short time. This is also surprising, especially since it has been known that there have been considerable differences in the efficacy of known cholesterol esterases with respect to different cholesterol esters.
Keksinnön mukaiset mikro-organismeista saadut kolesterolieste-raasit ovat osoittautuneet, mitä tulee lohkaisunopeuteen ja tehokkuuteen, mitä erilaisimpiin muualta peräisin oleviin kolesterolies-tereihin nähden ylivoimaisiksi.The cholesterol esterases produced by the microorganisms according to the invention have proven to be superior to a wide variety of cholesterol esters from elsewhere in terms of cleavage rate and efficiency.
Edelleen on todettu, että erilaiset mikro-organismit sisältävät erittäin aktiivisia kolesteroliesteraaseja ja niitä voidaan käyttää keksinnön mukaisen menetelmän puitteissa sellaisinaan kolesteroliesteraaseja erottamatta ja niitä puhdistamatta. Tällä on erittäin yksinkertaisen saatavuuden lisäksi myös se etu, että jättämällä pois kolesteroliesteraasien jokainen erottaminen ja rikastaminen vältetään vaara , että käytännössä tavallisesti esiintyvään useairpien erilaisten kolesteroliestereiden suhteen spesifisten kolesterolieste-raasien seokseen olisi kohdistettava sellaiset erottamistoimerpiteet, jotka vaikeuttaisivat kaiken sitoutuneen kolesterolin kvantitatiivista to-- teamista.It has further been found that various microorganisms contain highly active cholesterol esterases and can be used as such in the process of the invention without isolating and purifying the cholesterol esterases. In addition to very simple availability, this also has the advantage that by eliminating each separation and enrichment of cholesterol esterases, there is a risk that a mixture of cholesterol esterases specific for many different cholesterol esters would be subjected to separation measures that would complicate the quantification of all bound cholesterol.
Tämän lisäksi on otettava huomioon, että tavallisesti lipoi-dikalvoihin sitoutuneiden kolesteroliesteraasien puhdistaminen on monimutkaista ja johtaa tämän johdosta sellaiseen valmisteeseen, joka hintansa johdosta soveltuu huonommin tavanomaiseen diagnostiikkaan minkäänlaista entsyymipuhdistusta tarvitsevaan mikro-organismi-preparaattiin verrattuna.In addition, it must be borne in mind that the purification of cholesterol esterases normally bound to lipid membranes is complicated and therefore results in a preparation which, because of its cost, is less suitable for conventional diagnostics than any microorganism preparation requiring any enzyme purification.
Erittäin edullisia tuloksia on saatu keksinnön mukaista menetelmää sovellettaessa käytettäessä kolesteroliesteraasia, joka on saatu Candida rugosa (nimitetään myös nimellä Cylindracea) ATCC 14830 vast. WS 90031 ja Aspergillus spec. WS 90030 kannoista. Nämä “ 57783 molemmat mikro-organismit voidaan lisätä suoraan sellaisinaan tai liuotetussa muodossa, esim. asetonikuivajauheena, keksinnön puitteissa. Luonnollisesti on myös mahdollista käyttää näistä mikro-organismeista saatua rikastettua kolesteroliesteraasipreparaattia, jolloin erikoisetuna on se, että määrätty rikas tus voidaan aikaansaada erittäin yksinkertaisesti. Mainittu Candida rugosa muodostaa suurteknisessä mittakaavassa valmistetun mikro-organismin, jota pidetään kaupan. Käyttökelpoinen kaupallinen muoto on esim. laktoosin avulla stabiloitu asetonikuivajauhe, joka on osoittautunut edulliseksi keksinnön tarkoituksiin käytettäväksi. Saman kaltaisia edullisia ominaisuuksia on todettu seuraavilla kannoilla:Very advantageous results have been obtained using the method according to the invention using cholesterol esterase obtained from Candida rugosa (also called Cylindracea) ATCC 14830 resp. WS 90031 and Aspergillus spec. WS 90030 strains. Both of these microorganisms can be added directly as such or in dissolved form, e.g. as acetone dry powder, within the scope of the invention. Of course, it is also possible to use an enriched cholesterol esterase preparation obtained from these microorganisms, with the particular advantage that a certain enrichment can be achieved very simply. Said Candida rugosa forms a microorganism produced on a large technical scale which is marketed. A useful commercial form is, for example, lactone-stabilized acetone dry powder, which has proven to be advantageous for use in the invention. Similar advantageous properties have been found in the following strains:
Actinomyces aureoverticillium WS 90002Actinomyces aureoverticillium WS 90002
Actinomyces cyaneofuscatus WS 90003Actinomyces cyaneofuscatus WS 90003
Actinomyces griseomycini WS 90004Actinomyces griseomycini WS 90004
Actinomyces longisporus-fl. WS 90005Actinomyces longisporus-fl. WS 90005
Actinomyces malachiticus WS 90006Actinomyces malachiticus WS 90006
Actinomyces roseolus WS 90007Actinomyces roseolus WS 90007
Actinomyces toxytricini WS 90008Actinomyces toxytricini WS 90008
Actinomyces variabilis WS 90009Actinomyces variabilis WS 90009
Streptomyces spec. WS 90010Streptomyces spec. WS 90010
Streptomyces autotropicus WS 90011Streptomyces autotropicus WS 90011
Streptomyces canescens WS 90012Streptomyces canescens WS 90012
Streptomyces chartreusis WS 90013Streptomyces chartreusis WS 90013
Streptomyces michiganensis WS 90014Streptomyces michiganensis WS 90014
Streptomyces murinus WS 90015Streptomyces murinus WS 90015
Streptomyces hachijoensis WS 90016Streptomyces hachijoensis WS 90016
Streptomyces caelestes WS 90017Streptomyces caelestes WS 90017
Streptomyces tendae WS 90018Streptomyces tendae WS 90018
Nocardia rubra WS 90019Nocardia rubra WS 90019
Candida mycoderma WS 90020Candida mycoderma WS 90020
Candida albicans WS 90021Candida albicans WS 90021
Candida albicans WS 90022Candida albicans WS 90022
Candida albicans WS 90023Candida albicans WS 90023
Candida spec. WS 90024Candida spec. WS 90024
Cunninghamella elegans WS 90025Cunninghamella elegans WS 90025
Mueor mucedo WS 90026Mueor mucedo WS 90026
Rhizopus spec. WS 90027Rhizopus spec. WS 90027
Penicillium spec. WS 90028Penicillium spec. WS 90028
Aspergillus spec. WS 90029 5 57783Aspergillus spec. WS 90029 5 57783
Mikrobiologista alkuperää olevien edullisempien kolestero-liesteraasien ohella voidaan kuitenkin myös käyttää useissa tapauksissa muualta peräisin olevia kolesteroliesteraaseja.However, in addition to the more preferred cholesterol esterases of microbiological origin, cholesterol esterases from elsewhere can also be used in many cases.
Kuten edellä mainittiin, on esillä olevan keksinnön mukaisen menetelmän eräs tärkeä etu se, että tulee mahdolliseksi suorittaa täys-entsymaattinen kolesterolin kokonaismääräys. Tällöin on merkityksellistä se, että käytettäessä mikro-organismeista saatuja edullisimpia kolesteroliesteraasipreparaatteja, tulee kolesterolin nopea ja kvantitatiivinen vapautuminen estereistään mahdolliseksi. Erikoisesti käytettäessä edellä mainittuja edullisimpia mikro-organismeja, on mahdollista lisäämällä niitä suoraan erittäin vähäisessä määrässä» ja säilyttäen pH-arvo- ja lämpötilaolosuhteet sellaisina kuin ne ovat toivottavat seuraavassa entsymaattisessa kolesterolimääräyksessä, aikaansaada muutamien minuuttien kuluessa kolesterolin kvantitatiivinen vapautuminen. Tällöin on todettu, etteivät muut hiilihydraatti-perusteiset stabiloimisaineet, joita on käytetty tällaisten mikro-organismien yhteydessä, häiritse kolesterolin määritystä tällaisen täysentsymaattisen menetelmän puitteissa.As mentioned above, an important advantage of the method of the present invention is that it becomes possible to perform a fully enzymatic total cholesterol assay. In this case, it is important that the use of the most advantageous cholesterol esterase preparations obtained from microorganisms makes it possible to release cholesterol rapidly and quantitatively from its esters. In particular, when using the most preferred microorganisms mentioned above, it is possible to achieve a quantitative release of cholesterol within a few minutes by adding them directly in very small amounts and maintaining the pH and temperature conditions as desired in the next enzymatic cholesterol assay. In this case, it has been found that other carbohydrate-based stabilizers used in connection with such microorganisms do not interfere with the determination of cholesterol in the context of such a full enzymatic method.
Kuten jo mainittiin, voidaan keksinnön mukaisessa menetelmässä käyttää myös erotettua ja rikastettua kolesteroliesteraasia, joka on saatu mikro-organismeista. Sopiva rikastus voidaan aikaansaada lähdettäessä mikro-organismin tai sen kaltaisen biologisen materiaalin asetonikuivajauheesta ja tähän kohdistetaan dialyysikäsittely heikosti emäksisellä anioninvaihtajalla ja ammo-niumsulfaattifraktioiminen. Tällöin voidaan helposti suorittaa ko-lestroliesteraasin 20- ja aina 30-kertainen rikastaminen. Heikosti emäksisenä anioninvaihtajana on erittäin sopivaksi todettu dietyyli-aminoetanoliryhmillä modifioitu hiilihydraattiperusteinen preparaatti. Ammoniumsulfaattifraktioinnissa otetaan talteen edullisesti fraktio välillä 1,8 ja 2,¾ moolia ammoniumsulfaattia. Täten saatu entsyymifraktio kromatografoidaan tämän jälkeen edullisesti mainittua ioninvaihtomateriaalia käyttäen.As already mentioned, isolated and enriched cholesterol esterase obtained from microorganisms can also be used in the method according to the invention. Suitable enrichment can be obtained starting from the acetone dry powder of the microorganism or similar biological material and subjected to dialysis treatment with a weakly basic anion exchanger and ammonium sulfate fractionation. In this case, 20- and up to 30-fold enrichment of cholesterol esterase can easily be performed. As a weakly basic anion exchanger, a carbohydrate-based preparation modified with diethylaminoethanol groups has been found to be very suitable. In the ammonium sulphate fractionation, a fraction between 1.8 and 2.2 mol of ammonium sulphate is preferably recovered. The enzyme fraction thus obtained is then chromatographed preferably using said ion exchange material.
Erittäin edullisia tuloksia on aikaansaatu keksinnön puitteissa käyttämällä sellaisia mikro-organismeja, jotka on viljelty käyttäen kolesteroliesteripitoista elatusväliainetta. Tällöin voidaan kolesteroliesteri tai kolesteroliesteriseos lisätä ainoaksi hiilen lähtöaineeksi viljelyn aikana tai käyttää sitä yhdessä jonkin muun hiilen lähtöaineen kanssa. Erittäin edullista on käyttää sellaisia mikro-organismeja, jotka on saatu useampivaiheisen viljelymenetelmän avulla, jolloin ne viljellään ensimmäisessä vaiheessa käyt- 6 57783 täen sopivaa hiiltä luovuttavaa ainetta, kuten glyseriiniä, ja toisessa vaiheessa käyttäen kolesteroliesteriä. Eräs sopiva viljelymenetelmä on kuvattu esim. saksalaisissa hakemusjulkaisuissa n:ot 2 224 133 ja 2 307 518.Highly advantageous results have been obtained within the scope of the invention by the use of microorganisms cultured using a cholesterol ester-containing medium. In this case, the cholesterol ester or cholesterol ester mixture can be added as the sole carbon starting material during cultivation or used in combination with another carbon starting material. It is highly preferred to use microorganisms obtained by a multi-step culture method, in which case they are cultured in a first step using a suitable carbon donor such as glycerin and in a second step using a cholesterol ester. A suitable cultivation method is described, for example, in German Application Publication Nos. 2,224,133 and 2,307,518.
Keksinnön mukaisesti edullisesti käytetyllä Candida rugosa ATCC 14830-kannasta saadulla kolesteroliesteraasilla on heikosti happamalla alueella, välillä pH 5 ja 6,5» erittäin hyvä stabiilisuus. Entsyymin optimaalinen pH-arvo on 7»5· Entsyymin erikoislaatuisuus on siinä, että katalyyttisen reaktion erittäin hyvä kulku tapahtuu reaktioväliaineen suhteellisen suuressa suolapitoisuudessa. Tämän johdosta työskennellään edullisesti 0,2-0,8-m, erikoisesti 0,4-0,6-m puskuriliuoksessa. pH-arvo voi olla alueella välillä 4,5 ja 7,5 ja on edullisesti edellä mainitulla alueella välillä pH 5-6,5· Koleste-riiniesteraasin tehokkuuttanostetaan edullisesti lisäämällä pinta-ak-tiivisia aineita. Erittäin edullinen on hydroksipolyetoksidodekaani-lisäys.The cholesterol esterase from Candida rugosa ATCC 14830, preferably used according to the invention, has a very good stability in the weakly acidic range, between pH 5 and 6.5. The optimum pH of the enzyme is 7 »5 · The special feature of the enzyme is that the very good course of the catalytic reaction takes place at a relatively high salt content of the reaction medium. As a result, work is preferably carried out in a 0.2-0.8-m, especially 0.4-0.6-m, buffer solution. The pH value may be in the range between 4.5 and 7.5 and is preferably in the above-mentioned range between pH 5-6.5. · The efficiency of cholesterol esterase is preferably increased by the addition of surfactants. The addition of hydroxypolyethoxydodecane is very preferred.
Kuten edellä mainittiin, toteutetaan keksinnön mukainen menetelmä erittäin edullisesti täysentsymaattisesti, so. seuraava kolesterolimääritys tapahtuu myös entsymaattisesti käyttäen edullisesti kolesterolioksidaasia. Kuitenkin voidaan myös käyttää koles-terolidehydraasia tai kolesterolidehydrogenaasia.As mentioned above, the process according to the invention is very preferably carried out fully enzymatically, i.e. the subsequent cholesterol assay is also performed enzymatically using preferably cholesterol oxidase. However, cholesterol dehydrase or cholesterol dehydrogenase can also be used.
Kolesterolioksidaasin avulla tapahtuva määritys on kuvattu esimerkiksi saksalaisessa hakemusjulkaisussa n:o 2 224 132. Siinä kuvattu menetelmä voidaan yhdistää edullisesti keksinnön mukaisen menetelmän kanssa. Periaatteessa voidaan tällöin mitata hapen kulutus, ^Og-muodostus tai kolestenonin muodostuminen.The determination by means of cholesterol oxidase is described, for example, in German Patent Application No. 2,224,132. The method described therein can be advantageously combined with the method according to the invention. In principle, oxygen consumption, Og formation or cholestenone formation can then be measured.
Hapen kulutus voidaan mitata esim. kromatograafisesti, po-larometrisesti tai polarisaatiomenetelmällä. Nämä määräysmenetelmät ovat sinänsä tunnettuja. Muodostunut vetyperoksidi voidaan määrätä titraamalla potenticmetrisesti, polarograafisesti ja kolorimetrisesti sekä entsymaattisesti. Entsymaattinen määräys on edullisin käyttäen katalaasia tai peroksidaasia, erikoisesti määräys katalaasin avulla β-diketonien, kuten asetyyliasetonin, alempien alkohblien ja ammonium-ioni-pitoisen puskurin läsnäollessa, tai käyttäen määräystä peroksi-daasin avulla kromogeenin, kuten 2,2’-aminobentstiatsoliinisulfoni-hapon, läsnäollessa. Kolestenoni määrätään ketoreagenssien avulla käyttäen esim. 2,4-dinitrofenyylihydratsiinia, tai fotometrisesti arvossa 240 nm.Oxygen consumption can be measured, for example, chromatographically, polarometrically or by a polarization method. These ordering methods are known per se. The hydrogen peroxide formed can be determined by potentiometric, polarographic and colorimetric titration as well as enzymatically. An enzymatic assay is most preferred using a catalase or peroxidase, especially an assay using catalase in the presence of β-diketones such as acetylacetone, lower alcohols and ammonium ion-containing buffer, or using a peroxidase assay using a chromogen such as 2,2'-aminobenzthiazoline sulfone acid. Cholestenone is determined using keto reagents using, for example, 2,4-dinitrophenylhydrazine, or photometrically at 240 nm.
Siinä tapauksessa, että suoritetaan täysentsymaattinen kokonaiskolesterolin tai sitoutuneen kolesterolin määritys kolestero- 7 57783 lioksidaasin avulla, käytetään edullisesti sellaista, joka on saatu esim. kannoista Nocardia erythropolis ATCC 17895 5 Nocardia erythro-polis ATCC 4277* Nocardia formica ATCC 14811 tai Practinomyces erythropolis NCIB 9158.In the case of a fully enzymatic determination of total cholesterol or bound cholesterol by cholesterol oxidase, it is preferred to use one obtained, for example, from strains Nocardia erythropolis ATCC 17895 5 Nocardia erythro-Polis ATCC 4277 * Nocardia Formica ATCC 14811 or Practinomyces eryth
Keksinnön eräs toinen kohde on reagenssi kolesterolin määrittämiseksi, joka koostuu kolesteroliesteraasista, ja reagenssistä vapaan kolesterolin määrittämiseksi. Tällaisen reagenssin muodostaa edullisesti mikrobiologista alkuperää oleva kolesteroliesteraasi, kolesterolioksidaasi, järjestelmä ^Ojin määräämiseksi tai järjestelmä kolestenonin määräämiseksi. Aivan erikoisen edullinen on tällöin ' reagenssi, jossa käytetään kolesteroliesteraasina sellaista, joka on saatu jostain edellä mainitusta mikro-organismista erikoisesti asetonikuivajauheen muodossa, tai siitä saatua proteiinifraktiota, jolla on kolesteroliesteraasiaktiivisuus.Another object of the invention is a reagent for determining cholesterol, which consists of cholesterol esterase, and a reagent for determining free cholesterol. Such a reagent is preferably a cholesterol esterase of microbiological origin, a cholesterol oxidase, a system for determining cholesterol or a system for determining cholestenone. Very particular preference is given to a reagent which uses as cholesterol esterase one obtained from one of the above-mentioned microorganisms, in particular in the form of acetone dry powder, or a protein fraction obtained therefrom having cholesterol esterase activity.
Eräässä erikoisessa ja edullisessa toteuttamismuodossa muodostetaan tällainen reagenssi kolesterolioksidaasista, kolestero-liesteraasipreparaatista, joka on saatu jostain edellä mainitusta mikro-organismista, katalaasista, asetyyliasetonista, metanolista ja ammonium-ioneja sisältävästä puskurista, joita käytetään joko erikseen tai seoksena. Erään toisen edullisen toteuttamismuodon mukaisesti muodostetaan reagenssi kolesterolioksidaasista, jostain mainitusta kolesteroliesteraasiaktiivisuuden omaavan mikro-organismin muodostamasta preparaatista, peroksidaasista, kromogeenista ja puskurista joko erikseen tai seoksena. Kromogeenina käytetään edullisesti 2,2'-aminobentstiatsoliinisulfonihappoa.In a particular and preferred embodiment, such a reagent is formed from cholesterol oxidase, a cholesterol esterase preparation obtained from one of the above microorganisms, catalase, acetylacetone, methanol and ammonium ion-containing buffer, used either alone or in admixture. According to another preferred embodiment, the reagent is formed from cholesterol oxidase, a preparation of said microorganism having cholesterol esterase activity, a peroxidase, a chromogen and a buffer, either separately or as a mixture. 2,2'-Aminobenzthiazolinesulfonic acid is preferably used as the chromogen.
Erään toisen edullisen toteuttamismuodon mukaisesti muodostetaan keksinnön mukainen reagenssi kolesterolioksidaasista, jonkin mainitun mikro-organismin kolesteroliesteraasipreparaatista ja ketoryhmän kanssa hydratsonia muodostaen reagoivasta hydratsiinijoh-^ dannaisesta sekä sopivassa tapauksessa puskurista. Hydratsiinijoh dannaisena voidaan käyttää edullisesti 2,4-dinitrofenyylihydratsiinia.According to another preferred embodiment, the reagent according to the invention is formed from cholesterol oxidase, a cholesterol esterase preparation of one of said microorganisms and a hydrazine derivative which reacts with the keto group to form hydrazone and, if appropriate, a buffer. As the hydrazine derivative, 2,4-dinitrophenylhydrazine can be preferably used.
Edellä mainitut edulliset reagenssiyhdistelmät voivat sisältää esitettyjen pakollisten aineosien lisäksi myös tavanomaisia liuottimia, stabiloimisaineita ja/tai pinta-aktiivisia aineita. Kaikki nämä lisäaineet ovat asiantuntijalle tunnettuja ja tavanomaisia vetyperoksidin vast, kolestenonin määräysjärjestelmissä.In addition to the mandatory ingredients set forth above, the above-mentioned preferred reagent combinations may also contain conventional solvents, stabilizers and / or surfactants. All of these additives are known to those skilled in the art and are conventional in hydrogen peroxide or cholestenone delivery systems.
Edellä mainitut reagenssiyhdistelmät sisältävät edullisesti pääaineosiaan seuraavissa määräsuhteissa: 1. 13-150 U kolesterolioksidaasia, 0,05-0,5 mg mikro-orga- nismi-kolesteroliesteraasia, 2 x 10^ - 5 x 10^ U katalaasia, 0,05-0,2 8 57783 ml asetyyliasetonia ja 2-10 ml metanolia 100 ml:ssa ammoniumpitoista puskuria, pH 5-7, sekä sopivassa tapauksessa 0,02-0,3 ml pinta-aktiivista ainetta, edulliseksi hydroksipolyetoksidodekaania.The above reagent combinations preferably contain their main ingredients in the following proportions: 1. 13-150 U cholesterol oxidase, 0.05-0.5 mg microorganism cholesterol esterase, 2 x 10 ^ - 5 x 10 ^ U catalase, 0.05-0 , 287573 ml of acetylacetone and 2-10 ml of methanol in 100 ml of ammonium-containing buffer, pH 5-7, and, if appropriate, 0.02-0.3 ml of surfactant, preferably hydroxypolyethoxydodecane.
2. 3-40 U kolesterolioksidaasia, 0,05-0,5 mg mikro-organismi- kolesteroliesteraasia, sekä 2 x 10^ - 1 x 10^ U peroksidäasia, 50-200 mg 2,2’-aminobentstiatsoliinisulfonihappoa, sekä sopivassa tapauksessa 0,05-0,5 ml pinta-aktiivista ainetta, edullisesti hydroksipolyetoksidodekaania, 100 ml:ssa puskuria, pH 6-8.2. 3-40 U of cholesterol oxidase, 0.05-0.5 mg of microorganism cholesterol esterase, and 2 x 10 ^ - 1 x 10 ^ U of peroxidase, 50-200 mg of 2,2'-aminobenzthiazolinesulfonic acid, and optionally 0 .05-0.5 ml of surfactant, preferably hydroxypolyethoxydodecane, in 100 ml of buffer, pH 6-8.
3· 0,1-1 U kolesterolioksidaasi*, 0,05-0,5 mg mikro-orga- nismi-kolesteroliesteraasia, 1-5 ml 1-mimo. 2,4-dinitrofenyyli-hydratsiiniliuosta sekä sopivassa tapauksessa 0,005-0,1 ml pinta-aktiivista ainetta 10 ml:ssa puskuria, pH 6-8.3 · 0.1-1 U cholesterol oxidase *, 0.05-0.5 mg microorganism cholesterol esterase, 1-5 ml 1-mimo. 2,4-dinitrophenylhydrazine solution and, if appropriate, 0.005-0.1 ml of surfactant in 10 ml of buffer, pH 6-8.
4. 2-100 U kolesterolioksidaasia, 0,05-0,5 mg mikro-organis- mikolesteroliesteraasia, sekä sopivassa tapauksessa 0,1-2,0 ml pinta- -aktiivista ainetta (edullisesti hydroksipolyetoksidodekaania) 50 ml: ssa puskuria, pH 5-9, edullisesti 0,5-m natriumfosfaattipuskuria, pH 7,5.4. 2-100 U of cholesterol oxidase, 0.05-0.5 mg of microorganism cholesterol esterase, and, if appropriate, 0.1-2.0 ml of surfactant (preferably hydroxypolyethoxydodecane) in 50 ml of buffer, pH 5 -9, preferably 0.5 M sodium phosphate buffer, pH 7.5.
Keksinnön mukaista menetelmää ja reagenssia käytettäessä voidaan suorittaa erittäin nopea ja täydellinen sitoutuneen koles-teriinin saippuoiminen. Esimerkiksi kolesterolimäärlt.yksen olosuhteissa kolesterolioksidaasia keksinnön mukaisesti käytettäessä aikaansaadaan sitoutuneen kolesterolin kvantitatiivinen lohkeaminen 1-3 minuutin kuluessa lisättäessä Candida rugosa ATCC 14830- tai Aspergillus sp. WS 90030-asetonikuivajauhetta määrässä välillä 0,1 ja 0,3 mg.Using the method and reagent of the invention, very rapid and complete saponification of bound cholesterol can be performed. For example, under cholesterol quantification conditions, the use of cholesterol oxidase according to the invention provides quantitative cleavage of bound cholesterol within 1-3 minutes upon addition of Candida rugosa ATCC 14830 or Aspergillus sp. WS 90030 acetone dry powder in an amount between 0.1 and 0.3 mg.
Seuraavat esimerkit kuvaavat edelleen keksintöä.The following examples further illustrate the invention.
Esimerkki 1Example 1
Seerumista määritettiin käyttäen saksalaisen hakemus julkaisun n:o 2 224 132 esimerkissä 1 kuvattua menetelmää vapaa kolesterolipitoisuus 63 mg#:ksi (63 mg 100 ml:ssa). Sitoutuneen kolesterolin määrittämiseksi käsiteltiin seerumin vertailunäytettä 30 minuuttia alkoholipitoisella kalilipeällä lämpötilassa 70°C. Neutraloimisen ja läsnäolevan kolesterolin uuden mittauksen jälkeen saatiin kolesterolin kokonaispitoisuudeksi l8l mg#. Tästä ilmenee, että 118 mg ko-lesterolia/100 ml esiintyi sidotussa muodossa.Serum was determined to be 63 mg # (63 mg per 100 ml) of free cholesterol using the method described in Example 1 of German Application No. 2,224,132. To determine bound cholesterol, a serum reference sample was treated with alcoholic potassium hydroxide at 70 ° C for 30 minutes. After neutralization and a new measurement of the cholesterol present, a total cholesterol concentration of 181 mg # was obtained. This shows that 118 mg cholesterol / 100 ml was present in bound form.
Menetelmä toistettiin käyttäen käsittelemätöntä seerumia; kuitenkin määrityksen alussa lisättiin 0,3 mg (proteiinista laskettuna) Candida rugosa ATCC 14830-asetonikuivajauhetta kaupan olevassa muodossa. 3 minuutin kuluttua saatiin polarograafisen määräyksen perusteella kokonaiskolesterolipitoisuudeksi 183 mg#.The procedure was repeated using untreated serum; however, at the beginning of the assay, 0.3 mg (based on protein) of Candida rugosa ATCC 14830 acetone dry powder in commercial form was added. After 3 minutes, a total cholesterol content of 183 mg # was obtained by polarographic order.
9 577839 57783
Esimerkki 2Example 2
Kolesteroliesteraasiaktiivisuuden suurentamiseksi liuotettiin kaupan olevaa Candida rugosa ATCC 14830-asetonikuivajauhetta kaliumfosfaattipuskuriin, pH 6,0, ja dialysoitiin samaa puskuria käyttäen. Stabiloimisaineena käytetyn laktoosin poistamisen jälkeen oli spesifinen kolesteroliesteraasiaktiivisuus 0,3 U/mg proteiinia dialysoidussa liuoksessa.To increase cholesterol esterase activity, commercial Candida rugosa ATCC 14830 acetone dry powder was dissolved in potassium phosphate buffer, pH 6.0, and dialyzed using the same buffer. After removal of the lactose used as a stabilizer, the specific cholesterol esterase activity was 0.3 U / mg protein in the dialyzed solution.
Täten saatua liuosta sekoitettiin dietyyliaminoetanoli-ryhmillä modifioidun dekstraaniperusteisen ioninvaihtajan kanssa, ioninvaihtaja erotettiin ja elutoiminen suoritettiin 0,2-m fosfaat-~ tipuskurilla, pH 6,0. Eluaatin spesifinen kolesteroliesteraasiak- tiivisuus oli 1,2 U/mg.The solution thus obtained was mixed with a dextran-based ion exchanger modified with diethylaminoethanol groups, the ion exchanger was separated and eluted with 0.2 M phosphate buffer, pH 6.0. The specific cholesterol esterase activity of the eluate was 1.2 U / mg.
Täten saatu liuos fraktioitiin ammoniumsulfaattimenete1-^ mällä. Välillä 1,8 ja 2,4-ammoniumsulfaattia saadut proteiinifraktiot erotettiin. Spesifisen kolesteroliesteraasiaktiivisuuden arvo oli 2,5 U/mg.The solution thus obtained was fractionated by ammonium sulfate method. The protein fractions obtained between 1.8 and 2,4-ammonium sulfate were separated. The value of specific cholesterol esterase activity was 2.5 U / mg.
Saatu tuote liuotettiin uudelleen fosfaattipuskuriin, pH 6,0, dialysoitiin samaa puskuria käyttäen suolavapaaksi ja käsiteltiin sitten kromatograafisesti patsaassa, joka oli täytetty samalla anioninvaih-tajalla kuin edellä on esitetty. Eluutio tapahtui jälleen 0,2-m fosfaattipuskurilla, pH 6,0. Siinä fraktiossa, jossa esiintyi koles-teroliesteriaktiivisuus, spesifisen aktiivisuuden arvo oli 7 U/mg proteiinia.The resulting product was redissolved in phosphate buffer, pH 6.0, dialyzed against the same buffer to give it free of salt, and then chromatographed on a column packed with the same anion exchanger as described above. Elution was again with 0.2 M phosphate buffer, pH 6.0. In the fraction with cholesterol ester activity, the value of the specific activity was 7 U / mg protein.
Täten saatua rikastettua kolesteroliesteraasipreparaattia käsiteltiin esimerkissä 1 kuvatulla tavalla kolesteroiimäärityksessä. Lisätty määrä oli kuitenkin ainoastaan 0,001 mg proteiinista laskettuna. Tulos vastasi esimerkissä 1 saatua tulosta.The enriched cholesterol esterase preparation thus obtained was treated as described in Example 1 in a cholesterol assay. However, the amount added was only 0.001 mg based on protein. The result corresponded to the result obtained in Example 1.
Candida rugosasta saatu kolesteroliesteraasi voidaan puhdistaa tavanomaisilla entsyymin hienopuhdistusmenetelmillä. Edellä mainittujen rikastusvaiheiden sijasta voidaan käyttää myös muita biokemiallisia puhdistustoimenpiteitä, kuten esim. saostamista tai fraktioimista polyetyleeni-imiinin avulla tai orgaanisten liuottimien tai suolan muodostuksen avulla, kromatografiaa käyttäen mole-kyyliseuloja tai heikkoja anioninvaihtajia, joissa on muita funktionaalisia ryhmiä kuin dietyyliaminoetanoliryhmiä, protamiinisulfaatti-saostusta jne.Cholesterol esterase from Candida rugosa can be purified by conventional enzyme fine purification methods. Instead of the enrichment steps mentioned above, other biochemical purification measures can also be used, such as precipitation or fractionation with polyethyleneimine or with organic solvents or salt formation, chromatography using molecular sieves or weak anion exchangers with protamate sulfates, etc., other than diethylamine .
Esimerkki 3 0,5 ml:an seerumia vast, kolesteroli -standardia lisätään 1,0 ml 0,05-m kaliumfosfaattipuskuria, pH 7,5, joka sisältää 0,M % hydroksipolyetoksidodekaania ja 2,5 U kolesteroliesteraasia, esi- 10 57783 merkin 2 mukaisesti. Tätä reaktioseosta haudotaan 40 minuuttia lämpötilassa 37°C. Tämän jälkeen lisätään 0,25 ml tätä liuosta 3 ml:an kolesterolireagenssia, joka sisältää 2 osaa etikkahappoa, 3 osaa etikkahappoanhydridia ja 1 osan rikkihappoa (Liebermann-Burchard-reagenssi).Example 3 To 0.5 ml of serum or cholesterol standard is added 1.0 ml of 0.05 M potassium phosphate buffer, pH 7.5, containing 0.5% hydroxypolyethoxydodecane and 2.5 U cholesterol esterase, e.g. 2. This reaction mixture is incubated for 40 minutes at 37 ° C. 0.25 ml of this solution is then added to 3 ml of cholesterol reagent containing 2 parts of acetic acid, 3 parts of acetic anhydride and 1 part of sulfuric acid (Liebermann-Burchard reagent).
Käyttäen vertailusuureena vakiotulosta saatiin tavanomaisesta näytteestä kokonaiskolesterolimääräksi 170 mg#. Vertailu-määritys saippuoimalla kolesteroliesteri alkoholipitoisella kalili-peällä antoi tulokseksi 165 mg#.Using the standard result as a reference, the total cholesterol content of the conventional sample was 170 mg #. A control assay by saponification of the cholesterol ester with an alcoholic potassium salt gave 165 mg #.
Esimerkki 4 0,02 ml:an seerumia lisätään 10 ml 0,5-m kaliumfosfaatti-puskuria, joka sisältää 0,4 # hydroksipolyetoksidodekaania, ja 0,2 U kolesteroliesteraasia esimerkin 2 mukaisesti. Reaktioliuosta haudotaan 60 min. lämpötilassa 37°C. Tämän jälkeen määrätään ekstinktio (E-^) aaltopituudella 240 nm sopivassa spektraali fotometri as s a ja reaktio aloitetaan Brevibacterium sterolicum-kannasta saadun 0,1 U steriinidehydraasin kanssa. 15 minuutin kuluttua määritetään ekstinktio (E2) uudelleen. Muodostuneen Δ^-kolestenonin väkevyys ja täten kolesterolimäärä saadaan ensimmäisen ja toisen määräyksen välisestä 4 . . ...Example 4 To 0.02 ml of serum is added 10 ml of 0.5 M potassium phosphate buffer containing 0.4% hydroxypolyethoxydodecane and 0.2 U cholesterol esterase according to Example 2. The reaction solution is incubated for 60 min. at 37 ° C. The extinction (Eβ) at 240 nm is then determined in a suitable spectral photometer and the reaction is started with 0.1 U sterol dehydrase from a Brevibacterium sterolicum strain. After 15 minutes, the extinction (E2) is determined again. The concentration of Δ ^ -cholestenone formed and thus the amount of cholesterol is obtained from the first to second order 4. . ...
erosta ottaen huomioon Δ -kolestenonin molaansen ekstmktiokertoimen arvo aaltopituudella 240 nm. Tyypillisen näytteen kokonaiskoleste-roliarvoksi saatiin 183 mg#.taking into account the value of the molar extinction coefficient of Δ -cholestenone at 240 nm. The total cholesterol value of a typical sample was 183 mg #.
Vertailumääritys käyttäen kolesterolioksidaasia (saatu kannasta Nocardia erythropolis) sterolidehydraasien sijasta antoi kokonaiskolesterolimääräksi 181 mg#.A control assay using cholesterol oxidase (obtained from Nocardia erythropolis strain) instead of sterol dehydrase gave a total cholesterol of 181 mg #.
Esimerkki 5 ~ 10 g diammoniumvetyfosfaattia liuotetaan 100 ml:an vettä ja tämä säädetään pH-arvoon 7,0 85 #:n fosforihapon avulla. Sitten lisätään 10^ U katalaasia. Täten saatua liuosta lisätään seokseen, jossa on 0,2 ml asetyyliasetonia, 10 ml metanolia ja 0,1 g hydroksipolyetoksidodekaania, 100 m::n tilavuuteen saakka. Tähän liuokseen lisätään 2,5 U kolesteroliesteraasia, joka on saatu kannasta Rhizopus spec. (WS 90027)· 5,0 ml täten saatua liuosta sekoitetaan 0,02 ml:n kanssa seerumia, vast. 0,02 ml:n kanssa sellaista kolesteroli -standradi-liuosta, joka sisältää 200 mg# kolesterolia.. Yhtä suuriin tilavuus-ifiääriin seerumipitoista sekä kolesterolistandardipitoista näytettä lisätään kumpaankin 0,1 U kolesterolioksidaasia ja haudotaan 60 min lämpötilassa 37°C. Tämän jälkeen muodostunut väriaine mitataan arvossa 405 nm fotometrisesti ottaen huomioon näytteen alkuarvo.Example 5 ~ 10 g of diammonium hydrogen phosphate are dissolved in 100 ml of water and this is adjusted to pH 7.0 with 85% phosphoric acid. Then 10 μl of catalase is added. The solution thus obtained is added to a mixture of 0.2 ml of acetylacetone, 10 ml of methanol and 0.1 g of hydroxypolyethoxydodecane up to a volume of 100 m. To this solution is added 2.5 U cholesterol esterase obtained from the strain Rhizopus spec. (WS 90027) · 5.0 ml of the solution thus obtained are mixed with 0.02 ml of serum, resp. With 0.02 ml of a standard cholesterol solution containing 200 mg of #cholesterol. In equal volumes of serum and standard cholesterol, 0.1 U cholesterol oxidase is added to each and incubated for 60 min at 37 ° C. The dye formed is then measured photometrically at 405 nm, taking into account the initial value of the sample.
11 5778311 57783
Seerumipitoisen näytteen kolesterolipitoisuus oli, käytettäessä standardia vertailukohteena, 154 mg% kokonaiskolesterolia. Vertailumääritys sellaista kolesteroliestereraasia käytettäessä, joka oli saatu kannasta Candida rugosa ATCC 14830 kolesterolies-teraasin sijasta, joka oli saatu kannasta Rhizopus spec. (WS 90027), antoi saman arvon.The serum-containing sample had a cholesterol content of 154 mg% total cholesterol when used as a standard reference. Reference assay using cholesterol esterase obtained from Candida rugosa strain ATCC 14830 instead of cholesteroliesase derived from Rhizopus spec. (WS 90027), gave the same value.
Esimerkki 6Example 6
Keksinnön mukaiseen menetelmään soveltuvien mikro-organismi-kolesteroliesteraasien aktiivisuus määritettiin, tulokset ovat ^ taulukossa 1.The activity of the microorganism cholesterol esterases suitable for the method according to the invention was determined, the results of which are given in Table 1.
Taulukko 1.Table 1.
N: o Kanta WS ΔΕ/h 1 Actinomyces aureoverticillium 90 002 0,600 2 Actinomyces griseomycini 90 004 0,600 3 Streptomyces spec. 90 010 0,064 4 Streptomyces autotrophicus 90 011 0,500 5 Streptomyces caelestes 90 017 0,600 6 Streptomyces tendae 90 018 0,550 7 Candida mycoderma 90 020 0,080 8 Candida albicans 90 021 0,082 9 Candida albicans 90 022 0,050 10 Candida albicans 90 023 0,080 11 Candida spec. 90 024 0,070 12 Mucor mucedo 90 026 0,150 13 Rhizopus spec. 90 027 0,130 14 Penicillium spec. 90 028 0,130 15 Aspergillus spec. 90 029 0,130 16 Candida rugosa 90 031 0,020 ΔΕ saadaan seuraavan inkubaatiotestin avulla: 3,00 ml kaliumfosfaattipuskuri 0,5 M; pH 7,5 (0,33 ml Thesit ad 100 ml), kuplitetaan C^-kaasulla 0,05 ml kolesterolioleaatti (konsentraatiossa 10 mg/ml) 0,1 ml raakauutetta (konsentroituna 1:10 biomassasta) inkuboidaan 5~17 tuntia 25°C:ssa aloitus: lisäämällä 0,07 ml kolesterolioksidaasiaNo. Strain WS ΔΕ / h 1 Actinomyces aureoverticillium 90 002 0.600 2 Actinomyces griseomycini 90 004 0.600 3 Streptomyces spec. 90 010 0,064 4 Streptomyces autotrophicus 90 011 0,500 5 Streptomyces caelestes 90 017 0,600 6 Streptomyces tendae 90 018 0,550 7 Candida mycoderma 90 020 0,080 8 Candida albicans 90 021 0,082 9 Candida albicans 90 022 0,050 10 Candida albicans 90 023 0,080 11 Candida 90 024 0,070 12 Mucor mucedo 90 026 0,150 13 Rhizopus spec. 90 027 0.130 14 Penicillium spec. 90 028 0.130 15 Aspergillus spec. 90 029 0.130 16 Candida rugosa 90 031 0.020 ΔΕ is obtained by the following incubation test: 3.00 ml potassium phosphate buffer 0.5 M; pH 7.5 (0.33 ml Thesit ad 100 ml), bubble with CO2 gas 0.05 ml cholesterol oleate (10 mg / ml) 0.1 ml crude extract (concentrated 1:10 biomass) incubate for 5 ~ 17 hours At ° C start: by adding 0.07 ml of cholesterol oxidase
Claims (3)
Applications Claiming Priority (4)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE2315501A DE2315501C3 (en) | 1973-03-28 | 1973-03-28 | Method for the determination of cholesterol |
DE2315501 | 1973-03-28 | ||
DE2316637 | 1973-04-03 | ||
DE2316637A DE2316637A1 (en) | 1973-03-28 | 1973-04-03 | METHOD FOR DETERMINATION OF CHOLESTEROL |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
FI57783B FI57783B (en) | 1980-06-30 |
FI57783C true FI57783C (en) | 1980-10-10 |
Family
ID=25764885
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
FI941/74A FI57783C (en) | 1973-03-28 | 1974-03-27 | FOERFARANDE FOER BESTAEMNING AV KOLESTEROL |
Country Status (20)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US3925164A (en) |
AR (1) | AR200596A1 (en) |
BE (1) | BE812858A (en) |
CA (1) | CA1067804A (en) |
CH (1) | CH594887A5 (en) |
DD (1) | DD110356A5 (en) |
DE (2) | DE2315501C3 (en) |
DK (1) | DK151396C (en) |
FI (1) | FI57783C (en) |
FR (1) | FR2223696B1 (en) |
GB (1) | GB1429526A (en) |
HK (1) | HK46679A (en) |
HU (1) | HU174541B (en) |
IL (1) | IL44480A (en) |
IT (1) | IT1024524B (en) |
KE (1) | KE2968A (en) |
MY (1) | MY8000101A (en) |
NL (1) | NL157111B (en) |
SE (1) | SE460057B (en) |
YU (1) | YU86074A (en) |
Families Citing this family (39)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US3898130A (en) * | 1974-03-18 | 1975-08-05 | American Hospital Supply Corp | Rapid enzymatic hydrolysis of triglycerides |
US3884764A (en) * | 1974-03-25 | 1975-05-20 | Eastman Kodak Co | Method and composition for blood serum cholesterol analysis |
GB1515195A (en) * | 1975-08-05 | 1978-06-21 | Hycel Inc | Triglyceride assay |
US4184921A (en) * | 1976-03-25 | 1980-01-22 | Boehringer Mannheim Gmbh | Process and reagent for determining cholesterol |
CA1100023A (en) * | 1976-08-19 | 1981-04-28 | Charles T. Goodhue | Process and composition for the quantification of glycerol and triglycerides |
CA1114269A (en) * | 1976-08-19 | 1981-12-15 | Charles D. Warburton | Integral element for the detection of glycerol or triglycerides |
US4042461A (en) | 1976-09-10 | 1977-08-16 | Eastman Kodak Company | Method for purifying cholesterol esterase |
US4275152A (en) * | 1977-02-03 | 1981-06-23 | Eastman Kodak Company | Hydrolysis of protein-bound cholesterol esters |
US4275151A (en) * | 1977-02-03 | 1981-06-23 | Eastman Kodak Company | Hydrolysis of protein-bound cholesterol esters |
CA1104041A (en) * | 1977-02-03 | 1981-06-30 | Charles T. Goodhue | Hydrolysis of protein-bound cholesterol esters |
US4259440A (en) * | 1979-05-21 | 1981-03-31 | Miles Laboratories, Inc. | Hydrolysis and assay of triglycerides |
DE2933646A1 (en) * | 1979-08-20 | 1981-03-26 | Boehringer Mannheim Gmbh, 68305 Mannheim | METHOD FOR OBTAINING CHOLESTERINESTERASE |
DE2933648A1 (en) * | 1979-08-20 | 1981-03-26 | Boehringer Mannheim Gmbh, 68305 Mannheim | METHOD FOR OBTAINING CHOLESTERINESTERASE |
US4378429A (en) * | 1979-08-23 | 1983-03-29 | Modrovich Ivan Endre | Enzymatic method and stabilized solutions for determining total cholesterol in human serum |
EP0024578B1 (en) * | 1979-08-23 | 1983-12-07 | Ivan Endre Modrovich | Method of stabilizing an enzyme solution for use in total cholesterol determination, stabilized solution and test kit therefor |
IT1132230B (en) * | 1980-07-24 | 1986-06-25 | Anic Spa | PROCEDURE FOR THE PRODUCTION OF THE CHOLESTEROL-ESTERASE ENZYME AND FOR HYDROLYSIS OF ESTERS WITH FATTY ACIDS OF CHOLESTEROL BY USING THE ENZYME ITSELF |
US5387431A (en) * | 1991-10-25 | 1995-02-07 | Fuisz Technologies Ltd. | Saccharide-based matrix |
US5456932A (en) * | 1987-04-20 | 1995-10-10 | Fuisz Technologies Ltd. | Method of converting a feedstock to a shearform product and product thereof |
EP0395654A4 (en) * | 1987-09-22 | 1991-01-09 | Abbott Laboratories | Simultaneous assay for cholesterol and triglycerides |
US5156954A (en) * | 1989-03-08 | 1992-10-20 | Cholestech Corporation | Assay device and method using a signal-modulating compound |
US5171688A (en) * | 1988-08-30 | 1992-12-15 | Cholestech Corporation | Self-corrected assay device |
JP2514087B2 (en) * | 1989-01-06 | 1996-07-10 | 富士写真フイルム株式会社 | Total Cholesterol Analysis Factors |
US5114350A (en) * | 1989-03-08 | 1992-05-19 | Cholestech Corporation | Controlled-volume assay apparatus |
US5340539A (en) * | 1989-03-16 | 1994-08-23 | Chemtrak, Inc. | Non-instrumented cholesterol assay |
US5110724A (en) * | 1990-04-02 | 1992-05-05 | Cholestech Corporation | Multi-analyte assay device |
EP0584245B1 (en) * | 1991-05-17 | 2002-08-07 | Biovail Technologies Ltd. | Enzyme systems |
US5576042A (en) * | 1991-10-25 | 1996-11-19 | Fuisz Technologies Ltd. | High intensity particulate polysaccharide based liquids |
DE69309662D1 (en) * | 1992-01-31 | 1997-05-15 | Actimed Lab Inc | INHIBITION OF CATALASE ACTIVITY IN BIOLOGICAL LIQUIDS |
US5346377A (en) * | 1993-10-07 | 1994-09-13 | Fuisz Technologies Ltd. | Apparatus for flash flow processing having feed rate control |
US5445769A (en) * | 1994-06-27 | 1995-08-29 | Fuisz Technologies Ltd. | Spinner head for flash flow processing |
US5582855A (en) * | 1994-07-01 | 1996-12-10 | Fuisz Technologies Ltd. | Flash flow formed solloid delivery systems |
US5556652A (en) * | 1994-08-05 | 1996-09-17 | Fuisz Technologies Ltd. | Comestibles containing stabilized highly odorous flavor component delivery systems |
US5587198A (en) * | 1995-05-31 | 1996-12-24 | Fuisz Technologies Ltd. | Positive hydration method of preparing confectionery and product therefrom |
EP1357383B1 (en) | 2002-04-09 | 2005-11-09 | Cholestech Corporation | High-density lipoprotein assay device and method |
US20050074828A1 (en) * | 2003-07-16 | 2005-04-07 | Dimagno Theodore John | Uae of lipase for high-density lipoprotein cholesterol detection |
JP4643212B2 (en) * | 2003-11-28 | 2011-03-02 | シスメックス株式会社 | Cholesterol dehydrogenase stabilization method, cholesterol dehydrogenase-containing composition, and cholesterol measurement reagent |
US7824879B2 (en) | 2007-01-09 | 2010-11-02 | Cholestech Corporation | Device and method for measuring LDL-associated cholesterol |
US20100296087A1 (en) * | 2007-05-31 | 2010-11-25 | Juergen Gailer | Method for assessing trace element related disorders in blood plasma |
US9828624B2 (en) | 2013-07-24 | 2017-11-28 | Boston Heart Diagnostics Corporation | Driving patient compliance with therapy |
Family Cites Families (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US3607093A (en) * | 1968-02-15 | 1971-09-21 | Schering Corp | Devices for testing biological liquids |
FR2047147A5 (en) * | 1969-05-06 | 1971-03-12 | Kyowa Hakko Kogyo Kk | |
AR195000A1 (en) * | 1972-05-17 | 1973-08-30 | Boehringer Mannheim Gmbh | PROCEDURE FOR THE DETERMINATION OF CHOLESTEROL |
DK158602C (en) * | 1983-05-11 | 1990-11-19 | Interholz Technik Gmbh | PROCEDURE AND APPARATUS TO CORRECT ELEVATIVE WOODEN ELEMENTS |
-
1973
- 1973-03-28 DE DE2315501A patent/DE2315501C3/en not_active Expired
- 1973-04-03 DE DE2316637A patent/DE2316637A1/en active Pending
-
1974
- 1974-03-13 IT IT7467220Q patent/IT1024524B/en active
- 1974-03-24 IL IL44480A patent/IL44480A/en unknown
- 1974-03-25 GB GB1315974A patent/GB1429526A/en not_active Expired
- 1974-03-25 US US454522A patent/US3925164A/en not_active Expired - Lifetime
- 1974-03-25 NL NL7403978.A patent/NL157111B/en not_active IP Right Cessation
- 1974-03-25 CH CH413574A patent/CH594887A5/xx not_active IP Right Cessation
- 1974-03-25 AR AR252946A patent/AR200596A1/en active
- 1974-03-26 DD DD177462A patent/DD110356A5/xx unknown
- 1974-03-26 BE BE142475A patent/BE812858A/en not_active IP Right Cessation
- 1974-03-27 SE SE7404115A patent/SE460057B/en not_active IP Right Cessation
- 1974-03-27 CA CA196,179A patent/CA1067804A/en not_active Expired
- 1974-03-27 FI FI941/74A patent/FI57783C/en active
- 1974-03-27 HU HU74BO1493A patent/HU174541B/en unknown
- 1974-03-28 YU YU00860/74A patent/YU86074A/en unknown
- 1974-03-28 FR FR7410953A patent/FR2223696B1/fr not_active Expired
- 1974-03-28 DK DK172374A patent/DK151396C/en not_active IP Right Cessation
-
1979
- 1979-06-15 KE KE2968A patent/KE2968A/en unknown
- 1979-07-12 HK HK466/79A patent/HK46679A/en unknown
-
1980
- 1980-12-30 MY MY101/80A patent/MY8000101A/en unknown
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
DK151396B (en) | 1987-11-30 |
US3925164A (en) | 1975-12-09 |
IT1024524B (en) | 1978-07-20 |
FR2223696A1 (en) | 1974-10-25 |
DE2315501A1 (en) | 1974-10-17 |
DD110356A5 (en) | 1974-12-12 |
CH594887A5 (en) | 1978-01-31 |
DE2315501C3 (en) | 1980-02-21 |
NL7403978A (en) | 1974-10-01 |
HU174541B (en) | 1980-02-28 |
FI57783B (en) | 1980-06-30 |
FR2223696B1 (en) | 1976-10-08 |
AU6730074A (en) | 1975-10-02 |
DE2316637A1 (en) | 1974-10-17 |
HK46679A (en) | 1979-07-20 |
SE460057B (en) | 1989-09-04 |
BE812858A (en) | 1974-09-26 |
AR200596A1 (en) | 1974-11-22 |
GB1429526A (en) | 1976-03-24 |
IL44480A0 (en) | 1974-06-30 |
YU86074A (en) | 1984-04-30 |
CA1067804A (en) | 1979-12-11 |
IL44480A (en) | 1976-12-31 |
DK151396C (en) | 1988-07-04 |
MY8000101A (en) | 1980-12-31 |
NL157111B (en) | 1978-06-15 |
KE2968A (en) | 1979-07-20 |
DE2315501B2 (en) | 1979-04-26 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
FI57783B (en) | FOERFARANDE FOER BESTAEMNING AV KOLESTEROL | |
Majerus et al. | The acyl carrier protein of fatty acid synthesis: purification, physical properties, and substrate binding site | |
US5116751A (en) | Process for producing peroxidase | |
CA1054907A (en) | Method and composition for blood serum cholesterol analysis | |
EP0010296B1 (en) | Test composition for the determination of triglycerides and its use | |
US4181575A (en) | Composition and method for the determination of cholesterol | |
US4338395A (en) | Method for the analysis of triglycerides | |
US4999289A (en) | Lipase, its production and use for assay of triglycerides | |
US4309502A (en) | Enzymatic assay for glycerol and triglycerides and a reagent for use therein | |
US4216292A (en) | Process for the production of sarcosine oxidase | |
US4677062A (en) | Process for producing bilirubin oxidase | |
JPS6134800B2 (en) | ||
Bigelis et al. | Yeast alpha-isopropylmalate isomerase. Factors affecting stability and enzyme activity. | |
US4003794A (en) | Process for producing cholesterol oxidase | |
Watts et al. | A method for screening Baeyer-Villiger monooxygenase activity against monocyclic ketones | |
Mislovičová et al. | Enzymatic oxidation and separation of various saccharides with immobilized glucose oxidase | |
US4042461A (en) | Method for purifying cholesterol esterase | |
JP2647684B2 (en) | Triglyceride analysis reagent and analysis method | |
SU717994A3 (en) | Reagent for determining cholesterin in blood serum | |
Nagaoka | Chiral resolution function with immobilized food proteins | |
Szakmary et al. | Origin of oxidized cellulose degradation products and mechanism of their promotion of cellobiohydrolase I biosynthesis in Trichoderma reesei | |
CS212753B2 (en) | Reagent for determining cholesterol | |
RU2249043C2 (en) | Method for preparing derivatives of steroid glycosides from ruscus aculeatus | |
Nakano | Comparison of the enzyme oxidizing thyroid hormone with L-amino acid oxidase | |
CS212752B2 (en) | Method of determining total cholesterol or bonded cholesterol |