FI57760B - Foerfarande foer framstaellning av tillvaext av tumoerer foerhindrande n-formylleurocin - Google Patents

Description

Ιϊ2ΤΠ r.i kuulutusjuikaisu en η An

iK w ^»UTtAooNiNessicRiFT 5776Q

*5λ§ e (4S) Patentti ayönno Uy 10 10 1990 ^ ~ ^ (51) K^ltnLCL·^ C 07 D 519/0^ SUOMI—FIN LAND (21) PM^hakMMM-NttMmekiiinf ibi/ib (22) HakamispISvi—AfNBknlnfAg 07.02.ib (23) Alkuyilvt—GIWfh*tsda* 07.02.7^ (41) Tullut Julkiseksi — Bllvlt offemllg 17.08. jb (44) Nlhtlvikslpenoo Js kuuLjulkslsun pvm. —

Patent- och rogiatorttyrolMfl AmMcm uthgd och utUkrtfton pubttcersd 30.06.80 (32)(33)(31) pietty etuoikeus-feglrd prforket 16.02.73 Unkari-Ungern(HU) RI-502 (71) Richter Gedeon Vegy^szeti Gyär R.T., 21 Gyömröi ut, Budapest X, ^ Unkari-Ungern(HU) (72) Karola Jovanovics, Budapest, Kalman Szfisz, Budapest, Bela Kellner, Budapest, Laszlo Nemeth, Budapest, Zsuzsa Relle, Budapest, Emil Bittner, Budapest, Eszter Dezseri, Budapest, Janos files, Budapest, Unkari-Ungern(HU) (jb) Oy Kolster Ab (5^+) Menetelmä tuumorien kasvua estävän N-formyylileurosiinin valmistamiseksi - Förfarande för framställning av tillväxt av tumörer för-hindrande N-formylleurocin

Keksinnön kohteena on menetelmä tuumorien kasvua estävän N-formyyli-leurosiinin valmistamiseksi, jonka kaava on

OoCÖC

H A \ -- / ' H I l ch3ooc . Il I ^ch2ch_ 3 v UC0CH_

HO ^ J

υ cooch3

C0H

2 57760 ja sen farmaseuttisesti hyväksyttävien happoadditiosuolojen valmistamiseksi.

Viime vuosikymmeninä on suoritettu hyvin intensiivistä tutkimustyötä lääkkeiden valmistamiseksi, jotka ovat käyttökelpoisia syövän hoitoon. Tämän kauaskantoisen tutkimustyön aikana on suoritettu aineille, joilla on mitä erilaisimnat kemialliset rakenteet, "biologisia ja kliinisiä tutkimuksia, mutta vain hyvin rajoitettu lukumäärä näistä aineista on todettu parantaviksi ihmisten hoidossa. Näistä harvoista farmaseuttisista tuotteista, jotka ovat osoittaneet positiivisia tuloksia kliinisessä käytössä, on di-indolialkaloidit (dimeeriset indolialkaloidit) todettu oivallisen merkittäviksi. Tällaisia di-indolialkaloideja ovat esimerkiksi vinkaleukoblastiini (vinblastiini), leurokristiini (vinkristiini), vinleurosidiini (leurosidiini), vinleurosiini (leurosiini) jne. Kaikkia näitä yhdisteitä valmistettiin, tuloksena laajasta tutkimustyöstä, kasvista, jonka nimi on Cathareanthus roseus G. Don (tai vinka rosea L·.), ja joka kuuluu Apocynaceae-sukuun. Näitä di-indolialkaloideja on noin 1-3 % kasvin koko alkaloidipitoisuudesta ja kasvi sisältää yli 70 eri alkaloidia. Rakenneanalyysin avulla on todettu, että di-indolialkaloideilla on hyvin samanlaiset rakenteet, niinpä esimerkiksi vinblastiini- ja vinkristiinimolekyylit sisältävät kumpikin yhden osan, joka on velbanamiinirakennetta, ja toisen osan, joka sisältää indoliinirungon; ainoa ero on se, että molekyylin vindoliiniosa sisältää N-metyyliryhmän vinblastiinissa ja N-formyyliryhmän vinkristiinissä. Tämä vähäinen rakenteellinen ero aiheuttaa kuitenkin huomattavan eroavaisuuden näiden yhdisteiden biologisissa aktiviteeteissa; vinkristiinin on nimittäin todettu olevan aktiivisempaa sekä eläinkokeissa että ensisijaisesti ihmisten hoidossa.

Leurosiini eroaa rakenteeltaan edellä mainitusta vinblastiinista tai vinkristiinistä sikäli, että se sisältää epoksi-velbanamiiniosan velbamiinin sijasta.

Edellämainittuja di-indolialkaloideja ja niiden happoadditiosuoloja sekä näiden yhdisteiden valmistusta on selostettu monissa julkaisuissa, joista mainittakoon US-patenttijulkaisut 3 097 137, 3 205 220 ja 3 225 030 sekä HU-patentti-julkaisut 153 200, 15U 715 ja l60 967.

Keksinnölle on tunnusomaista, että leurosiini, jonka kaava on 57760 ocpa / \ { o “’s000 " CH_0 7 ^OCOCH- 3 I ™ 'COOCH, 3

CH3 J

tai leurosiinin happoadditiosuola hapetetaan kromihapolla tai sen suolalla lämpötilassa alle -30°C, ja saatu yhdiste formyloidaan ja erotetaan, ja vapaa happo haluttaessa muutetaan happoadditiosuolakseen.

Keksinnön mukaisesti valmistetulla N-formyylileurosiinilla on tärkeitä etuja verrattuna vinkristiiniin, joka on tunnettu ja tähän asti parhaana pidetty tuumorien kasvua estävä yhdiste. Uuden yhdisteen myrkyllisyys on huomattavasti alhaisenpi: ID^q on hiirillä intraperitoneaalisesti annettuna 28,8 mg/kg, kun taas vinkristiinin vastaava arvo on U,0 mg/kg. Vinkristiinillä on haitallinen sivuvaikutusj joissain tapauksissa tämän yhdisteen antamisesta aiheutuu halvaus-symptooneja syystä, että vinkristiini on hermomyrkky. Keksinnön mukaisesti valmistetulla yhdisteellä ei ole tällaista sivuvaikutusta. Uusi yhdiste on tehokas , myös sellaisia tuumoreita vastaan, joihin vinkristiini ei vaikuta. Vinkristiini on täysin tehoton rottien VX-2 karsinoamaa vastaan myrkyllä sinäkin annoksina annettuna, kun taas uudella yhdisteellä on 70-100 %\τι estovaikutus päivittäisen intravenoosisen annoksen ollessa 3 mg/kg. Vinkristiini on tehoton Harding-Passey-melanoomaa vastaan, kun taas uuden yhdisteen estovaikutus on UT-Etinen annettaessa yhdistettä lU päivän ajan intraperitoneaalisesti päivittäin 5 mg/kg. Vinkristiini estää Rhabdomyo-sarkooman kasvun 25->f:isesti annettaessa yhdistettä 8 päivän ajan päivittäin 0,2 mg/kg intraperitoneaalisesti (yhdisteen myrkyllisyyden vuoksi ei voida antaa suurempia annoksia). Uuden yhdisteen estovaikutus on 6l-£:inen annettaessa sitä 10 päivän ajan intraperitoneaalisesti päivittäin 2,0 mg/kg.

Keksinnön mukaisesti valmistetulla yhdisteellä on etuja myös vinblastii-nin ja lähtöaineena käytettyyn leurosiiniin verrattuna. Kumpikin viime mainituista ei ole aktiivinen rottien VX-2 karsinoomaa, Hardin-Passey-melanoomaa eikä Rhabdomyo-sarkoomaa vastaan. Leurosiini ei ole aktiivinen S-l80 sarkocmaa eikä 11 57760

Novikoff-hepatocmaa vastasin, kun taas N-formyylileurosiini on aktiivinen kaikkia näitä pahanlaatuisia kasvaimia vastaan.

Uusi yhdiste aikaansaa täydellisen parantumisen tai 300 %iu suuruisen eliniän pitenemisen 50-70 /?:ssa tapauksista kokeissa, joissa hiiriin ympättiin Ehrilich’in ascites-karsinooma tai NK/Ly lymfooma.

Uudella yhdisteellä suoritettu hoito pidentää eläinten ikää, joita vaivaa L-1210 imukudosleukemia, s37 ascites-sarkocma tai Yoshida ascites-sarkooma, noin I5O-25O %. Ihonalaisesti ruiskutettuna tämä yhdiste ehkäisee 70-80 % siirrettyjen kiinteiden kasvannaisten (Guerin-karsinooma, S-l80 sarkooma) kasvusta.

Eläinkokeissa tätä yhdistettä voidaan antaa annosten suuruuden ollessa 0,3-5,0 mg/kg pitkiä aikoja .^aiheuttamatta sivuvaikutuksia, jotka ovat luonteenomaisia ja väistämättömiä tunnettuja vinka-alkaloideja käytettäessä. Tämän alkaloidin terapeuttinen alue on tällöin jonkin verran samanlainen kuin vinkristiinil-lä ja noin U kertaa laajempi kuin vinleurosiinilla.

Vertailu ^ ^50 LD50 ip, mg/kg hiirellä rotalla vinkristiini l+,0 1,2 vinhlastiini 7,5 5,6 N-formyylileurosiini 28,8 13,1

Huomataan, että N-formyylileurosiini on neljä kertaa vähemmän myrkyllinen kuin tunnettu vinhlastiini ja seitsemän kertaa vähemmän myrkyllinen kuin tunnettu vinhlastiini.

2. Sivuvaikutus keskushermostoon.

Rotille (4-¾ eläintä) annettiin myrkyllinen annos (1,5 mg/kg) vinkristii-niä ja myrkyllinen annos (15 mg/kg) N-formyylileurosiinia. Vinkristiini aiheutti kaikilla neljällä eläimellä takajalkojen halvaantumisen, ja kahdessa tapauksessa havaittiin iskiashermon huomattavaa lymf osyytti-inf diltraatiota ilman myeliini-katoa. N-formyylileurosiini ei aiheuttanut missään keskushermoston osassa halvausta eikä histologisia muutoksia.

5 57760 cd

co -P

3 co

•"3 '5 TSL

11 O 0) P s»

H CO

a w ^

•H

h a a p a a ra m a a) ra a ra a

H ·η a ·Η (D

,ο Ha; H a a H ra a H ra «j

h ra >> X X >> X X

>o X O X Λ O 3 § | § ra Iira a ra p _ a ra p a ϊα

3 H

X ·Η ITS

•h a) is. -ft OJ

it O 0) P f» ra W *A Ή a

•H

•h aa p a a .

ra a oj \ _ a •h ra a we bo a a ·η a ·η a χ a

5 Ha Η a X

a H ra a Η ω a bO ·Η · •Hra SX X XXX Ö,®5 o)

> O X O X X O X K _ P

a a a a a a X cm ft τί m § ^ « I S n o H co § § -------a

cd S

CO -P Ö a w a p a b a • h a »* ** ra “ ·η i> a o t·- h ia e o a r— x· vo ia •H p > p • nra p

ra X

o ia

a X

M 3 aa ft a PH P< ·Η Ό a -h a -h a a ·η äh Saa o •h>» a *o a Tja > ab χ X x

> a M > "H bO*H ÖO-H *H

am x-h a x a x a a a o o 'v. "·. \ iä V ° jjjj) tj tjp-ö m-ö ·η

PS5§ O ” X "O X

ra CO H l/\ H OJH o "-----i a 5 s

ra tJ

a · *h x S a •na a a h m ·η oi a ra o •h a a a a m a pöh s a o x o -HOHig >» a p b-η fto-HMö aa x aa a a a a o 8 o x a o ή ή ·η a a o a H S OJ m Ή Ό a P X x a lacinH a a a • P x a a a a .a a oof! > X X SS «m * 6 57760

Taulukosta huomataan, että N-formyylileurosiini on tehokas sellaisia tuumoreita vastaan, jotka ovat resistenttejä muihin di-indolialkoloideihin nähden.

Keksinnön mukainen menetelmä käsittää seuraavat vaiheet: leurosiinia, joka on saatu erottamalla kromatograafisesti di-indolialkaloideja Catharanthus roseus G. Don-nimisestä kasvista HU—patenttijulkaisun n:o l60 967 mukaan, tai sen suolaa, edullisesti sulfaattia, liuotetaan orgaaniseen liuottimeen tai liuotinseokseen, edullisesti asetonin ja jääetikan seokseen, liuos jäähdytetään alle 0°C:n lämpötilaan, edullisesti välille -30 ja ~90°C, edellämainittuan liuokseen lisätään samalla voimakkaasti sekoittaen ja jäähdyttäen kromihappoa tai kromaattisuolaa liuotettuna saman lämpötilan omaavaan orgaaniseen liuottimeen, edullisesti etikkahappoanhydridiin, ja reaktioseoksen annetaan seistä 5“15 minuuttia, edullisesti 8 minuuttia. Sen jälkeen reaktioseosta käsitellään varovasti kylmällä (välillä -Uo ja ~50°C) ammoniakin vesiliuoksella pH:n säätämiseksi arvoon 8-9, seos laimennetaan vedellä ja uutetaan useilla annoksilla orgaanista liuotinta, edullisesti metyleenikloridilla kunnes yhtään alkaloidia ei ole läsnä.

Uutteet yhdistetään, pestään vedellä, kuivataan ja haihdutetaan kuiviin alipaineessa. Tällöin saadaan valkoinen, vaahtomainen, amorfinen kuiva jäännös, joka koostuu pääasiallisesti N-formyylileuEosiinista ja N-demetyyli-leurosiinista.

Nämä yhdisteet erotetaan toisistaan kromatograafisesti käyttäen pylvästä, joka on täytetty aluminiumoksidilla (aktiviteettiaste IV-V). Täytös valmistetaan aluminiumoksidin bentseenisuspensiosta. Ensimnäinen eluentti on bentseeni ja seuraavat eluentit ovat bentseenin seoksia erilaisten määrien kanssa kloorattua hiilivetyä, edullisesti kloroformia. Eri eluaattifraktioissa olevat aineet identifioidaan ohutkerroskramatografiän avulla. Ensimmäisenä poistuu pylväästä seura-aineita, sen jälkeen N-demetyyli-leurosiinia ja lopuksi eluoituu N-formyyli-leurosiinia. Samoja aineita sisältävät fraktiot yhdistetään, haihdutetaan kuiviin alipaineessa ja, mikäli halutaan, saadut emäkset muutetaan niiden happoadditio-suoloiksi, edullisesti vastaaviksi monosulfasteiksi. Yhdisteet voidaan puhdistaa _ haluttaessa uudelleenkiteytäämällä. Tätä puhdistusmenetelmää käytetään ensisijaisesti suoloille. N-demetyyli-leurosiini formyloidaan tunnetuilla menetelmillä (katso C .W. Huffman: J. Org. Chem. 23, 727 /1958.7) N-formyyli-leurosiinin saamiseksi.

Keksinnön erään edullisen menetelmän mukaan menetellään seuraavalla tavalla: Kuiva jäännös, joka on saatu käsittelemällä hapetuksen reaktiotuotetta, formy-loidaan muurahaishapon ja etikkahappoanhydridin seoksen kanssa. Tässä reaktiossa N-demetyyli-leurosiini muuttuu N-formyyli-leurosiiniksi. Reaktioseos neutraloidaan, uutetaan metyleenikloridilla, uute pestään vedellä ja haihdutetaan kuiviin alipaineessa. Saatu kuiva jäännös puhdistetaan krcmatografisesti. Saatu N-formyy-li-leurosiini muutetaan mahdollisesti sen suolaksi, edullisesti sulfaatiksi, ja 7 57760 suola kiteytetään haluttaessa uudelleen.

Keksintöä valaistaan lähemmin seuraavien esimerkkien avulla.

Esimerkki 1 N-formyylileurosiini ja -monosulfaatti 12 g (0,0132 moolia) leurosiinisulfaattia liuotetaan 2 6^0 ml:aan asetonia, jonka jälkeen lisätään 0,6 litraa jääetikkaa, joka on juuri tislattu kromihappoa sisältävästä seoksesta. Liuos jäähdytetään ~50°C:een ja kylmää aset-anhydridiä, joka sisältää 5,9^ g (0,135 moolia) kromihappoa, lisätään hämmennettyyn seokseen 3 minuutin kuluessa. Seoksen annetaan seistä vielä 5 minuuttia, jonka jälkeen liuoksen pH säädetään arvoon 6 käyttäen kylmää väkevää ammoniakin vesiliuosta.

Tämä operaatio suoritetaan 7 minuutin kuluessa ja ammoniakkiliuosta tarvitaan noin 6 litraa. Tämän neutraloinnin aikana seosta jäähdytetään lämpötilan estämiseksi kohoamasta yli +50°C. Saatu seos täytetään lasiastiaan, joka on varustettu lasisella hämmennyslaitteella ja laskuhanalla, ja se sisältää ennestään 9 litraa tislattua vettä. Laimennettu liuos tehdään alkaliseksi ammoniakin vesiliuoksen lisämäärillä pH:n säätämiseksi arvoon 8,5.

Tämän jälkeen reaktioseos uutetaan metyleenikloridilla (1+ x 1,5 litraa). Alkaloidiemäkset siirretään metyleenikloridifaasiin. Faasit erotetaan, orgaaniset liuokset yhdistetään ja pestään tislatulla vedellä (3x1 litra) neutraloimis-vaiheessa muodostuneen ammoniumasetaatin poistamiseksi. Tämän jälkeen orgaaninen faasi kuivataan natriumsulfaatin avulla ja haihdutetaan kuiviin alipaineessa.

Tällöin saadaan 10 g beigenvalkoista kuivaa jäännöstä. Tuote on N-formyyli-leulbsiinin ja U-demetyylileurosiinin epäpuhdasta seosta.

Kuiva jäännös liuotetaan 60 ml:aan bentseeniä ja liuos kaadetaan kromato-grafiapylvään päälle, jonka halkaisija on 35 mm ja joka on täytetty 500 g: 11a aluminiumoksidia (aktiviteettiaste IV-V). Täytös valmistetaan aluminiumoksidin bents eeni suspensiosta.

Pylväs eluoidaan taulukossa 1 luetelluilla liuottimilla tai liuotinseok- silla.

Taulukkol

Eluoimisaineen kokoomus Eluoimisaineen määrä ml

Bentseeniä 900

Bentseenin ja kloroformin 9:l~seosta 1 800

Bentseenin ja kloroformin 8,5il,5_seosta 1 000

Bentseenin ja kloroformin 8:2-seosta 2 800

Bentseenin ja kloroformin l:l-seosta 2 800

Kloroformia 800 8 57760

Eluaatti kootaan UOO ml:n fraktioiksi. Eri fraktiot tutkitaan ohutkerros-kromatografian avulla (Fransvorth, N.R. et ai.: Lloydia, 27, 302 /l96U7).

Fraktiot 1-5 eivät sisällä alkaloideja. Ensimmäiset jäljet alkaloidista ilmestyvät yleensä fraktiossa 6, joka sisältää pääasiallisesti ei-reagoinutta leurosiinia. N-demetyyli-leurosiinia ilmaantuu yleensä ensimmäisen kerran suunnilleen fraktiossa 7 ja se eluoituu täydellisesti suunnilleen fraktioon 15 mennessä. N-formyyli-leurosiinin eluoituminen alkaa suunnilleen fraktiossa 13 ja päättyy yleensä suunnilleen fraktioissa 19-21.

Fraktiot, jotka ohutkerroskromatograafisen analyysin perusteella sisältävät samoja alkaloideja, yhdistetään ja haihdutetaan kuiviin alipaineessa. _ Tällöin saadaan 5,6 g raakaa, amorfista N-formyyli-leurosiinia ja 1,5 g raakaa, amorfista N-demetyyli-leurosiinia.

Seuraavassa vaiheessa nämä epäpuhtaat, amorfiset emäkset muutetaan erikseen niiden monosulfaateiksi. 1 paino-osa raakaa tuotetta liuotetaan 5 tilavuus-osaan kuivaa etanolia, sen jälkeen liuos hapotetaan pH-arvoon k lisäämällä rikkihapon l-$:ista liuosta kuivassa etanolissa. Kiteisen sulfaatin erottuminen alkaa välittömästi. Seoksen annetaan seistä huoneen lämpötilassa useita tunteja ja sen jälkeen erottuneet kiteet suodatetaan. Suolat kiteytetään sen jälkeen uudelleen seuraavalla tavalla: 1 paino-osa kiteistä sulfaattia liuotetaan 5 tilavuusosaan metanolia ja liuoksen tilavuus suurennetaan viisinkertaiseksi kuivalla etanolilla. Liuoksen annetaan seistä huoneen lämpötilassa, jonka jälkeen erottunut tuote suodatetaan, pestään kuivalla etanolilla ja kuivataan.

Tässä menetelmässä saadaan seuraavia aineita: U8 g (Uo,l %) N-formyyli-leurosiinimonosuifaattia, sp.: 2U8-252°C (Boetius), (^Ogg = +37° (c = 1, vedessä); ja 1,1 g (9,3 %) N-demetyyli-leurosiinimonosulfaattia; hajoaa sulamatta; (of)^ “ 3,2 (c 1, vedessä).

N-formyyli-leva* osiini emäksen fysikaalisten vakioiden määrittämiseksi liuotetaan osa näin saatua N-formyyli-1eurosiinimonosulfaattia veteen, liuoksen pH säädetään välille 8-9 väkevällä ammoniakin vesiliuoksella ja seos uutetaan kolmasti metyleenikloridilla. Orgaaniset faasit yhdistetään, kuivataan ja haihdutetaan kuiviin alipaineessa. Saatu amorfinen N-formyylileurosiini kiteytetään uudelleen metanolista. Kiteinen N-formyylileurosiini sulaa välillä 209-211°C (Boetius); (0()^ “ +90,3° (c = 1, kloroformissa).

N-formyylileurosiinin IR-spektri on esitetty kuviossa 1· Tämän spektrin ero leurosiinin spektristä on formyyliryhmän voimakkaassa absorptiovyössä, joka esiintyy kohdassa 1672 cm \

Mauoaapektr.iri perusteella on N-formyyli-leurosiinimolekyyli-ionin massa-luku 822. Mitattu tarkka massa on M * 822.3977, josta voidaan laskea empiirinen kaava C^gH^N^O^, jonka teoreettinen massaluku on 822.3909.

9 57760

Analyysi:

Lasketut arvot kaavalle C: 67,15 %, H: 6,6l %t N: 6,8l $, 0: 19,1+3 %t

Saadut arvot: 66,95 %, H: 6,58 %t N: 6,75 %t 0: 19,27 %.

Tämä molekyyli-ioni aiheuttaa ionihuipun massaluvulla 793, mikä vastaa formyyliryhmän poistumista, kuten osoitetaan tarkan massaluvun avulla "/'mitattu ' 793>3866·

Empiirinen kaava, joka vastaa tätä massalukua, on C^H^N^O^, jonka —- laskettu massa on "/'laskettu * TM.3S82.

Samoin kuin leurosiini emäksen massaspektrillä, esiintyy ionihuippu, joka vastaa massalukua 353, N-formyyli-leukosiiniemäksen massaspektrissä, mikä vastaa epoksivelbanamiini-osaa» Tämä seikka on myös varmennettu mittaamalla tarkka massa: m/e ... . = 353,187!+, mitattu * * joka vastaa empiiristä kaavaa jonka laskettu massa on "/'laskettu * 353·1858·

Esimerkki 2 N-formyylileurosiinimonosulfaatti 1 g N-demetyylileurosiinia liuotetaan seokseen, jossa on 6 ml väkevää muurahaishappoa ja 1 ml a s e.t.-anhydr i di ä, ja seoksen annetaan seistä huoneen lämpötilassa 10 minuuttia. Sen jälkeen seos kaadetaan 30 ml:aan kylmää vettä (0-5°C), ja seoksen pH säädetään arvoon 9,0 kylmällä, väkevällä ammoniakin vesi-~ liuoksella. Ammoniakkiliuosta lisättäessä hämmennetään. Alkoloidi uutetaan vesi- liuoksesta metyleenikloridilla (3 x 30 ml). Metyleenikloridiliuokset yhdistetään, kuivataan ja haihdutetaan kuiviin alipaineessa.

-» Tällöin saadaan 0,95 g amorfista, valkoista N-formyylileurosiinia, joka muutetaan sen monosulfaatiksi esimerkissä 1 kuvatulla tavalla. Tässä reaktiossa saadaan 1,01 g N-formyylileurosiinimonosulfaattia.

Esimerkki 3 N-f oimyy lileur os i ini 10 g beigenvalkoista, vaahtomaista raakaa tähdettä, joka koostuu N-for-myylileurosiinista ja N-demetyylileurosiinista ja joka on saatu hapettamalla 12 g (0,0132 moolia) leurosiinisulfaattia esimerkissä 1 kuvatulla tavalla, liuotetaan seokseen, jossa on 60 ml väkevää muurahaishappoa ja 10 ml aset»anhydri-diä, ja seos kaadetaan, samalla hämmentäen, 300 ml:aan kylmää (0~5°C) vettä. Seoksen pH säädetään, samalla hämmentäen, arvoon 10 57760 9,0 kylmällä, väkevällä enoillekin vesiliuokeslla. Llnoe uutetaan aetylesni-kloridilla (3 x 100 ai). Hetyleenikloridifaasit yhdistetään, kuivetaan ja haihdutetaan kuiviin alipaineessa. Tällöin saadaan 9,8 g amorfista, valkoista, raakaa Jf-formyyli-leurosiinia.

Saatu raaka R-forayylileurosiini puhdistetaan pylväskroaatografian avulla· Raaka tuote liuotetaan 60 altaan henteeeniä ja tänä liuos kaadetaan pylvään päälle, joka halkaisija on 43 ai ja joka on täytetty 300 gslla alumlniuaokeidia (aktlviteettieste III) bentseenlssä. Pylväs eluoidaan taulukossa 2 luetelluilla liuottimilla.

Taulukko 2

Eluoimisaineen kokoomus Eluoimisaineen aäärä, ai

Bentseeniä 1200

Bentseenin ja kloroformin 2il-seosta 3000

Benteeenin ja kloroformin ltl-seosta 3000

Kloroformia 800

Eluaatti kootaan fraktioiksi, joiden jokaisen tilavuus on 400 ai.

Fraktiot 1-3 eivät sisällä alkaloideja. Fraktiot 4-10 sisältävät seura-aineita. Suunnilleen fraktiosta 11 alkaen esiintyy myös N-forayyli-leurosiinia seura-aineiden lisäksi. Suunnilleen fraktiot 15 - 20 sisältävät yksistään I-forayyli-leurosiinia. Seuraavissa fraktioissa pienenee eluoitu-neen H-formyyli-leurosiinin aäärä asteettaia. He fraktiot, jotka sisältävät yksistään H-forayyli-leurosiinia, yhdistetään ja haihdutetaan kuiviin alipaineessa. Tällöin saadaan 6,5 g raakaa, amorfista H-formyylileurosiinia.

Tämä raaka, amorfinen H-forayyli-leurosiinieaäs muutetaan sen mono-sulfaatiksi seuraavalla tavalla) 6,5 g I-forayylileurosiinia liuotetaan 32,5 altaan kuivaa etanolia, jonka jälkeen liuos hapotetaan pH-arvoon 4 lisäämällä rikkihapon 1 Ritistä liuosta kuivassa etanolissa. Kiteisen aineen erottuminen alkaa välittömästi. Seoksen annetaan seistä huoneen lämpötilassa useita tunteja, jonka jälkeen kiteet erotetaan suodattamalla ja pestään kuivalla metanolilla. Tällöin saadaan 6,5 g kiteistä I-formyylileurosiini-aonosulfaattia.

Sluaatit, jotka on koottu ennen puhdasta I-forayylileurosiinia sisältäviä fraktioita ja niiden jälkeen, sisältävät seura-aineita ja I-fornyyli-leurosiinia. Nänä fraktiot yhdistetään ja haihdutetaan kuiviin. Tällä taval- 11 57760 la eaatu amorfinen aine (1,75 e) liuotetaan bentseeniin ja puhdistetaan kromatograafisesti edellä kuvatulla tavalla, vain sillä erotuksella, että paremman erottumisen takaamiseksi pylväs eluoidaan 1200 ml:11a bentseenin ja kloroformin 2:l-seosta. Niitä fraktioita, jotka sisältävät yksinomaan N-formyyli-leurosiinia, käsitellään edellä kuvatulla tavalla, jolloin saadaan lisäksi 1,05 g puhdasta, kiteistä H-formyylileurosiinimonosulfaat-tia. Kokonaissaanto: 7*10 g (63,7 N-formyyli-leurosiinimonosulfaattia. Tämän yhdisteen fysikaaliset vakiot ovat identtiset esimerkissä 1 esitettyjen vakioiden kanssa.

4*

Claims (1)

12 57760 Patenttivaatimus: Menetelmä tuumorien kasvua estävän N-formyylileurosiinin valmistamiseksi, jonka kaava on OCX, ox :/r V / ' h . n CH-OOC \ ^ L I D 3 [ 1 I 10-0½¾ HoXO'ococh3 C00CH3 COH - Co h ja sen farmaseuttisesti hyväksyttävien happoadditiosuolojen valmistamiseksi, tunnettu siitä, että leurosiini, jonka kaava on jryYS "Y- H ΐ'^ΐ CK300C X 1 J J™2™3 CHo0r^X/^N X^V>< ^OCOCH. J ΗΛΧ ^ -3 ηυ "C00CH3 CH3 tai leurosiinin happoadditiosuola hapetetaan kromihapolla tai sen suolalla l½pötilassa alle -30°C, ja saatu yhdiste formyloidaan ja erotetaan, ja vapaa happo haluttaessa muutetaan happoadditiosuolakseen.