FI118264B - Mannanaasientsyymit, niitä koodavat geenit ja menetelmä näiden eristämiseksi sekä menetelmä lignoselluloosapitoisen massan valkaisemiseksi - Google Patents

Description

1 1 8264 '

Mannanaasientsyymit, niitä koodaavat geenit ja menetelmä näiden eristämiseksi sekä menetelmä lignoselluloosapitoisen massan valkaisemiseksi 5 Esillä oleva keksintö koskee DNA sekvenssiä, joka koodaa mannanaasientsyymejä.

Keksintö koskee myös mainittua DNA-sekvenssiä sisältäviä vektoreita, hiivakantoja ja homekantoja. Edelleen keksinnön kohteena on menetelmä mannanaaseja määrittävien geenien eristämiseksi sekä menetelmä sellaisten hiivakantojen konstruoimiseksi, jotka kykenevät ilmentämään mannanaasia. Keksinnön mukaan aikaansaadaan myös 10 ainakin yhtä mannanaasia sisältävä entsyymituote sekä menetelmä mannanaasientsyymin ja -entsyymituotteiden valmistamiseksi. Lopuksi keksintö liittyy vielä menetelmään mannopolymeerien hydrolysoimiseksi ja menetelmään lignoselluloosapitoisen massan valkaisemiseksi.

15 Puun pääkomponentit ovat selluloosa, ligniini ja hemiselluloosa. Havupuuksylaani on pääasiassa arabino-4-O-metyyliglukuronoksylaania ja lehtipuuksylaani on O-asetyyli-4- O-metyyliglukuronoksylaania. Glukomannaanit ovat muodostuneet pääketjusta, jossa on glukoosi- ja mannoosiyksiköitä ja pääketju on substituoitu galaktoosi- ja asetyyliyksi- . köillä. Lehtipuussa on vain vähän glukomannaania (2 - 5 %) ja lehtipuun glukomannaa- * · · . ;1;20 ni eroaa rakenteeltaan havupuun glukomannaanista, koska se ei ole asetyloitunutta eikä * · « ;·,· siinä ole galaktoosisivuryhmiä (Timell 1967). Kemiallisen massan keittoprosessin aikana • · hemiselluloosien suhteellinen koostumus muuttuu natiivipuuhun verrattuna ja sekä havu-% 1 1 1 t |i· että lehtipuusulfaattimassan pääasiallisin hemiselluloosa on ksylaani (Sjöström 1977).

• · · 2 : 118264 uskotaan sijaitsevan kuidussa tasaisesti, kun taas ksylaanikonsentraatio on kuidun pinnalla suurin (Luce 1964).

Kemiallisessa sellun keitossa massaan jää keitossa tummunutta jäännösligniiniä, joka 5 poistetaan massasta valkaisussa. Perinteisessä kloorivalkaisussa ligniinin liuottamiseen käytetään klooria tai klooridioksidia. Nykyisin käytetään myös usein happivalkaisua, vetyperoksidia tai näiden ja edellä mainittujen yhdistelmiä.

Hemisellulaaseilla, etenkin ksylanaasilla, on todettu aikaansaatavan kuidun valkaistavuu- 10 den paranemista (Kantelinen et ai 1988, Viikari et ai 1991a). Tarvittavat entsyymimää- rät ovat pienet valkaisuefektin saavuttamiseksi ja entsyymikäsittely voidaan helposti liittää osaksi massanvalmistusprosessia. Tähän astisissa sovelluksissa on kuidun ksylaa- nia hydrolysoimalla pystytty edistämään kuidun valkaistavatta. Nykyisten käsitysten mukaan ksylanaasit vaikuttavat siis pääasiassa massakuidun pinnalla olevaan ksylaaniin 15 (Kantelinen et ai 1991). Hemisellulaaseja (ksylanaaseja) on yhdistelty erilaisiin val- kaisusekvensseihin. Laboratoriomittakaavassa entsyymien käyttöä valkaisussa on tutkittu peroksididelignifioinnin avulla (Viikari et ai. 1986, Viikari et ai. 1987, Viikari et ai.

1990) ja erilaisilla kloorivalkaisusekvensseillä. Tehdasmittakaavassa entsyymejä on , yhdistetty erilaisiin kloorivalkaisusekvensseihin ja myös monivaiheisiin peroksidival- • · · » · · . .*.20 kaisusekvensseihin (Viikari et ai. 1991b). Monivaiheisista peroksidisekvensseistä huoli- • · · • · · : matta täysin ilman kloorikemikaaleja valkaistun massan vaaleus jää alhaisemmaksi kuin • · : kloorikemikaaleilla valkaistun massan.

• · ·

«Μ I

» · ·

»•M

On myös tutkittu bakteeri- ja homeperäisten mannanaasien käyttöä valkaisun esikäsitte- 25 lynä (Clark et ai 1990, Clark et ai 1991). Näitä mannanaasipreparaatteja on tuotettu ..*·* Bacillus subtilis, T. harzianum ja Aspergillus niger -organismien avulla. Tuotteilla on · · V : raportoitu olleen myös valkaisua lievästi edistävä vaikutus, mutta niiden sisältämien *:··· epäpuhtauksien takia mannanaasikomponentin vaikutusta ei ole erikseen pystytty osoitta- *:··: maan.

/:-.30 • ♦ ψ

Esillä olevan keksinnön tarkoituksena on poistaa tunnettuun tekniikkaan liittyvät epä- *· · kohdat ja saada aikaan aivan uudenlainen entsyymituote, jota voidaan käyttää esim.

3 118264 selluloosamassan valkaisun yhteydessä.

Esillä oleva keksintö perustuu siihen yllättävään havaintoon, että Trichoderma -suvun homeiden tuottamat mannanaasientsyymit sopivat erityisen edullisesti mannopolymeeri-en hydrolysointiin ja siten esim. selluloosamassojen käsittelyyn.

5

On tunnettua, että useiden homeiden mannanaasintuottoa voidaan indusoida käyttämällä alustassa sekä selluloosaa (Lyr 1963) että mannaanipitoisia komponentteja (Reese ja Shibata 1964). On myös tunnettua, että Trichoderma reesei -home on tehokas selluloosaa (esim. Bisaria ja Ghose 1981) ja ksylaania (Poutanen et ai. 1987) hajottavien 10 entsyymien tuottajana. Luonnossa kasvaessaan Trichoderma reesei hyödyntää monipuo lisesti kasvimateriaalista selluloosan lisäksi sen hemiselluloosaosan.

Keksinnön pohjana olevassa tutkimustyössä voitiin todeta erään Trichoderma reesei - kannan (Rut C-30, VTT D-86271) tuottavan fermentorissa runsaasti mannanaasiaktiivi- 15 suutta kasvatettuna alustalla, jossa hiililähteenä oli selluloosa ja typpilähteenä maissin- liotusvesi. Keksinnön yhteydessä Trichoderma reesei -kannasta on saatu entsyymiseos, joka sisältää ainakin yhden seuraavista entsyymeistä: mannanaasiaktiivisuuden omaava entsyymi, jonka isoelektrinen piste (pl) on noin 3,8, mannanaasiaktiivisuuden omaava , entsyymi, jonka pl on noin 4,1, mannanaasiaktiivisuuden omaava entsyymi, jonka pl on • · · . .·. 20 noin 4,5, mannanaasiaktiivisuuden omaava entsyymi, jonka pl on noin 5,4 ja man- **# nanaasiaktiivisuuden omaava entsyymi, jonka pl on noin 6,5. Isoelektriset pisteet on • · ; määritetty isoelektrisellä fokusoinnilla, jolloin määrityksen tarkkuus on luokkaa ±0,5 « ·· · pl-yksikköä.

♦ · 4 ♦ · ♦ 4 · · 25 Edellä esitetty mannanaasivalmiste on ominaisuuksiltaan erilainen kuin aikaisemmin tunnetut mannanaasit ja se toimii mannopolymeerien hydrolyysissa huomattavasti tehok- V · kaammin kuin esim. lajista Bacillus subtilis eristetty mannanaasi.

« ····· • · *:**: Keksinnön mukaan haluttua entsyymiä (haluttuja entsyymejä) voidaan tuottaa myös 30 muilla Trichoderma reesei -kannoilla, muilla Trichoderma -sukuun kuuluvilla kannoilla * ♦ ♦ * ja muita kasvatusalustoja käyttäen. Tästä syystä keksinnön yhteydessä on myös eristetty ·*· edellä mainittuja entsyymejä koodaavat geenit sen mahdollistamiseksi, että entsyymiä 118264 4 voitaisiin tuottaa esimerkiksi geneettisesti tai mutatoimalla parannettuja Trichoderma reesei -kantoja käyttäen tai muilla geneettisesti muunnelluilla tuottoisännillä (esim. hiivasolu), joihin Trichoderma reesein mannanaaseja koodaavat geenit on siirretty. Geenien eristämiseksi on samalla kehitetty uusi menetelmä.

5

Keksinnön mukaisen ratkaisun tunnusmerkit käyvät täsmällisemmin ilmi oheisista patenttivaatimuksista.

"Mannanaasilla" tarkoitetaan entsyymiä, joka kykenee pilkkomaan mannoosiyksiköitä 10 sisältäviä polyoosiketjuja (mannopolymeerejä). Mannanaasilla tarkoitetaan siten sekä endomannanaaseja, jotka pilkkovat mannopolymeerejä ketjun sisältä, että eksoman-nanaaseja, jotka pilkkovat mannopolymeerejä ketjun päistä. Esimerkkeinä mannopoly-meereista mainittakoon glukomannaani, galaktoglukomannaani ja galaktomannaani.

15 Tässä hakemuksessa käytetyllä termillä "entsyymivalmiste" tarkoitetaan mitä tahansa sellaista tuotetta, joka sisältää ainakin yhden mannanaasientsyymin. Niinpä entsyymivalmiste voi olla esim. mannanaasia tai mannanaaseja sisältävä kasvatusliuos, eristetty mannanaasi tai kahden tai useamman mannanaasin seos.

• * · « ** ; .*.20 "Hybridisaatiolla" tarkoitetaan olosuhteita, joissa DNA-sekvenssien eri muodot hybri- ·#· disoituvat Trichoderman mannanaasia koodaaviksi DNA-sekvensseiksi.

% « t * • · » i · * *:* Tässä keksinnössä mannanaasi erotettiin Trichoderma reesein kasvuliuoksesta sinänsä · 4 V : tunnetuilla proteiinien puhdistusmenetelmillä. Entsyymin erottamiseen käytettiin anioni- 25 siä ja kationisia ioninvaihtimia ja hydrofobiseen vuorovaikutukseen perustuvaa kromato- grafiaa. Yllättävää oli entsyymin erottamisen yksinkertaisuus ja nopeus. Keksinnössä ei • V · : kuitenkaan rajoituta tähän entsyymin erotusmenetelmään, vaan entsyymi on mahdollista * *:*·: erottaa myös muita tunnettuja menetelmiä käyttäen.

♦ ··**· • · 30 Entsyymin mannanaasiaktiivisuus on määritetty käyttäen menetelmää, jossa entsyymi- näytteen annetaan vaikuttaa Johanneksen leipäpuun mannaaniin halutun ajan, minkä »«* jälkeen analysoidaan liuoksesta vapautuneet sokerit. Menetelmän kulku on seuraava: 5 118264

Valmistetaan Johanneksen leipäpuun marmaanista (Sigma G-0753, locust bean gum) 0,5 % liuos 50 mM Na-sitraattipuskuriin pH:ssa 5,3 ja poistetaan tästä mannaaniliuoksesta liukenematon kiintoaine sentrifugoimalla. Lisätään 1,80 ml:aan mannaaniliuosta 0,200 ml sopivasti laimennettua entsyyminäytettä, jonka annetaan vaikuttaa mannaaniin + 50 5 °C:ssa. Tarkalleen 5 minuutin kuluttua entsyyminäytteen lisäyksestä lisätään 3,00 ml DNS-reagenssia, ja pidetään seosta 5 min kiehuvassa vedessä, jonka jälkeen seos jäähdytetään kylmällä vedellä. Muodostunut väri mitataan spektrofotometrillä käyttäen aallonpituutta 540 nm. Lasketaan näytteessä olevien pelkistävien sokerien määrä vertaamalla mitattua spektrofotometrilukemaa, josta on vähennetty entsyyminäytteen sello laisenaan sisältämien pelkistävien sokereiden vaikutus, arvoihin, jotka saadaan kun tunnetun vahvuista maimoosiliuosta on käsitelty vastaavalla tavoin kuin entsyyminäytettä. Yksi aktiivisuuden yksikkö (kat/ml) on se 1 ml:n laimentamatonta näytettä sisältämä entsyymimäärä, joka vapauttaa 1 moolin pelkistäviä sokereita sekuntia kohden edellä kuvatuissa määritysolosuhteissa.

15

Keksinnössä kuvaillaan edelleen spesifiset Trichodemum mannanaaseja koodattavat geenit. Keksinnön mukaiselle DNA-sekvenssille on siten ominaista, että se koodaa Trichoderma -suvun homeen mannanaasia ja hiiva- tai homekantaan siirrettynä saa ( tämän kannan tuottamaan mannanaasia.

. λ 20 > t » r tt

On huomattava, että nykyinen biokemiallinen ja molekyylibiologinen tieto osoittaa, että ; : : vastaavanlainen, sovelluksiin soveltuva entsyymiaktiivisuus voidaan mahdollisesti saada aikaan ilmentämällä myös ko. geenien osia tai nukleotidisekvenssiltään luonnollisesta

I * F

V 1 geenistä eroavia geenimuotoja tai synteettisiä geenejä. Täten kyseisen keksinnön piiriin 25 kuuluvat myös kaikki tässä keksinnössä kuvailtuja geenejä muistuttavat geenimuodot, t ..." jotka koodittavat vastaavanlaista mannanaasiaktiivisuutta.

•i» * t * ' · ψ t * *ί**ϊ DNA-sekvenssistä voidaan muodostaa vektori, kuten esimerkissä 1 kuvattavat hiivavek- **"· torit pMANl, pMAN2, pMAN3 tai pMAN4. Nämä vektorit on talletettu hiivakannassa * 30 Saccharomyces cerevisiae DBY746 kokoelmaan Deutsche Sammlung von Mikroor- *

i ”: ganismen und Zellkulturen GmbH 30. joulukuuta 1992 numeroilla DSM 7363, DSM

f*· 7364, DSM 7366 ja vastaavasti DSM 7365. Kloonaukseen käytettyä hiivakantaa on 118264 6 kuvattu tarkemmin julkaisussa Penttilä, M.E. et ai., Cloning of Aspergillus niger genes in yeast. Expression of the gene coding Aspergillus /3-glucosidase, Mol. Gen. Genet. 194 (1984),494-499.

5 Tämän keksinnön yhteydessä on myös saatu aikaan menetelmä etenkin Trichoderma reesein mannanaaseja määrittävien geenien eristämiseksi. Menetelmä sopii kuitenkin muidenkin mikro-organismien mannanaaseja määrittävien geenien eristämiseen. Menetelmässä käytetään hyväksi hiivaan, etenkin Saccharomyces cerevisiae -kantaan rakennettua ekspressiogeenipankkia. Tällöin homeen geenit ilmentyvät hiivassa hiivan pro-10 moottorin alaisina. Mannanaasiproteiini erittyy hiivasta solun ulkopuolelle ja mannanaa- sigeenin sisältävät hiivakloonit voidaan löytää niiden tuottaman mannanaasiaktiivisuuden perusteella, joka voidaan todeta entsyymiaktiivisuustestillä tai maljatestein. Man-nanaasiaktiivisuutta tuottava hiiva voidaan löytää myös esim. mannanaasia vastaavan vasta-aineen avulla. Entsyymiaktiivisuuteen perustuva menetelmä on erittäin suositeltava 15 mannanaasigeenien eristämiseksi, koska näin löydetään aktiivista mannanaasientsyymiä tuottavat hiivat ja geeni voidaan eristää karakterisointia varten näistä hiivoista. Eks-pressiohiivapankki voidaan rakentaa myös käyttämällä jotain toista, myös heikomman ekspressiotason antavaa hiivapromoottoria. Mahdollisesti myös mannanaasigeenin omaa promoottoria voidaan käyttää, ja geenien eristämiseen voidaan mahdollisesti käyttää 20 myös kromosomaalista geenipankkia. Geenipankki voidaan rakentaa myös esim. yksiko- • · « pioplasmidiin.

* · t • * · • · · • · • * *

Edellä esitetyn perusteella keksinnön mukainen menetelmä mannanaaseja määrittävien • · · geenien eristämiseksi voidaan yleisessä muodossaan määritellä seuraavien edullisten toi- • · · *

25 menpiteiden avulla: Mannanaasiaktiivisuutta tuottavan mikro-organismin lähetti-RNA

• · pooli rikastetaan ensin mannanaasin lähetti-RNA:n suhteen kasvattamalla mikro-organis- •|. mia olosuhteissa, jotka indusoivat mikro-organismin mannanaasituotannon. Mannanaasi- * · · · tuotannon indusoivat esim. mannanaasipitoiset ja/tai selluloosapitoiset kasvatusalustat. Mikro-organismista eristetään lähetti-RNA:ta, josta tuotetaan vastaava cDNA. Saatu • · 30 cDNA liitetään vektoriin hiivapromoottorin alaiseksi ja saadut rekombinanttiplasmidit transformoidaan hiivakantaan, joka luontaisesti ei oleellisesti tuota vastaavaa mannanaa- • · * • · · siä, ekspressiogeenipankin aikaansaamiseksi. Saatuja hiivaklooneja kasvatetaan tämän • · *· 118264 7 jälkeen kasvatusalustalla, jolla ekspressiogeenipankki ilmentyy hiivassa. Mannanaasia tuottavat hiivakloonit erotetaan muista hiivaklooneista. Ensin mainittujen kloonien plasmidi-DNA eristetään ja haluttaessa sekvensoidaan DNA mannanaasia vastaavan DN A-sekvenssin määrittämiseksi.

5

Kuten yllä on todettu, menetelmässä käytetään mannanaasia tuottavana mikro-organismina edullisesti hometta ja erityisen edullisesti Trichoderma -sukuun kuuluvaa home-kantaa. Erään edullisen sovellutusmuodon mukaan hometta kasvatetaan tällöin alustalla, jonka hiililähde sisältää ainakin mannaani- (esim. galaktomannaani-) ja/tai selluloosapi-10 toista substraattia ja tämän lisäksi mahdollisesti asetyyliglukuronoksylaania ja/tai ksylaa- nia. Kuten alla esitettävästä esimerkistä 2 käy ilmi, alusta voi esim. sisältää kaikkien näiden aineiden yhdistelmän sekä typpilähteenä edelleen esim. maissinliotusvettä.

Menetelmän seuraavassa vaiheessa rekombinanttiplasmidit siirretään edullisesti Saccha-15 romyces -sukuun kuuluvaan hiivakantaan, erityisen edullisesti Saccharomyces cerevisiae ; -kantaan, jota kasvatetaan mannanaasin tuottamiseksi. Plasmidivektorin hiivapromootto-rina voi olla esim. PGK tai sentapainen vahvaksi katsottava promoottori, jolloin hiiva-klooneja voidaan kasvattaa erilaisilla alustoilla, kuten glukoosilla ja galaktoosilla. Kasvatusalusta valitaan sen mukaan, minkä promoottorin alle geeni laitetaan. Keksinnön 20 mukaan on myös mahdollista käyttää hiivavektoria, jossa promoottori on galaktoosilla * * · *·;* indusoituva, jolloin hydrolaasigeenit saadaan ilmentymään galaktoosilla eikä esim.

« « · Γ\ glukoosilla. Promoottorin PGK:n etuna on vahva ekspressiotaso, mikä on edullista, kun • · · t * · .* / kyse on entsyymeistä, joilla on pieni katalyyttinen aktiivisuus. Sen manipulointi on • · · *’V myös helppoa. Kuten esimerkissä 1 on täsmällisemmin esitetty, plasmidivektorina * #···,25 voidaan käyttää esim. vektoria pAJ401, joka on valmistettu vektorista pFL60 kat- • * · kaisemalla tämä restriktioentsyymeillä ja liittämällä siihen oligonukleotideista koostuva adapteri. Mikro-organismin lähetti-RNA:sta syntetisoitu cDNA liitetään tällöin vektoriin • · · · pAJ401 promoottorin ja terminaattorin väliin, promoottorista alajuoksuun.

On huomattava, että tämän keksinnön puitteissa mannanaasigeenit voidaan eristää • « periaatteessa myös kaikilla muilla yleisesti tunnetuilla menetelmillä, esim. menetelmillä, • · · joissa ekspressiogeenipankki rakennetaan E.coli -bakteeriin esim. lambdavektoriin, • · • · * * * 118264 jolloin tiettyä proteiinia vastaavan geenin sisältämä klooni voidaan löytää esim. proteiinia vastaavan vasta-aineen avulla. Geeni voidaan löytää myös esim. käyttämällä koettimena geenipankin hybridisaatiossa mannanaasiproteiinin N-terminaalista aminohap-posekvenssiä vastaavia oligonukleotideja.

5

Keksinnössä kuvaillaan T.reesei -homeen mannanaasigeenien ekspressio hiivassa ja aktiivisen geenituotteen eritys hiivan kasvuliuokseen. Koska S.cerevisiae ei eritä luonnostaan mannanaasiaktiivisuutta, voidaan rekombinanttihiivaa, joka tuottaa T.reesein mannaasia, käyttää sellaisenaan spesifisen mannanaasia sisältävän entsyymipreparaatin 10 tuottamiseen. Aiemmin ei ole kuvailtu minkään mannanaasigeenin ekspressiota vieraas sa isäntäorganismissa. Keksintömme osoittaa, että homeperäistä mannanaasia voidaan tuottaa ja erittää hiivassa, ja täten keksinnön piiriin kuuluu mannanaasientsyymin tuotto myös muissa hiivoissa, esim. Kluyveromyces, Pichia tai Hansenula-hjeissa. Mannanaa-sigeeni voidaan siirtää muihin homeisiin, esim. Aspergillus, Penicillium, Neurospora tai 15 Phanerochaete -lajeihin, tunnetuilla menetelmillä ja saada home erittämään aktiivista

Trichoderman mannanaasia. Myös Trichodemum itsensä mannanaasien tuottoa voidaan geenin eristämisen jälkeen tehostaa tai modifioida tunnetuilla geeniteknisillä keinoilla esim. siirtämällä homeeseen useita kopioita kromosomaalista mannanaasigeeniä tai kytkemällä geeni toisen geenin (esim. vahvemman) promoottorin alaiseksi ja näin saada : 20 aikaan mannanaasiekspressio halutuissa kasvuolosuhteissa, esim. sellaisilla alustoilla, * · · missä home ei luonnostaan mannanaaseja tuota. Keksinnön piiriin kuuluvat siis kyseisiä ·*/.: Trichoderman mannanaaseja tuottavat organismit.

• * • · · • · « t · ·

Keksinnön mukaiselle rekombinanttihiiva-tai homekannalle on siten ominaista, että se • · » • · « _ *.* * 25 sisältää DNA-sekvenssin, joka koodaa Trichoderma -suvun homeen mannanaasia.

Edullisesti tämä hiivakanta on Saccharomyces cerevisiae lajin kanta, kuten S.c.mani, • · ·.* ” S.c.man2, S.c.man3 tai S.c.man4 (ks. alla esitettävä esimerkki 1). Rekombinanttihome- • * "* kanta on taas edullisesti Trichoderma -sukuun kuuluva.

* · · • * · • · · • * · • · *·..* 30 Edellä esitetyn perusteella saadaan myös aikaan menetelmä sellaisten hiivakantojen V.· konstruoimiseksi, jotka kykenevät ilmentämään mannanaasia. Menetelmän mukaan * · mannanaasia koodaavat DNA-sekvenssit eristetään sopivasta homekannasta, DNA- ·. ' 9 118264 sekvenssistä muodostetaan hiivavektori ja hiivavektori siirretään sopivaan hiivakantaan. Hiivavektorit siirretään tällöin esim. Saccharomyces, Kluyveromyces, Pichia tai Han-senula -suvun hiivakantaan.

5 Keksintö käsittää vielä menetelmän mannanaasientsyymin tuottamiseksi, jossa menetel mässä Trichoderma reesei -homeesta eristetään mannanaasia koodaava DNA-sekvenssi, minkä jälkeen muodostetaan sanottua DNA-sekvenssiä sisältävä vektori, joka siirretään sopivaan hiiva- tai homekantaan rekombinanttikannan aikaansaamiseksi. Rekombinantti-kantaa kasvatetaan sitten sellaisissa olosuhteissa, joissa kanta pystyy ilmentämään man-10 nanaasia. Tuotettu mannanaasi otetaan talteen esim. eristämällä se kasvatusalustasta.

Keksinnön mukaan tuotettavia mannanaasivalmisteita voidaan erityisen edullisesti käyttää mannopolymeerien hydrolyysiin, etenkin selluloosamassojen valkaisun yhteydessä. Valkaisussa käytetään tällöin T. reeseistä eristettyjä (tai jollain muulla yllä selostettaval-15 la tavalla tuotettuja) mannanaaseja joko seoksena, puhdistettuina tai kasvuliuoksena.

Mannanaaseja voidaan käyttää yhdessä ksylanaasin kanssa. Erityisen edulliseksi on havaittu yhdistetyn mannanaasi/ksylanaasi- käsittelyn suorittaminen kloorikemikaaleja käyttävän valkaisun yhteydessä. Kloorittomissa valkaisumenetelmissä (esim. peroksidi-valkaisu) saavutetaan sensijaan varsin hyviä tuloksia jo pelkällä mannanaasientsyymival- , 20 misteella. Entsyymikäsittelyllä voidaan tehostaa jäännösligniinin uuttumista kemialli- • « * * · · sessa valkaisussa entisestään, ja menetelmällä on siten huomattava ympäristöllinen ja • · * • · · taloudellinen vaikutus.

*··-• · · » · • · • · · • · * • · * · Tässä keksinnössä esitetyllä mannanaasikäsittelyllä voidaan erityisesti täysin kloorikemi- ·*·· 25 kaalittomissa valkaisusekvensseissä saavuttaa sellainen vaaleuden nousu, jota ei pystytä pelkällä peroksidilla tai muulla kemikaalilla aikaansaamaan yhtä pienin kustannuksin tai ··· menettämättä massan lujuutta. Keksinnössä esitetty mannanaasikäsittely yhdistettynä

• •«I

ksylanaasikäsittelyyn edistää valkaistavuutta erityisen edullisesti sekä perinteisissä kloorisekvensseissä että täysin kloorikemikaalittomissa sekvensseissä. Perinteisessä • » 30 kloorivalkaisusekvenssissä voidaan massaa valkaista vakiokemikaaliannoksella suurem- * t paan loppuvaaleuteen tai vaihtoehtoisesti entsyymien avulla voidaan alentaa kemikaali- * « · • · f annosta alkuvalkaisussa kun tavoitteena on tietty vaaleus, jolloin entsyymikäsittelyllä on • · • · ·

Ik 118264 ίο ympäristöä säästävä vaikutus.

Entistä tehokkaampien entsyymien ansiosta voidaan siis suoraan vaikuttaa myös niiden kemikaalien tyyppiin ja määrään, joilla ligniini teollisesti uutetaan kuidusta ja voidaan 5 näin ollen edelleen parantaa ympäristön kannalta edullisia vähäkloorisia tai kloorittomia valkaisumenetelmiä.

Keksintöä ryhdytään seuraavassa tarkastelemaan muutaman ei-rajoittavan esimerkin valossa.

10

Esimerkeissä viitataan oheen liitettyihin piirustuksiin, jolloin kuviossa 1 on esitetty pFL60-plasmidista rakennetun pAJ401-plasmidin rakenne, kuviossa 2 on esitetty hiivavektorin pMANl mannanaasia koodaavan insertin restriktio-entsyymien leikkauskohdat, 15 kuviossa 3 on esitetty hiivavektorin pMAN2 mannanaasia koodaavan insertin restriktio- entsyymien leikkauskohdat, , kuviossa 4 on esitetty hiivavektorin pMAN3 mannanaasia koodaavan insertin restriktio-entsyymien leikkauskohdat ja kuviossa 5 on esitetty hiivavektorin pMAN4 mannanaasia koodaavan insertin restriktio- , 20 entsyymi leikkauskohdat.

* * * • * · tlf « * *

Esimerkki 1 4 f » • · ' t • ,·, Mannanaasigeenien eristäminen ja ilmentäminen hiivassa l « r • * · t f 9 · · « • f f 9 25 Trichoderma reesei -kantaa QM 9414 kasvatettiin fermenttorissa 42 h alustalla, joka m sisälsi litraa kohden: 20 g Solca floc selluloosaa, 10 g Locust bean gum (Sigma), 5 g ·;* KHzP04, 5 g (NH4)2S04. Tämän jälkeen alustaan lisättiin litraa kohden 1 g laktoosia, • * * · 1 g Birke 150 asetyyliglukuronoksylaania ja 1 g Oat Spelt ksylaania, ja hometta kasva- ,,*,i tettiin edelleen 24 h. Homeesta eristettiin RNA Chirgwinin et ai. (1979) mukaisesti ja * * 30 tästä erotettiin poly A+ mRNA oIigo(dT)-kromatografialla oleelliselta osiltaan kuten on

.1. kuvattu (Maniatis et ai,, 1982). mRNA:sta syntetisoitiin cDNA Stratagenen ZAP-cDNA

» I · -synteesimenetelmällä, ja se liitettiin plasmidivektoriin pAJ401. pAJ401 valmistettiin • · • * · 118264 11 vektorista pFL60 (Minet & Lacroute, 1990) katkaisemalla se EcoRI ja XhoI restriktio-entsyymeillä ja liittämällä tähän väliin adapteri, joka saatiin yhdistämällä oligonukleoti-dit 5’-tcgaagaattegagagactcgagt-3’ ja 3’-tcttaagctctctgagctcattaa-5\ Tällöin EcoRI ja XhoI entsyymien katkaisukohtien orientaatio muuttui plasmidissa. Syntetisoitu cDNA 5 liitettiin EcoRLllä ia Xholtllä katkaistuun pAJ401-vektoriin PGK promoottorin ia ter- minaattorin väliin. Kloonauksessa cDNA:n 5’-puoli asettuu PGK-promoottorista alajuoksuun. Ligaatioseos transformoitiin E. coli -kantaan PLK-F’ elektroporaatiolla (Dower et ai., 1988).

10 Plasmidin pAJ401 rakenne on esitetty kuviossa.

Geenipankkiplasmidit eristettiin yhdessä erässä noin 42 000 bakteeripesäkkeestä ja transformoitiin Saccharomyces cerevisiae -hiivakantaan DBY746 (Penttilä et ai., 1984) elektroporaatiolla (Becker & Guarante 1990) selektoiden transformantit Sc-alustalla, 15 josta puuttui urasiili. Hiivapesäkkeet kaavittiin maljoilta ja säilytettiin yhtenä eränä Se ura-alustalla 15 % glyserolissa -70 °C:ssa.

Mannanaasigeenien eristämistä varten geenipankkiseosta pipetoitiin substraattia sisältäville maljoille (hiivan minimimaljat, joissa 1000 ml kohden oli: 0,058 histidiiniä, , 20 0,082 g tryptofaania, 0,262 g leusiinia ja 0,1 % Locust bean gum (0,5 % kantaliuos 50 ♦ * » • « · mM:ssa sitraattipuskurissa pH 5,3. Yhteensä n. 100 000 geenipankkikloonia testattiin • · « viikon kasvatuksen jälkeen mannanaasiaktiivisuuden suhteen replikoimalla ensin mal- • tl ; joilta pesäkkeet, huuhtelemalla maljat vedellä ja värjäämällä maljat 0,1 %:sella Congo I « t • at ψ ,:. Red -liuoksella. Hydrolyysirenkaan antavat hiivapesäkkeet poimittiin replikamaljoilta ja f f .M.\25 niiden mannanaasiaktiivisuus testattiin uudelleen maljatestillä.

·*· Neljä mannanaasipositiivista hiivakloonia nimettiin Saccharomyces cerevisiae mani, • * « · ; S.c. man2, S.c. man3 ja S.c. man4. Nämä kannat talletettiin kokoelmaan Deutsche *

Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH 30. joulukuuta 1992 nume- • · 30 roilla DSM 7363, DSM 7364, DSM 7366 ja vastaavasti DSM 7365.

i • · · »av VV»

Hiivaklooni S.c. mani (DSM 7363) sisältää hiivavektorin pMANl, joka koostuu plas- « * * · « 1 1 8264 12 midista pAJ401, jossa EcoRI ja Xhol restriktioentsyymien avauskohdassa on 0,7 kb:n kokoinen mannanaasia koodaava insertti.

Hiivaklooni S.c. man2 (DSM 7364) sisältää hiivavektorin pMAN2, joka koostuu plas-5 midista pAJ401, jossa EcoRI ja Xhol restriktioentsyymien avauskohdassa on 0,7 kb:n kokoinen mannanaasia koodaava insertti.

Hiivaklooni S.c. man3 (DSM 7366) sisältää hiivavektorin pMAN3, joka koostuu plas-midista pAJ401, jossa EcoRI ja Xhol restriktioentsyymien avauskohdassa on 1,4 kb:n 10 kokoinen mannanaasia koodaava insertti.

Hiivaklooni S.c. man4 (DSM 7365) sisältää hiivavektorin pMAN4, joka koostuu plas-midista pAJ401, jossa EcoRI ja Xhol restriktioentsyymien avauskohdassa on 1,0 kb:n kokoinen mannanaasia koodaava insertti.

15

Mannanaasipositiivisista hiivaklooneista eristettiin DNA (Sherman et ai 1981), jolla transformoitiin E.coli -kantaa DH5a. Ampisilliinipositiivisista transformanteista eristettiin plasmidi-DNA konventionaalisilla menetelmillä ja digestoitiin useilla restriktioent-syymeillä, jotta saatiin selville, mitkä klooneista sisälsivät saman mannanaasigeenin.

. 20 Kloonit sekvensoitiin konventionaalisilla menetelmillä mahdollisimman täyspitkän • · · : kloonin saamiseksi kustakin geenistä.

• * « • · ♦ · * • ·· • * ::: Mannanaasigeenien cDNA-sekvenssi määritettiin konventionaalisilla menetelmillä.

*

Sekvenssiluettelossa SEQ NO. 1 on esitetty vektorin pMANl insertin nukleotidisek- • · · : 25 venssi.

« · • · ·* ** Klooneista eristettiin myös kromosomaalinen kopio aiemmin valmistetusta geenipankista • · · * · *···' (Vanhanen et ai. 1989), ja geenin 5’ pää määritettiin sekvensoimalla käyttäen hyväksi \j.: cDNA-sekvenssin perusteella suunniteltuja 5’-päälle spesifisiä alukkeita. Sekvenssiluot- • · · *...· 30 telossa SEQ ID NO. 2 on esitetty vektorin pMAN2 insertin 5’-pään nukleotidisekvenssi * : V: ja sekvenssiluettelossa SEQ ID NO. 3 vastaavasti sen 3’-pään nukleotidisekvenssi.

!.*.{ Sekvenssiluottelossa SEQ ID NO. 4 on esitetty vektorin pMAN3 insertin 5’-pää ja 13 1 1 8 2 64 sekvenssiluettelossa SEQ ID NO. 5 vastaavasti sen 3’-pää.

Esimerkki 2

Mannanaasigeenien eristäminen 5 Tässä esimerkissä kuvataan vaihtoehtoinen tapa eristää mannanaasigeenit geenipank-kiseoksesta. Trichoderma reesei -kannan QM 9414 kasvattaminen, geenipankkiplasmidi-en muodostaminen sekä geenien ilmentäminen hiivassa tehtiin esimerkissä 1 esitetyllä tavalla.

10

Mannanaasigeenien eristämistä varten geenipankkiseosta pipetoitiin Sc-ura-kasvuliuok-seen mikrotiitterilevyille siten, että jokaiseen mikrotiitterilevyn kaivoon tuli keskimäärin 70 erillistä hiivapankkikloonia, yhteensä noin 75 000 kloonia. Mikrotiitterilevyjä kasvatettiin 4 vrk ja solut sentrifugoitiin kaivojen pohjalle. Supematantista testattiin man-15 nanaasiaktiivisuus käyttäen substraattina Johanneksen leipäpuuta (ks. yllä). Muutama kaivo sisälsi mannanaasiaktiivisuutta, ja kyseisten kaivojen sisältämät hiivasolut maljat-tiin Sc-ura-maljoille erillispesäkkeiksi. Noin 130 erillispesäkettä kaivoa kohden testattiin uudelleen mannanaasiaktiivisuuden suhteen yksittäisten mannanaasigeenin sisältävien hiivakloonien identifioimiseksi.

20

Esimerkki 3 * • · · *·:·* Hiivakloonien kasvatus ja karakterisointi • * • * « • *· • · • · •tl ** V Tämä esimerkki kuvaa vaihtoehtoista tapaa karakterisoida mannanaasigeenejä sisältäviä « ♦ · • ' .

**** 25 hiivaklooneja.

• · · • · ·

Esimerkin 1 mukaan saatuja plasmidiklooneja pMANl, pMAN2, pMAN3 ja pMAN4 ,···, vastaavat hiivakloonit S.c.mani, S.c.man2, S.c.man3 ja S.c.man4 kasvatettiin Sc-ura- • * · • # kasvuliuoksessa 2 vrk pullossa ja supematantti analysoitiin Western blot -menetelmällä ", 30 käyttäen T.reeseistä puhdistettuja mannanaaseja vastaan tehtyjä vasta-aineita. Klooneista • * . saatua 5’-pään nukleotidisekvenssiä verrattiin myös puhdistetuista mannanaaseista saa- • * · • · · tuun N-terminaaliseen sekvenssiin. Näin saatiin selville, mitkä eristetyt man- * · * * · • * • · · 118264 14 nanaasigeenit vastaavat aiemmin puhdistettuja mannanaasiproteiineja.

Esimerkki 4 Entsyymin eristäminen 5

Entsyymin eristämistä varten Trichoderma reesein (Rut C-30, VTT D-86271) kasvuliu-os käsiteltiin bentoniitilla, kuten Zurbriggen et ai. (1990) ovat kuvanneet. Tämän jälkeen liuos konsentroitiin ultrasuodattamalla ja konsentraatti kuivattiin sumutuskuivai-mella.

10

Entsyymin eristäminen aloitettiin liuottamalla sumutuskuivattu kasvuliuos fosfaattipuskuriin. Liukenematon aines erotettiin sentrifugoimalla ja entsyymiliuos puskuroitiin geelisuodattamalla pH-arvoon 7,2 (Sephadex G-25). Entsyymiliuos pumpattiin tässä pH -arvossa kationit vaihtavaan kromatografiapylvääseen (CM-Sepharose FF), johon osa 15 näytteen proteiineista tarttui. Haluttu entsyymi kerättiin pylvään läpi siihen sitoutumatta jääneisiin jakeisiin.

Entsyymiliuos pumpattiin tässä pH-arvossa (pH 7,2) anionit vaihtavaan kromatografiapylvääseen (DEAE-Sepharose FF), johon suurin osa näytteen proteiineista tarttui.

20 Haluttu entsyymi kerättiin pylvään läpi siihen sitoutumatta jääneisiin jakeisiin.

« · · • · « »«* t « · ·

Entsyymin sisältävät jakeet puhdistettiin edelleen hydrofobiseen vuorovaikutukseen • · « / [· perustuvan kromatografiapylvään (Phenyl Sepharose FF) avulla. Entsyymi sidottiin * * * **.* e.m. materiaaliin suolakonsentraatiossa 0,3 M (NH4)2S04:a. Pylvääseen tarttunut « · · 25 entsyymi eluoitiin puskurilla pH 6,5 siten, että muodostui laskeva lineaarinen • · · • · · (NH4)2S04:n konsentraatiogradientti välille 0,3 - 0 M, jonka jälkeen eluointia jatkettiin puskurilla pH 6,5. Mannanaasientsyymi kerättiin gradientin lopussa ja sen jälkeen .··*. kerättyihin jakeisiin.

tl· *·· • · · · « ] 30 Entsyymiliuos puskuroitiin geelisuodattamalla pH-arvoon 4,3 (Sephadex G-25). Entsyy- . mi sidottiin tässä pH-arvossa kationit vaihtavaan kromatografiapylvääseen (CM-Sepha- ··· *·* * rose FF), ja osa pylvääseen tarttuneista proteiineista (mm. pääosa jäljellä olevista • · · • · t · ··· 15 118264 sellulaaseista) eluoitiin puskurilla pH 4,4. Mannanaasientsyymi eluoitiin puskurilla pH 4,3, johon lisättiin natriumkloridia siten, että muodostui lineaarinen konsentraatiogra-dientti pitoisuusvälille 0 - 0,05 M. Puhdistettu entsyymi kerättiin gradientin avulla eluoituneisiin jakeisiin.

5 '

Esimerkki 5

Entsyymin karakterisointi 10 Esimerkin 4 mukaisesti puhdistetun entsyymipreparaatin proteiiniominaisuudet määritettiin tavanomaisilla proteiinikemian menetelmillä. Molekyylipainot määritettiin SDS-PAGE-menetelmällä, jonka tarkkuus on noin ± 10%.

Valmiste sisältää kahta mannanaasi-isoentsyymiä, jotka biokemiallisilta ja toiminnallisilta 15 ominaisuuksiltaan osoittautuivat lähes samanlaisiksi. Isoentsyymit on nimetty EM 3:ksi ja EM 4:ksi. Näiden ominaisuuksia on kuvattu taulukossa 1.

• · · • · · ·· · ♦ · » • ♦ · • * · *···· ··· • · • · * * ♦ ··· ····-.

t ♦ · · • * ♦ ♦ *»« • · · * · · • · * * * »·· » * * · * · • « « « · • · · ··· • * * · * · · • · ·

♦ · I

• · · * IM • « * Φ • · · 118264 16

Taulukko 1. Trichoderma reesein mannanaasin ominaisuudet

Ominaisuus Yksikkö EM 3 EM 4

Molekyylipaino denatu- kDa 51 53 5 roivissa olosuhteissa isoelektrinen piste 4,5 5,4 suhteellinen spesifinen % vertailusubs- aktiivisuus traatin aktiivisuu desta -vertailu* 100 100 10 - guar-mannaani 45 40 - kivipähkinän 7 9 liukenematon mannaani - kivipähkinän 126 145 liukoinen mannaani 15 pH-optimi 3-5,3 3-5,3 lämpötilaoptimi aktiivi- °C 70 70 suusmäärityksen olosuhteissa liukoisen/3-1,4-mannaanin M2, M3 M2, M3 20 hydrolyysituotteet a: Johanneksen leipäpuun mannaani . M2 mannobioosi M, mannotrioosi * · · «Il 4 4 « • · \*·; 25 Entsyymeistä EM3 ja EM4 on myös määritetty N-terminaaliset aminohapposekvenssit ja • · : nämä on ilmoitettu sekvenssiluetteloissa SEQ ID NO, 6 ja vastaavasti SEQ ID NO. 7.

« « · « ·«·*>.

• * * * *

Esimerkki 6 0 • 0 0 *··*· 30 Trichoderma reesein kasvuliuokseensa tuottamat mannanaasit ***

• 4 I

• * * *

Trichoderma reesei -hometta (VTT-D-86271) kasvatettiin fermentorissa 5 vrk * * ravintoalustalla, jonka pääkomponentit olivat selluloosa ja maissinliotusvesi. Tämän : jälkeen liuoksesta erotettiin solut sentrifugoimalla ja kasvuliuoksen mannanaasi- * * * • * • · * * * 118264 17 aktiivisuutta karakterisoitiin isoelektristä fokusointia, ioninvaihtokromatografiaa ja kromatofokusointia käyttäen.

Isoelektrinen fokusointi tehtiin Pharmacia-LKB:n Phast-laitteistolla valmistajan ohjeiden 5 mukaan saman valmistajan toimittamassa geelissä, johon fokusoinnissa muodostui pH:n suhteen gradientti välille pH 3 - pH 9. Tästä geelistä siirrettiin isoelektrisen fokusointiajon jälkeen proteiinit värjäysgeelille, joka sisälsi Johanneksen leipäpuun mannaania. Tästä geelistä voitiin kongopunavärjäyksellä havaita mannanaasiproteiinien paikka, jonka perusteella mannanaasientsyymien isoelektrinen piste arvioitiin.

10

Isoentsyymien osuus kokonaismannanaasiaktiivisuudesta arvioitiin ajamalla Pharmacia-LKB:n toimittamassa PBE 94 -geelissä kromatofokusointi valmistajan ohjeiden mukaisesti ja mittaamalla saaduista fraktioista mannanaasiaktiivisuus sekä tekemällä niistä aktiivisuusvärjäys edellä kuvatulla tavalla. Lisäksi puhdistusproseduurin eri 15 fraktioista tehtiin tarvittaessa mannanaasimäärityksen lisäksi aktiivisuusvärjäys. Näitä menetelmiä käyttäen osuus esimerkin mukaisessa liuoksessa voitiin arvioida 10 -20 %:n tarkkuudella.

Taulukossa 2 on ilmoitettu mannanaasientsyymien isoelektriset pisteet ja suhteelliset 20 aktiivisuudet.

• · v • 1 · * 1 1 • « 1 • · ♦ ···' • 1 » 1 » / / Taulukko 2. Trichoderma reesein tuottamien mannanaasien isoelektriset pisteet ja • § · suhteelliset osuudet kokonaismannanaasiaktiivisuudesta

«M

: Γί 25 pl Arvioitu osuus mannanaasiaktiivisuudesta (%) *::: emi 3,8 5-15 * 1 · - _ . · • · · - - - EM 2 4,1 10-30 • ___ • 4»»« - - EM 3 4,5 30-40

*·«·« —.................... , , I I

EM 4 5,4 30 - 40 '·2 1' 30 EM 5 6,5 alle 5 * 1 1 7 » 2 • » · 118264 18

Esimerkki 7

Sulfaattimassan hydrolyysikoe.

Mäntysulfaattimassaa, mäntypuujauhoa sekä näistä eristettyjä glukomannaanifraktioita 5 hydrolysoitiin T. reesein mannanaasilla. Käytetty entsyymiannos oli 5000 nkat/g laskettuna glukomannaania kohden. Käsittely tehtiin 50 mM sitraattipuskurissa pH 5,0. Käsittely kesti 24 h, lämpötila oli 45 °C. Käsittelyn jälkeen mitattiin liuenneet sokerit happohydrolyysin jälkeen. Tulos ilmoitettiin % alkuperäisestä glukomannaanista, joka oli hydrolysoitunut (taulukko 3).

10

Taulukko 3. Hydrolysoitujen glukomannaanien suhteellinen osuus

Substraatti % glukomannanista hydrolysoitunut 15 j _;_;_ · mäntypuujauho 11 mäntypuusta eristetty mannaani 65 mäntysulfaattimassa 10 mäntysulfaattimassasta eristetty mannaani 79 20 _;_________ • » » • 1 · • · « • · · *···] Mannanaasi hydrolysoi siis tehokkaasti sekä mäntypuusta että mäntysulfaattimassasta i · » ,1 / eristettyä mannaania tuottaen glukomanno-oligomeerejä.

t $ ·

( 1 I

* » · 1 * * · · *::: 25 • # 1

Esimerkki 8 ,·, Sellumassan valkaisukoe (mannanaasiesikäsittely) • · · · • · 1 • · 1

• t I

, Mäntysulfaattimassan (kappa 26,2) käsittely T. reesei mannanaasilla 5 % sakeudessa, * · . 30 2 h, pH 5, 45 °C. Käsittelyn jälkeen massa pestiin (2xl0xmassan kuiva-aine) ja • · . valkaistiin 1-vaiheisella peroksidisekvenssillä. Peroksidivaiheen jälkeen massa • · 1 * 1 1 1 '•'t‘ hapotettiin ja siitä mitattiin vaaleus, kappa ja viskositetti. Tulokset on annettu » t ·« tv1 118264 19 taulukossa 4. Käytetyt kemikaaliannokset ja olosuhteet olivat: H202 3 %, NaOH 1,5 %, DTPA 0,2 %, MgS04 0,5 %, 80 °C, lh.

S Taulukko 4. Sulfaattimassa valkaisu peroksidilla mannanaasikäsittelyn jälkeen

Annos vapautuneet kappa vaaleus viskositeetti nkat/g pelkistävät % dm3/kg sokerit % ka:sta 100 0,25 13,9 42,9 970 500 0,48 13,5 43,2 940 10 ref 0 17,6 41,0 980

Pelkällä mannanaasikäsittelyllä peroksidivaiheen kappareduktio oli referensssikäsittelyyn verrattuna 23 %.

15

Esimerkki 9

Sellumassan valkaisukoe.

• « · • » · ··* ψ · !Λ! Noudatettiin esimerkissä 5 esitettyä menettelyä sillä erolla, että havupuumassaa t · • * * :.::20 käsiteltiin mannanaasilla ja ksylanaasilla. Massalle suoritettiin peroksididelignifiointi * • · « *·” kuten esimerkissä 4. Tulokset on ilmoitettu taulukossa 5.

* * · s * f * · · f • · t • » · 4. · · • a · · · • · ···»« *♦* ·· » · 1 • · 9 « ♦ * · 118264 20

Taulukko 5. Sulfaattimassan valkaisu peroksidilla mannanaasi/ksylanaasikäsittelyn jälkeen

Ents. Annos Peik. sokerit kappa vaaleus viskositeetti nkat/g % ka:sta % dm3/kg XYL + 100 0,45 12,8 45,0 990 5 MAN + 100 XYL + 100 0,9 11,8 44,8 950 MAN + 500 XYL 100 0,41 16,8 43,7 990 ref - 0 17,6 41,0 980 10 XYL = ksylanaasi MAN = mannanaasi

Mannanaasikäsittely yhdistettynä ksylanaasikäsittelyyn laski peroksidivalkaistun massan • ♦ · 15 kappaa 32 % verrattuna referenssikäsittelyyn.

• · · * ·· * t i * i • ·· « · ♦ · • · ♦ • · φ • ·· »

Esimerkki 10 t· · · ♦

Sellumassan kloorikemikaaleilla suoritettu valkaisukoe f 20 _ Laboratoriossa keitettyä mäntysulfaattimassaa (kappa 34.4) käsiteltiin T. reeseistä iT: puhdistetulla mannanaasilla 5 % sakeudessa pH:ssa 5 ja lämpötilassa 45 °C, Käsittelyn jälkeen massa pestiin ja valkaistiin sekvensillä (D50/C50)EDED.

t « 25 ♦ Ψ ♦ f » t * f · W t f ♦ · 118264 21

Taulukko 6. Havupuumassan valkaisu kloorikemikaaleilla entsyymikäsittelyn jälkeen

Ents. Annos Klooraus Välikappa Vaaleus Viskositeetti nkat/g -kerroin % dm3/kg MAN 90 0,15 6,4 88,4 1050 5 XYL pI9 100 0,15 5,6 89,5 1080 MAN + 90 + 0,15 5,2 90,3 1060 XYL 100 ref - 0,15 6,5 88,1 1050 ref - 0,18 4,5 90,5 1050 10

Pelkkään ksylanaasikäsittelyyn verrattuna saatiin yhdistetyllä ksylanaasi- ja mannanaasikäsittelyllä huomattavasti pienempi välikappa ja korkeampi loppuvaaleus.

Esimerkki 11 15 Mannanaasilla käsitellyn sulflittimassan valkaisukoe . Havusulfiittimassaa käsiteltiin mannanaasilla 5 % sakeudessa pH:ssa 5, 45 °C, 2 h.

' · · ; Käsittelyn jälkeen massa pestiin ja valkaistiin 1-vaiheisella peroksidisekvenssillä.

·*» }\j Peroksidivaiheen jälkeen massasta mitattiin vaaleus, kappa ja viskositetti. Käytetyt itj : 20 kemikaaliannokset olivat 1,5 % H202, NaOH 1,2 % ja MgS04 0,05 %. Kesto 60 min, 80 °C. (Enz= XYL 100, XYL 100 +500, MAN 500) • * * t * · • * ·

Havaittiin, että mannanaasikäsittelyllä pystyttiin edistämään sulflittimassan ’··’ valkaistavuutta.

:«f * ¥ t · .* '25 ♦ » 4 # · f • t ♦ («f·· • * I ’ # « « »f·'.

* »*· t f » · f * · 22 - 1 1 8264 .:

Esimerkki 12

Mannanaasilla ja ksylaanilla käsitellyn sulfaattimassan valkaisukoe

Havusulfaattimassaa (kuusi/mänty) käsiteltiin mannanaasilla ja ksylanaasilla kuten 5 esimerkissä 7. Käsittelyn jälkeen massa pestiin ja valkaistiin sekvenssillä D(ED)DED. Valkaisuolosuhteet on esitetty taulukossa 7A.

Mannanaasikäsittelyn avulla massan välikappa ja vaaleus olivat paremmat kuin referenssimassan. Kun mannanaasikäsittely yhdistettiin ksylanaasikäsittelyyn, oli 10 välikappa huomattavasti pienempi ja yli 90 % loppuvaaleus saavutettiin 15 % kemikaalisäästöllä 7B.

··· « * · * * * • · * • · · • · • * · • a · • · • · • · t * * * * • a a a • · * a · * • a · • * · * • · · *·*' * * * * « · · Φ • · ·*·· • · ··· • · · • * t « · t • * * Φ * * · 23 118264 5 5 n s- _ q pr o # f- S - ^

' ΓΜ ^ 1 O

£ — 01 Ό w © „ .O m ft. ^ ö ^ *3 W n <? q j ^ "m w. V) ^ rn ^ rs ^ rt ‘«“1 lo —-^— ————--- o" _ *n σ\ ,Ξ g °l o ^ d> *"1 O & hh ^ m ^^4-

45 i i i · I

O On O ^ rf oo oo S J ci O ro O rn ΊΆ — ^ 3 «3

Ui _ ____^____ o------

O

2

n‘ w .S o o £ o S

. £-J <u c vo vo Ξ2 όΞΞ • · · ϋΰ s/ ^

\:.* Q

* ΧΛ) • · * Cm B------o

:*·.: Q .S

|·.··: 1 i- O g g O g g I

... . u 13 * · * C s * <3 S io ···· K O ^ *** 3 — O rs V : -i 3 % % B “ i .:. > ä * * 2 2 SS | ° | ·;:: s έ«| . . . ä o .3 2 • · · js___ _ -js o o . s 1 S E 3 ....: ri ° ^ m ‘s '-’ ! ! -7; g iS “

. M § % I 1 S

* · 3 rt > 2 g Ä

* 3 ^ q o. q tN fy w2(S

.*:·.£ > StuQujQ " * “ ·,· · Γ* 1^ I I I I I_l____^_| i- m m »·· · « ♦ ···." 24 118264 • w1 1 M ° t t a I -a

3 3 (P

"g w> ? § § ^ R

3 Ή ^5. O' ON OS Os On • ίΛ T\ "e s > a 1 <N--

PS

& jf , CO °° <N t-„ t-; ~ •o 3 3 os o o on o

*S . Q< ω oo Os Os 00 O

i & 1 Λ a---- E/3 £9 S'· . e« -t 10. 1n °° <»

£N 3 O CN m Os <N

B _ .¾ oo oo oo r·· oo a d ! 1 : P-< uu-- 0 — ci,

Sg §" N VI N SO 1—^ § J2 so ίο «O so so 3 ia «5 > m ____ 3 S: a j, £4 3 _ «0<0i0»00

73 g .5 li—II—IfS

•S 8 g °’ °1 ° °1 °" 1 H Ä

. _ — II

* 1 1 • · · c *♦· : 1.: § ^ § o oo o :.·; s 3 ! Jj = ° ° ··· · C JP O Kö * S3 Pi1 ΙΛ Q"’ ··· 1rr> * S' " • ·· ·

*“·1· .g Q

*·1 =¾ Ξ •a + * I J .2 s s s

·:· a <3 <o — ό I I

··1· >» — .·:·. a • 1 1 * · Eh *** · r-~ 1a 3 1 S. + ”·1: 3 i S z i z 3 S a $ rf $ * 33 3 O J s1h s2 .·:·. S J |_ω_ s x S a a · · • 1 • · 2 * 1 1 25 1 1 8264

Viitteet

Becker, D.M. & Guarante, L. (1990) High efficiency transformation of yeast by electroporation. Meth. Enzymol. 194:182-.

5

Beldman, G., Searle-van Leeuwen, M.F., Rombouts, F.M. and Voragen, F.G.J.

(1985) The cellulase of Trichoderma viride Purification, characterization and compa-rision of all detectable endoglucanases, exoglucanases and 0-glucosidases. Eur. J. Biochem. 146:301-308.

10

Bisaria, V.S. and Ghose, T.K. (1981) Biodegradation of cellulosic materials: substrates, micro-organisms, enzymes and products. Enzyme Microb. Technol. 3: 90-104.

Chirgwin, J.M., Przybyla, A.E., MacDonald, R.J., and Rutter, W.J. (1979) Isolation 15 of biologically active ribonucleic acid from sources enriched in ribonuclease.

Biochemistry 18:5294-5299.

Clark TA, McDonald AG, Senior DJ, Mayers PR (1990), Abstr. 4th Int. Conf. on Biotechnology in the Pulp and Paper Industry, Raleigh 1989, pp. 39-40.

. .-20 » I I • · · j .·. Clark, T.A., Steward, D., Bruce, M.E., McDonald, A.G., Singh, A.P. and Senior, • » · j D.J. (1991) Proc. 45th APPITA Annual General Conference, Melbourne 1991, Voi. I, * * • pp. 193-200.

» · * · · * « · · .*1*25 Dower, W.J., Miller, J.F. & Ragsdale, C. W. (1988) High efficiency transformation of * E.coli by high voltage electroporation. Nucl. Acids Res. 16:6127-6145.

*»· « · · · : Kantelinen, A., Rättö, M., Sundquist, J., Ranua, M., Viikari, L. and Linko, M.

....: (1988) Hemicellulases and their potential role in bleaching. 1988 International Pulp ·;·50 Bleaching Conference. Tappi Proceedings, 1-9.

* • · · - .

«II • « ·

Kantelinen, A., Sundquist, J., Linko, M. and Viikari, L. (1991) The role of • » 118264 26 reprecipitated xylan in the enzymatic bleaching of kraft pulp. Proc. 6th International Symposium on Wood and Pulping Chemistry, Melbourne 1991, Voi. I, pp. 493-500.

Luce, J.E. (1964) Radial distribution of properties through the cell wall. Pulp and 5 Paper Magazine of Canada 65, 419-423.

Lyr, H. (1963) Occurence of mannanases in fungi. Z. Allgem. Mikrobiol. 3, 25-35.

Maniatis, T., Fritsch, E.F. and Sambrook, J. (1982) Molecular cloning. A laboratory 10 manual. Cold Spring Harbor Laboratory, New York.

Minet & Lacroute (1990) Curr. Genet. 18:287-291.

Penttilä, M.E., Nevalainen, K.M.H., Ray nai, A. & Knowles, J.K.C. (1984) Cloning 15 of Aspergillus niger genes in yeast. Expression of the gene coding Aspergillus j3- glucosidase. Mol. Gen. Genet. 194: 494-499.

Poutanen, K. Rättö, M., Puls, J. and Viikari, L. (1987) Evaluation of different microbial xylanolytic systems. J. Biotechnol. 6: 49-60.

.20 • · · *’! Reese, E.T. and Shibata, Y. (1965) 0-Mannanases of fungi. Can. J. Microbiol. 11: • · · 167-183.

• · t * ·· * · .

· • « · • · ·

Sherman, F., Fink, G.R. and Hicks, J.B. (1981) Methods in Yeast Genetics. Cold * 1 1 1 :1:125 Spring Harbor Laboratory, New York.

* ··· Simonson, R. (1971) The hemicellulose in the sulfate pulping process. Svensk • · · · :T: Papperstidning 74, 691-700.

**··· * · ...30 Sjöström, E. (1977) The behavior of wood polysaccharides during alkaline pulping .1. processes. Tappi 60, 151-154.

• · 1 • · · ...

· · • · • · • · · 27 1 1 8264

Timell, T.E. (1967) Recent progress in the chemistry of wood hemicelluloses. Wood Science and Technology 1, 45-70.

Vanhanen, S., Penttilä, M., Lehtovaara, P. & Knowles, J. (1989) Isolation and 5 characterization of the 3-phosphoglycerate kinase gene (pgk) from the filamentous fungus Trichoderma reesei. Curr. Genet. 15: 181-186.

Viikari, L., Ranua, M., Kantelinen, A., Linko, M. and Sundquist, J. (1986) Bleaching with enzymes. Biotechnology in the Pulp and Paper Industry, Proc. 3rd Int. Conf., 10 Stockholm, pp. 67-69.

Viikari, L., Ranua, M., Kantelinen, A., Linko, M. and Sundquist, J. (1987) Application of enzymes in bleaching. Proc. 4th Int. Symp. Wood and Pulping Chemistry, Paris, Voi. 1, pp. 151-154.

15

Viikari, L., Kantelinen, A., Poutanen, K. and Ranua, M. (1990) Characterization of pulps treated with hemicellulolytic enzymes prior to bleaching. In: Kirk, K. T. and Chang, H.-M. (eds), Biotechnology in Pulp and Paper Manufacture, Butterworth-

Heinemann, Boston, pp. 145-151.

..*20 • · I « · · . Viikari, L., Kantelinen, A., Rättö, M. and Sundquist, J. (1991a) Enzymes in pulp and it· :\! paper processing. In: Leatham, G.F. and Himmel, M.E. (eds), Enzymes in Biomass « « • :*; Conversion, ACS Symp. Ser. 460, American Chemical Society, Washington, DC, pp.

• § · « ·;· 12-22.

• · · · • · · 1 : :25

Viikari, L., Sundquist, J. and Kettunen, J. (1991b) Xylanase enzymes promote pulp bleaching. Paper and Timber 73, 384-389.

• « · «II • * · ·:*·; Yllner, S. and Enström, B. (1956) Studies of the adsorption of xylan on cellulose fibres ·:·5ίθ during the sulphate cook. Part 1. Svensk Papperstidning 59, 229-232.

• · · • · · • · · * ·· .··*. Yllner, S., Ostberg, K. and Stockman, L. (1957) A study of the removal of the

• II

118264 28 constituents of pine wood in the sulphate process using a continuous liquor flow method. Svensk Papperstidning 60, 795-802.

Zurbriggen, B., Bailey, M., Penttilä, M., Poutanen, K. and Linko, M. (1990). J.

5 Biotechnol. 13: 267-278.

Zurbriggen, B.D., Penttilä, M.E., Viikari, L. & Bailey, M.J. (1991). Pilot scale production of fungal endo-/3-glucanase by brewer’s yeast. J. Biotechnol. 17: 133-146.

* • « · • · · * 9 · · . .

• * * ft ft · 9 9 • · ft ft * 9 9 • * ft ft · • · * • ·· ft *·· ft ...

• ft ft ft *·· ft · .

ftftft * ft ··· ft ft··· ft · ···'' ft * · « * . . .

9 ft · · · · * ft ft ft·*··.''' • · • • ft · » f I ft ft ft • • ft ft • ft • · ··· ' k

SEKVENSSILISTAUS

118264 (1) YLEISET TIEDOT: (i) HAKIJA: (A) NIMI: Valtion teknillinen tutkimuskeskus (B) KATU: Tekniikantie 12 (C) KAUPUNKI: Espoo (E) MAA: Finland (F) POSTINUMERO: 02150 (G) PUHELIN: +358 0 4561 (ii) KEKSINNÖN OTSIKKO: Mannanaasientsyymit, niitä koodaavat geenit, ja menetelmä näiden eristämiseksi sekä menetelmä lignoselluloosapitoisen massan valkaisemiseksi (lii) SEKVENSSIEN LUKUMÄÄRÄ: 7 (iv) ETUOIKEUSTIEDOT: (A) HAKEMUSNUMERO: FI 922373 (B) HAKEMISPÄIVÄ: 22. TOUKOKUUTA 19922 (A) HAKEMUSNUMERO! FI 931193 (B) HAKEMISPÄIVÄ: 17. MAALISKUUTA 1993 (2) SEKVENSSIN ID NO:l TIEDOT: * • · · • · * "I (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: < · j ’·!· (A) PITUUS: 536 emäsparia • t'·· (B) TYYPPI: nukleiinihappo I «*« (C) JUOSTEISUUS: Yksinkertainen juoste ***. (D) TOPOLOGIA: lineaarinen * **··

ij · (ii) MOLEKYYLITYYPPI: cDNA

(vi) ALKUPERÄ: ··· *··· (A) ORGANISMI: Trichoderma reesei (B) KANTA: QM9414 »···· • · ·♦*·· * • * · • * l ···.

* • * · • · * · ·*· 118264 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID N0:1: GAATTCGGCA CGAGAGTCTC TCCTTTTTTT CTCACTATAT CTTTCCTTTG TCCATGTTGC 60 TGTTGTCGTC GTTGTTCTTG AGACTATGCT GGCCTGGTTG GTCCGGATGA ACTGGTGGTT 120 GGGATGGCTG GAGCCTGTGG AAGCGGGCTC GCCGTGGCGT TGGTCAACCG ATTGTATATC 180 AGTCTATGCC TCTGTACACT TCGTCTCTAG CGAAGAGGAG TTGAATACAA ATCTGTAAAA 240 CACTTGACTG TGTCTTCTAG CTATGAGACT CCCTTGCCTA CTGGAGCCTT CAAGATACTT 300 TGGTACTGTA TGAGACCACG CCTACCTCGA CTTCATGTTT GAAACCAGTC AGTAATTCTC 360 TATGAACATG AAACAACACA TTGATCTCTG TAACATCTCA TTGCATAGTA AACCTTCTTA 420 CATTGATTAC TGGCTATGAA CAAAGGTTGT AGGGTAGGTA ACGAAAAAAA AAAAAAAAAA 480 AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA CTCGAG 536 (2) SEKVENSSIN ID NO: 2 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS:: 243 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: yksinkertainen juoste (D) TOPOLOGIA: lineaarinen * « · • · » *« «

, (ii) MOLEKYYLITYYPPI: cDNA

* I ♦ 4 « « » · ’· *i (vi) ALKUPERÄ: ·,· ; (A) ORGANISMI: Trichoderma reesei (B) KANTA: QM9414 f ♦ ♦ * *r* * · * (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO: 2: GAATTCGGCA CGAGCTCTTA ACCAACCACC AAACTACAGC CACCCACCAT GTCCGCCCAA 60 • * · * • f · • · * *·* ' GACTACTACG TCCAGCGCCT CCGGAGGCAG CAGCAACGGT TATCCTCCTC AGCAGTACCA 120 f « r « * · * * * . CCAGCAGCAG CAACAGCCAT ACGGCCAGCA GCAGCCAGGG TATGACCAGC AGTACCCCGG 180 »»*·* • » CGCCGGAGTC GATGGAGGCC CCGACGGAGA GCGCGGCCTC GGCGCGACCC TCGTCGGCGG 240 » » * * 4 » * ’'·* CGG 243 (2) SEKVENSSIN ID NO; 3 TIEDOT: 3i 1 1 8 2 6 4 (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS:: 289 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: yksinkertainen juoste (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: cDNA (vi) ALKUPERÄ: (A) ORGANISMI: Trichoderma reesei (B) KANTA: QM9414 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO: 3: CTGCAGCCGC CGGAGCCATT GGGGCGAATC TCATTGAGAA CGCATACAAG AAGCACAAGG 60 AGGAAAAGAT GTACAATGAT GGCGGACACC ATGGCCATCA CCACCATTCG CATCATCATA 120 AGCACTAGAA TGATTTGATG AAGAATATGA CATTGCATGC CTGCTACATA CGTAGATTAT 180 GATTGGGGGA GGGGCGTTTT TGATGAATAT ATATATATAT CAATAAAAAA AAAAAAAAAA 240 AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAACTCGAG 289 * I · Φ • · ·

««I

, (2) SEKVENSSIN ID NO: 4 TIEDOT: * 1 · > · ' 1i (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: jj : (A) PITUUS:: 865 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo "ΐ (C) JUOSTEISUUS: yksinkertainen juoste t » · : 1 *·1 1 (D) TOPOLOGIA: lineaarinen

(ii) MOLEKYYLITYYPPI: cDNA

9 •f I» • · f «Il v 1 (vi) ALKUPERÄ: ·"»! (A) ORGANISMI: Trichoderma reesei • f . (B) KANTA: QM9414 *4« » · · > · » 9 1 f V · f · 9Ψ 9 ...

32 118264 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO: 4: GAATTCGGCA CGAGTTTTTT TTTTTTTTTT TACAGTATAC GTTAGGTGTA TTCGAACGAA 60 AGCCTGAAAT AGGTACAAAT AGCCACAACA GAAACGATTG TCTGACCTCC ACTGAGAAAA 120 TCCCCCTCGT CCCCCAGACA GGTCTGATCA AACACCAGCT ATCTACCTGC AAATGCCCCA 180 TATGTAGGTC ACACAGTAAG GAGTGGATTC GCTATATACA TCGGGTACGT TCGCATCACC 240 CCATGGCAAG GGAGGTGACT TAAGCAAAAC CGCCACTAAC CACAAAGCTC AACTGCATAG 300 TATCGACTTC AAGGAAAACA CGGACAAATA ATCATCATGG TTGCCTTTTG CAGCCTCATC 360 TGCGCTCTCA CGAGGCATCG CCAGTACTCT GGCGATGCCC ACAGGCTCGA GCCTGAGAGC 420 AGTGTCAACG TCACAGAGCG TGGCATGTAC GACTTTGTTC TTGGAGCTCA CAATGATCAT 480 CGCCGTCGTG CTAGCATCAA CTACGACCAA AACTACCAAA CTGGCGGACA AGTCAGCTAT 540 TCGCCTTCCA ACACTGGCTT CTCAGTGAAC TGGAACACTC AAGATGACTT TGTTGTGGGC 600 GTTGGTTGGA CGACTGGATC TTCTGCTCCC ATCAACTTTG GCGGCTCTTT TAGTGTCAAC 660 AGCGGAACTG GCCTGCTTTC CGTCTATGGC TGGAGCACCA ACCCACTGGT TGAGTACTAC 720 ATCATGGAGG ACAACCACAA CTACCCAGCA CAGGGCACCG TCAAGGGAAC CGTCAACAGC 780 : : ί GACGGGGCAC TTACACCATC TTGGGGGATT ACCGTGTAAC GAGCCTTCCA TCCAGGGTAC 840 * * * * * * · • · AGCGCCTTCA ACCGTACATT TCCGT 865 • · · • · · 4 * • · : (2) SEKVENSSIN ID NO: 5 TIEDOT: ♦ · · ”··· (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: • · ♦ (A) PITUUS:: 319 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo ·♦· (C) JUOSTEISUUS: yksinkertainen juoste (D) TOPOLOGIA: lineaarinen il*.

• ·

·;” (ii) MOLEKYYLITYYPPI: cDNA

(vi) ALKUPERÄ: ·"*· (A) ORGANISMI: Trichoderma reesei 4 * (B) KANTA: QM9414 • · • « • · * (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO: 5: 118264 CAGATGAACT ACCCAGGTTG TCGCTGTCGA AAGGCTGGGG TGGTAGTGGT TCTGCCTCAC 60 AGAGTGTCAG CAACTAGGTT CTGTTGATGT TGACTTGGAG TGGATGAGGG GTTTGAGCTG 120 GTATGTAGTA TTGGGGTGGT TAGTGAGTTA ACTTGACAGA CTGCACTTTG GCAACAGAGC 180 CGACGATTAA GAGATTGCTG TCATGTAACT AAAGTAGCCT GCCTTTGACG CTGTATGCTC 240 ATGATACATG CGTGACATCG AAATATATCA GCCAAAGTAT CCGTCCGGCG AAAAAAAAAA 300 AAAAAAAAAA AAACTCGAG 319 (2) SEKVENSSIN ID NO: 6 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS:: 15 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (C) JUOSTEISUUS: yksinkertainen juoste (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: proteiini (iv) FRAGMENTTITYYPPI: N-terminaalinen (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO: 6:

Xaa Xaa Xaa Phe Vai Thr Ile Ser Xaa Thr Gin Xaa Xaa Ile Asp 1 5 10 15 * · · • * · .·. : (2) SEKVENSSIN ID NO: 7 TIEDOT: ♦ · * * · • · : (i) sekvenssin ominaispiirteet: *;· (A) PITUUS:: 15 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo * · * (c) JUOSTEISUUS: yksinkertainen juoste (D) TOPOLOGIA: lineaarinen « · ·

• ,· I

····'.

(ii) MOLEKYYLITYYPPI: proteiini * * * *. (iv) FRAGMENTTITYYPPI: N-terminaalinen * **#♦· • · (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO: 7: • ·

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Thr Ile Ser Gly Thr Gin Xaa Xaa Ile Asp .···. 1 5 10 15 * · * * *

Claims (12)

1. Entsyymivalmiste, tunnet t u siitä että se sisältää kohotetun määrän yhtä tai useampaa Trichoderma reesei - homeelle endogeenista mannanaasi-entsyymiä, joka on 5 tuotettu yhdellä tai useammalla Trichoderma - sukuun kuuluvalla mikro-organismilla ja joka mannanaasientsyymin määrä on korkeampi kuin mitä villityypin Trichoderma tuottaa i kasvualustaansa.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen entsyymivalmiste, tunnettu siitä, että se sisältää 10 ainakin yhden seuraavista mannanaaseista: mannanaasiaktiivisuuden omaava entsyymi, jonka isoelektrinen piste (pl) on noin 3,8, mannanaasiaktiivisuuden omaava entsyymi, jonka pl on noin 4,1, mannanaasiaktiivisuuden omaava entsyymi, jonka pl on noin 4,5, mannanaasiaktiivisuuden omaava entsyymi, jonka pl on noin 5,4 ja mannanaasiaktiivisuuden omaava entsyymi, jonka pl on noin 6,5, jolloin isoelektriset pisteet on määritetty 15 isoelektrisellä fokusoinnilla.

3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen entsyymivalmiste, tunnettu siitä, että valmiste sisältää kohotetun määrän EM3-ja EM4-mannanaaseja.

4. Menetelmä mannopolymeerien hydrolysoimiseksi, tunnettu siitä,, että . hydrolyysissä käytetään patenttivaatimuksen 1 mukaista entsyymivalmistetta. • * * • t

· * • * * • · · : 5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, t u n n e 11 u siitä, että menetelmällä • · · • · t .·. hydrolysoidaan selluloosamassan glukomannaaneja. ··· · 25

• · * * ; *: ‘ · 6. Patenttivaatimuksen 4 tai 5 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mannanaasia t käytetään yhdessä ainakin yhden ksylanaasin kanssa. ·· • · • »·

7. Menetelmä selluloosamassan valkaisemiseksi, tunnettu siitä, että hydrolyysissä : 30 käytetään patenttivaatimuksen 1 mukaista entsyymivalmistetta. • « ·** • · * · * « ·

8. Patenttivaatimuksen 7 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mannanaasi- t * * * · \ . käsittely suoritetaan ennen valkaisua. • · * * · 35 1 1 8264

9. Patenttivaatimuksen 8 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mannanaasikäsittely suoritetaan ennen kloorikemikaalitonta valkaisua.

10. Patenttivaatimuksen 9 mukainen menetelmä, t u n n e 11 u siitä, että mannanaasi-5 käsittely suoritetaan ennen peroksidivalkaisua.

11. Patenttivaatimuksen 8 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mannanaasikäsittely yhdistetään ksylanaasikäsittelyyn.

12. Jonkin patenttivaatimuksen 7-11 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mannanaasikäsittely suoritetaan sulfiittimassan valkaisun yhteydessä. a * i » • · · * * * a · « • · · • aa * · • · · · · • · * * • · a «aa • * a a a ··· • •aa • * · • aa aa# aa aa a aa • • aa • a • a • a a • • a • aa' • a a aa·. aa· • a • a • a a • • a • a • aa a a a • a a a a a • a 36 1 1 8 2 6 4