FI109557B - Menetelmä hemoglobiiniadditiotuotteiden määrittämiseksi - Google Patents

Description

109557

Menetelmä hemoglobiiniadditiotuotteiden määrittämiseksi Tämä hakemus on osittain jatkoa samanaikaisesti avoinna olevalle, rinnakkaiselle US-hakemusjulkaisulle 5 sarjanumero 08/041 471, joka on jätetty 2. huhtikuuta 1993 .

Tiettyjen verenkierrossa olevien proteiinien, esimerkiksi hemoglobiinin, glykaatiotasoa voidaan käyttää veren keskimääräisen glukoosipitoisuuden seuraamiseen, 10 koska glykaatio on ei-entsymaattinen, hidas ja jatkuva reaktio, joka riippuu pääasiassa ympäristön glukoosipitoi-suudesta, jonka vaikutuksen alaisena hemoglobiini on vii-pymisaikanaan verenkierrossa. Nämä kaksi tekijää, glukoo-sipitoisuus ja viipymisaika, ilmenevät in vivo veren ko-15 honneen glukoosipitoisuuden (hyperglykemian) asteena ja kestona. Niinpä veren glukoosipitoisuuden ollessa koholla, kuten diabeetikoilla, joiden sokeritauti ei ole hyvin hallinnassa, muodostuu suurentuneita määriä glykoitunutta hemoglobiinia. Glykoituneen hemoglobiinin määrä yksilön 20 veressä heijastaa veren keskimääräistä glukoosipitoisuut- ta, jonka vaikutuksen alaisena hemoglobiini on ollut elinaikanaan verenkierrossa. Tämä jakso on noin 100 vuorokautta, joten glykoituneen hemoglobiinin määritys voi antaa kuvan yksilön veren aiemmasta glukoosipitoisuusprofiilis-25 ta.

Kuvattuihin menetelmiin glykoituneen hemoglobiinin mittaamiseksi kuuluvat kromatografia ioninvaihtokolonnilla tai boronaattiaffiniteettikolonneilla, HPLC ja agaroosi-geelielektroforeesi. Kullakin näistä menetelmistä on 30 monimutkaisuuteen, kalliisiin laitteisiin, tarkkuuteen tai vaihtelevuuteen liittyviä haittapuolia.

Saatavana on immuunimenetelmiä, joiden yhteydessä on kehitetty monoklonaalisia vasta-aineita reagoimaan glykoituneen hemoglobiinin, ts. glukoosin ja hemoglobiini-35 proteiinin reaktiivisten amiiniryhmien välisessä ei-entsy- 2 109557 maattisessa reaktiossa muodostuneen hemoglobiinijohdannai-sen, epitooppien kanssa ja helpottamaan glykoituneen hemoglobiinin pitoisuuden määrittämistä tavanomaisin im-muunikemiallisin menetelmin, kuten ELISAlla tai lateksi-5 agglutinaatiomäärityksellä. Mainitunlainen lateksiaggluti-naatiomääritys esitetään US-patenttijulkaisussa 4 970 171, jossa kuvataan immuunimääritystä, joka on tarkoitettu glykoituneen hemoglobiinin, esimerkiksi HBAlcm, β- alayksikön kohdalta glykoituneen hemoglobiinilajikkeen, 10 määrittämiseen verinäytteestä ja sisältää seuraavat vaiheet: a) käsitellään verinäyte tiosyanaattisuolalla, jolla on kyky denaturoida verinäytteen sisältämä hemoglobiini, ja hapettimella, jolla on kyky muuttaa 15 käsitellyssä verinäytteessä oleva hemoglobiini met- hemoglobiinimuotoon; b) määritetään käsitellystä näytteestä met- hemoglobiini, joka edustaa hemoglobiinin kokonaismäärää näytteessä; 20 c) määritetään denaturoidusta, hapetetusta veri- '·.· näytteestä immuunimäärityksellä kulloinkin etsittävän he- .‘.J moglobiinijohdannaisen denaturoituneen muodon määrä; • .·. d) lasketaan etsittävän hemoglobiini johdannaisen <tw| muodossa olevan hemoglobiinin suhteellinen määrä verrattu- . 25 na hemoglobiinin kokonaismäärään tutkittavassa näytteessä.

*)” Tässä glykoituneen proteiinin immuunimäärityksessä • · · *·’ * on havaittu olevan latentti virhe, joka on vaikuttaa määritystarkkuuteen ja perustuu siihen havaintoon, että • · ·.’·! glykoituneen hemoglobiinin jonkin tietyn pitoisuuden 30 aiheuttama reaktio ei riipu pelkästään kyseisen johdannai-: .·, sen pitoisuudesta vaan myös kokonaishemoglobiinipitoisuu- desta. On havaittu, että glykoituneen hemoglobiinin nä- • · ’!* ennäisen pitoisuuden ja kokonaishemoglobiinipitoisuuden välillä vallitsee käänteinen riippuvuus, ts. kun kokonais-•35 hemoglobiinipitoisuus on suuri, glykoituneen hemoglobiinin 3 109557 näennäinen pitoisuus on odotettua pienempi, ja kun kokonaishemoglobiinipitoisuus on pieni, glykoituneen hemoglobiinin näennäinen pitoisuus on odotettua suurempi. Samoja ilmiöitä havaitaan määritettäessä hemoglobiinin 5 muiden additiotuotteiden pitoisuutta analyyttisin tasa- painomenetelmin, joissa hemoglobiinimolekyylin dimeerisen ja tetrameerisen muodon välistä tasapainoa ei häiritä kemiallisesti. Immuuni-, entsymaattisia ja kemiallisia analyysimenetelmiä pidetään tasapainomenetelminä, kun taas 10 kromatografiset ja pepsiinipilkkomismenetelmät eivät ole sellaisia. Tämä keksintö perustuu tämän ilmiön takana olevan syyn keksimiseen ja menetelmän kehittämiseen sen voittamiseksi .

Tämä keksintö on parannettu menetelmä hemoglobii-15 nin additiotuotteiden, esimerkiksi hemoglobiiniasetalde- hydin, hemoglobiiniurean, hemoglobiiniaspiriinin, hemo-globiiniglukoosi-6-fosfaatin, hemoglobiiniglukoosi-1,6-difosfaatin, hemoglobiiniglutationin ja hemoglobiinin gly-kaation lopputuotteiden määrittämiseksi verinäytteestä, 20 joka menetelmä käsittää seuraavat vaiheet: \j a) määritetään verinäytteestä siinä läsnä olevan .·. : hemoglobiinin kokonaismäärä; • b) määritetään verinäytteestä siinä läsnä olevan hemoglobiinin additiotuotteen määrä; , 25 c) normalisoidaan hemoglobiinin additiotuotteen c · · ·"! määritystulos näytteessä läsnä olevan hemoglobiinin koko- *·’ naismäärän suhteen; d) jaetaan hemoglobiinin additiotuotteen normali-soitu pitoisuus kokonaishemoglobiinipitoisuudella, jolloin ’tt>i 30 saadaan hemoglobiinin additiotuotteen korjattu pitoisuus.

; ’·, Kuvio 1 on hemoglobiini Alc:n immuunimäärityksen • · · *!!.* standardikäyrä. Käyrä muodostettiin käyttämällä kuutta • · kalibrointinäytettä, jotka sisältävät erilaisina prosentu-·.,/ aalisina osuuksina HbAlC:tä mutta joissa vallitsi sama I ' : 35 hemoglobiinipitoisuus 14 g/dl.

4 109557

Kuvio 2 valaisee HbAlc:n havaitun prosentuaalisen osuuden riippuvuutta kokonaishemoglobiinipitoisuudesta määritettynä immuunimäärityksellä. Siinä näkyvät myös HbAlc:n havaittua prosentuaalista osuutta koskevia tulok-5 siä vastaavat toisen kertaluvun polynomit erilaisilla HbAlc-pitoisuuksilla.

Kuvio 3 esittää ai-kertoimia erilaisilla HbAlc-pitoisuuksilla. Se valaisee myös ai-kertoimia vastaavaa suoraa. Suoran leikkauspiste on Ιχ-kerroin ja suoran kulma-10 kerroin on Si-kerroin.

Kuvio 4 esittää a2-kertoimia erilaisilla HbAlc-pitoisuuksilla. Siinä näkyy myös a2-kertoimia vastaava suora. Suoran leikkauspiste on I2-kerroin ja suoran kulmakerroin on S2-kerroin.

15 Vaikka normalisointimenettelyä voidaan soveltaa mihin tahansa määritykseen, joka ei, toisin kuin kromato-grafia, hajota kokonaan hemoglobiinimolekyyliä, tämä keksintö on erityisen käyttökelpoinen glykoituneen hemoglo-1 biinin, esimerkiksi HbAlC:n, määrittämiseen immuunimääri- i 20 tysmenetelmillä. Muihin esitasapainomääritysmenetelmiin, ; \j joita voidaan käyttää, kuuluvat entsymaattiset menetelmät, .·. : esimerkiksi menetelmät, joissa käytetään oksidaaseja, re- • .·. duktaaseja tai fosfataaseja, jotka voivat olla vuorovaiku- tuksessa additiotuotteessa olevan glukoosin, glukoosi-6-25 fosfaatin tai glukoosi-1,6-difosfaatin kanssa, ja kemial-liset menetelmät, esimerkiksi menetelmät, joissa käytetään » · · ’·* ' kemiallisia reaktioita, jotka voivat hapettaa, pelkistää tai hydrolysoida additiotuotteen. Tarkemmin määriteltynä ·.*·: hemoglobiinin ja glukoosin additiotuotteen glukoosiosa 3 0 voidaan vapauttaa 5-hydroksimetyylifurfuraalina happokä- ; .·. sittelyllä. 5-hydroksimetyylifurfuraali saatetaan sitten * · · reagoimaan tiobarbituurihapon kanssa, jolloin muodostuu värillinen kompleksi. Kompleksin värin intensiteetti on verrannollinen näytteessä läsnä olevan hemoglobiini-glu-• 3 5 koosiadditiotuotteen pitoisuuteen. Yksi toinen esimerkki 5 109557 kemiallisesta määrityksestä on asetaldehydin ja hemoglobiinin muodostaman additiotuotteen analysointi. Asetaldehydin, etanolin ensimmäisen metaboliatuotteen, on osoitettu muodostavan additiotuotteita hemoglobiinin kanssa, ja 5 hemoglobiiniin liittyneen asetaldehydin mittaamisen on raportoitu erottavan toisistaan alkoholia käyttävät ja käyttämättömät yksilöt. Additiotuotteessa oleva asetalde-hydi voidaan hydrolysoida ja saattaa sitten reagoimaan 1,3-sykloheksaanidionin kanssa, jolloin muodostuu fluoro-10 fori, joka analysoidaan kvantitatiivisesti. Fluoroforipi-toisuus on verrannollinen näytteen hemoglobiini-asetalde-hydiadditiotuotepitoisuuteen. Nämä menetelmät hemoglobiinin additiotuotteen määrittämiseksi eivät tyypillisesti vaadi hemoglobiinin denaturointia.

15 Tämä keksintö perustuu siihen tosiasiaan, että natiivi hemoglobiini esiintyy tetrameeristen a- ja β-ket-jujen (a2 β2) ja dimeerisen muodon (αβ) tasapainoseoksena. Kukin näistä a- ja β-ketjuista on pituudeltaan noin 143 aminohappoa, β-alayksikön päässä on valiiniyksikkö, joka 20 on osa hemoglobiinin Alc-epitooppia ja voi reagoida '·,· glukoosin kanssa. Natiivin hemoglobiinin ja hemoglobiinin : additiotuotteiden seoksessa (kuten veressä) esiintyy, gly- • .·. koituneen hemoglobiinin ollessa kyseessä, glykoitumat- • · · tornien tetrameerien, glykoitumattomien dimeerien, mono- . 25 glykoituneiden tetrameerien ja monoglykoituneiden • · · dimeerien seos. Kaikilla glykoituneilla komponenteilla on • i t '·* * erilainen immuuni-, entsymaattinen tai kemiallinen reak tiivisuus; glykoituneet dimeerit ovat reaktiivisimpia, ·.’·· sillä niiden glykaatiokohdat ovat esillä ja reagoivan ai- 30 neen saavutettavissa vuorovaikutusta varten. Glykoitunei- : ,·. den tetrameerien reaktiivisuus on paljon vähäisempi, koska * * · '···' tetrameerisessa konf iguraatiossa glykoitunut kohta on *!’ steerisesti estetty. Kun kokonaishemoglobiinipitoisuus ·...· näytteessä kasvaa, glykoituneen hemoglobiinin tetrameeri- • ’/· 35 sen muodon ja sen dimeerisen muodon välinen tasapaino 6 109557 siirtyy kohden tetrameerista muotoa, koska pitoisuuksien ollessa suurempia yhteenliittynyt tetrameerinen muoto on termodynaamisesti edullisempi. Tämä tasapainon siirtyminen ja glykoituneen hemoglobiinin tetrameeristen ja dimee-5 risten muotojen väliset reaktiivisuuserot vasta-ainerea-genssin suhteen saavat yhdessä aikaan sen, että verinäytteessä läsnä olevan hemoglobiinin kokonaismäärä vaikuttaa määritykseen. Kliinisissä puitteissa tämä "hemoglobiini -riippuvuusvaikutus", joka on näytteessä läsnä olevan hemo-10 globiinin kokonaismäärään perustuva poikkeama, tulisi ottaa huomioon määritettäessä hemoglobiiniadditiotuotepitoi-suutta.

Sen mukaan, minkä hemoglobiiniadditiotuotteen läsnäoloa tai pitoisuutta etsitään ja mitä menetelmää kul-15 loinkin käytetään sen määrittämiseen, voi olla välttämätöntä paljastaa hemoglobiiniadditiotuotteen reaktiivinen kohta denaturoimalla. Termi denaturointi on tässä käytettynä tarkoitettu merkitsemään mitä tahansa käsittelyä, joka paljastaa reaktiivisen kohdan valitulle analyysirea-20 genssille häiritsemättä dimeeristen ja tetrameeristen he-\· moglobiiniketjujen välistä tasapainoa. Soveltuviin denatu- : rointimenetelmiin kuuluvat näytteen käsittely korkealla • ·« • .·. suolapitoisuudella; alhainen tai korkea pH; kaotrooppinen ♦ · * I reagenssi, kuten tiosyanaatti, guanidiniumyhdiste, urea . 25 tai pinta-aktiivinen aine, kuten ioniton, kationinen tai • · · •;;j anioninen detergentti. Kaikki nämä käsittelyt aiheuttavat '·* ' hemoglobiinimolekyylin vetysidosten jonkinasteista katke amista ja paljastavat siten reaktiivisen kohdan. Nämä kä-V·· sittelyt eivät aiheuta hemoglobiinin täydellistä hajoamis- • · t ’ : 30 ta eivätkä siten muuta edellä mainittua tasapainoa. Pro- ; *.§ teolyyttinen pilkkominen tai kromatografia eivät soveltui- • i · si käytettäviksi tämän menetelmän yhteydessä, sillä ne • · häiritsevät tätä tasapainoa. Glykoituneen hemoglobiinin, esimerkiksi HbAlc:n, määrittämiseen liittyy tyypillisesti »* · | * : 35 hemoglobiinin denaturointi, erityisesti kun on määrä käyt- 7 109557 tää jotakin immuunimääritysmenetelmää.

Tämän keksinnön mukainen menetelmä toteutetaan, valittaessa asian valaisemiseksi immuunimääritys ja gly-koitunut hemoglobiini, seuraavasti: 5 Ensimmäisessä vaiheessa denaturoidaan hemoglo biini, jotta glykoitunut N-terminaalinen peptidiryhmä saadaan käytettäväksi vasta-aineen sitomiseen. US-patentti-julkaisussa 4 658 022 kuvataan lukuisia menetelmiä proteiinin denaturoimiseksi, mukaan luettuna proteiinin 10 käsittely fysikaalisin keinoin, kuten lämmöllä, ultra-äänikäsittelyllä ja korkealla ja alhaisella pH:11a, ja kemiallinen denaturointi, kuten pilkkominen tai vuorovaikutus kaotrooppisen aineen, kuten guanidiinin, urean tai detergentin, kuten natriumdodekyylisulfaatin, kanssa.

15 Yhdessä edullisessa menetelmässä proteiini denaturoidaan peptidiepitoopin paljastamiseksi vasta-aineen sitomista varten käsittelemällä verinäyte tiosyanaattisuolalla ja hapettimella tavalla, joka esitetään US-patentti- julkaisussa 4 970 171, joka mainitaan tässä viitteenä.

20 Kyseisessä patenttijulkaisussa esitetyssä menetelmässä *.J hapetetaan hemoglobiini met-hemoglobiiniksi, joka muute- .·. : taan tiosyaani-met-hemoglobiiniksi, joka on stabiili väri- • ,·] komponentti, ts. sen värin intensiteetti korreloi ! hemoglobiinipitoisuuden kanssa. Näytteen kokonaishemo- , 25 globiinin mittaus perustuu tuloksena olevaan tiosyaani- ••y met-hemoglobiiniin, kun taas kyseisen hemoglobiinijoh- '·' * dannaisen denaturoitunut muoto toimii analysoitavana aineena menetelmän immuunimääritysosassa. Tiosyanaatti- suola valitaan sellaisten suolojen joukosta, jotka ioni-‘ : 30 soituessaan muodostavat tiosyanaattianionin (SCN") , hemo- ; [·' globiinin tekemiseksi detektointiin soveltuvaksi immuuni- määrityksessä. Ammonium-, natrium- ja kaliumionit ovat sopivia vastakationeja. Litiumtiosyanaatti antaa tuloksek-:,it: si nopeamman denaturoi tumisen samoin kuin testattavassa : 1 : 3 5 verinäytteessä olevien punasolujen nopeutetun hajoamisen.

8 109557

Hapetin, joka voi olla käytännöllisesti katsoen mikä tahansa epäorgaaninen hapetin, muuttaa natiivin hemoglobiinin rauta(II)ionin rauta(III)-met-hemoglobiinimuotoon-sa. Soveltuviin hapettimiin kuuluvat rauta(III)syanidi, 5 jodaatti, kloraatti, bromaatti, kromaatti, hypokloriitti, perjodaatti ja peroksidi.

Met-hemoglobiinipitoisuus määritetään kätevästi mittaamalla sille tunnusmerkillinen absorbanssi aallonpituudella 540 nm käyttämällä tavanomaista spektrofotomet-10 riä, kuten HP 8450A -spektrofotometriä tai vastaavaa. Vaihtoehtoisesti voidaan käyttää Drabkinin menettelyä, jota kuvataan standardissa National Commission for Clinical Laboratory Standards of the United States, Proposed Standard PSH-15.

15 Denaturoinnin jälkeen verinäytteestä määritetään kokonais-met-hemoglobiini ja kiinnostuksen kohteena oleva hemoglobiiniadditiotuote. Tämä tehdään kätevimmin immuuni-määrityksellä käyttämällä monoklonaalisia vasta-aineita, jotka on kehitetty sitoutumaan spesifisesti denaturoidussa 20 proteiinissa olevaan hemoglobiiniadditiotuotteelle, esi-‘.j merkiksi hemoglobiini Aleille, karakteristiseen epitoop- : piin. Kulloinkin käytettävä immuunimääritysmenetelmä ja -muoto samoin kuin leimaustapa ja muodostettava detektoin- • * · tisignaali eivät ole ratkaisevia. Voidaan käyttää radio-25 isotooppimenetelmiä tai entsyymileimausmenetelmiä (ELISA).

··*· Immuunimääritys, jossa mitataan hiukkasten agglutinaation tt· V ' inhibitiota ja joka perustuu vasta-ainehiukkasreagenssin ja agglutinoivan reagenssin spesifiseen vuorovaikutukseen, ί/·· on erityisen käyttökelpoinen. Vasta-ainehiukkasreagenssi *'**: 30 käsittää monoklonaalista vasta-ainetta tai sen jotakin • · # .fragmenttia sidottuna veteen suspendoitavissa olevaan » » · hiukkasmateriaaliin, tyypillisesti polystyreeniin tai jo- ”· honkin muuhun lateksiin. Agglutinoiva aine käsittää lukui- • · · :>(i’ siä epitooppisia sitoutumiskohtia vasta-ainereagenssia 35 varten. Analysoitavan aineen poissa ollessa vasta-aine- • · 9 109557 hiukkanen ja agglutinoiva aine sitoutuvat toisiinsa ja muodostavat valoa sirottavan kompleksin, joka voidaan määrittää kvantitatiivisesti turbidometrisella mittauksella. Läsnä olevan analysoitavan aineen määrän kasvaessa liuok-5 sen sameus laskee, koska vasta-ainehiukkaset sitoutuvat analysoitavaan aineeseen eivätkä pääse sitoutumaan agglu-tinoivaan aineeseen, joka on tyypillisesti polymeerirunko, johon on kiinnitetty joukko orgaanisia ryhmittymiä, kuten peptidiryhmiä, joissa on kiinnostuksen kohteena olevalle 10 hemoglobiinijohdannaiselle karakteristinen epitooppi. Kun on määrä määrittää hemoglobiini Ale, epitooppi käsittää muutaman aminohappoyksikön kokoisia glykoituneita peptidiryhmiä, jotka vastaavat hemoglobiini Alc:n glykoituneen N-terminaalisen ryhmän sekvenssiä.

15 Kun kokonaishemoglobiini- ja hemoglobiinijohdan- naispitoisuudet on määritetty, lasketaan hemoglobiiniaddi-tiotuotteen prosentuaalinen osuus kokonaishemoglobiinista. Tämä määritys tehdään tekniikan tason mukaisesti yksinkertaisesti jakamalla hemoglobiinijohdannaispitoisuus koko-20 naishemoglobiinipitoisuudella, jolloin saadaan hemoglobii-j niadditiotuotteen prosenttiosuus. Tämä laskelma ei kuiten- I ,·.; kaan anna täysin tarkkaa kuvaa edellä mainitun hemoglobii- niriippuvuusvaikutuksen vuoksi. Tämän keksinnön tavoittee- • f · ! na on tarjota käyttöön menetelmä hemoglobiiniriippuvuus- • · » « · • · 25 vaikutuksen poistamiseksi hemoglobiinijohdannaismäärityk- • i t "·· sestä ja siten tarkempi menetelmä tarkasteltavan hemoglo- t 4 · '·'’ biinijohdannaisen pitoisuuden määrittämiseksi. Tässä pa rannetussa menetelmässä normalisoidaan analyysissä määri- ‘,*·· tetty hemoglobiini johdannaispitoisuus. Tämä tehdään päät- 30 telemällä todellinen hemoglobiinijohdannaispitoisuus sen » |.f reaktiivisuudesta ja kokonaishemoglobiinipitoisuudesta, » » 4 jotka molemmat arvot määritetään analyysin kuluessa. Nor- * t ”/ malisointimenettely toteutetaan 5 vaiheessa. Nämä vaiheet *44 • · ovat seuraavat: 4 1« 35 > * 109557 10 A. muodostetaan kalibrointikäyrä, joka suhteuttaa (a) hemoglobiiniadditiotuotepitoisuuden, joka on määritetty jollakin referenssimenetelmällä, kuten HPLC:llä, joka ei ole altis hemoglobiinin vaikutukselle, (b) immuunireak- 5 tiovasteeseen käyttämällä kalibrointiverinäytteitä, jotka sisältävät normalisoituna pitoisuutena hemoglobiinia ja erilaisina pitoisuuksina hemoglobiiniadditiotuotetta; B. valmistetaan sarja verinäytteitä, jotka sisältävät erilaisina pitoisuuksina hemoglobiinia, mutta 10 joissa hemoglobiiniadditiotuotteen prosentuaalinen osuus on sama kussakin sarjassa, määritetään kustakin näytteestä immuunireaktiovaste ja otetaan kunkin näytteen havaittu j hemoglobiiniadditiotuotepitoisuus vaiheessa A muodoste tulta kalibrointikäyrältä; 15 C. muodostetaan sarja (n:nnen asteen) polynomisia sovitettuja käyriä, jotka suhteuttavat (a) kunkin sarjan vaiheessa B määritetyn hemoglobiiniadditiotuotepitoisuuden (b) sarjan kunkin näytteen hemoglobiinipitoisuuteen, otetaan kunkin polynomikäyrän sovituskertoimet (an, an-i, i 20 an-2....ao) ja toistetaan menettely koko käyräsarjalle; ·. : D. muodostetaan lineaarinen käyräsovitus, joka I ,·, ; suhteuttaa (a) vaiheessa C muodostetun käyräsarj an poly- .1.1 nomikäyrän sovittamiskertoimen an (b) hemoglobiiniadditio- ! tuotteen prosentuaaliseen osuuteen normalisoidun hemo- 25 globiinipitoisuuden vallitessa, ja otetaan lineaarisen « · · ···· käyräsovituksen kulmakerroin (Sn) ja leikkauspiste (In) ; ’ E. otetaan Sn-i, Sn-2 · · · · Si ja Ιη-ι, Ιη-2·.·.Ιι vastaa vasta polynomikäyrän sovituskertoimesta an-i, an-2 · · · ai :/·· vaiheen D mukaisella menettelyllä; ' : 30 F. lasketaan korjattu hemoglobiiniadditiotuotepi- . toisuus suhteuttamalla (a) havaittu hemoglobiiniadditio- tuotepitoisuus (b) hemoglobiinipitoisuuteen ratkaisemalla ·;· seuraava yhtälö: • · · · 11 109557

Hbad = [Hbad' - (Hbn - 14n).In - (Hb11"1 - 14n_1).In-i - (Hbn’2 - 14n~2).In-2 - ---- (Hb - 14).Il] / [ (Hb11 - 14n) .Sn + (Hb11'1 - 1411"1) -Sn-ι + (Hb11"2 - 14n"2).Sn-2 + ---- (Hb-14) .Si + 1] .

5 jossa

Hbad on pitoisuusmäärityksen kohteena olevan hemo-globiiniadditiotuotteen korjattu pitoisuus;

Hbad- on hemoglobiiniadditiotuotteen immuunimääri-tyksellä saatu pitoisuus; 10 Hb on kokonaishemoglobiinipitoisuus (g/dl);

In....li ja Sn....Si ovat kokeellisesti määritettyjä kertoimia; 14 edustaa normalisoiduksi pitoisuudeksi valittua hemoglobiinipitoisuutta 14 g/dl. Normalisoitu pitoisuus 15 tarkoittaa tässä käytettynä hemoglobiinin vakiopitoisuut-ta. Mikä tahansa pitoisuus voidaan valita normalisoiduksi pitoisuudeksi; 14 g/dl on kuitenkin edullinen käytettäväksi tässä menetelmässä, koska pääosassa kliinisiä verinäytteitä hemoglobiinipitoisuus on tämä. Tästä on etuna, että 20 jos näytteen hemoglobiinipitoisuus on yhtä suuri kuin nor-malisoitu pitoisuus, korjausta ei tarvita, sillä tässä .·. : tapauksessa korjattu pitoisuus on yhtä suuri kuin havaittu • s, pitoisuus .

Menetelmää tämän keksinnön toteuttamiseksi valais-25 taan edelleen seuraavalla esimerkillä, jossa HbAlc on ···· kiinnostuksen kohteena oleva hemoglobiiniadditiotuote.

’·' * Tässä menetelmässä voidaan käyttää lineaarista käyrää tai 2. tai ylemmän asteen polynomikäyräsovitusta. Lineaarinen ·,’·· käyräsovitus ei kuitenkaan korjaa tulosten epälineaari- ' : 30 suutta, ja ylemmän asteen polynomeille käytettävä .algoritmi on monimutkaisempi ja tuo mukanaan enemmän • i · kertoimia, ts. lineaarinen sovitus vaatii kertoimet li ja Si ja toisen asteen polynomi kertoimet li, I2, Si ja S2, kun taas kolmannen asteen polynomi vaatii kertoimet li, • ‘ ' 35 I2, I3/ Si, S2 ja S3.

12 109557

Esimerkki A. Valmistettiin kuusi kalibrointinäytettä, jotka sisälsivät 2,5; 5,9; 7,9; 8,93; 10,97 ja vastaavasti 12,54 % hemoglobiini Alc:tä HPLC:llä määritettynä. Kunkin 5 kalibrointiverinäytteen kokonaishemoglobiinipitoisuus oli 14 g/dl. Kunkin kalibrointinäytteen immuunireaktiovaste mitattiin aiemmin kuvatulla lateksiagglutinaatiomenetel-mällä; tulokset esitetään taulukossa I.

10 Taulukko I

Ale (%) 14 g/dl, Ale (mmol/dm3) mA

0 0 827,0 15 2,5 108,5 670,5 5.93 257,4 440,2 7,97 345,9 321,7 8.93 387,6 271,6 10,97 476,1 212,3 20 12,54 544,2 173,4 .·. : Näitä immuunireaktiovasteita käytettiin kuvion 1 mukaisen kalibraatiokäyrän muodostamiseen, jolloin immuu-i nireaktiovasteita käytettiin y-arvoina ja referenssi-Alc- 25 pitoisuuksia x-arvoina. Tässä esimerkissä immuunireaktio-···* vastetta edustaa arvo mA (540 nm, 168 - 28) , joka on 28 ja

• I I

• · · ' 168 s:n kuluttua reaktion käynnistämisestä aallonpituudel la 540 nm mitattujen milliabsorbanssilukemien ero.

• · B. Seuraava vaihe oli kuuden näyteryhmän valmista- 30 minen, jotka sisälsivät 2,5; 5,93; 7,97; 8,93; 10,97 ja . \t 12,54 % Alc:tä (vastaavat referenssimenetelmällä vaiheessa » > · A havaittuja HbAlc-pitoisuuksia) ja joista ryhmistä kukin sisälsi hemoglobiinia viitenä tai useampana, alueella 9-20 g/dl olevana pitoisuutena. Nämä näytteet valmistet-: * : 35 tiin tiivistetyistä ihmisen punasoluista ja ihmisen plas- 13 109557 masta. Niiden immuunireaktiovasteet mitattiin aiemmin kuvatulla lateksiagglutinaatiomenetelmällä ja immuunireak-tiovasteista laskettiin näiden näytteiden Alc-pitoisuudet käyttämällä vaiheessa A muodostettua kalibraatiokäyrää.

5 Näytteiden pitoisuudet esitetään taulukossa II havaittuina Alc-arvoina. Menetelmää HbAlcm mittaamiseksi kuvataan yksityiskohtaisesti US-patenttijulkaisussa 4 847 209, samoin kuin HbAlc-konsentraation (pmol/dm3) suhdetta prosentuaaliseen HbAlc-pitoisuuteen (%) . Tämä patenttijulkaisu 10 mainitaan tässä viitteenä.

C. Piirrettiin kunkin vaiheessa B käytetyn näyte-ryhmän havaitut Alc-arvot (%) hemoglobiinipitoisuuden funktiona (kuvio 2). Käyttämällä havaittuja Alc-arvoja (%) y-arvoina ja hemoglobiinipitoisuutta x-arvoina (taulukko 15 II) voidaan tulokset sovittaa polynomikäyräsovitukselle käyttämällä kaupallista sovitusohjelmaa, kuten ohjelmaa SlideWritec (Advance Graphic Software Inc.) tai Sigmaplotc (Jandel Scientific). Tulokset voidaan sovittaa minkä ta-; hansa asteen polynomiin.

20 Näyteryhmälle, jossa Alc-pitoisuus oli 2,5 %, saa- i ’·.· tuja prosentuaalisia Alc-arvoja 2,28; 2,43; 2,57; 2,43; : 2,75 ja 2,5 käytettiin y-arvoina ja hemoglobiinipitoisuuk- • .·. siä 21,9; 17,5; 14; 14; 12,1 ja 10,4 x-arvoina. Kun oli • · · tehty näiden tulosten 2. asteen polynomikäyrän sovitus, . 25 saatiin tälle näyteryhmälle yhtälö < I i ·;;; y = -0,0011617.x2 + 0,02542.x + 2,490.

'·’ ' Näyteryhmälle, jossa Alc-pitoisuus oli 5,93 %, ; saatuja prosentuaalisia Alc-arvoja 5,17; 5,58; 5,79; 6,06; * · 6,35 ja 6,45 käytettiin y-arvoina ja hemoglobiinipitoi-30 suuksia 19,9; 16,3; 14; 13,2; 11,7 ja 10,3 x-arvoina. Kun ; ,·, oli tehty näiden tulosten 2. asteen polynomikäyrän sovitus, saatiin tälle näyteryhmälle yhtälö y = 0,004478.x2 - 0,2747.x + 8,859.

14 109557 Näyteryhmälle, jossa Alc-pitoisuus oli 7,97 %, saatuja prosentuaalisia Alc-arvoja 7,05; 7,88; 8,05; 8,26; 8,87 ja 9,08 käytettiin y-arvoina ja hemoglobiinipitoisuuksia 20,4; 16,8; 14; 13,4; 11,6 ja 10,4 x-arvoina. Kun 5 oli tehty näiden tulosten 2. asteen polynomikäyrän sovitus, saatiin tälle näyteryhmälle yhtälö y = 0,006158.x2 - 0,3860.x + 12,419.

Näyteryhmälle, jossa Alc-pitoisuus oli 8,93 %, saatuja prosentuaalisia Alc-arvoja 7,92; 8,60; 9,33; 9,26; 10 9,92 ja 10,58 käytettiin y-arvoina ja hemoglobiinipitoisuuksia 21,9; 17,1; 14,2; 14; 12,3 ja 10,8 x-arvoina. Kun oli tehty näiden tulosten 2. asteen polynomikäyrän sovitus, saatiin tälle näyteryhmälle yhtälö y = 0,017231-x2 - 0,7985.x + 17,158.

15 Näyteryhmälle, jossa Alc-pitoisuus oli 10,97 %, saatuja prosentuaalisia Alc-arvoja 9,72; 10,94; 11,02; 12,14,- 12,96 ja 14,13 käytettiin y-arvoina ja hemoglobiinipitoisuuksia 19,7; 15,2; 14; 12; 10,4 ja 8,7 x-arvoina. Kun oli tehty näiden tulosten 2. asteen polynomikäyrän 20 sovitus, saatiin tälle näyteryhmälle yhtälö ··.: y = 0,01644.x2 - 1,14462-x + 11,064.

.·. : Näyteryhmälle, jossa Alc-pitoisuus oli 12,54 %, • .·. saatuja prosentuaalisia Alc-arvoja 10,13; 11,97; 12,44; ! ” ! 13,08; 14,46 ja 16,01 käytettiin y-arvoina ja hemoglobii- ! . 25 nipitoisuuksia 20,9; 16,2; 14; 12; 11 ja 9,2 x-arvoina.

* * * * * *; Kun oli tehty näiden tulosten 2. asteen polynomikäyrän '·' * sovitus, saatiin tälle näyteryhmälle yhtälö y = 0,02734.x2 - 1,3086.x + 25,608.

Näissä toisen asteen yhtälöissä -0,001617; \['m: 30 0,004478; 0,006158; 0,017231; 0,02644 ja 0,02734 ovat ; a2-kertoimia ja 0,02542; -0,2747; -0,386; -0,7985; -1,1462 ja -1,3086 ovat ai-kertoimia, jotka saatiin käyränsovitus-vaiheista. Vaiheiden D ja E mukaiset menettelyt vaativat näiden ai- ja a2-kertoimien käyttöä jatkolaskelmiin.

:*·/. 35 15 109557 D. Käytettiin ai-arvoja 0,02542; -0,2747; -0,3860; -0,7985; -1,1462 ja -1,3086 y-arvoina ja piirrettiin ne x-arvoina käytettyjen prosentuaalisten Alc-arvojen 2,5; 5,93; 7,97; 8,93; 10,97 ja 12,54 funktiona, jolloin saa- 5 tiin kuvio 3. Näille tuloksille etsittiin niitä vastaava suora käyttämällä SlideWritec käyränsovitusohjelmaa. Tässä sopivan suoran haussa saadaan seuraava tulos: y = -0,141.x + 0,505 jossa -0,141 on Si-kerroin ja 0,505 Ii-kerroin.

10 E. Käytettiin a2-arvoja -0,001617; 0,004478; 0,006158; 0,017231; 0,02644 ja 0,02734 y-arvoina ja piirrettiin ne x-arvoina käytettyjen prosentuaalisten Alc-arvojen 2,5; 5,93; 7,97; 8,93; 10,97 ja 12,54 funktiona, jolloin saatiin kuvio 4. Nämä tulokset sovitettiin 15 lineaariseen käyräsovitukseen, jolloin saatiin seuraava tulos: y = 0,0032-x - 0,0129 20 jossa 0,0032 on S2-kerroin ja 0,0129 I2-kerroin.

F. Korjattu Alc-pitoisuus saatiin ratkaisemalla .·. : seuraava yhtälö: " ! Ale = [Ale1 - (Hb2-142).I2 - (Hb-14)-li] / [ (Hb2-142) .S2 + 25 (Hb-14) .Si + 1] I ·;;; (yhtälö 1) • · · • * · ; jossa ; Ale' on immuunimäärityksessä havaittu HbAlc-pitoi- ‘ 3 0 suus (%) ; : ’·, Hb on kokonaishemoglobiinipitoisuus (g/dl) ; I I t I2, II, S2 ja Si ovat kokeellisesti määritettyjä » · kertoimia; 14 on normalisoiduksi pitoisuudeksi valittu hemo-| 1 : 35 globiinipitoisuus 14 g/dl.

16 109557

Kun hemoglobiinipitoisuus on kauempana normalisoidusta pitoisuudesta, havaitaan HbAlc-arvojen suurempi poikkeaminen referenssiarvosta (esimerkiksi HPLC-arvosta). Siksi on edullista asettaa normalisoiduksi pitoisuudeksi 5 hemoglobiinipitoisuus, joka esiintyy yleisimmin tutkittavassa verinäytteessä, jotta saadaan testi, jossa poikkeama on pienin. Tätä korjausmenetelmää voidaan käyttää erilaisilla normalisoiduilla pitoisuuksilla, esimerkiksi 13 g/dl, 14 g/dl, 15 g/dl jne. Koska pääosassa verinäyt-10 teistä hemoglobiinipitoisuus on 14 g/dl, on kuitenkin edullista valita tämä pitoisuus normalisoiduksi pitoisuudeksi .

Edellä olevassa esimerkissä kuvataan hemoglobiini Ale -epitoopin määrittämistä; tämän keksinnön mukainen 15 menetelmä on kuitenkin yhtä hyvin sovellettavissa muiden hemoglobiinijohdannaisten, kuten muita glykoituneita amiiniepitooppeja a- ja β-alayksiköissä sisältävien johdannaisten määrittämiseen. Tämä menetelmä on samoin sovellettavissa muihin määritysmenetelmiin kuin immuunimääri-20 tykseen, jotka eivät kokonaan hajota hemoglobiinia. Näihin ; menetelmiin kuuluvat kemialliset ja entsymaattiset määri- : tykset.

• Taulukossa I, jossa esitetään tämän kokeen tulok- ” · set, korjaamattomien tulosten poikkeama (havaitun arvon ja . 25 referenssiarvon välinen prosentuaalinen ero) oli alueella • 1 » | 1"j 28,7 - -18,6 %. Algoritmilla (yhtälö 1) ja edellä maini- * tuilla kertoimilla tehdyn korjauksen jälkeen poikkeama j pieneni alueelle 7,0 - -5,6 %.

* · · • · · • · » · · · • » 17 109557

Taulukko II

Lateksiin sidotun vasta-aineen avulla toteutetulla agglutinaatiomenetelmällä määritetyn HbAlc:n 5 hemoglobiinikorjaus

Referenssi- Havaitut Hb- Havaitut Ale- Poikkeama Ale kor- Poikkeama

Ale- pitoisuudet arvot referenssi- 1 suksen referemssi- arvot (S) arvoista jälkeen arvoista kor- 10 (*) (S) jauksen JAi keen (A) 2,5 * 21,9 2.28 -11.3 2.46 -4.4 17.5 2.43 -5.4 2.43 -5.6 15 14 2,57 0.0 2.57 0.0 14 2,43 -5.4 2.43 -5.4 12.1 2.73 6.2 2.75 7.0 10.4 2.5 -2,7 2.60 1,0 20 5,93 * 19,9 5.17 -10.7 5.90 2.0 16.3 5.58 -3,6 5.92 2,2 14 5,79 0.0 5,79 0,0 13.2 6,06 4.7 5,93 2.4 11.7 6.35 9.7 5.95 2.7 25 10.3 6.45 11.4 5,80 0.2 • '· 7,97 * 20,4 7,05 -12.4 8.30 3.1 * « ' ·.: 16.8 7,88 -2.1 8.60 6.8 • · 14 8.05 0.0 8.05 0.0 ·: : 30 13.4 8,26 2.6 8,09 0.5 ""I 11.6 8.87 10,2 8.14 1,1 .I. 10,4 9,08 12.8 7,96 -1.1 « * t · ·_! ί 8,93 * 21.9 7,92 -14.5 9.56 3.3 35 17.1 8.6 -7.1 9.50 2.6 14.2 9,33 0.8 9.40 1,5 ·/·* 14 9.26 0,0 9.26 0,0 12.3 9.92 7,1 9,30 0,5 ‘1’ 10,8 10.58 14.3 9,33 0,8 » » » * * » 18 109557

Taulukko 11 (jatkuu)

Ref eränäsi- Havaitut Hb- Havaitut Ale- Poikkean Ale kor- Poikkean

Ale- pitoisuudet arvot referenssi- jauksen referenssi- 5 arvot [%) arvoista jälkeen arvoista kor- {*) (X) jauksen jäl keen (S) 10 10,97 * 19,7 9,72 -11,8 11,49 4,3 15.2 10,94 -0,7 11,44 3,8 14 11.02 0,0 11,02 0,0 12 12,14 10,2 11,19 1,5 10,4 12.96 17,6 11,12 1,0 15 8,7 14,13 28,2 11.20 1.6 12,54 20.9 10,13 -18,6 12,23 -1,7 16.2 11,97 -3,8 12,98 4,4 14 12,44 0,0 12,44 0,0 ! 20 13 13,08 5,1 12,55 0,9 I 11 14,46 16.2 12.69 2,0 I 9,2 16,01 28.7 12.87 3,5

Poikkeama (%) on laskettu pitoisuudella 14 g/dl saatujen 25 arvojen suhteen.

• · .'·· Tämän keksinnön mukainen vaihe, jossa tehdään nor- malisointi hemoglobiinipitoisuuden suhteen, voidaan to-] teuttaa esiohjelmoidulla tietokoneen muistilla, joka voi 30 olla mikrosirun muodossa. Sisällyttämällä mikrosiru tun-nettuun laitteeseen ennalta valitun hemoglobiiniadditio-tuotteen määrittämiseksi, kuten laitteeseen, jota kuvaavat • · · D. G. Marrero et ai. julkaisussa Diabetes Care 15/8 (1992) 1045 - 1049, saadaan laite, joka käsittää 35 a) välineen hemoglobiinin kokonaismäärän määrittä- miseksi verinäytteestä; • /; b) välineen hemoglobiiniadditiotuotteen määrittämi- seksi; c) välineen hemoglobiiniadditiotuotetta koskevan 40 mittaustuloksen normalisoimiseksi näytteessä olevan hemo-: . ‘ globiinin kokonaismäärän suhteen; 19 109557 d) välineen normalisoidun hemoglobiiniadditiotuote-pitoisuuden jakamiseksi kokonaishemoglobiinipitoisuudella, jolloin saadaan korjattu hemoglobiiniadditiotuotepitoi-suus.

5 Kun kyseinen hemoglobiiniadditiotuote ja/tai määri tysmenetelmä ovat sellaisia, että tarvitaan hemoglobiinin denaturointia, laite sisältää myös välineen hemoglobiinin denaturoimiseksi.

Laite sisältää muistin, joka esiohjelmoidaan teke-10 mään kaikki tarvittavat laskelmat hemoglobiiniadditiotuot-teen mitatun pitoisuuden normalisoimiseksi näytteessä olevan hemoglobiinin kokonaismäärän suhteen.

Matemaattinen yhtälö, esimerkiksi yhtälö I, ja kertoimet I ja S voidaan ohjelmoida ja tallentaa laskenta-15 laitteen, kuten laskimen, tietokoneen tai hemoglobiiniko-konaispitoisuuden ja hemoglobiiniadditiotuotepitoisuuden määrittämiseen pystyvään kliiniseen analysaattoriin kytketyn tietokoneen, muistiin. Kunkin kliinisen näytteen kohdalla määritetään hemoglobiiniadditiotuotteen havaittu 20 pitoisuus ja kokonaishemoglobiinipitoisuus tekemällä mää-. . ritys. Korjattu hemoglobiiniadditiotuotepitoisuus määrite- | ) tään sitten joko manuaalisesti käyttämällä laskinta tai * I 4 '· '· esiohjelmoidun tietokoneen avulla. Vaihtoehtoisesti tulok- j M ! set voidaan saada suoraan tietokoneelta, joka on kytketty ’ ‘ 25 kliiniseen analysaattoriin.

> • I « # I I · I t * ♦ * · tll » t * « « · • » I * I » i i < m t t • · t · t »

Claims (10)

109557

1. Menetelmä jonkin määrätyn hemoglobiiniadditio-5 tuotteen määrittämiseksi verinäytteestä, tunnettu siitä, että menetelmä käsittää seuraavat vaiheet: a) määritetään verinäytteestä siinä läsnä olevan hemoglobiinin kokonaismäärä; b) tutkitaan verinäyte määritysmenetelmällä, joka 10 on altis verinäytteen kokonaishemoglobiinimäärän aiheuttamalle poikkeamalle ja spesifinen sen hemoglobiiniadditio-tuotteen suhteen, jota määritetään; c) normalisoidaan hemoglobiiniadditiotuotteen mää-ritystulos näytteessä läsnä olevan hemoglobiinin kokonais- 15 määrän suhteen; d) jaetaan hemoglobiiniadditiotuotteen normalisoitu pitoisuus kokonaishemoglobiinipitoisuudella, jolloin saadaan hemoglobiiniadditiotuotteen korjattu pitoisuus.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, 20 tunnettu siitä, että normalisointivaihe toteute- . . taan seuraavasti: ; j A. muodostetaan kalibrointikäyrä, joka suhteuttaa '· " (a) hemoglobiiniadditiotuotepitoisuuden, joka on määritet- · : ty jollakin referenssimenetelmällä, joka ei ole altis ve- 25 rinäytteessä olevan kokonaishemoglobiinimäärän aiheutta-malle poikkeamalle, (b) vasteeseen, joka saadaan analysoi-maila hemoglobiiniadditiotuote kalibrointiverinäytteistä käyttämällä menetelmää, joka on altis verinäytteessä ole- .·.: van kokonaishemoglobiinimäärän aiheuttamalle poikkeamalle; • · .···, 30 B. valmistetaan sarja verinäytteitä, jotka sisäl- tävät erilaisia pitoisuuksia hemoglobiinia hemoglobiiniad- • * · : ditiotuotepitoisuuden ollessa sama kussakin näytteessä, ·...· määritetään additiotuotepitoisuus menetelmällä, joka on .··*. altis poikkeamalle, ja otetaan kunkin näytteen havaittu 35 • · 109557 hemoglobiiniadditiotuotepitoisuus vaiheessa A muodostetulta kalibrointikäyrältä; C. muodostetaan sarja (n:nnen asteen) polynomisia sovitettuja käyriä, jotka suhteuttavat (a) kunkin sarjan 5 vaiheessa B havaitun hemoglobiiniadditiotuotepitoisuuden (b) sarjan kunkin näytteen hemoglobiinipitoisuuteen, otetaan kullekin käyrälle polynomikäyrän sovituskertoimet (an, an-i, an-2....a0) ja toistetaan menettely koko käyräsarjalle;

10 D. muodostetaan lineaarinen käyräsovitus, joka suhteuttaa (a) vaiheessa C muodostetun käyräsarjan polynomikäyrän sovituskertoimen an (b) hemoglobiinin prosentuaaliseen osuuteen normalisoidun hemoglobiinipitoisuuden | vallitessa, ja otetaan lineaarisen käyräsovituksen 15 kulmakerroin (Sn) ja leikkauspiste (In) ; E. otetaan arvot Sn-i, Sn-2....Si ja Ιη-ι, Ιη-2··..Ιι vastaavasta polynomikäyrän sovituskertoimesta an-i, an-2.... ai; F. lasketaan korjattu hemoglobiiniadditiotuotepi-20 toisuus suhteuttamalla (a) havaittu hemoglobiiniadditio- j . . tuotepitoisuus (b) havaittuun kokonaishemoglobiinipitoi- j · suuteen ratkaisemalla seuraava yhtälö: i ! β φ » * 22 1 0 9 5 5 7

3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että normalisoitu hemoglobiinipitoisuus on 14.

4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, 5 tunnettu siitä, että hemoglobiiniadditiotuote on glykoitunut hemoglobiini.

5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että glykoitunut hemoglobiini on HbAlc.

6. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että havaittu additiotuotepitoi- suus määritetään immuunimääritys-, kemiallisella tai ent-symaattisella menetelmällä.

7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen menetelmä, 15 tunnettu siitä, että havaittu additiotuotepitoi- suus määritetään lateksiagglutinaatioimmuunimäärityksellä.

8. Minkä tahansa patenttivaatimuksista 1-7 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että hemoglobiini denaturoidaan ennen määritystä.

9. Patenttivaatimuksen 8 mukainen menetelmä, . . tunnettu siitä, että denaturointireagenssi on pin- ; ta-aktiivinen aine.

’· “ 10. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, ·.:: tunnettu siitä, että polynomi käyrät ovat toisen 25 asteen polynomi käyriä. « · · » * 109557