FI103151B - Immunomääritykseen soveltuva laitteisto ja menetelmä sen käyttämiseksi - Google Patents

Description

103151

Immunomääritvkseen soveltuva laitteisto ja menetelmä sen käyttämiseksi T Keksinnön kohde

Keksinnön kohteena on laitteisto, joka soveltuu kantajaan perustuvaan 5 immunomääritykseen sekä menetelmä laitteiston käyttämiseksi.

Tunnettu tekniikka

On lukuisia kiinteään kantajaan perustuvia immunomääritys-menetelmiä, jotka ovat alan ammattimiehelle yleisesti tunnettuja. Immuno-määrityksessä käytettävissä pikatesteissä kantaja on usein testiliuskaan kiin-10 nitetty tasainen pinta. Kiinteään kantajaan sidotaan jokin reaktioaine, kuten antigeeni tai vasta-aine, ja sitten kantajaan sidottu ensimmäinen reaktioaine saatetaan kosketukseen sen kanssa reagoivan toisen reaktioaineen esim. vastaavan vasta-aineen tai antigeenin kanssa, minkä jälkeen toisen reaktioaineen sitoutumista ensimmäisen reaktioaineen kautta kantajaan määritetään 15 joko suoraan tai epäsuorasti.Osoituksessa käytetään usein hyväksi merkkiainet ta, joka on kytketty johonkin reaktioaineeseen esim. vasta-aineeseen. Tämä merkkiaine voi olla esim. fluoresoiva aine, radioaktiivinen aine tai entsyymi, joka sitten voidaan havaita fluoresenssin avulla, mittaamalla radioaktiivisuus tai osoittamalla kyseistä entsymaattista reaktiota.

20 Ongelmana näissä yleisesti tunnetuissa immunomääritysmenetelmissä on usein se, että reaktioon osallistuvien aineiden konsentraatio on niin alhainen, että niiden havaitseminen on vaikeaa, jolloin osoituksessa käytettävän merkkiaineen rikastaminen olisi suotavaa. Muita ongelmia immunomäärityksissä muodostaa myös esim. aggregaattien muodostuminen eli epäspesifinen sitoutu-25 minen. Epäspesifisen sitoutumisen vähentämiseksi ja reagoimattomien aineiden erottamiseksi joudutaan yleensä suorittamaan perusteelliset pesut, jolloin - : kantajan koko pintaa tulisi pystyä käsittelemään samalla tavalla.

Yhteenveto keksinnöstä

Esillä olevan keksinnön tarkoitus on poistaa edellä mainitut ongelmat. 30 Tämän toteuttamiseksi keksintö taijoaa laitteiston, joka käsittää sähköä johtavaa nestettä varten olevaan astiaan sijoitettavat + ja--anturit, jotka kytketään 2 103151 virtalähteeseen, ja niiden väliin sijoitettavan kiinteän kantajan. Laitteisto soveltuu kiinteään kantajaan perustuviin immunomääritysmenetelmiin, joissa osoitusreaktiossa käytetään ionimuotoon saatettavaa merkkiainetta, jota voidaan erottaa nesteestä sähköisesti jomman kumman anturin avulla.

5 Keksinnön mukaiselle laitteistolle on tunnusomaista, että se käsittää astiaan 4 sijoitettavat, virtalähteeseen kytkettävät + ja--anturit 1 ja 2 ja astiaan sijoitettavan kiinteän kantajan 3, jolloin + ja--anturit on sijoitettu siten, että toinen anturi on astiaan sijoitettavan kiinteän kantajan sisällä ja toinen anturi on sen ulkopuolella. Keksinnön suositeltavat suoritusmuodot on 10 esitetty oheistetuissa patenttivaatimuksissa 2 - 10.

Keksinnön mukainen laitteisto soveltuu käytettäväksi immuno-määrityksissä, jotka perustuvat kiinteän kantajan käyttöön ja joissa osoituksessa käytetään merkkiainetta, jota pystytään erottamaan sähköisesti anturin avulla. Keksinnön mukaiselle immunomääritysmenetelmälle on tunnusomaista, että 15 kiinteään kantajaan 3 sidotaan vasta-aine tai antigeeni, joka saatetaan kos ketukseen tutkittavassa näytteessä olevan vastaavan analysoitavan antigeenin tai vasta-aineen kanssa, jonka osoituksessa käytetään merkkiainetta, jota erotetaan sähköisesti anturin 1 tai 2 avulla sähköä johtavasta nesteestä. Menetelmän suositeltavat suoritusmuodot on esitetty oheistetuissa patenttivaatimuksissa 12 -20 18.

:' Keksinnön mukaisesti kanta sijoitetaan + ja —anturin väliin astiassa, jossa on sähköä johtavaa nestettä, jolloin sähköisesti varautunut merkkiaine kulkeutuu vastakkaiselle anturille, kun virta kytketään. Mittaus voidaan suorittaa yksinkertaisesti elektrodilla, sen sijaan, että se tehdään silmukan tai vas-25 taavan immunoliuskan pinnalta. Tällöin merkkiaine rikastuu ja menetelmän tarkkuus paranee. Merkkiaineen rikastusmahdollisuuden lisäksi esillä oleva ' keksintö taijoaa muitakin etuja. Kantajan ollessa edullisesti kupera aggregaat tien muodostuminen todennäköisesti vähenee ja esim. kantajan ollessa silmukan muotoinen pesu voidaan suorittaa tasaisesti koko pinnalla pyörittämällä sil-30 mukkaa pesunesteessä. Pesua voidaan säätää ja yhdenmukaistaa paitsi pesu- ajalla myös silmukan pyörimisnopeudella.

3 103151

Kuvioluettelo

Seuraavassa keksintöä selitetään seikkaperäisemmin yhden edullisen suoritusmuodon avulla viittaamalla oheistettuun piirustukseen, jossa kuvio 1 esittää keksinnön mukaista laitteistoa päältäpäin, 5 kuvio 2 esittää keksinnön mukaista laitteistoa sivultapäin poikkileik- kauskuvana, kuviot 3 a ja b esittävät keksinnön mukaista laitteistoa sovitettuna kuoppalevyyn, sivultapäin poikkileikkauskuvana, kuvio 4 esittää silmukan muotoista kiinteää kantajaa ja 10 kuvio 5 esittää silmukkaan kiinnitettyä vasta-ainetta, sen antigeeniä ja radioaktiivisella metallilla leimatun antigeenin vastaista vasta-ainetta.

Keksinnön yksityiskohtainen kuvaus

Kuvioissa 1 ja 2 on esitetty keksinnön mukainen laitteisto, joka käsittää + -anturin 1 eli anodin ja —anturin 2 eli katodin, joiden väliin on 15 sijoitettu kiinteä kantaja 3 siten, että se ympäröi anturia 2. Antureihin on kytketty virtalähde. Anturit ovat tavanomaisia + ja —elektrodeja.

Edullisesti toinen anturi 2 on sisällytetty kärkeen 14, joka sisältää myös osoitusyksikön 10. Anturi 2 voi edelleen olla sijoitettuna tilaan 12, jota ympäröi puoliläpäisevä kalvo 11. Tilaan 12 voi johtaa kanava 13 osoituksessa 20 käytettäviä reagensseja varten. Käijen päässä voi olla eriste 15.

Kantajaa ympäröivä anturi voi olla esim. rengasmainen kuten kuvios-sa 1 ja 2 tai verkkomainen. Laitteisto on sijoitettu astiaan 4 sähköä johtavaa nestettä varten. Astia voi edullisesti olla esim. Eppendorff-koeputki tai kuviossa 3 esitetyn kuoppalevyn 17 kuoppa 16. Mainitussa kuoppalevyssa toinen 25 elektrodi 1 on kuoppalevyn seinämällä. Kuviossa 3a on esitetty kuoppalevy, jossa asetettaessa toinen elektodi 2 silmukkaan toinen elektrodi 1 kytkeytyy » samalla johtimeen 19. Tämä vaatii erikoisrakenteisen kuoppalevyn, jossa on johtimet sisäänrakennettuina erikseen joka kuoppaan. On myös mahdollista rakentaa molemmat elektrodit 1 ja 2 kuoppalevyn 17 kuoppaan 16 tai muuhun 30 astiaan 4, jossa määritys suoritetaan. Tällöin elektrodi 2 voi sijaita astian pohjasta ylöstyöntyvässä ulokkeessa 18, joka keksinnön mukaisesti sijoitetaan 4 103151 kantajan keskelle, ks. kuvio 3b.

Kiinteä kantaja 3 on sellainen, että toinen anturi voidaan sijoittaa sen sisään ja toinen sen ulkopuolelle. Kantaja voi olla esim. reijitetty pallo, jonka ^ sisään asetetaan toinen anturi, mutta edullisesti se on silmukan muotoinen, 5 kuten kuviossa 4 on esitetty. Edullisesti silmukkaan on vielä kytketty varsi 5, jossa on katkaisukohta 6. Varren 5 katkaisukohdassa 6 on heikennys. Reijitetty pallo voi myös olla toteutettu siten, että samaan kantajaan on rakennettu useita silmukoita avaruudellisesti eri kulmiin pallon akseliin nähden, johon anturi asetetaan. Tällöin näiden yhteenrakennettujen silmukoiden ympyröiden kehät 10 sijaitsevat samalla kuvitteellisella pallopinnalla. Kiinteä kantaja 3 voi olla mitä tahansa materiaalia, johon reaktioainetta esim. proteiinia voidaan sitoa, kuten esim. polyvinyylikloridia tai polystyreeniä.

Keksinnön mukaista laitteistoa voidaan käyttää erityyppisissä im-munomäärityksissä, jotka perustuvat kiinteän kantajan käyttöön. Kysymykseen 15 tulevat sekä suorat että epäsuorat osoitusmenetelmät, jotka voivat olla sekä kilpailevia että ei-kilpailevia menetelmiä. Näitä sinänsä tunnettuja immunologisia menetelmiä on kuvattu laajalti alan kirjallisuudessa, josta tässä mainittakoon esim. C.P. Price & DJ. Newman (Eds.), 1991: Principles and Practice of Immunoassay. Stockton Press, New York, USA. ja E. Harlow & D. Lane 20 1988: Antibodies - a Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory, USA. Alla esitetty menetelmäsovellutus on vain yksi esimerkki, joka valaisee :· keksintöä, mutta alan ammattimiehelle on selvää, että laitteistoa voidaan soveltaa myös muuntyyppisiin immunomääritysmenetelmiin.

Kantajaan 3 sidotaan vasta-aine 7 tiettyä antigeeniä kohtaan (Kuvio 25 5). Kantajaan sidottu vasta-aine saatetaan sitten reagoimaan tutkittavassa nes- tenäytteessä olevan antigeenin 8 kanssa, minkä jälkeen silmukka pestään pyörittämällä sitä pesunesteessä. Tämän jälkeen silmukka, johon on kiinnittynyt vasta-aine ja sen antigeeni, saatetaan reagoimaan antigeenin vastaisen vasta-aineen kanssa 9, johon on kytketty merkkiaine (Me*) esim. radioaktiivinen 30 metalli. Merkkiaineen on oltava sellainen, että se voidaan muuttaa ionimuo- toon, jolloin se voidaan erottaa reaktioliuoksesta sähköisesti. Keksinnön 5 103151 mukaisessa menetelmässä on edullista käyttää merkkiaineen metallia, joka positiivisen varauksensa ansiosta helposti sitoutuu proteiiniin, jonka nettovaraus yleensä on negatiivinen. On lukuisia tunnettuja tapoja kytkeä metalleja proteiineihin.

5 Reagoituaan vasta-aineen 9 kanssa silmukka pestään jälleen sitoutu mattoman leimatun vasta-aineen poistamiseksi. Tämän jälkeen silmukka asetetaan astiaan 4, joka sisältää sähköä johtavaa reaktioliuosta ja silmukkaan kiinnitetty merkkiaineella leimattu vasta-aine 9 saatetaan olosuhteisiin, joissa sen merkkiaine muuttuu ionimuotoon esim. alentamalla pH:ta. Silmukan varsi 10 katkaistaan katkaisukohdasta 6, anturit upotetaan reaktioliuokseen ja virta kytketään päälle, jolloin sähköisesti varautuneessa muodossa oleva merkkiaine kulkeutuu vastakkaista varausta olevalle anturille, tässä tapauksessa--an- * turille. Edullisesti anturi, johon merkkiaine kulkee, sijaitsee silmukan sisällä ja vielä edullisemmin siihen on edelleen kytketty osoitusyksikkö 10, joka pystyy 15 ilmaisemaan merkkiaineen määrää, joka on suhteessa tutkittavassa näytteessä olevaan analyyttiin. Merkkiainetta voidaan mitata joko suoraan esim. radioaktiivisuutensa perusteella tai epäsuorasti. Mittaus voi tapahtua myös hyödyntämällä merkkiaineen aiheuttamia sähköisiä ilmiöitä. Epäsuorassa mittauksessa merkkiaineena voidaan esim. käyttää ainetta, joka ionimuodossa on jonkin 20 entsyymin (esim. värireaktion aiheuttavan entsyymin) aktivaattori tai inhibiittori (esim. ko. värireaktiossa). Esimerkkinä mainittakoon β-galaktosidaasi, joka .. inhiboituu raskasmetalleilla (Johansson, A., 1991. Heterogenous enzyme immunoassay In Price, C.P. and Newman, D.J. (Eds.), Principles and Practice of Immunoassay. Stockton Press, New York, USA.) Samoin on mahdollista 25 käyttää esim. Ca-leimaa, jolloin vasta-ainekompleksin dissosioituessa katodille pyrkivä Ca2+ voi toimia kalsiumilla aktivoituvan fotoproteiinin aktivoijana.

- .·' Aktivoitunut fotoproteiini emittoi valoa, jota voidaan mitata optisesti (Blinks, J.R., 1985. Detection of Ca2+ with Photoproteins In Van Dyke, K. (Ed.), Applications, voi. II. CRC Press Inc. Boca Raton, Florida, USA). Merkkiaineen 30 ollessa esim. lantanidi, katodille kulkeutunut lantanidi-ioni voidaan saattaa reagoimaan tiettyjen kelaatinmuodostajien kanssa, jolloin muodostuu erittäin 6 103151 voimakkaasti fluoresoivia kelaatteja (Faix, J.D. (1992). Delfia (Dissosiation-Enhanced Lanthanide Fluoroimmunoassay) Analyzer In (D.W. Chan, Ed.) Immunoassay Automation: A Practical Guide. Academic Press, San Diego, USA. s. 151 - 166; Stählberg, T.; Markela, E.; Mikola, H.; Mottram, P. & 5 Hemmilä, I. (1994). Europium and samarium in time-resolved

Fluoroimmunoassays. International Laboratory Jan/Feb 1994; ja Ellis, G. (1992). CyberFluor Immunoassay System In (D.W. Chan, Ed.) Immunoassay Automation: A Practical Guide. Academic Press, San Diego, USA. s. 137 -150).

10 Osoitusyksikkönä 10 voidaan käyttää optista kuitua tai muuta sensoria tai detektoinnin apuvälinettä, joka mittaa esim. radioaktiivisuutta, fluoresenssia, väriä, entsymaattisessa reaktiossa tapahtuvaa värin muutosta jne.

Kanavan 13 kautta voidaan lisätä merkkiaineen osoittamiseen tarvittavia reagensseja, kuten esim. entsyymit, Caz+ - aktivoituvat fotoproteiinit jne.

15 Tällöin on myös edullista, että merkkiainetta puoleensa vetävä anturi sisällyte tään tilaan 12, jota rajoittaa puoliläpäisevä kalvo 11. Mainittu kalvo estää reagenssien diffundoitumisen pois anturiin kulkeutuneen osoitettavan merkkiaineen luota.

On myös mahdollista kytkeä anturit toisin siten, että —anturi on 20 silmukan ulkopuolella ja + -anturi on silmukan sisäpuolella. Merkkiaine voi myös vaihtoehtoisesti olla negatiivisesti varautunut, jolloin se kulkeutuu + -.. anturille. Edelleen on mahdollista käyttää useampia kuin yhtä merkkiainetta, joista osa voi kulkeutua + -anturille ja osa —anturille.

t

Claims (18)

103151

1. Laitteisto, joka soveltuu immunomääritykseen, jossa vasta-aine tai antigeeni on sidottu kiinteään kantajaan, tunnettu siitä, että se käsittää 5 astiaan (4) sijoitettavat, virtalähteeseen kytkettävät + ja —anturit (1 ja 2) ja antureiden väliin astiaan sijoitettavan kiinteän kantajan (3), jolloin + ja-- anturit on sijoitettu siten, että toinen anturi on astiaan sijoitettavan kiinteän kantajan sisällä ja toinen anturi on sen ulkopuolella.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen laitteisto, tunnettu siitä, 10 että astiaan sijoitettava kantaja (3) on silmukan muotoinen ja siihen on liitetty katkaistava varsi (5).

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen laitteisto, tunnettu siitä, että astiaan sijoitettava kantaja (3) on reijitetyn pallon muotoinen.

4. Jonkin patenttivaatimuksista 1-3 mukainen laitteisto, 15 tunnettu siitä, että kantaja (3) on polystyreeniä.

5. Jonkin patenttivaatimuksista 1-4 mukainen laitteisto, tunnettu siitä, että toinen anturi on sijoitettu kärkeen (14), joka sisältää edelleen osoitusyksikön (10).

6. Jonkin patenttivaatimuksista 1-5 mukainen laitteisto, 20 tunnettu siitä, että kantajan (3) sisällä oleva anturi (2) on sovitettu merkkiaineen vastaanottamista varten. •:r-

7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen laitteisto, tunnettu siitä, että anturi (2) on sijoitettu tilaan (12), jota erottaa puoliläpäisevä kalvo (11).

8. Patenttivaatimuksen 7 mukainen laitteisto, tunnettu siitä, 25 että tilaan (12) johtaa kanava (13) osoituksessa käytettäviä reagensseja varten.

9. Patenttivaatimuksen 1 mukainen laitteisto, tunnettu siitä, ’ että se edelleen käsittää astian (4), joka on kuoppalevyn (17) kuoppa (16), ·· johon anturi (1) voidaan sovittaa siten, että virtapiiri kytkeytyy samanaikaisesti, kun toinen anturi (2) sijoitetaan kuoppalevyn kuopassa (16) olevan kiinteän 30 kantajan (3) sisälle.

10. Patenttivaatimuksen 1 mukainen laitteisto, tunnettu siitä, 103151 että se edelleen käsittää astian (4), joka on kuoppalevyn (17) kuoppa (16), jossa toinen anturi (1) sijaitsee kuopan (16) seinämällä ja toinen anturi (2) sijaitsee kuopan (16) pohjasta ylöstyöntyvässä ulokkeessa (18).

11. Menetelmä patenttivaatimuksen 1 mukaisen laitteiston käyttämi- 5 seksi, tunnettu siitä, että kiinteään kantajaan (3) sidotaan vasta-aine tai antigeeni, joka saatetaan kosketukseen tutkittavassa näytteessä olevan vastaavan analysoitavan antigeenin tai vasta-aineen kanssa, jonka osoituksessa käytetään ionimuotoon saatettavaa merkkiainetta, jota saatetaan ionimuotoon ja erotetaan sähköisesti anturin (1 tai 2) avulla sähköä johtavasta nesteestä ja määritetään 10 anturiin kulkeutunut ioni analysoitavan vasta-aineen tai antigeenin mittana.

12. Patenttivaatimuksen 11 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että merkkiaineena käytetään proteiiniin sidottua metallia, joka voidaan muuttaa ionimuotoon ja rikastaa —anturille, josta se mitataan.

13. Patenttivaatimuksen 12 mukainen menetelmä, tunnettu 15 siitä, että metalli on radioaktiivinen.

14. Patenttivaatimuksen 12 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että metalli mitataan optisesti sen aiheuttaman fotoproteiinin aktivoitumisen ja näin emittoiman valon avulla.

15. Patenttivaatimuksen 12 mukainen menetelmä, tunnettu 20 siitä, että metalli mitataan sen aiheuttaman entsyymiproteiinin aktivoitumisen tai inhiboitumisen avulla.

" 16. Patenttivaatimuksen 12 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että metalli mitataan sen aiheuttaman fluoresenssi-ilmiön avulla.

17. Patenttivaatimuksen 12 mukainen menetelmä, tunnettu 25 siitä, että käytetään silmukan muotoista kantajaa (3), jonka keskelle on sijoitet tu —anturi (2).

18. Patenttivaatimuksen 11 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että käytetään useampia kuin yhtä merkkiainetta, joista osa voi kulkeutua m + -anturille ja osa —anturille. 30 103151 Patentkraven