FI113297B - Menetelmä ja laitteisto analyyttien kvalitatiiviseksi ja kvantitatiiviseksi osoittamiseksi - Google Patents

Description

113297

MENETELMÄ JA LAITTEISTO ANALYYTTIEN KVALITATIIVISEKSI JA KVANTITATIIVISEKSI OSOITTAMISEKSI

Keksinnön kohteena on menetelmä ja vastaavan menetelmän toteut-5 tava laitteisto analyytin kvalitatiiviseksi ja kvantitatiiviseksi osoittamiseksi, jossa analyytin osoituksessa näytteestä käytetään pitkänomaista migraatioalustaa, jossa on ainakin ensimmäinen alue magneettisesti leimatun analyytin sitomiseksi ja toinen alue näytteen etenemisen kontrolloimiseksi migraatioalus-10 talla, ja jossa vaiheittain - näyte absorboidaan migraatioalustaan lähempänä sanottua ensimmäistä aluetta olevaa päätä, - näyte etenee migraatioalustassa ohittaen sanotun ensim- 15 mäisen alueen, - näyte saavuttaa migraatioalustalla sanotun toisen alueen .

Diagnostiset testit, jotka suoritetaan normaalin 20 laboratorioympäristön ulkopuolella ja usein ilman erityisiä instrumentteja, ovat saaneet viime aikoina suuren merkityksen. Monet näistä testeistä, esimerkkinä koriongonadotropiinin toteaminen virtsasta raskauden osoittamiseksi, ovat luonteeltaan immunologisia pikatestejä. Nopean immunologisen diagnostiikan • · ' 25 välineeksi on viime vuosina noussut erityisesti t • · · » · * · immunckromatografiatesti . Tälle menetelmälle on luonteenomaista • · « huokoisen materiaalin, kuten muovikalvolle kiinnitetyn nitrosel- • · I l | luloosan käyttö väliaineena, johon kiinnitetään imeyttämällä tai *: 1 1: muulla tavoin kapea osoitusvyöhyke biokemiallisesti aktiivista 30 sitojareagenssia, joka testin kuluessa sitoo väliaineessa kapil-

»M

laarivoimien ajamana liikkuvaa analyyttiä.

• · « · · · • · ... Tunnetut immunomääritysmenetelmät voidaan karkeasti jakaa kah- teen päätyyppiin. Ns. sandwich-tyypissä mitattava analyytti 35 kerrostetaan osoitusvyöhykkeeksi kahden spesifisen sitojamole-:...· kyylin väliin, joista toinen on kiinnitetty kiinteään materiaa- liin ja toinen leimattu radioaktiivisella, fluoresoivalla, vä- • · · 2 113297

Tiilisellä tai muulla leimalla. Osoitusvyöhykkeitä voi olla yksi tai useampia. Sitojareagenssit ovat tavallisesti molemmat biokemialliselta luonteeltaan vasta-aineita. Näytteen sisältämä analyytti osoitetaan saattamalla näyte kontaktiin osoitusvyöhyk-5 keen kanssa yhdessä leimatun, niinikään analyyttispesifisen sitojareagenssin kanssa, jolloin analyytti kerrostuu osoitus-vyöhykkeelle osoitusvyöhykkeeseen kiinnitetyn sitojareagenssin ja leimatun sitojareagenssin väliin ("sandwich-periaate"). Leimattu sitojareagenssi voi olla värillinen, mikä saadaan aikaan io leimaamalla sitojareagenssi mikropartikkeleilla tai kolloidisella metalli- tai epämetallisuolalla.

Ns. kompetitiivisessa määritystyypissä leimattu analyytti kilpailee näytteen sisältämän analyytin kanssa sitoutumisesta sito-15 jareagenssiin. Sitojareagenssiin sitoutuneen mitattavan leiman määrä riippuu tässä systeemissä käänteisesti näytteen sisältämän analyytin määrästä. Kolmatta päätyyppiä, ns. homogeenista määritystä, edistää homogeeninen entsyymi-immunoassay, joka on tunnettu patenttijulkaisusta US-3 , 817 , 834 . Toinen eteeristä estettä 20 hyödyntävä tekniikka on Steric Hindranee Enzyme Immunoassay SHEIA. Tässäkin menetelmässä analyytti heikentää mitattavaa signaalia eikä vahvista sitä. Sinänsä huokoisen matriisin käyttö . migraatioalustana ja spesifisen sitovan reagenssin kuten vasta- « · · | aineen kiinnittäminen siihen on ollut tunnettua jo 1980-luvulla.

***** ' ' 25 *·<·1 Tällaisten testien tulosten tulkinta perustuu yleensä migraatio- > i * · · : alustan visualiseen tarkasteluun, kuten esimerkiksi raskaustes- tissä syntyneen viivan havainnointiin migraatioalustasta. Osassa

IM

: J testeistä syntynyt visuaalinen efekti on niin heikko, että sen 30 tarkastelemiseksi on käytettävä fotometrisiä laitteita, joiden mittaustulos on hankalaa muuntaa tulosten j atkoanalysointia .·2. varten elektroniseen muotoon.

» i » « • · • · »

Magneettisilla partikkeleilla leimattuja vasta-aineita on ylei-

• I

35 sesti käytetty immunokromatograf isissä määrityksissä. Tunnettuja */|1; laitteistoja näiden osoittamiseksi ovat siltatyyppiset ratkai- 2 » 113297 3 sut, joissa käytetään kelaa migraatioalustan analyytistä aiheutuneen magneettisuuden tutkimisessa. US-patentissa 6,110,660 on esitetty kyseisen tyyppinen laitteisto, joka kuitenkin on kyt-kennöiltään monimutkainen.

5

Patenttikirjallisuudessa magneettisten partikkelien käyttöä immunomäärityksissä koskevat lisäksi mm. patenttijulkaisut US-4628037, US-5252493, US-5238811, US-5993740, US-6150181 ja EP-3 86690A1.

10

Immunokromatografiatestiä on tähän mennessä sovellettu lähinnä proteiinianalyyttien osoittamiseen. Nämä ovat suhteellisen suuria molekyylejä, joiden osoittamiseen soveltuu edellä kuvatulla sandwich-periaatteella toimiva testi. Monet kiinnostavat analyy-15 tit kuten steroidit, lääkeaineet, pestisidit ym. ovat kuitenkin molekyylikooltaan niin pieniä, että sandwich-periaatetta ei yleensä voida niiden osoittamiseen soveltaa. Tällaisten analyyt-tien määritykseen on sovellettu kompetitiivista periaatetta.

20 Tämän keksinnön tarkoituksena on aikaansaada laitteisto ja menetelmä, jolla voidaan tehdä nopeasti ja tarkasti immunologisia . pikamäärityksiä (immunoassays), joihin perinteisesti luetaan • * * · esimerkiksi radioimmunoassay (RIA) , enzyme-immunoassay (ΕΙΑ) , ja ,···. f luoroimmunoassay. Keksinnön teollinen käyttöala on diagnostic- • 25 kassa, jossa keksinnön mukaista laitteistoa ja laitteistoa hyö- ' dyntäviä reagenssikittejä voidaan valmistaa erityisesti käytet täväksi immunologisissa pikatesteissä, joissa määritys suorite-’···* taan nopeasti.

’·*'·’ 30 Keksinnön mukaisen menetelmän tunnusomaiset piirteet käyvät ilmi patenttivaatimuksesta 1 ja laitteiston tunnusomaiset piirteet . .·, patenttivaatimuksesta 5. Keksinnön mukaisella laitteistolla saavutetaan nopea ja tarkka osoitustulos. Keksinnön mukaisen menetelmän käyttäminen soveltuu erityisen hyvin viime vuosina '.· * 35 tärkeäksi kasvaneeseen ryhmään diagnostisia testejä, jotka suo- '*"· ritetaan laboratorioympäristön ulkopuolella, kuten lääkärien 113297 4 vastaanotoilla. Analyyttejä, joiden määrittämiseen keksinnön mukainen menetelmä soveltuu, ovat mm. proteiinit, nukleiinihapot, peptidit, polysakkaridit, steroidit, lääkeaineet, pes-tisidit, antibiootit, toksiset aineet, virukset, bakteerit, 5 hiivat ja alkueläimet.

Laitteisto on rakenteeltaan yksinkertainen ja mittaustulokset ovat valmiiksi elektronisina signaaleina tulkittavissa ja jatko-käsiteltävissä. Laitteisto on värineutraali, jolloin värilliset io näytteet eivät aiheuta ongelmia tulosten tulkinnassa, kuten tunnetun tekniikan mukaisissa fotometrisissä menetelmissä. Erään edullisen suoritusmuodon mukaan migraatioalustana voidaan laitteistossa käyttää levy- tai putkimaisia kapillaareja, joilla tapahtuva osoitus on nopea. Muut keksinnölle tunnusomaiset piir-15 teet käyvät ilmi oheisista patenttivaatimuksista.

Keksintöä kuvataan seuraavassa yksityiskohtaisesti viittaamalla oheisiin eräitä keksinnön sovellusmuotoja kuvaaviin piirroksiin, joissa 20

Kuva 1 esittää kaaviomaisesti keksinnön mukaisen lait- ·'. teiston perusrakennetta kaaviokuvana,

Kuva 2 esittää kaaviomaisesti keksinnön mukaisen lait- • teiston erästä suoritusmuotoa kaaviokuvana ja . 25 Kuva 3 esittää keksinnön mukaisen laitteiston vastaan- | ottavaa kelaa osoitustilanteessa.

Kuvassa 1 on esitetty keksinnön mukaisen laitteiston perusrakenne, jolla voidaan suorittaa immunologisia pikamäärityksiä. Kuva ’·"· 30 selventää laitteiston yleistä toimintaperiaatetta. Laitteisto ' : muodostuu kelajärjestelmästä, joka on jaettu primaaripuoleen (PRI) ja sekundaaripuoleen (SEC). Primaaripuolella on ns. ajokeli! la 11, johon on kytketty vaihtomuotoisen virran (AC) syöttöväli- *1* neet 12. Sekundaaripuolella on sarjaan kytketty kelapari 10, * * * ·.·* : 35 joka muodostuu keloista 10.1 ja 10.2. Kelat 10.1 ja 10.2 on mitoitettu siten, että niiden induktanssit ovat yhtä suuret.

113297 5

Oleellista vastaanottavien kelojen 10.1, 10.2 sijoittelussa on, että ne on kierretty vastakkaissuuntaisesti. Tällaista kelaparia 10 voidaan kutsua myös astaattiseksi pariksi. Kela 10.1 toimii keksinnön mukaisessa laitteistossa ns. migraatioalustan 14 vas-5 taanottavana kelana ja kela 10.2 tämän vastaparina. Kelojen 10.1, 10.2 pituus esimerkin mukaisessa laitteistossa on 1 cm. Ajokelan 11 pituus on esimerkin mukaisessa laitteistossa 5 cm, ja se kattaa pituudeltaan kelaparin 10. Jännitettä vastaanottavassa kelaparissa 10 voidaan kasvattaa valmistamalla siihen 10 enemmän lankakierroksia pituusyksikköä kohden kuin on ajokelassa 11. Kummallakin sekundaaripuolen kelalla 10.1, 10.2 voi myös olla vaihtoehtoisesti omat ajokelat, joiden toimintaparametrit ja sijainnit migraatioalustan 14 vastaanottavaan kelaan 10.1 ja tämän vastapariin 10.2 nähden on oltava identtiset (ei esitet-15 ty) . On huomattava, että kuvan 1 mukainen asetelma on kaaviomai-nen esitys todellisesta laitteistosta. Todellisuudessa primaareja sekundaaripuoli voi olla aseteltu sisäkkäin siten, että sekundaaripuolen kelapari 10 on sijoitettu primaaripuolena toimivan ajokelan 11 sisäpuolelle.

20

Ajokelan 11, joka on esimerkin mukaisessa laitteistossa molem-.·. mille sekundaariparin 10 keloille 10.1, 10.2 yhteinen, käyttö- i * · · ..tt; taajuutena voidaan pitää esimerkiksi 20 kHz. Taajuus riippuu mm.

... ajokelan 11 kierrosmäärästä.

• « 25 ’*·· Sekundaaripuolen kelapari 10 on kytketty herkkään jännitemitta riin 13, jolla ilmaistaan mittaustulos. Jännitemittarin 13 ti-'...· lalla voidaan käyttää myös kehittyneempää datankeruulaitetta, kuten esimerkiksi tietokonetta, jolla mittaustuloksia voidaan 30 helposti tallentaa ja analysoida.

Kuvassa 2 on esitetty erään edullisen sovellusmuodon mukainen laitteisto, joka on perusperiaatteeltaan kuvan 1 mukainen. Tähän *;·* on kuitenkin lisätty edullisesti lukitusvahvistin (lock-in) 15 • » · : 35 sekundaaripuolelta 10 tulevan signaalijohtimen ja jännitemitta- ·;·*: rin 13 väliin. Lukitusvahvistimen 15 referenssisignaali otetaan 113297 6 primaaripuolen ajokelan 11 virransyötöstä 12. Lukitusvahvisti-mella 15 saadaan mittaussignaalin taajuus lukittua primaaripuo-lelle syötetyn virran taajuuteen, jolloin laitteiston käytön yhteydessä syntyviä häiriötaajuuksia saadaan edullisesti suoda-5 tettua pois. Lukitusvahvistin 15 saa mittaussignaalin vahvistimen 16 kautta, jolla signaalia vahvistetaan sen mittauksen mahdollistamiseksi. Laitteistossa voi olla esitetyn sovellusesimerkin lisäksi muutakin mittauksessa yleisesti avustavaa elektroniikkaa, mikä on alan ammattimiehelle tunnettua.

10

Kuvassa 2 esitetyn sovellusesimerkin mukaan ajokela 11, vastaanottavat kelat 10.1, 10.2 ja mahdollisesti myös migraatioalusta 14 voivat olla kytkettyinä kaikki samaan maadoituspotentiaaliin 17. Kyseisellä järjestelyllä pyritään eliminoimaan muuttuvia, 15 häiriöitä aiheuttavia hajakapasitansseja ja induktiivista kytkeytymistä, joita kelasysteemin sisällä syntyy.

Erään toisen edullisen suoritusmuodon mukaan ajavan 11 ja vastaanottavien kelojen 10.1, 10.2 väliin voidaan asettaa maadoi-20 tettu johtava alue (ei esitetty). Tällä on tunnetun muuntajatek-niikan mukaisesti hajakapasitansseja pienentävä ja resonanssi-taajuutta kasvattava vaikutus, joka antaa voimakkaammat signaa-lit. Myös muut muuntajien perusrakenteisiin liittyvät ratkaisut ... ovat alan ammattimiehelle ilmeisiä.

."I 25 ··· ’ Kuvassa 3 on esitetty erästä edullista migraatioalustan 14 vas taanottavan kelan 10.1 toteutusmuotoa. Kela 10.1 on sisätilal-·...* taan muotoiltu migraatioalustan 14 muotoiseksi, jolloin tämä saadaan sovitettua tiiviisti kelan 10.1 sisään. Tällä paranne-’ ϊ * *: 30 taan mittaustuloksen tarkkuutta, koska migraatioalustalla 14 tapahtuneiden biokemiallisten reaktioiden seurauksena syntynyt magneettisuus on hyvin heikkoa.

*;· Seuraavaksi selostetaan kuvan 2 avulla keksinnön mukaisen lait- * · » : 35 teiston toimintaa. Laitteiston toiminta perustuu keskinäisinduk- ··.··: tanssi ilmiöön, jossa primaaripuolella olevalla ajokelalla 11 113297 7 indusoidaan sekundaaripuolen muodostavassa kelaparissa 10 oleviin keloihin 10.1, 10.2 jännite, joka riippuu ajokelan 11 parametreistä ja siihen syötetystä virrasta ja toisaalta myös sekundaaripuolen kelojen 10.1, 10.2 parametreistä, kuten esimerkiksi 5 dimensioista ja keloihin kierrettyjen lankakierrosten lukumäärästä. Koska kelat 10.1, 10.2 on asetettu toisiinsa nähden as-taattisesti, eli ne on kierretty vastakkain, niihin indusoituneet jännitteet ovat kelojen identtisyydestä johtuen yhtä suuret, mutta vastakkaismerkkiset. Tällöin kelapariin 10 indusoitu-10 nut kokonaisjännite on hyvin pieni, ideaalitapauksessa nolla. Tällä automaattisella nollaindikaattoriominaisuudella saavutetaan huomattava parannus ulkoisten häiriöiden eliminoinnissa.

Laitteiston toimintakunnon tarkistaminen ja kalibrointi voidaan 15 suorittaa asettamalla vuoronperään vastaanottavan kelan 10.1 sisään pitkänomaiselle migraatioalustalle 14 näytteet, joista ensimmäinen tiedetään varmuudella puhtaaksi tutkittavasta ana- lyytistä, ja toisessa tiedetään olevan tutkittavaa analyyttiä.

Tällaisella mittausjärjestelyllä saadaan kuva kyseisen analyytin 20 lineaarisesta käyttäytymisestä, jonka perusteella laitteisto voidaan kalibroida ja mittaustulokseen saadaan varmuutta. Erään .·, edullisen sovellusmuodon mukaan keksinnön mukaisessa laitteis- * · · tossa voidaan hyödyntää myös taustan kompensointiperiaatetta, t · ... johon astaattisen kelaparin 10 käyttö antaa mahdollisuuden.

25 Tällöin koko migraatioalusta 14 työnnetään vastaanottavaan kela- ··*’ · parin 10 sisään siten, että alusta 14 työntyy kelasta 10.1 kelan ‘ ' 10.2 sisään siltä pituudelta, jolla alustassa 14 olevien partik- • · # kelien konsentraatio vastaa taustaa (ei esitetty) .

*;··: 30 Tutkittava näyte voidaan keksinnön mukaista laitteistoa käytet- ·“*: täessä absorboida esimerkiksi nitroselluloosapäällysteiselle muoviliuskalle. Erään toisen edullisen sovellusmuodon mukaan a · « näytteen migraatioalustana 14 voidaan käyttää lasista tai muo-vista kapillaariputkea tai kahta vastakkain asetettua tasopin- • i * : : : 35 taa, joiden välisessä raossa näyte etenee kapillaarivoimien ;··· ajamana. Kapillaariputkea käytettäessä näyte ajautuu nopeammin 113297 8 analysoitavaan tilaan, jolloin mittauksen suoritukseen kuluvaa aikaa saadaan lyhennettyä. Kapillaariputken tai -levyn, jonka halkaisija on esimerkiksi 1 mm ja pituus 1-2 cm, sisäpinnat on käsitelty reagenssiaineilla, jotka määräytyvät etsittävän ana-5 lyytin biokemiallisesta luonteesta.

Kun pitkänomainen migraatioalusta 14, jossa on tutkittavaa näytettä, asetetaan sekundaaripuolen näytteen vastaanottavan kelan 10.1 sisään, näytteessä olevat magneettiset partikkelit, jotka 10 ovat analyytin läsnäollessa tunnetulla biokemiallisella tavalla reagoineet, synnyttävät sekundaaripuolen kelaparin 10 yli jännitteen, joka havaitaan jännitemittarilla 13. Syntyneestä jännitteestä voidaan todeta näytteessä olevan analyytin läsnäolo ja pitoisuus, vertaamalla saatua jännitelukemaa kalibrointikuvaa-15 jaan, joka on muodostettu nolla-pitoisen näytteen ja pitoisuudeltaan tunnetun näytteen avulla. Jännitemittarin 13 tilalla voidaan yhtä lailla käyttää kehittyneempiäkin datankeräyslait-teita, kuten esimerkiksi tietokonetta, jolla mittaustulokset voidaan edullisesti tallentaa mahdollista jatkoanalysointia 20 varten.

,·, Laitteistoa käytettäessä mittaustulos saadaan välittömästi * · · . elektronisessa muodossa, jolloin esimerkiksi näytteen väri * » ... (esimerkiksi veren tapauksessa) ei aiheuta tulkintaongelmia, 25 toisin kuin fotometrisissä määrityksissä saattaa tapahtua.

* · t • · · i » » i imi * * On ymmärrettävä, että edellä oleva selitys ja siihen liittyvät • » * kuvat on tarkoitettu ainoastaan havainnollistamaan esillä olevaa keksintöä. Keksintöä ei siten ole rajattu pelkästään edellä 30 esitettyihin tai patenttivaatimuksissa määriteltyihin *"*; suoritusmuotoihin, vaan alan ammattimiehelle tulevat olemaan • · · *. ilmeisiä monet erilaiset keksinnön variaatiot ja muunnokset, * · · • · » J * · jotka ovat mahdollisia oheisten patenttivaatimusten • * ’y’ määrittelemän keksinnöllisen ajatuksen puitteissa.

i * · * » * f 4 · I f » I » • ·

Claims (10)

1. Menetelmä analyyttien kvalitatiiviseksi ja kvantitatiiviseksi osoittamiseksi, jossa analyytin osoituksessa näytteestä käyte- 5 tään pitkänomaista migraatioalustaa (14), jossa on ainakin ensimmäinen alue magneettisesti leimatun analyytin sitomiseksi ja toinen alue näytteen etenemisen kontrolloimiseksi migraatioalus-talla (14), ja jossa vaiheittain - näyte absorboidaan migraatioalustaan (14) lähempänä salo nottua ensimmäistä aluetta olevaa päätä, - näyte etenee migraatioalustassa (14) ohittaen sanotun ensimmäisen alueen, - näyte saavuttaa migraatioalustalla (14) sanotun toisen alueen, 15 tunnettu siitä, että pitkänomainen migraatioalusta (14) työnnetään kelan (10.1) sisään ja tunnistetaan magneettisesti leimatun analyytin pitoisuutta korreloiva induktanssin muutos.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, 20 että sanottu kela (10.1) on toinen astaattisesti asetetusta : ’ kelaparista (10), jonka yli primaariseen ajokelaan (11) syötetty t ! vaihtovirta indusoi jännitteen näytteessä olevan magneettisesti leimatun analyytin läsnäollessa.

3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnettu .. siitä, että näytteen migraatioalustana (14) käytetään huokoista • * liuskaa.

4. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnettu ’·; 30 siitä, että näytteen migraatioalustana (14) käytetään levy- tai edullisemmin putkimaista kapillaaria. • » • · * * »

5. Laitteisto analyyttien kvalitatiiviseksi ja kvantitatiivisek-si osoittamiseksi, jossa migraatioalustalle (14) absorboitu » · 35 magneettisesti leimattu analyytti on sovitettu osoitettavaksi kelavälinein, jotka käsittävät 10 113297 - primaarikelavälineet (11), - välineet (12) vaihtovirran syöttämiseksi sanottuihin primaarikelavälineisiin (11), - primaarikelavälineiden (11) yhteyteen sovitetut sekun- 5 daarikelavälineet, joihin kuuluu ainakin kahdesta sekun- daarikelasta (10.1, 10.2) muodostettu astaattinen kelapari (10) ja - välineet (13) sanotun kelaparin (10) tasapainotilan tarkkailemiseksi, 10 tunnettu siitä, että ainakin toinen sekundaarikeloista (10.1) on sovitettu muodoltaan vastaanottamaan edullisesti liuskamaisen migraatioalustan (14) tiiviisti sisäänsä.

6. Patenttivaatimuksen 5 mukainen laitteisto, tunnettu siitä, 15 että näytteen migraatioalustana (14) on sovitettu käytettäväksi huokoista liuskaa.

7. Patenttivaatimuksen 5 mukainen laitteisto, tunnettu siitä, että näytteen migraatioalustana (14) on sovitettu käytettäväksi 20 levy- tai edullisemmin putkimaista kapillaaria.

8. Jonkin patenttivaatimuksen 5-7 mukainen laitteisto, tunnet-tu siitä, että laitteistoon on sovitettu lukitusvahvistin (15) t ” » « ; , häiriötaajuuksien eliminoimiseksi ja jossa sanotun lukitusvah- t 1 i ,,, 25 vistimen (15) referenssisignaali on sovitettu otettavaksi pri- ,1· , maarikelavälineiden (11) vaihtovirransyöttövälineiltä (12) . • · V >·'·' 9. Jonkin patenttivaatimuksen 5-8 mukainen laitteisto, tunnet- tu siitä, että primaari- ja sekundaaripuolella (11, 10) olevat t i 30 kelat (11, 10.1, 10.2) on sovitettu maadoitettavaksi samaan > < > t.' potentiaaliin (17). f 1 '

9 113297

10. Jonkin patenttivaatimuksen 5-8 mukainen laitteisto, tun-nettu siitä, että migraatioalusta (14) on sovitettu maadoitetta- > » 35 vaksi samaan potentiaaliin (17) primaari- ja sekundaaripuolella (11, 10) olevien kelojen (11, 10.1, 10.2) kanssa. il 113297