ES3074005T3 - Gene therapy constructs for treating wilson disease - Google Patents

Abstract

Esta solicitud se refiere a vectores virales adenoasociados que codifican una proteína ATP7B truncada pero funcional para su uso en terapia génica para el tratamiento de la enfermedad de Wilson (EW). La proteína ATP7B truncada descrita en este documento presenta varias ventajas sobre la proteína ATP7B de tipo silvestre, como una mayor eficacia y un mejor rendimiento de fabricación. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

[0001] DESCRIPCIÓN

[0002] Constructos de terapia génica para el tratamiento de la enfermedad de Wilson

[0003] Campo técnico de la invención

[0004] Esta solicitud se refiere generalmente a vectores virales adenoasociados y métodos de su uso en terapia génica para el tratamiento de la enfermedad de Wilson (WD). Esta invención se refiere a un constructo de ácido nucleico recombinante tal como se define en las reivindicaciones adjuntas, y a una partícula de rAAV que comprende el constructo de ácido nucleico recombinante, y una célula huésped, composición y método tal como se definen en las reivindicaciones adjuntas.

[0005] Antecedentes de la invención

[0006] La enfermedad de Wilson (WD) es un trastorno genético autosómico recesivo que causa acumulación de cobre principalmente en el hígado y posteriormente en el sistema neurológico y otros tejidos. La WD es un trastorno raro que afecta aproximadamente a 1 de cada 30000 personas, causado por mutaciones en el gen de la ATPasa 2 transportadora de cobre (ATP7B) en el cromosoma 13. Existen más de 600 mutaciones únicas de ATP7B. La ATP7B se expresa principalmente en los hepatocitos y participa en el transporte transmembrana del cobre. La ausencia o la función reducida de ATP7B provoca una disminución de la excreción hepatocelular de cobre en la bilis, lo que causa enfermedad hepática. Con el tiempo, sin el tratamiento adecuado, los altos niveles de cobre pueden causar daños orgánicos potencialmente mortales.

[0007] Los pacientes con WD hepática usualmente se presentan al final de la infancia o en la adolescencia, y muestran características de hepatitis aguda, insuficiencia hepática fulminante o enfermedad hepática crónica progresiva. Las manifestaciones neurológicas de la WD típicamente se presentan más tarde que la enfermedad hepática, con mayor frecuencia en la segunda o tercera década, e incluyen síntomas extrapiramidales, cerebelosos y relacionados con el cerebro.

[0008] El objetivo del tratamiento médico de la WD es eliminar el depósito tóxico de cobre del cuerpo y prevenir su reacumulación. Los tratamientos actuales para la WD consisten en terapia oral diaria con agentes quelantes (D-penicilamina, trientina y sales de zinc). El tratamiento médico es eficaz en la mayoría, pero no en todos los pacientes con WD. El trasplante de hígado es una opción terapéutica en pacientes con WD que presentan insuficiencia hepática fulminante o insuficiencia hepática progresiva. Sin embargo, los receptores de trasplantes deben mantener un régimen constante de inmunosupresión para prevenir el rechazo.

[0009] El documento WO 2016/097219 describe constructos de ácidos nucleicos y vectores de terapia génica que comprenden una variante de ATP7B para su uso en el tratamiento de afecciones asociadas con una deficiencia o disfunción de la ATPasa 2 transportadora de cobre, y en particular de la enfermedad de Wilson. El documento WO 2018/126116 se refiere a composiciones y regímenes útiles para el tratamiento de la enfermedad de Wilson. Las composiciones incluyen un virus adenoasociado recombinante (rAAV) con un potenciador de transtiretina y un promotor que impulsa la expresión de una ATP7B humana.

[0010] Mee Y. Bartee et al, Biochemistry, vol 48, no 24, 23 de junio de 2009, pp5573-5581 XP055676887 describe que el bucle que conecta los dominios de unión a metales 3 y 4 de ATP7B es un objetivo de una fosforilación mediada por quinasa.

[0011] Lelita T. Braiterman et al, Journal of Biological Chemistry, vol. 290, no. 14, 9 de febrero de 2015 pp8803-8819 XP055676961 describe que la comunicación entre los extremos N y C es necesaria para la fosforilación de Ser/Thr estimulada por cobre de la Cu(I)-ATPasa (ATP7B).

[0012] Nesrin M. Hasan et al, Journal of Biological Chemistry, vol.287, no.43, 19 de octubre de 2012, pp36041-36050, XP055677240 describe los eventos moleculares que inician la salida de una ATPasa transportadora de cobre ATP7B de la red trans-golgi.

[0013] La presente invención aborda la necesidad de un tratamiento mejorado y sostenible de la WD al administrar un gen que expresa ATP7B truncada pero funcional a pacientes con un vector viral adenoasociado. La proteína ATP7B truncada de la presente invención presenta una mayor eficacia en el tratamiento de la WD y ofrece una ventaja de una mayor facilidad y eficiencia de fabricación en comparación con la proteína ATP7B de tipo silvestre y otras formas truncadas.

[0014] Compendio de la invención

[0015] La invención se define mediante las reivindicaciones adjuntas. Esta invención proporciona composiciones y métodos para su uso en terapia génica. En este documento se proporcionan vectores de virus adenoasociados (AAV) útiles para el tratamiento de la WD. Esta invención proporciona un constructo de ácido nucleico recombinante que comprende:

[0016] (a) una secuencia de repetición terminal invertida 5' (ITR) del virus adenoasociado (AAV);

[0017] (b) una secuencia promotora;

[0018] (c) una secuencia de ácido nucleico que codifica una ATPasa 2 transportadora de cobre humana truncada (ATP7B) (i) que carece de dominios de unión a metales (MBD) 1-3, y en la cual (ii) están presentes al menos los residuos S340 y S341 del bucle rico en serina entre MBD3 y MBD4, y (iii) están presentes los MBD 4-6; y (d) una secuencia 3'-ITR de AAV.

[0019] En un aspecto, se describe un constructo de ácido nucleico recombinante que comprende: una secuencia de repetición terminal invertida 5' (ITR); una secuencia promotora; una secuencia de ácido nucleico que codifica una ATPasa 2 transportadora de cobre humana truncada (ATP7B) en la cual se han eliminado los dominios de unión a metales (MBD) 1-3, pero está presente el bucle rico en serina que incluye dos residuos de serina (S340 y S341) entre MBD3 y MBD4; y una secuencia 3'-ITR.

[0020] En otro aspecto, se describe un virus adenoasociado recombinante (rAAV) útil para el tratamiento de la enfermedad de Wilson, en el cual el rAAV comprende una cápside de AAV y un genoma vectorial empaquetado en ella, el genoma vectorial comprende una secuencia de repetición terminal invertida 5' (ITR); una secuencia promotora; una secuencia de ácido nucleico que codifica una ATPasa 2 transportadora de cobre humana truncada (ATP7B) en la que se han eliminado los dominios de unión a metales (MBD) 1-3, pero está presente el bucle rico en serina que incluye dos residuos de serina (S340 y S341) entre MBD3 y MBD4; y una secuencia 3'-ITR.

[0021] Estos y otros aspectos y características de la invención se describen en las siguientes secciones de la solicitud. Breve descripción de los dibujos

[0022] La invención se puede comprender más completamente con referencia a los siguientes dibujos.

[0023] La FIG.1 es un diagrama ilustrativo que muestra un constructo de genoma vectorial ejemplar que comprende una secuencia de nucleótidos, que codifica una ATPasa 2 transportadora de cobre humana truncada (ATP7B), en la cual se han eliminado los dominios de unión a metales (MBD) 1-3, pero está presente el bucle rico en serina que incluye dos residuos de serina (S340 y S341) entre MBD3 y MBD4 ("ATP7B Δ1-3-SS" o "ATP7B del1-3 nativo"). A continuación se proporcionan las características del constructo del genoma vectorial ejemplar:

[0024] Inicio (Posición del Extremo (Posición del Descripción

[0025] nucleótido) nucleótido)

[0026] 1 145 Repetición terminal invertida (ITR)

[0027] 146 245 Potenciador

[0028] 246 435 Promotor

[0029] 436 530 Intrón

[0030] 531 536 Secuencia consenso de Kozak

[0031] 540 4142 ADNc (tipo silvestre) de ATP7B del1-3 nativo 4143 4340 Señal poli A

[0032] 4341 4485 Repetición terminal invertida (ITR)

[0033] La FIG. 2 es una representación esquemática de un vector AAV ejemplar (DTC319), con diversos componentes clave mostrados en la misma.

[0034] La FIG. 3 es una representación esquemática de un plásmido ejemplar, el plásmido pAAV2/8.KanR (p2123FH) AAV Rep/Cap, que proporciona la función Rep y Cap en el empaquetamiento de rAAV cuando se co-transfecta con vectores AAV en células huésped.

[0035] La FIG. 4 es una representación esquemática de un plásmido ejemplar, el plásmido auxiliar de adenovirus pAdDeltaF6 (Kan), para la producción de rAAV cuando se co-transfecta con vectores AAV y plásmidos Rep/Cap en células huésped.

[0036] La FIG.5 es un diagrama de dispersión del cobre hepático (µg/g) en ratones hembra C3He-Atp7b<tx-j>(representados por círculos) inyectados con 10<9>, 10<10>o 10<11>copias del genoma (GC)/kg de ATP7BcoFL (ATP7B humano de longitud completa que ha sido optimizado para codones) y ratones macho C3He-Atp7b<tx-j>(representados por cuadrados) inyectados con 10<10>o 10<11>GC/kg del mismo vector. En el diagrama de dispersión también se representan los niveles de cobre de ratones heterocigotos (Het) y C3He-Atp7b<tx-j>machos y hembras no inyectados de la misma edad.

[0037] La FIG. 6 es un gráfico de barras que muestra el rendimiento total de rAAV (títulos en GC) producido a partir de células huésped después de la transfección de vectores AAV que codifican secuencias codificantes completas o parciales de ATP7B humano (vector AAV que contiene la secuencia de nucleótidos para codificar ATP7B humano de longitud completa (FL); vector AAV que contiene la secuencia de nucleótidos para codificar ATP7B humano en donde se han eliminado los MBD 1-3, pero está presente el bucle rico en serina que incluye dos residuos de serina (S340 y S341) entre MBD3 y MBD4 (ATP7B Δ1-3-SS); o vector AAV que contiene la secuencia de nucleótidos para codificar ATP7B humano en donde se han eliminado los MBD 1-4 (ATP7B Δ1-4).

[0038] La FIG. 7 es un diagrama de dispersión de los niveles de cobre en orina e hígado, cuadrados y círculos, respectivamente (µg/g), analizados después de que ratones C3He-Atp7b<tx-j>fueran inyectados con AAV8 que contenía ATP7B humano de longitud completa (ATP7B FL), ATP7B Δ1-3-SS o ATP7B Δ1-4. Los ratones C3He-Atp7b<tx-j>a los que se les administró solución salina tamponada con fosfato (PBS) sirvieron como controles (vehículo).

[0039] La FIG. 8 es un gráfico de barras que muestra el rendimiento total de rAAV (títulos en GC) producido a partir de células huésped después de la transfección del vector AAV (DTC319) que codifica una ATP7B humana truncada, en la cual se han eliminado los dominios de unión a metales (MBD) 1-3, pero está presente el bucle rico en serina que incluye dos residuos de serina (S340 y S341) entre MBD3 y MBD4, que codifica la cápside de AAV8 o AAV9. La FIG. 9 es un gráfico de barras de los niveles de acumulación de cobre en el hígado (µg/g de peso seco) en ratones C3He-Atp7b<tx-j>a los que se les administró una inyección intravenosa de un control de vehículo (tampón de dilución; WD) o una infusión de AAV8 que transportaba ATP7B Δ1-3-SS nativo (DelA). Los niveles de acumulación de cobre en el hígado de ratones de tipo silvestre (WT) no inyectados, representados en el gráfico de barras, sirvieron como control negativo. Los valores se expresan como media ± SEM (error estándar de la media). La FIG.10 es un gráfico de barras de la actividad de la ceruloplasmina en ratones C3He-Atp7b<tx-j>a los que se les administró una inyección intravenosa de un control de vehículo (tampón de dilución; WD) o una infusión de AAV8 que transportaba ATP7B Δ1-3-SS nativo (DelA), medida mediante un ensayo de actividad colorimétrico basado en una reacción enzimática. La actividad de la ceruloplasmina en ratones de tipo silvestre (WT) no inyectados, medida mediante el mismo ensayo colorimétrico de actividad basado en la reacción enzimática, también se representa en el gráfico de barras.

[0040] La FIG.11 es un gráfico de barras de la puntuación media tras la evaluación estándar de las láminas teñidas con hematoxilina y eosina (H&E) para detectar el agrandamiento nuclear y la hipertrofia hepatocelular, la desorganización, el infiltrado inflamatorio y la necrosis hepatocelular.

[0041] La FIG. 12 es un diagrama ilustrativo que muestra un constructo de genoma vectorial DTC327 ejemplar que comprende una cápside AAV9 con PPIA poliA, AAV2 Rep/ITR con promotor p5 completo que comprende 145 pb ITR, y una secuencia de nucleótidos que codifica una ATPasa 2 transportadora de cobre humana truncada (ATP7B), en la cual se han eliminado los dominios de unión a metales (MBD) 1-3, pero está presente el bucle rico en serina que incluye dos residuos de serina (S340 y S341) entre MBD3 y MBD4.

[0042] Descripción detallada de la invención

[0043] Esta invención proporciona agentes y composiciones para su uso en el tratamiento de la enfermedad de Wilson (WD). Las secuencias de ácidos nucleicos, los vectores, los virus recombinantes y las composiciones asociadas de esta invención, tal como se describen en este documento, pueden utilizarse para mejorar, prevenir o tratar la WD.

[0044] La invención se define mediante las reivindicaciones adjuntas. Esta invención proporciona un constructo de ácido nucleico recombinante que comprende:

[0045] (a) una secuencia de repetición terminal invertida 5' (ITR) del virus adenoasociado (AAV);

[0046] (b) una secuencia promotora;

[0047] (c) una secuencia de ácido nucleico que codifica una ATPasa 2 transportadora de cobre humana truncada (ATP7B) (i) que carece de dominios de unión a metales (MBD) 1-3, y en la cual (ii) están presentes al menos los residuos S340 y S341 del bucle rico en serina entre MBD3 y MBD4, y (iii) están presentes los MBD 4-6; y (d) una secuencia 3'-ITR de AAV.

[0048] A menos que se indique lo contrario, los términos técnicos se utilizan según el uso convencional. Las definiciones de términos comunes en biología molecular se pueden encontrar en Benjamin Lewin,Genes V, publicado por Oxford University Press, 1994 (ISBN 0-19-854287-9); Kendrew et al. (eds.),The Encyclopedia of Molecular Biology,publicado por Blackwell Science Ltd., 1994 (ISBN 0-632-02182-9); y Robert A. Meyers (ed.),Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference,publicado por VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8).

[0049] Para facilitar la revisión de las diversas realizaciones de la divulgación, se proporcionan las siguientes explicaciones de términos específicos:

[0050] Virus adenoasociado (AAV): Un virus pequeño, defectuoso en la replicación y sin envoltura que infecta a los humanos y a algunas otras especies de primates. No se sabe que el AAV cause enfermedades y provoca una respuesta inmunitaria muy leve. Los vectores de terapia génica que utilizan AAV pueden infectar tanto células en división como en reposo y pueden persistir en un estado extracromosómico sin integrarse en el genoma de la célula huésped. Estas características hacen del AAV un vector viral atractivo para la terapia génica. Actualmente se reconocen 12 serotipos de AAV (AAV1 - 12).

[0051] Administración/Administrar: Para proporcionar o dar a un sujeto un agente, como un agente terapéutico(por ejemplo,un AAV recombinante), por cualquier vía eficaz. Las vías de administración ejemplares incluyen, pero no se limitan a, inyección tópica (tal como subcutánea, intramuscular, intradérmica, intraperitoneal, intratumoral e intravenosa), vías oral, ocular, sublingual, rectal, transdérmica, intranasal, vaginal y por inhalación.

[0052] ATP7B Δ1-3-SS: Tal como se utiliza en este documento, ATP7B Δ1-3-SS se refiere a una ATPasa 2 transportadora de cobre humana truncada (ATP7B), en la cual se han eliminado los dominios de unión a metales (MBD) 1-3, pero está presente el bucle rico en serina que incluye dos residuos de serina (S340 y S341) entre MBD3 y MBD4. Codones optimizados: Un ácido nucleico "con codones optimizados" se refiere a una secuencia de ácido nucleico que ha sido alterada de tal manera que los codones son óptimos para la expresión en un sistema particular (tal como una especie o grupo de especies en particular). Por ejemplo, una secuencia de ácido nucleico puede optimizarse para su expresión en células de mamíferos o en una especie de mamífero en particular (tal como las células humanas). La optimización de codones no altera las secuencias de aminoácidos de las proteínas codificadas.

[0053] Potenciador: Una secuencia de ácido nucleico que aumenta la tasa de transcripción al aumentar la actividad de un promotor.

[0054] Intrón: Un segmento de ADN dentro de un gen que no contiene información codificante para una proteína. Los intrones se eliminan antes de la traducción del ARN mensajero.

[0055] Repetición terminal invertida (ITR): secuencias de ácidos nucleicos simétricas en el genoma de los virus adenoasociados necesarias para una replicación eficiente. Las secuencias ITR se encuentran en cada extremo del genoma de ADN del AAV. Las ITR sirven como orígenes de replicación para la síntesis del ADN viral y son necesarias para la encapsidación del vector.

[0056] Aislado: Un componente biológico "aislado" (tal como una molécula de ácido nucleico, proteína, virus o célula) ha sido sustancialmente separado o purificado de otros componentes biológicos en la célula o tejido del organismo, o del organismo mismo, en el cual el componente se encuentra naturalmente, tal como otro ADN y ARN cromosómico y extracromosómico, proteínas y células. Las moléculas de ácido nucleico y las proteínas que han sido "aisladas" incluyen aquellas purificadas mediante métodos de purificación estándar. El término también abarca las moléculas de ácido nucleico y las proteínas preparadas mediante expresión recombinante en una célula huésped, así como las moléculas de ácido nucleico y las proteínas sintetizadas químicamente.

[0057] Vinculado operativamente: Una primera secuencia de ácido nucleico está vinculada operativamente con una segunda secuencia de ácido nucleico cuando la primera secuencia de ácido nucleico se coloca en una relación funcional con la segunda secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, un promotor está vinculado operativamente a una secuencia codificante si el promotor afecta la transcripción o la expresión de la secuencia codificante. En general, las secuencias de ADN operativamente vinculadas son contiguas y, cuando es necesario para unir dos regiones codificantes de proteínas, se encuentran en el mismo marco de lectura.

[0058] Transportador farmacéuticamente aceptable: Los transportadores (vehículos) farmacéuticamente aceptables útiles en esta divulgación son convencionales. Remington's Pharmaceutical Sciences, de E. W. Martin, Mack Publishing Co., Easton, Pa., 15.ª edición (1975), describe composiciones y formulaciones adecuadas para la administración farmacéutica de uno o más compuestos, moléculas o agentes terapéuticos.

[0059] En general, la naturaleza del portador dependerá del modo particular de administración que se emplee. Por ejemplo, las formulaciones parenterales usualmente comprenden fluidos inyectables que incluyen fluidos farmacéutica y fisiológicamente aceptables tales como agua, solución salina fisiológica, soluciones salinas equilibradas, dextrosa acuosa, glicerol o similares como un portador. Para composiciones sólidas (por ejemplo, formas de polvo, píldora, comprimido o cápsula), los portadores sólidos no tóxicos convencionales pueden incluir, por ejemplo, calidades farmacéuticas de manitol, lactosa, almidón o estearato de magnesio. Además de los portadores biológicamente neutros, las composiciones farmacéuticas a administrar pueden contener cantidades menores de sustancias auxiliares no tóxicas tales como agentes humectantes o emulsionantes, conservantes y agentes tamponantes del pH y similares, por ejemplo acetato de sodio o monolaurato de sorbitán.

[0060] Prevenir, tratar o mejorar una enfermedad: "Prevenir" una enfermedad (tal como la WD) se refiere a inhibir el desarrollo completo de una enfermedad. El término "tratar" se refiere a una intervención terapéutica que mejora un signo o síntoma de una enfermedad o condición patológica (tal como la WD) después de que haya comenzado a desarrollarse. "Mejorar" se refiere a la reducción en el número o la gravedad de los signos o síntomas de una enfermedad (tal como la WD).

[0061] Promotor: Una región de ADN que dirige/inicia la transcripción de un ácido nucleico(por ejemplo,un gen). Un promotor incluye las secuencias de ácidos nucleicos necesarias cerca del sitio de inicio de la transcripción. Purificado: El término "purificado" no requiere pureza absoluta; más bien, se entiende como un término relativo. Por lo tanto, por ejemplo, un péptido, proteína, virus u otro compuesto activo purificado es aquel que se aísla total o parcialmente de proteínas asociadas de forma natural y otros contaminantes. En ciertas realizaciones, el término "sustancialmente purificado" se refiere a un péptido, proteína, virus u otro compuesto activo que ha sido aislado de una célula, medio de cultivo celular u otra preparación cruda y sometido a fraccionamiento para eliminar diversos componentes de la preparación inicial, tal como proteínas, restos celulares y otros componentes.

[0062] Recombinante: Una molécula de ácido nucleico recombinante es aquella que tiene una secuencia que no se produce de forma natural o tiene una secuencia que se crea mediante una combinación artificial de dos segmentos de secuencia que de otro modo estarían separados. Esta combinación artificial puede lograrse mediante síntesis química o mediante la manipulación artificial de segmentos aislados de moléculas de ácido nucleico, tal como mediante técnicas de ingeniería genética.

[0063] De manera similar, un virus recombinante es un virus que comprende una secuencia (tal como una secuencia genómica) que no se produce de forma natural o que se crea mediante la combinación artificial de al menos dos secuencias de diferente origen. El término "recombinante" también incluye ácidos nucleicos, proteínas y virus que han sido alterados únicamente mediante adición, sustitución o eliminación de una porción de una molécula de ácido nucleico, proteína o virus natural. Tal como se utiliza en este documento, "AAV recombinante" se refiere a una partícula de AAV en la cual se ha empaquetado una molécula de ácido nucleico recombinante, tal como una molécula de ácido nucleico recombinante que codifica una ATP7B humana truncada (por ejemplo,SEQ ID NO:1 o SEQ ID NO: 15).

[0064] Identidad de secuencia: La identidad o similitud entre dos o más secuencias de ácidos nucleicos, o dos o más secuencias de aminoácidos, se expresa en términos de la identidad o similitud entre las secuencias. La identidad de secuencia se puede medir en términos de porcentaje de identidad; cuanto mayor sea el porcentaje, más idénticas serán las secuencias. La similitud de secuencias se puede medir en términos de porcentaje de similitud (que tiene en cuenta las sustituciones conservativas de aminoácidos); cuanto mayor sea el porcentaje, más similares serán las secuencias. Los homólogos u ortólogos de secuencias de ácidos nucleicos o aminoácidos poseen un grado relativamente alto de identidad/similitud de secuencia cuando se alinean utilizando métodos estándar. Esta homología es más significativa cuando las proteínas ortólogas o los ADNc se derivan de especies más estrechamente relacionadas (tal como las secuencias humanas y de ratón), en comparación con especies más distantemente relacionadas (tal como las secuencias humanas y deC. elegans).

[0065] Los métodos de alineación de secuencias para comparación son bien conocidos en la técnica: Various programs and alignment algorithms are described in: Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482, 1981; Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol.48:443, 1970: Pearson & Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444, 1988; Higgins & Sharp, Gene, 73:237-44, 1988; Higgins & Sharp, CABIOS5:151-3, 1989; Corpet et al., Nuc. Acids Res. 16:10881-90, 1988; Huang et al. Computer Appls. in the Biosciences 8, 155-65, 1992: y Pearson et al., Meth. Mol. Rio.24:307-31, 1994. Altschul et al., J. Mol. Biol.215:403-10, 1990, presenta una consideración detallada de los métodos de alineación de secuencias y los cálculos de homología.

[0066] La herramienta de búsqueda de alineación local básica del NCBI (BLAST) (Altschul et al., J. Mol. Biol.215:403-10, 1990) está disponible en diversas fuentes, incluido el Centro Nacional de Información Biológica (NCBI) y en Internet, para su uso en conexión con los programas de análisis de secuencias blastp, blastn, blastx, tblastn y tblastx. Puede encontrar información adicional en el sitio web del NCBI.

[0067] Serotipo: Un grupo de microorganismos estrechamente relacionados (tal como los virus) que se distinguen por un conjunto de características de antígenos.

[0068] Secuencia de relleno: Se refiere a una secuencia de nucleótidos contenida dentro de una molécula de ácido nucleico más grande (tal como un vector) que se utiliza típicamente para crear el espaciado deseado entre dos características de ácido nucleico (tal como entre un promotor y una secuencia codificante), o para extender una molécula de ácido nucleico para que tenga una longitud deseada. Las secuencias de relleno no contienen información codificante de proteínas y pueden ser de origen desconocido/sintético y/o no estar relacionadas con otras secuencias de ácidos nucleicos dentro de una molécula de ácido nucleico más grande.

[0069] Tema: Organismos vertebrados multicelulares vivos, una categoría que incluye mamíferos humanos y no humanos. Sintético: Producido por medios artificiales en un laboratorio, por ejemplo, un ácido nucleico sintético puede sintetizarse químicamente en un laboratorio.

[0070] Cantidad terapéuticamente efectiva: Una cantidad de un agente farmacéutico o terapéutico específico(por ejemplo,un AAV recombinante) suficiente para lograr un efecto deseado en un sujeto, o en una célula que esté siendo tratada con el agente. La cantidad efectiva del agente dependerá de diversos factores incluyendo, pero sin limitarse a, el sujeto o las células que se tratan, y la forma de administración de la composición terapéutica.

[0071] Vector: Un vector es una molécula de ácido nucleico que permite la inserción de ácido nucleico extraño sin alterar la capacidad del vector para replicarse y/o integrarse en una célula huésped. Un vector puede incluir secuencias de ácidos nucleicos que le permiten replicarse en una célula huésped, tal como un origen de replicación. Un vector también puede incluir uno o más genes marcadores seleccionables y otros elementos genéticos. Un vector de expresión es un vector que contiene las secuencias reguladoras necesarias para permitir la transcripción y traducción del gen o genes insertados. En algunas de las realizaciones en este documento, el vector es un vector AAV.

[0072] A menos que se indique lo contrario, todos los términos técnicos y científicos utilizados en este documento tienen el mismo significado que entiende comúnmente un experto en la técnica a la que pertenece esta divulgación. Las formas en singular "un", "una" y "el", "la" incluyen referencias en plural a menos que el contexto indique claramente lo contrario. "Que comprende A o B" significa que incluye A o B, o A y B. Además se entiende que todos los tamaños de base o tamaños de aminoácidos, y todos los valores de peso molecular o masa molecular, dados para los ácidos nucleicos o polipéptidos, son aproximados y se proporcionan para la descripción. Aunque se pueden utilizar métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en este documento en la práctica o ensayo de la presente divulgación, a continuación se describen métodos y materiales adecuados. En caso de conflicto, prevalecerá la presente especificación, incluyendo las explicaciones de los términos. Además, los materiales, métodos y ejemplos son solo ilustrativos y no pretenden ser limitativos.

[0073] Vectores virales:

[0074] En algunos aspectos, la presente divulgación proporciona un vector de virus adenoasociado recombinante (AAV) que contiene un genoma que comprende una secuencia de repetición terminal invertida 5' (ITR) de AAV, una secuencia promotora, una secuencia de ácido nucleico que codifica ATP7B Δ1-3-SS(por ejemplo,SEQ ID NO:1 o SEQ ID NO:15) y una secuencia de repetición terminal invertida 3' (ITR) de AAV.

[0075] En algunas realizaciones, el genoma puede comprender además un potenciador, un intrón, una secuencia consenso de Kozak y/o una señal de poliadenilación como se describe en este documento. En algunas realizaciones, el vector recombinante puede incluir además una o más secuencias de ácidos nucleicos de relleno. En una realización, una secuencia de ácido nucleico de relleno se sitúa entre el intrón y la secuencia codificante parcial o completa de ATP7B.

[0076] En diversas realizaciones descritas en este documento, el vector viral recombinante es un vector de virus adenoasociado (AAV). El vector AAV puede ser un vector AAV de serotipo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 o 12(es decir,AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11 o AAV 12), así como una cualquiera de las más de 100 variantes aisladas de tejidos de primates humanos y no humanos.Ver, por ejemplo,Choi et al., 2005, Curr Gene Ther.5: 299-310, 2005 y Gao et al., 2005, Curr Gene Ther.5: 285-297. En la presente invención se pueden utilizar vectores AAV de cualquier serotipo, y la selección del serotipo de AAV dependerá en parte del(de los) tipo(s) de células a las que se dirige la terapia génica. Para el tratamiento de la WD, el hígado es uno de los órganos objetivos relevantes. En algunas realizaciones, el vector AAV se selecciona entre el serotipo 9 (AAV9), el serotipo 8 (AAV8), el serotipo 5 (AAV5) o alguna variante de los mismos. En una realización ejemplar, el vector AAV es del serotipo 9 (AAV9) o una variante del mismo.

[0077] En algunas realizaciones, el vector AAV recombinante incluye una secuencia ITR de AAV, que funciona como el origen de replicación del ADN del vector y la señal de empaquetamiento del genoma vectorial, cuando se proporcionan funciones auxiliares de AAV y adenovirus entrans.Además, las ITR sirven como el objetivo para el corte endonuclear monocatenario por las grandes proteínas Rep, resolviendo genomas individuales de los intermediarios de replicación.

[0078] En algunas realizaciones, la secuencia 5'-ITR viene de AAV2. En algunas realizaciones, la secuencia 3'-ITR viene de AAV2. En algunas realizaciones, la secuencia 5'-ITR y la secuencia 3'-ITR vienen de AAV2. En algunas realizaciones, la secuencia 5'-ITR y/o la secuencia 3'-ITR vienen de AAV2 y comprenden o consisten en SEQ ID NO:2. En otras realizaciones, la secuencia 5'-ITR y/o la secuencia 3'-ITR vienen de una fuente que no es AAV2.

[0079] En algunas realizaciones ejemplares, el vector AAV es un vector AAV de serotipo 9 (AAV9), y el vector incluye un potenciador, un promotor, un intrón, una secuencia de ácido nucleico que codifica ATP7B Δ1-3-SS (por ejemplo,SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 15) y una señal de poliadenilación descrita en este documento. En algunas realizaciones, el vector AAV9 incluye además dos secuencias de repetición terminal invertida (ITR) de AAV2, AAV8 o AAV9: una 5' del potenciador y otra 3' de la señal de poliadenilación. En una realización ejemplar, el vector AAV9 incluye dos secuencias de repetición terminal invertida (ITR) de AAV2: una 5' del potenciador y otra 3' de la señal de poliadenilación. En algunas realizaciones, las secuencias ITR de AAV2 comprenden o consisten en SEQ ID NO:2. En otra realización ejemplar, el vector AAV9 incluye dos secuencias de repetición terminal invertida (ITR) de AAV9: una 5' del potenciador y otra 3' de la señal de poliadenilación.

[0081] En algunas realizaciones ejemplares, la presente divulgación proporciona un ácido nucleico recombinante que comprende un genoma vectorial que comprende una secuencia de repetición terminal invertida 5' (ITR) de AAV, una secuencia promotora, una secuencia de ácido nucleico representada por SEQ ID NO:1, que codifica ATP7B Δ1-3-SS nativo, y una secuencia de repetición terminal invertida 3' (ITR) de AAV. En algunas realizaciones ejemplares, la presente divulgación proporciona un ácido nucleico recombinante que comprende un genoma vectorial que comprende una secuencia de repetición terminal invertida 5' (ITR) de AAV, una secuencia promotora, una secuencia de ácido nucleico representada por SEQ ID NO:15, que codifica un codón optimizado ATP7B Δ1-3-SS, y una secuencia de repetición terminal invertida 3' (ITR) de AAV. En algunas realizaciones ejemplares, la presente divulgación proporciona un genoma vectorial que comprende SEQ ID NO:14, que comprende una secuencia de repetición terminal invertida 5' (ITR) de AAV, una secuencia promotora, una secuencia de ácido nucleico representada por SEQ ID NO:1, que codifica ATP7B Δ1-3-SS nativo, o un vector de virus adenoasociado (AAV) que comprende lo mismo.

[0083] En aspectos adicionales, la solicitud proporciona secuencias de ácidos nucleicos recombinantes que corresponden a genomas vectoriales útiles en el tratamiento de la WD. En algunas realizaciones, la solicitud proporciona un ácido nucleico recombinante que es 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más idéntico a SEQ ID NO:14. Por lo tanto, la solicitud proporciona ácidos nucleicos recombinantes que son al menos un 80 %(por ejemplo,80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,1 %, 99,2 %, 99,3 %, 99,4 %, 99,5 %, 99,6 %, 99,7 %, 99,8 %, 99,9 % o 100 %) idénticos a SEQ ID NO:14. En una realización ejemplar, la solicitud proporciona una secuencia de ácido nucleico recombinante que corresponde a un genoma vectorial que comprende una secuencia de repetición terminal invertida 5' (ITR) de AAV, una secuencia promotora, una secuencia de ácido nucleico representada por SEQ ID NO:1, que codifica ATP7B Δ1-3-SS nativo, y una secuencia de repetición terminal invertida 3' (ITR) de AAV, en donde el genoma vectorial comprende o consiste en SEQ ID NO:14. En una realización ejemplar, la solicitud proporciona un ácido nucleico recombinante que comprende un genoma vectorial que comprende una secuencia de repetición terminal invertida 5' (ITR) de AAV, una secuencia promotora, una secuencia de ácido nucleico representada por SEQ ID NO:15, que codifica un codón optimizado ATP7B Δ1-3-SS, y una secuencia de repetición terminal invertida 3' (ITR) de AAV.

[0085] Promotor:

[0087] En diversos aspectos descritos en este documento, se proporcionan vectores AAV que comprenden una secuencia promotora que ayuda a impulsar y regular la expresión del transgén,por ejemplo, la expresión de ATP7B Δ1-3-SS (por ejemplo, la secuencia de aminoácidos de ATP7B Δ1-3-SS representada por SEQ ID NO:8). En realizaciones ejemplares, la secuencia promotora se encuentra entre la secuencia 5'-ITR seleccionada y la secuencia codificante para ATP7B Δ1-3-SS (por ejemplo,SEQ ID NO:1 o SEQ ID NO:15). En algunas realizaciones, la secuencia promotora se encuentra aguas abajo de una secuencia potenciadora. En algunas realizaciones, la secuencia promotora se encuentra aguas arriba de una secuencia intrónica. En algunas realizaciones ilustrativas, un vector descrito en este documento utiliza el promotor de la transtiretina (TTR), que opcionalmente puede estar ubicado aguas abajo de un potenciador de la transtiretina (enTTR).

[0089] En algunas realizaciones, el promotor se selecciona de un promotor de transtiretina (TTR), un promotor de β-actina de pollo (CBA), un promotor de gen temprano inmediato del citomegalovirus (CMV), un promotor de globulina de unión a tiroxina (TBG), un promotor de alfa-1 antitripsina (A1AT) y un promotor CAG (construido utilizando el elemento potenciador temprano CMV, el promotor, el primer exón y el primer intrón del gen CBA, y el aceptor de empalme del gen de beta-globina del conejo). En una realización ejemplar, el promotor es el promotor TTR. En una realización, el promotor TTR comprende o consiste en SEQ ID NO:12.

[0091] Además de un promotor, un vector AAV puede contener otras secuencias apropiadas de iniciación, terminación y potenciación de la transcripción, y señales eficientes de procesamiento de ARN. Como se describe con más detalle a continuación, dichas secuencias incluyen señales de empalme y poliadenilación (poli A), elementos reguladores que mejoran la expresión (es decir,WPRE), secuencias que estabilizan el ARNm citoplasmático, secuencias que mejoran la eficiencia de la traducción (es decir,la secuencia consenso de Kozak), y secuencias que mejoran la estabilidad de las proteínas.

[0092] En algunas realizaciones, el vector AAV contiene un genoma vectorial que comprende además una secuencia consenso de Kozak. En algunas realizaciones, la secuencia consenso de Kozak se encuentra aguas abajo de una secuencia intrónica. En una realización, la secuencia consenso de Kozak es GCCGCC (SEQ ID NO:11). Como comprenderán los expertos en la materia, la secuencia consenso de Kozak se ubica típicamente inmediatamente antes de una secuencia codificante; en este caso, inmediatamente antes de una secuencia codificante para ATP7B truncado (ATP7B Δ1-3-SS) (por ejemplo,SEQ ID NO:1 o SEQ ID NO:15). Como apreciará el artesano experto, la secuencia consenso de Kozak puede considerarse que comparte un residuo ATG correspondiente al codón de inicio del polipéptido terapéutico,por ejemplo,ATP7B truncado (ATP7B Δ1-3-SS) (por ejemplo,SEQ ID NO:1 o SEQ ID NO:15). Para simplificar la divulgación, la secuencia consenso de Kozak, tal como se describe aquí, comprende una secuencia de seis nucleótidos que corresponde a la región no compartida con el ácido nucleico que codifica el polipéptido terapéutico,por ejemplo, ATP7B truncado (ATP7B Δ1-3-SS codificado por SEQ ID NO:1 o SEQ ID NO:15).

[0093] Polipéptidos ATP7B:

[0094] Como se describe en este documento, los aspectos de la invención proporcionan vectores recombinantes que incluyen un genoma que comprende una secuencia de repetición terminal invertida 5' de AAV (ITR), una secuencia promotora, una secuencia codificante para ATP7B humano truncado (ATP7B Δ1-3-SS) que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:8 (por ejemplo,SEQ ID NO:1 o SEQ ID NO:15) y una secuencia de repetición terminal invertida 3' de AAV (ITR). ATP7B tiene ocho dominios transmembrana que forman una vía a través de las membranas celulares para la translocación de cobre; y un gran extremo N con seis dominios de unión a metales (MBD), cada uno compuesto por aproximadamente 70 aminoácidos y el motivo de unión a metales altamente conservado GMxCxxC (donde x es cualquier aminoácido). Además de la secuencia canónica (también llamada isoforma a, que es la isoforma más larga; Secuencia de Referencia NCBI: NP_000044.2), se conocen cuatro isoformas adicionales: Secuencias de Referencia NCBI cuatro isoformas adicionales se conocen: Secuencias de Referencia NCBI NP_001005918.1, NP_001230111.1, NP_001317507.1, NP_001317508.1. Las composiciones y los métodos descritos en este documento pueden utilizarse para tratar a sujetos que tienen una proteína variante ATP7B no funcional que causa enfermedad.

[0095] En una realización, una secuencia codificante para ATP7B humano truncado (ATP7B Δ1-3-SS) (por ejemplo,SEQ ID NO:1 o SEQ ID NO:15) codifica para una proteína con aminoácidos como se describe en SEQ ID NO:8. SEQ ID NO:1 proporciona el ADNc para ATP7B humano nativo al que se le han eliminado los MBD 1-3. SEQ ID NO: 8 representa la proteína DEL1-3 nativa o ATP7B Δ1-3-SS, en la que están presentes dos residuos de serina correspondientes a las posiciones 340 y 341 de la secuencia completa de la proteína ATP7B de tipo silvestre. En diversas realizaciones descritas en este documento, se proporcionan vectores que contienen un genoma que comprende una secuencia codificante para ATP7B truncado (ATP7B Δ1-3-SS) (por ejemplo,SEQ ID NO:1 o SEQ ID NO:15).

[0096] En algunas realizaciones, se proporcionan vectores que contienen un genoma que comprende un ADNc modificado para ATP7B humano, que ha sido optimizado para codones (por ejemplo, SEQ ID NO:15). Los polipéptidos administrados con los vectores descritos en este documento comprenden ATP7B truncado en el cual se han eliminado los dominios MBD 1-3 (ATP7B Δ1-3-SS), que son adecuados para su uso en el tratamiento de la enfermedad de Wilson.

[0097] En algunas realizaciones, el polipéptido expresado con un vector descrito en este documento es un ATP7B humano truncado (SEQ ID NO:8).

[0098] Elementos vectoriales:

[0099] En algunas realizaciones, el vector AAV contiene un genoma que comprende además una o más secuencias potenciadoras. En una realización, el potenciador se selecciona entre un potenciador de transtiretina (enTTR), un potenciador del gen temprano inmediato del citomegalovirus (CMV), un potenciador de β-actina de pollo (CBA), un potenciador de En34 y un potenciador de apolipoproteína (ApoE). En una realización ejemplar, el potenciador es el potenciador enTTR. En una realización, el potenciador enTTR comprende o consiste en SEQ ID NO:3.

[0100] En algunas realizaciones, el vector AAV contiene un genoma que comprende además una o más secuencias potenciadoras. En una realización, el intrón se selecciona entre un intrón SV40 small T, un intrón de la subunidad beta de la hemoglobina de conejo (rHBB), un intrón IVS2 de la globina beta humana, un intrón quimérico de βglobina/IgG (intrón quimérico de Promega) o un intrón hFIX. En una realización ejemplar, el intrón es el intrón SV40 Small T. En una realización, la secuencia intrónica SV40 Small T comprende o consiste en SEQ ID NO:4. En otra realización ejemplar, el intrón es el intrón rHBB. En una realización, la secuencia intrónica rHBB comprende o consiste en SEQ ID NO:5.

[0101] En algunas realizaciones, el vector AAV contiene un genoma que comprende además una secuencia de señal de poliadenilación. En una realización, la secuencia de señal de poliadenilación se selecciona entre una secuencia de señal de poliadenilación de SV40, una secuencia de señal de poliadenilación de la hormona de crecimiento bovina (BGH) y una secuencia de señal de poliadenilación de la beta-globina de conejo. En un realización ejemplar, la secuencia de señal de poliadenilación es la secuencia de señal de poliadenilación de la hormona de crecimiento bovina (BGH). En una realización, la secuencia de señal de poliadenilación BGH comprende o consiste en SEQ ID NO:6. En otra realización ejemplar, la secuencia de señal de poliadenilación es la secuencia de señal de poliadenilación SV40. En una realización, la secuencia de señal de poliadenilación SV40 comprende o consiste en SEQ ID NO:7.

[0102] Cápsides de AAV:

[0103] En otro aspecto, la solicitud proporciona un virus adenoasociado recombinante (rAAV) útil como agente para la terapia génica en el tratamiento de la WD, en donde dicho rAAV comprende una cápside de AAV y un genoma vectorial como se describe en este documento. En algunas realizaciones, la cápside de AAV es de un AAV de serotipo 9, 8, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 10, 11, 12, rh10 o hu37 (es decir,AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAVrh10 o AAVhu37). En una realización ejemplar, el vector AAV es un vector AAV de serotipo 9 (AAV9), un vector variante de AAV9, un vector AAV de serotipo 8 (AAV8), un vector AAV de serotipo 5 (AAV5) o un vector AAV de serotipo 2 (AAV2). En ciertas realizaciones, la cápside y el vector AAV pertenecen a un serotipo AAV9. En ciertas realizaciones, la cápside y el vector AAV pertenecen a un serotipo AAV8. La cápside AAV9 es una cápside AAV autoensamblada compuesta por múltiples proteínas VP AAV9. Las proteínas VP AAV9 se expresan típicamente como variantes de empalme alternativas codificadas por una secuencia de ácido nucleico con SEQ ID NO:9 o una secuencia que es al menos 70 %, al menos 75 %, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 97 %, al menos 99 % de la misma, que codifica la secuencia de aminoácidos de la proteína de la cápside VP1 con ID de secuencia NO:10 (número de acceso de GenBank: AAS99264). Estas variantes de empalme dan como resultado proteínas de diferente longitud de SEQ ID NO:10. En ciertas realizaciones, una cápside de AAV9 incluye una proteína de cápside de AAV9 que tiene una secuencia de aminoácidos que es 99 % idéntica a AAS99264 o 99 % idéntica a SEQ ID NO:10.Ver tambiénPatente de EE. UU. n.º 7,906,111 y publicación internacional n.º WO/2005/033321. Tal como se utiliza en este documento, una variante de AAV9 incluye aquellas descritas en,por ejemplo, la publicación internacional n.º WO/2016/049230, la Patente de EE. UU. n.º 8,927,514, la publicación de Patente de EE. UU. n.º 2015/0344911 y la Patente de EE. UU. n.º 8,734,809.

[0104] Como se indica en este documento, las secuencias de la cápside AAV9 y las proteínas de la cápside codificadas por las secuencias (por ejemplo, la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO:9 o la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:10 que codifica la proteína de la cápside AAV9 VP1) son útiles en la producción de rAAV. Sin embargo, en otras realizaciones, se selecciona otra cápside de AAV. La especificidad tisular está determinada por el tipo de cápside. Los serotipos de AAV que transducen un objetivo adecuado (por ejemplo,hígado, músculo, pulmón o SNC) pueden seleccionarse como fuentes de cápsides de vectores virales AAV, incluidos,por ejemplo, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV6.2, AAV7, AAV8, AAV9, AAVrh10, AAVrh64Rl, AAVrh64R2, AAVrh8.Ver, por ejemplo,la Publicación de Patente de EE. UU. n.º 2007/0036760; Publicación de Patente de EE. UU. n.º 2009/0197338; y el documento EP1310571.Ver tambiénla solicitud internacional n.º WO 2003/042397 (AAV7 y otros AAV de simios), las Patentes de EE. UU. n.º 7,282,199 y 7,790,449 (AAV8). Además, se puede utilizar como fuente para la cápside del AAV un virus adenoasociado (AAV) aún por descubrir, o un AAV recombinante basado en el mismo. Estos documentos también describen otros AAV que pueden seleccionarse para generar AAV. En algunas realizaciones, una cápside de AAV para su uso en el vector viral puede generarse mediante mutagénesis (es decir,mediante inserciones, deleciones o sustituciones) de una de las cápsides de AAV mencionadas anteriormente o de su ácido nucleico codificante.

[0105] Células huésped que comprenden una molécula de ácido nucleico recombinante:

[0106] En algunos aspectos, se proporcionan en este documento células huésped que comprenden una molécula de ácido nucleico recombinante, un vector viral,por ejemplo,un vector AAV, o un rAAV divulgado en este documento. En realizaciones específicas, las células huésped pueden ser adecuadas para la propagación del AAV.

[0107] Se puede utilizar una amplia gama de células huésped, tal como bacterias, levaduras, insectos, células de mamíferos,etc.En algunas realizaciones, la célula huésped puede ser una célula (o una línea celular) apropiada para la producción de AAV recombinante (rAAV), por ejemplo, una célula HeLa, Cos-7, HEK293, A549, BHK, Vero, RD, HT-1080, ARPE-19 o MRC-5. En ciertas realizaciones, la línea celular huésped de la presente invención es una línea celular HeLa (por ejemplo,HeLa S3). En otra realización, la línea celular huésped de la presente invención es una línea celular HEK293.

[0108] Las moléculas o vectores de ácido nucleico recombinante pueden administrarse en el cultivo de células huésped utilizando cualquier método adecuado conocido en la técnica. En algunas realizaciones, se genera una línea celular huésped estable que tiene la molécula o vector de ácido nucleico recombinante insertado en su genoma. En algunas realizaciones, se genera una línea celular huésped estable que contiene un vector AAV descrito en este documento. Después de la transfección del vector AAV en el cultivo huésped, la integración del rAAV en el genoma del huésped puede analizarse mediante diversos métodos, tales como selección con antibióticos, clasificación de células activada por fluorescencia, transferencia Southern, detección basada en PCR, hibridación in situ por fluorescencia, como se describe en Nakai et al., Nature Genetics (2003) 34:297-302; Philpott et al., Journal of Virology (2002) 76(11):5411-5421, y Howden et al., J. Gene Med. (2008) 10:42-50. Además, se pueden establecer líneas celulares estables según protocolos bien conocidos en la técnica, tales como los descritos en Clark, Kidney International Vol.61 (2002):S9-S15, y Yuan et al., Human Gene Therapy (2011) 22(5):613-24.

[0109] AAV recombinante para terapia génica:

[0110] El virus adenoasociado (AAV) pertenece a la familiaParvoviridaey al géneroDependovirus.El AAV es un virus pequeño, sin envoltura, que contiene un genoma de ADN lineal monocatenario. Tanto la cadena codificante como la cadena no codificante del ADN del AAV se empaquetan en las cápsides del AAV con igual frecuencia.

[0111] El genoma del AAV se caracteriza por dos repeticiones terminales invertidas (ITR) que flanquean dos marcos de lectura abiertos (ORF). Por ejemplo, en el genoma del AAV2, los primeros 125 nucleótidos del ITR son un palíndromo, que se pliega sobre sí mismo para maximizar el apareamiento de bases y forma una estructura de horquilla en forma de T. Las otras 20 bases de la ITR, denominadas secuencia D, permanecen sin aparear. Las ITR son secuencias cis-activas importantes para la replicación del ADN del AAV; la ITR es el origen de la replicación y sirve como cebador para la síntesis de la segunda cadena por la ADN polimerasa. El ADN de doble cadena que se forma durante esta síntesis, denominado monómero en forma replicativa, se utiliza para una segunda ronda de replicación autocebante y forma un dímero en forma replicativa. Estos intermediarios de doble cadena se procesanmedianteun mecanismo de desplazamiento de cadena, lo que da como resultado ADN de cadena simple utilizado para el empaquetamiento y ADN de doble cadena utilizado para la transcripción. Dentro del ITR se encuentran los elementos de enlace Rep y un sitio de resolución de terminal (TRS). Estas características son utilizadas por la proteína reguladora viral Rep durante la replicación del AAV para procesar los intermediarios de doble cadena. Además de su función en la replicación del AAV, el ITR también es esencial para el empaquetamiento del genoma del AAV, la transcripción, la regulación negativa en condiciones no permisivas y la integración específica del sitio (Days and Berns, Clin. Microbiol. Rev. (2008) 21(4):583-593).

[0112] El ORF izquierdo del AAV contiene el gen Rep, que codifica cuatro proteínas - Rep78, Rep68, Rep52 y Rep40. El ORF derecho contiene el gen Cap, que produce tres proteínas de la cápside viral (VP1, VP2 y VP3). La cápside del AAV contiene 60 proteínas virales de la cápside dispuestas con simetría icosaédrica. VP1, VP2 y VP3 están presentes en una proporción molar de 1:1:10 (Daya and Berns, Clin. Microbiol. Rev. (2008) 21(4):583-593). El AAV es actualmente uno de los virus más utilizados para la terapia génica. Aunque el AAV infecta a los humanos y a algunas otras especies de primates, no se sabe que cause enfermedades y provoca una respuesta inmunitaria muy leve. Los vectores de terapia génica que utilizan AAV pueden infectar tanto células en división como en reposo y persistir en un estado extracromosómico sin integrarse en el genoma de la célula huésped. Debido a las características ventajosas del AAV, la presente divulgación contempla el uso de AAV para las moléculas de ácido nucleico recombinante y los métodos aquí descritos.

[0113] El AAV posee diversas características deseables para un vector de terapia génica, incluyendo la capacidad de unirse y entrar en las células objetivo, entrar en el núcleo, la capacidad de expresarse en el núcleo durante un período prolongado de tiempo y baja toxicidad. Sin embargo, el pequeño tamaño del genoma del AAV limita el tamaño del ADN heterólogo que se puede incorporar. Para minimizar este problema, se han construido vectores AAV que no codifican Rep ni el elemento de eficiencia de integración (IEE). Los ITR se conservan ya que son señalescisnecesarias para el empaquetamiento (Daya and Berns, Clin. Microbiol. Rev. (2008) 21(4):583-593). Los métodos para producir rAAV adecuados para la terapia génica son bien conocidos en la técnica (Ver, por ejemplo,Solicitud de Patente de EE. UU. n.° 2012/0100606; 2012/0135515; 2011/0229971; y 2013/0072548; y Ghosh et al., Gene Ther. (2006) 13(4):321-329), y pueden utilizarse con las moléculas de ácido nucleico recombinante y los métodos divulgados en este documento.

[0114] En algunos aspectos, la solicitud se relaciona con el uso de un rAAV divulgado en este documento para el tratamiento de la enfermedad de Wilson (WD), en donde el rAAV incluye una cápside de AAV y un genoma vectorial empaquetado en la misma. En algunas realizaciones, el vector contiene un genoma que comprende como componentes vinculados operativamente en orden 5' a 3': una secuencia de repetición terminal invertida 5' (ITR), una secuencia promotora, una secuencia codificante para un ATP7B humano truncado (ATP7B Δ1-3-SS) (por ejemplo,SEQ ID NO:1 o SEQ ID NO:15) y una secuencia de repetición terminal invertida 3' (ITR). En una realización ejemplar, el genoma vectorial también comprende una secuencia potenciadora aguas arriba de la secuencia promotora, un intrón aguas abajo del promotor y una secuencia de poliadenilación aguas arriba del 3'-ITR. Por lo tanto, en otra realización ejemplar, el genoma vectorial comprende como componentes vinculados operativamente en orden 5' a 3': una secuencia de repetición terminal invertida 5' (ITR), una secuencia potenciadora, una secuencia promotora, una secuencia intrónica, una secuencia codificante para un ATP7B humano truncado (ATP7B Δ1-3-SS) (por ejemplo,SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 15), una secuencia de señal de poliadenilación y una secuencia de repetición terminal invertida 3' (ITR). En otra realización ejemplar, el genoma vectorial comprende como componentes vinculados operativamente en orden 5' a 3': una secuencia AAV25'-ITR, un potenciador enTTR, un promotor TTR, un intrón SV40 Small T, una secuencia codificante para un ATP7B humano truncado (ATP7B Δ1-3-SS) (por ejemplo,SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 15), una secuencia de señal de poliadenilación de SV40 y un AAV23'-ITR. En algunas realizaciones, el genoma vectorial comprende además una secuencia consenso de Kozak situada aguas abajo de la secuencia intrónica. En algunas realizaciones, la cápside es una cápside AAV9.

[0116] En algunos aspectos, la solicitud se relaciona con el uso de un rAAV divulgado en este documento para el tratamiento de la enfermedad de Wilson (WD), en donde el rAAV incluye una cápside de AAV y un genoma vectorial empaquetado en la misma. En algunas realizaciones, el genoma vectorial comprende como componentes vinculados operativamente en orden 5' a 3': una secuencia de repetición terminal invertida 5' (ITR), una secuencia promotora, una secuencia codificante para un ATP7B humano truncado (ATP7B Δ1-3-SS) (por ejemplo,SEQ ID NO:1), y una secuencia de repetición terminal invertida 3' (ITR). En una realización ejemplar, el genoma vectorial también comprende una secuencia potenciadora aguas arriba de la secuencia promotora, un intrón aguas abajo del promotor y una secuencia de poliadenilación aguas arriba del 3'-ITR. Por lo tanto, en otra realización ejemplar, el vector contiene un genoma que comprende como componentes vinculados operativamente en orden 5' a 3': una secuencia de repetición terminal invertida 5' (ITR), una secuencia potenciadora, una secuencia promotora, una secuencia intrónica, una secuencia codificante para un ATP7B humano truncado (ATP7B Δ1-3-SS) (por ejemplo,SEQ ID NO: 1), una secuencia de señal de poliadenilación y una secuencia de repetición terminal invertida 3' (ITR). En otra realización ejemplar, el vector contiene un genoma que comprende como componentes vinculados operativamente en orden 5' a 3': una secuencia AAV25'-ITR, un potenciador enTTR, un promotor TTR, un intrón SV40 Small T, una secuencia codificante para un ATP7B humano truncado (ATP7B Δ1-3-SS) (por ejemplo,SEQ ID NO: 1), una secuencia de señal de poliadenilación de SV40 y un AAV23'-ITR. En algunas realizaciones, el genoma empaquetado comprende además una secuencia consenso de Kozak ubicada aguas abajo de la secuencia intrónica. En algunas realizaciones, la cápside es una cápside AAV9.

[0118] En algunos aspectos, la solicitud se relaciona con el uso de un rAAV divulgado en este documento para el tratamiento de la enfermedad de Wilson (WD), en donde el rAAV incluye una cápside de AAV y un genoma vectorial empaquetado. En algunas realizaciones, el vector contiene un genoma empaquetado que comprende como componentes vinculados operativamente en orden 5' a 3': una secuencia de repetición terminal invertida 5' (ITR), una secuencia promotora, una secuencia codificante para un ATP7B humano truncado (ATP7B Δ1-3-SS) (por ejemplo,SEQ ID NO:15) y una secuencia de repetición terminal invertida 3' (ITR). En una realización ejemplar, el genoma empaquetado también comprende una secuencia potenciadora aguas arriba de la secuencia promotora, un intrón aguas abajo del promotor y una secuencia de poliadenilación aguas arriba del 3'-ITR. Por lo tanto, en otra realización ejemplar, el vector contiene un genoma empaquetado que comprende como componentes vinculados operativamente en orden 5' a 3': una secuencia de repetición terminal invertida 5' (ITR), una secuencia potenciadora, una secuencia promotora, una secuencia intrónica, una secuencia codificante para un ATP7B humano truncado (ATP7B Δ1-3-SS) (por ejemplo,SEQ ID NO: 15), una secuencia de señal de poliadenilación y una secuencia de repetición terminal invertida 3' (ITR). En una realización ejemplar adicional, el vector contiene un genoma empaquetado que comprende como componentes vinculados operativamente en orden 5' a 3': una secuencia AAV2 5'-ITR, un potenciador enTTR, un promotor TTR, un intrón SV40 Small T, una secuencia codificante para un ATP7B humano truncado (ATP7B Δ1-3-SS) (por ejemplo,SEQ ID NO: 15), una secuencia de señal de poliadenilación de SV40 y un AAV23'-ITR. En algunas realizaciones, el genoma empaquetado comprende además una secuencia consenso de Kozak ubicada aguas abajo de la secuencia intrónica. En algunas realizaciones, la cápside es una cápside AAV9.

[0120] En la FIG.1 se proporciona un diagrama ilustrativo que muestra un constructo de genoma vectorial empaquetado ejemplar para la expresión de ATP7B truncado que conserva los MBD 4, 5 y 6. Un 5'-ITR está representado por los nucleótidos 1-145; un potenciador enTTR está representado por los nucleótidos 146-245; un promotor TTR está representado por los nucleótidos 246-435; un intrón SV40 Small T está representado por los nucleótidos 436-530; una secuencia consenso de Kozak está representada por los nucleótidos 531-536; una secuencia codificante truncada de ATP7B está representada por los nucleótidos 540-4142; una secuencia de señal de poliadenilación de SV40 está representada por los nucleótidos 4143-4340; y un 3'-ITR está representado por los nucleótidos 4341-4485.

[0122] En ciertas realizaciones, la secuencia de ácido nucleico que codifica ATP7B Δ1-3-SS es la secuencia humana nativa (representada por SEQ ID NO: 1). Alternativamente, en algunas realizaciones, la secuencia de ácido nucleico que codifica ATP7B Δ1-3-SS es una secuencia humana optimizada para codones (representada por SEQ ID NO: 15).

[0124] Eficacia mejorada en el tratamiento de la WD:

[0126] En ciertas realizaciones, el ATP7B humano truncado (ATP7B Δ1-3-SS) codificado por SEQ ID NO:1 o SEQ ID NO: 15, descrito en este documento, es más eficaz que la longitud completa u otras formas truncadas de ATP7B (porejemplo

, ATP7B Δ1-4, SEQ ID NO: 13). En algunos aspectos, el ATP7B Δ1-3-SS de la presente divulgación se localiza en la red trans-Golgi (TGN). En ciertas realizaciones, un rAAV que comprende la secuencia de ácido nucleico SEQ ID NO: 1, que codifica ATP7B Δ1-3-SS, al inyectarse en un mamífero diagnosticado con un trastorno del metabolismo del cobre (por ejemplo, la enfermedad de Wilson), disminuye los niveles de cobre en el hígado y la orina del mamífero.

[0127] Rendimiento mejorado de los vectores AAV que contienen ATP7B truncado:

[0128] En un aspecto, el rAAV que comprende la secuencia de ácido nucleico que codifica ATP7B Δ1-3-SS, empaquetado en AAV8 o AAV9, descrito en este documento, tiene un rendimiento de fabricación aproximadamente 1,1 a aproximadamente 10 veces mayor (por ejemplo,aproximadamente 1,1 veces, aproximadamente 1,2 veces, aproximadamente 1,3 veces, aproximadamente 1,4 veces, aproximadamente 1,5 veces, aproximadamente 1,6 veces, aproximadamente 1,7 veces, aproximadamente 1,8 veces, aproximadamente 1,9 veces, aproximadamente 2 veces, aproximadamente 3 veces, aproximadamente 4 veces, aproximadamente 5 veces, aproximadamente 6 veces, aproximadamente 7 veces, aproximadamente 8 veces, aproximadamente 9 veces o aproximadamente 10 veces) que el de ATP7B de longitud completa o ATP7B Δ1-4.

[0129] Rendimiento mejorado del vector AAV que comprende la cápside AAV9:

[0130] En un aspecto, el rAAV que comprende la cápside AAV9 tiene un rendimiento de fabricación aproximadamente 1,1 a aproximadamente 10 veces mayor (por ejemplo, aproximadamente 1,1 veces, aproximadamente 1,2 veces, aproximadamente 1,3 veces, aproximadamente 1,4 veces, aproximadamente 1,5 veces, aproximadamente 1,6 veces, aproximadamente 1,7 veces, aproximadamente 1,8 veces, aproximadamente 1,9 veces, aproximadamente 2 veces, aproximadamente 3 veces, aproximadamente 4 veces, aproximadamente 5 veces, aproximadamente 6 veces, aproximadamente 7 veces, aproximadamente 8 veces, aproximadamente 9 veces o aproximadamente 10 veces) en comparación con el rAAV que comprende la cápside AAV8.

[0131] Composiciones farmacéuticas:

[0132] La presente divulgación proporciona composiciones que comprenden el rAAV divulgado en este documento y un portador farmacéuticamente aceptable. Se pueden encontrar formulaciones farmacéuticas adecuadas para la administración de rAAV, por ejemplo, en la Publicación de solicitud de Patente de EE. UU. n.° 2012/0219528. Los transportadores (vehículos) farmacéuticamente aceptables útiles en esta divulgación son convencionales. Remington's Pharmaceutical Sciences, by E. W. Martin, Mack Publishing Co., Easton, Pa., 15ª Edición (1975), describe composiciones y formulaciones adecuadas para la administración farmacéutica de uno o más compuestos, moléculas o agentes terapéuticos.

[0133] Como se destacó en el párrafo anterior, la solicitud se relaciona en algunos aspectos con composiciones farmacéuticas que comprenden un rAAV de la invención. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica comprende un portador o excipiente farmacéuticamente aceptable. En algunas realizaciones, las composiciones farmacéuticas se formulan para administración subcutánea, intradérmica, intraperitoneal, o intravenosa. En una realización ejemplar, la composición farmacéutica está formulada para administración intravenosa.

[0134] En algunas realizaciones, el rAAV se formula en un tampón/portador adecuado para la infusión en sujetos humanos. El tampón/portador debe incluir un componente que impida que el rAAV se adhiera al tubo de infusión, pero que no interfiera con la actividad de unión del rAAVin vivo.Diversas soluciones adecuadas pueden incluir una o más de las siguientes: una solución salina tamponada, un surfactante y una sal fisiológicamente compatible o una mezcla de sales ajustada a una fuerza iónica equivalente a aproximadamente 100 mM de cloruro de sodio (NaCl) a aproximadamente 250 mM de NaCl, o una sal fisiológicamente compatible ajustada a una concentración iónica equivalente. El pH puede estar en el rango de 6,5 a 8,5, o de 7 a 8,5, o de 7,5 a 8. Se puede seleccionar un surfactante adecuado, o una combinación de surfactantes, entre los Poloxámeros,es decir,copolímeros tribloque no iónicos compuestos por una cadena hidrofóbica central de polioxipropileno 10 (poli(óxido de propileno)) flanqueada por dos cadenas hidrofílicas de polioxietileno (poli(óxido de etileno)), SOLUTOL HS 15 (hidroxiestearato de macrogol-15), LABRASOL (glicérido caprílico de polioxi), éter oleílico de polioxi 10, TWEEN (ésteres de ácidos grasos de sorbitán de polioxietileno), etanol y polietilenglicol.

[0135] Métodos de tratamiento de la enfermedad de Wilson:

[0136] Las referencias a métodos de tratamiento en los párrafos siguientes de esta descripción deben interpretarse como referencias a los compuestos, composiciones farmacéuticas y medicamentos de la presente invención para su uso en un método para el tratamiento del cuerpo humano (o animal) mediante terapia.

[0137] En otro aspecto más, la solicitud se refiere a métodos para tratar la WD en un sujeto humano que comprenden administrar al sujeto humano una cantidad terapéuticamente efectiva de un rAAV que incluye SEQ ID NO:1 o SEQ ID NO:15 para codificar un ATP7B truncado (ATP7B Δ1-3-SS), divulgado en este documento.

[0138] En una realización, la solicitud proporciona un método para tratar la WD que comprende administrar un rAAV que incluye una cápside de AAV y un genoma vectorial empaquetado, en donde el genoma vectorial comprende una secuencia codificante para un ATP7B humano truncado (ATP7B Δ1-3-SS)(por ejemplo,SEQ ID NO:1 o SEQ ID NO:15).

[0140] En otro aspecto más, la solicitud se refiere a métodos para tratar la WD en un sujeto humano que comprenden administrar a un sujeto humano diagnosticado con al menos una mutación en ATP7B, una cantidad terapéuticamente efectiva de al menos un rAAV que comprende un genoma vectorial que comprende una secuencia codificante para un ATP7B humano truncado (ATP7B Δ1-3-SS) (por ejemplo,SEQ ID NO:1 o SEQ ID NO:15). En una realización, la solicitud proporciona un método para tratar la enfermedad de Wilson en un sujeto humano diagnosticado con al menos una mutación en ATP7B que comprende la administración de un rAAV que incluye una cápside de AAV y un genoma de vector empaquetado, donde el genoma vectorial comprende la secuencia codificante para un ATP7B humano truncado (ATP7B Δ1-3-SS) (por ejemplo,SEQ ID NO:1 o SEQ ID NO:15). La secuencia codificante representada por SEQ ID NO: 1 codifica una ATP7B truncada representada por SEQ ID NO: 8. En algunas realizaciones, la cápside es una cápside AAV9.

[0142] En otro aspecto más, la solicitud se refiere a métodos para tratar la WD en un sujeto humano que comprenden administrar a un sujeto humano diagnosticado con al menos una mutación en ATP7B, una cantidad terapéuticamente efectiva de al menos un rAAV que comprende un genoma vectorial que comprende una secuencia codificante para un ATP7B humano truncado (ATP7B Δ1-3-SS) (por ejemplo,SEQ ID NO:1). En una realización, la solicitud proporciona un método para tratar la WD en un sujeto humano diagnosticado con al menos una mutación en ATP7B que comprende administrar un rAAV que incluye una cápside de AAV y un genoma de vector empaquetado, en donde el genoma vectorial comprende la secuencia codificante para un ATP7B humano truncado (ATP7B Δ1-3-SS) (por ejemplo,SEQ ID NO:1). La secuencia codificante representada por SEQ ID NO: 1 codifica una ATP7B truncada representada por SEQ ID NO: 8. En algunas realizaciones, la cápside es una cápside AAV9.

[0144] En otro aspecto más, la solicitud se refiere a métodos para tratar la WD en un sujeto humano que comprenden administrar a un sujeto humano diagnosticado con al menos una mutación en ATP7B, una cantidad terapéuticamente efectiva de al menos un rAAV que comprende un genoma vectorial que comprende una secuencia codificante para un ATP7B humano truncado (ATP7B Δ1-3-SS) (por ejemplo,SEQ ID NO:15). En una realización, la solicitud proporciona un método para tratar la WD en un sujeto humano diagnosticado con al menos una mutación en ATP7B que comprende administrar un rAAV que incluye una cápside de AAV y un genoma vectorial empaquetado, en donde el genoma vectorial comprende la secuencia codificante para un ATP7B humano truncado (ATP7B Δ1-3-SS) (por ejemplo,SEQ ID NO:15). En algunas realizaciones, la cápside es una cápside AAV9.

[0146] Se puede utilizar cualquier método o ruta adecuada para administrar un rAAV o una composición que contenga rAAV descrita en este documento. Las rutas de administración incluyen, por ejemplo, la sistémica, oral, por inhalación, intranasal, intratraqueal, intraarterial, intraocular, intravenosa, intramuscular, subcutánea, intradérmica y otras vías de administración parenteral. En algunas realizaciones, el rAAV o una composición que comprende un rAAV se administra vía intravenosa.

[0148] La dosis específica administrada puede ser una dosis uniforme para cada paciente, por ejemplo, 1,0 x 10<11>- 1,0 x 10<14>genoma viral por kilogramo de peso corporal del paciente (vg)/kg. Alternativamente, una dosis del paciente puede ajustarse al peso corporal o superficie corporal aproximada del paciente. Otros factores que determinan la dosis adecuada pueden incluir la enfermedad o condición que se va a tratar o prevenir, la gravedad de la enfermedad, la ruta de administración y la edad, el sexo y el estado de salud del paciente. Los expertos en la técnica realizan habitualmente un perfeccionamiento adicional de los cálculos necesarios para determinar la dosis adecuada para el tratamiento, especialmente a la luz de la información sobre dosificación y los ensayos que se divulgan en este documento. La dosis también puede determinarse mediante el uso de ensayos conocidos para la determinación de dosis, junto con los datos apropiados de dosis-respuesta. La dosis de un paciente también puede ajustarse a medida que se monitoriza la evolución de la enfermedad.

[0150] En algunas realizaciones, el rAAV se administra en una dosis de,por ejemplo,aproximadamente 1,0 x 10<11>vg/kg a aproximadamente 1 x 10<14>vg/kg, aproximadamente 5 x 10<11>vg/kg a aproximadamente 5 x 10<13>vg/kg, o aproximadamente 1 x 10<12>a aproximadamente 1 x 10<13>vg/kg, según se mida mediante qPCR o PCR digital de gotas (ddPCR). En algunas realizaciones, el rAAV se administra a una dosis de aproximadamente 2×10<12>vg/kg. En algunas realizaciones, el rAAV se administra a una dosis de aproximadamente 5×10<12>vg/kg. En algunas realizaciones, el rAAV se administra a una dosis de aproximadamente 6×10<12>vg/kg. En algunas realizaciones, el rAAV se administra a una dosis de aproximadamente 1×10<13>vg/kg. En algunas realizaciones, el rAAV se administra a una dosis de aproximadamente 7×10<13>vg/kg. El rAAV se puede administrar en una sola dosis o en dosis múltiples (como 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más dosis) según sea necesario para obtener los resultados terapéuticos deseados. En algunas realizaciones ejemplares, solo se administra una única dosis de un rAAV en particular.

[0152] A lo largo de la descripción, cuando se describen composiciones que tienen, incluyen o comprenden componentes específicos, o cuando se describen procesos y métodos que tienen, incluyen o comprenden pasos específicos, se contempla que, además, existen composiciones de la presente invención que consisten esencialmente en, o consisten en, los componentes mencionados, y que existen procesos y métodos según la presente invención que consisten esencialmente en, o consisten en, los pasos de procesamiento mencionados.

[0153] En la solicitud, donde se dice que un elemento o componente está incluido y/o seleccionado de una lista de elementos o componentes mencionados, debe entenderse que el elemento o componente puede ser uno cualquiera de los elementos o componentes mencionados, o el elemento o componente puede seleccionarse de un grupo que consiste en dos o más de los elementos o componentes mencionados.

[0154] Debe entenderse que la expresión "al menos uno de" incluye individualmente cada uno de los objetos mencionados después de la expresión y las diversas combinaciones de dos o más de los objetos mencionados a menos que se entienda lo contrario a partir del contexto y el uso. La expresión "y/o" en conexión con tres o más objetos mencionados debe entenderse que tiene el mismo significado a menos que se entienda lo contrario a partir del contexto.

[0155] El uso del término "incluir", "incluye", "que incluye", "tener", "tiene", "que tiene", "contener", "contiene" o "que contiene", que incluye sus equivalentes gramaticales, debe entenderse en general como abierto y no limitativo, por ejemplo, sin excluir elementos o etapas adicionales no mencionados, a menos que se indique o entienda específicamente lo contrario a partir del contexto.

[0156] Cuando el uso del término "aproximadamente" se da antes de un valor cuantitativo, la presente invención también incluye el valor cuantitativo específico en sí, a menos que se indique específicamente lo contrario. Tal como se utiliza en este documento, el término "aproximadamente" se refiere a una variación de ±10 % del valor nominal, a menos que se indique o se infiera lo contrario.

[0157] Debe entenderse que el orden de las etapas o el orden para realizar ciertas acciones es irrelevante siempre que la presente invención siga siendo operativa. Además, se pueden realizar dos o más etapas o acciones simultáneamente.

[0158] Se pretende que el uso de todos y cada uno de los ejemplos o las expresiones en este documento, por ejemplo, "tal como" o "incluyendo" ilustre mejor la invención y no presente una limitación al alcance de la invención a menos que se reivindique. No se debe interpretar ninguna expresión de la especificación como indicación de que algún elemento no reivindicado sea esencial para la puesta en práctica de la presente invención.

[0159] Ejemplos

[0160] La invención, que se ha descrito en términos generales, se comprenderá más fácilmente con referencia a los siguientes ejemplos, que se incluyen meramente para ilustrar determinados aspectos y realizaciones de la presente invención y no pretenden limitar la invención.

[0161] Ejemplo 1 - Vectores AAV y rAAV producidos a partir de los vectores

[0162] Vector AA V

[0163] Este ejemplo describe el constructo de un vector AAV con la secuencia de ácido nucleico representada por SEQ ID NO:1, delimitada por dos repeticiones terminales invertidas de AAV2 (ITR, SEQ ID NO:2). SEQ ID NO:1 representa el ADNc para ATP7B humano nativo al que se le han eliminado los MBD 1-3. Los nucleótidos 223-225 en SEQ ID NO:1 codifican el residuo de serina S340 y los nucleótidos 226-228 en SEQ ID NO:1 codifican el residuo de serina S341 (la numeración se basa en la secuencia completa de la proteína ATP7B de tipo silvestre).

[0164] Como se ilustra en la FIG. 1, dentro del vector AAV, el casete de expresión ATP7B contiene un potenciador (EnTTR), un promotor (TTR), un intrón (intrón SV40 Small T), la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO:1, que codifica una ATP7B humana truncada (ATP7B Δ1-3-SS), y una señal de poli (A) de SV40. En laFIG.2se muestra un mapa circular del vector que ilustra los diversos componentes.

[0165] El vector AAV DTC319 contiene una secuencia ATP7B humana truncada en la cual se conservan los dominios de unión a metales 4, 5 y 6. La secuencia truncada de ATP7B humano codifica una proteína que comprende dos residuos de serina, S340 y S341 (enumerados según la secuencia de referencia del NCBI: NP_000044.2), representados por SEQ ID NO:8.

[0166] La señal de poliadenilación tardía del virus simio 40 (SV40) (número de acceso de Genbank J02400 (SEQ ID NO:7) proporciona una secuenciacispara la poliadenilación eficiente del ARNm ATP7B. Este elemento funciona como una señal para un evento de escisión específico en el extremo 3' del transcrito naciente y la adición de una larga cola de poliadenilo.

[0167] Cada casete de expresión ATP7B truncado se clonó en un vector AAV. Todos los vectores AAV tenían una estructura básica que codificaba el gen de resistencia a la kanamicina. En la FIG. 2 se ilustra un vector AAV ejemplar, DTC319. La FIG.1 muestra el casete de expresión de DTC319 para expresar ATP7B (ATP7B Δ1-3-SS).Viriones rAA V

[0168] El genoma vectorial AAV es un genoma de ADN monocatenario. Únicamente las secuencias entre e incluyendo las secuencias ITR se empaquetan en el virión AAV. Los viriones se produjeron mediante la transfección de tres plásmidos en células de riñón embrionario humano 293 (HEK293), que proporcionan los productos de los genes E1a y E1b. El primer plásmido puede ser un vector AAV descrito en este documento. El segundo plásmido puede ser un plásmido de empaquetamiento que contiene los genes rep de tipo silvestre de AAV2 y cap de AAV8 o AAV9. El tercer plásmido es un plásmido de adenovirus auxiliar.

[0169] En la FIG.3 se muestra una ilustración de un plásmido de empaquetamiento ejemplar, el plásmido pAAV2/8.KanR (p2123FH). En este plásmido, el plásmido Rep/Cap adenoasociado pAAV2/8.KanR(p2123FH) (8354 pb) codifica las cuatro proteínas de replicación viral (Rep) de AAV2 de tipo silvestre y las tres proteínas de la cápside (cap) VP de AAV de tipo silvestre del serotipo 8. Dentro del plásmido, el promotor p5 de AAV que normalmente impulsa la expresión del gen Rep se ha movido del extremo 5' de la región Rep al extremo 3' de la región cap de AAV8. Esta disposición introduce un espaciador entre el promotor y el gen Rep(es decir,la estructura del plásmido), lo que da como resultado una regulación negativa de la expresión de Rep y un aumento en la capacidad de mantener una producción de rAAV de alto título. El gen de resistencia a la kanamicina y el origen MB1 se incluyen para la producción de plásmidos enE. coli.

[0170] En la FIG.4 se muestra una ilustración de un plásmido auxiliar ejemplar, pAdDeltaF6 (Kan). En este plásmido, se proporcionan las regiones del genoma del adenovirus importantes para la replicación del AAV, concretamente E2A, E4 y el ARN VA. Las funciones de E1 del adenovirus también son necesarias, pero las proporcionan las células huésped HEK293. El plásmido que se muestra en la FIG.4 no contiene otros genes de replicación de adenovirus, genes estructurales ni elementosciscríticos para la replicación de adenovirus, como los ITR adenovirales y, por lo tanto, no se espera que se genere ningún adenovirus infeccioso. El gen de resistencia a la kanamicina y el origen MB1 se incluyen para la producción de plásmidos enE. coli.

[0171] Ejemplo 2 - Eliminación de los dominios de unión a metales (MBD) 1-3 en la ATP7B humana mejora el rendimiento de fabricación

[0172] Este ejemplo describe experimentos que demostraron que ATP7B Δ1-3-SS tenía un rendimiento mayor que el ATP7B de longitud completa o la forma truncada ATP7B Δ1-4.

[0173] La falta de ATP7B funcional produce acumulación de cobre en el hígado y otros tejidos, lo que se manifiesta como enfermedad hepática con síntomas neurológicos o psiquiátricos. La WD se puede tratar al reducir la absorción de cobre o al eliminar el exceso de cobre del cuerpo. Los ratones C3He-Atp7b<tx-j>no expresan Atp7b funcional y, por lo tanto, sirven como un modelo de ratón para la WD. Se utilizaron vectores AAV que contenían la secuencia ATP7B humana de longitud completa optimizada para codones para transfectar células HEK293 con el plásmido Rep/Cap, que codifica cuatro proteínas de replicación viral (Rep) de AAV2 de tipo silvestre y las tres proteínas de la cápside (cap) VP de AAV de tipo silvestre, del serotipo 8 y el plásmido auxiliar para obtener partículas virales ATP7BcoFL. Los ratones macho C3He-Atp7b<tx-j>fueron inyectados por vía intravenosa (i.v.) con 10<10>o 10<11>GC/kg de ATP7BcoFL (ATP7B humano de longitud completa que ha sido optimizado para codones). Los ratones hembra C3He-Atp7b<tx-j>se inyectaron pori.v.con 10<9>, 10<10>o 10<11>GC/kg del mismo vector. Los niveles de cobre en el hígado de machos (representados por cuadrados) y hembras (representados por círculos) se evaluaron mediante espectrometría de masas de plasma acoplado inductivamente (ICP-MS) y se compararon con los niveles de cobre de ratones heterocigotos (Het) y machos y hembras C3He-Atp7b<tx-j>no inyectados de la misma edad. Se realizó la necropsia a los ratones aproximadamente a los 9 meses de edad y se extrajo el hígado. Los datos se presentan en la FIG.

[0174] 5.

[0175] La terapia génica que utiliza vectores AAV puede utilizarse para tratar la WD. Sin embargo, existe un límite en el tamaño del ADNc que se puede empaquetar dentro de la cápside de un vector AAV. El genoma del AAV de tipo silvestre tiene un tamaño de 4,7 kb, y el empaquetamiento de genomas más grandes puede reducir potencialmente el rendimiento y la integridad de la secuencia de ADN encapsulada dentro de la cápside del AAV. Por lo tanto, la secuencia de nucleótidos que codifica ATP7B Δ1-3-SS se empaquetó dentro de la cápside de AAV8 y se probó el rendimiento de fabricación de ATP7B Δ1-3-SS. Se transfectaron en células HEK293 vectores AAV que codificaban la proteína ATP7B humana de longitud completa (FL), la proteína ATP7B humana en la que se habían eliminado los dominios MBD 1-3, pero en la que estaba presente el bucle rico en serina que incluía dos residuos de serina (S340 y S341) entre MBD3 y MBD4 (ATP7B Δ1-3-SS), o la proteína ATP7B humana en la que se habían eliminado los dominios MBD 1-4 (ATP7B Δ1-4). El plásmido Rep/Cap, que codifica cuatro proteínas de replicación viral (Rep) de AAV2 de tipo silvestre y las tres proteínas de la cápside (cap) VP de AAV de tipo silvestre del serotipo 8, y el plásmido auxiliar se cotransfectaron con los vectores AAV que expresan diversas proteínas ATP7B. La FIG. 6 es un gráfico de barras que muestra los títulos de rAAV producidos a partir de células huésped después de la transfección de diversos vectores AAV. El eje Y indica el rendimiento total de cada título de rAAV en copias del genoma (GC). Los datos muestran que ATP7B Δ1-3-SS tuvo un rendimiento mayor que la forma completa o la forma truncada ATP7B Δ1-4.

[0176] Ejemplo 3 - ATP7B Δ1-3-SS es más eficaz en la restauración del metabolismo del cobre en comparación con ATP7B FL

[0177] Este ejemplo describe un experimento que demostró que ATP7B Δ1-3-SS fue más eficaz que ATP7B de longitud completa (ATP7B FL) o ATP7B Δ1-4 para restaurar el metabolismo del cobre en ratones C3He-Atp7b<tx-j>.

[0178] Como se describió anteriormente en el Ejemplo 2, el empaquetamiento de una secuencia de ADNc voluminosa dentro de una cápside de vector AAV puede reducir la integridad de la secuencia de ADN y tener posibles problemas de calidad. Por lo tanto, se empaquetaron versiones truncadas de ATP7B humano dentro de la cápside AAV8 y se probó su eficacia para restaurar el metabolismo del cobre. Se administraron 1,0 x 10<13>GC/kg del vector AAV8 que contenía ATP7B humano de longitud completa o truncado a ratones C3He-Atp7b<tx-j>. Los niveles de cobre en el hígado y la orina se evaluaron mediante espectrometría de masas de plasma acoplado inductivamente. La FIG. 7 es un diagrama de dispersión de los niveles de cobre en orina e hígado, cuadrados y círculos, respectivamente (µg/g), analizados después de que ratones C3He-Atp7b<tx-j>fueran inyectados con AAV8 que contenía ATP7B humano de longitud completa (ATP7B FL), ATP7B Δ1-3-SS o ATP7B Δ1-4. La FIG.7 muestra que ATP7B Δ1-3-SS es más eficaz que ATP7B de longitud completa (ATP7B FL) o ATP7B Δ1-4 para restaurar el metabolismo del cobre en ratones C3He-Atp7b<tx-j>. Los ratones C3He-Atp7b<tx-j>a los que se les administró solución salina tamponada con fosfato (PBS) sirvieron como controles (vehículo).

[0179] Ejemplo 4 - El vector AAV que comprende la cápside AAV9 mostró una mayor producción viral

[0180] Este ejemplo describe un experimento que demostró que la producción de un vector AAV que comprende la cápside AAV9 genera un rendimiento mayor en comparación con la producción de un vector AAV que comprende la cápside AAV8. Se titularon diferentes vectores AAV mediante qPCR cuantificando partículas resistentes a la DNasa (DRP). LaFIG.8muestra el rendimiento total de rAAV (títulos en copias del genoma (GC)) producido a partir de células huésped después de la transfección de un vector AAV (DTC319) que codifica una ATP7B humana truncada, en la que se han eliminado los dominios de unión a metales (MBD) 1-3, pero está presente el bucle rico en serina que incluye dos residuos de serina (S340 y S341) entre MBD3 y MBD4, y cotransfectado con un plásmido que codifica la cápside AAV8 o la cápside AAV9.

[0181] Ejemplo 5 - Propiedades terapéuticas de ATP7B Δ1-3-SS

[0182] Este ejemplo describe estudios en animales que demostraron la eficacia de ATP7B Δ1-3-SS (por ejemplo, DTC319, un vector rAAV que codifica un ATP7B humano truncado, en donde se han eliminado los dominios de unión a metales (MBD) 1-3, pero está presente el bucle rico en serina que incluye dos residuos de serina (S340 y S341) entre MBD3 y MBD4) para mejorar los síntomas y tratar la enfermedad de Wilson (WD) en un modelo de ratón (C3He-Atp7b<tx-j>). En este ejemplo, se evaluaron tres grupos de ratones macho: ratones WD (ratones C3He-Atp7b<txj>) a los que se les administró una infusión de AAV de ATP7B Δ1-3-SS (por ejemplo, DTC319) codificado en un vector AAV8 o una inyección intravenosa de vehículo de control (tampón de dilución), y ratones de tipo silvestre (WT), que sirvieron como control negativo. Para la infusión, el rAAV se produjo mediante transfección transitoria triple de células HEK adherentes y se purificó mediante ultracentrifugación en gradiente de cloruro de cesio, un método de purificación ampliamente conocido. Al finalizar el estudio, 4 semanas después de la infusión, se evaluó la acumulación de cobre en el hígado, la actividad de la ceruloplasmina y la patología hepática en los ratones de cada grupo.

[0183] La acumulación de cobre en el hígado se midió mediante espectrometría de masas de plasma acoplado inductivamente (ICP-MS) y se demostró que el nivel de cobre en el hígado se redujo significativamente en ratones WD a los que se les administró ATP7B Δ1-3-SS (por ejemplo, DTC319) (Verla FIG. 9, barra para DelA), en comparación con el control del vehículo. La FIG.9 muestra los niveles de acumulación de cobre en el hígado (µg/g) en ratones C3He-Atp7b<tx-j>después de que se les administró una inyección intravenosa de un control de vehículo (tampón de dilución, barra para WD) o una infusión de AAV8 que transporta ATP7B Δ1-3-SS nativo (barra para DelA). Los niveles de acumulación de cobre en el hígado de ratones de tipo silvestre (WT) no inyectados, representados en el gráfico de barras, sirvieron como control negativo. Los valores se expresan como promedios ± SEM.

[0184] La actividad de la ceruloplasmina aumentó significativamente en ratones WD después de que se les administró ATP7B Δ1-3-SS (por ejemplo, DTC319) (Verla FIG. 10, barra para DelA). La actividad de la ceruloplasmina se detectó utilizando un ensayo de actividad colorimétrico basado en una reacción enzimática, como es bien conocido en la técnica (VerSchosinsky et. al., Clin Chem. 1974; 20(12):1556-63). La FIG. 10 muestra la actividad de la ceruloplasmina en ratones C3He-Atp7b<tx-j>después de recibir una inyección intravenosa de un control de vehículo (tampón de dilución, barra para WD) o una infusión de AAV de ATP7B Δ1-3-SS codificada en un vector AAV8 (barra para DelA), medida mediante un ensayo de actividad colorimétrico basado en una reacción enzimática. La actividad de la ceruloplasmina en ratones de tipo silvestre (WT) no inyectados, medida mediante el mismo ensayo colorimétrico de actividad basado en la reacción enzimática, también se representa en el gráfico de barras. La gráfica muestra la actividad de la ceruloplasmina medida en densidad óptica, OD a 540 nm. Los valores se expresan como promedios ± SEM.

[0185] Se extrajo el hígado de todos los animales de cada grupo y se tiñó con H&E (tinción de hematoxilina y eosina). Las preparaciones histológicas teñidas con H&E fueron evaluadas por un patólogo certificado para detectar agrandamiento nuclear e hipertrofia hepatocelular, desorganización, infiltrado inflamatorio y necrosis hepatocelular según el sistema de puntuación de 0-4. Se calculó el promedio de las puntuaciones de cada ratón en un grupo. La FIG.11 muestra la puntuación promedio obtenida después de la evaluación estándar de las diapositivas de H&E para los animales en cada grupo.

[0186] Ejemplo 6 - La terapia génica con AAV9 como una terapia viable para la enfermedad de Wilson (WD)

[0187] Este ejemplo describe el uso de partículas rAAV que comprenden ATP7B Δ1-3-SS en el tratamiento de la WD en un sujeto. Un vector AAV que contiene una secuencia de nucleótidos que codifica una ATP7B humana truncada (ATP7B Δ1-3-SS), por ejemplo, DTC319 (FIG. 2), un plásmido Rep/Cap, que codifica cuatro proteínas de replicación viral (Rep) de AAV2 de tipo silvestre y las tres proteínas de la cápside (cap) VP de AAV de tipo silvestre del serotipo 9 (AAV9), y un plásmido auxiliar, como se describe en el Ejemplo 1, se cotransfectan en una célula huésped. Las partículas de rAAV recolectadas se administran posteriormente por vía intravenosa a un sujeto que necesita terapia para la WD. Alternativamente, se administran a un sujeto partículas rAAV que se obtienen de una célula huésped transfectada con el vector representado por la FIG.12, para el tratamiento de la WD.

Claims (15)

1. REIVINDICACIONES

1. Un constructo de ácido nucleico recombinante que comprende:

(a) una secuencia de repetición terminal invertida 5' (ITR) del virus adenoasociado (AAV);

(b) una secuencia promotora;

(c) una secuencia de ácido nucleico que codifica una ATPasa 2 transportadora de cobre humana truncada (ATP7B) (i) que carece de dominios de unión a metales (MBD) 1-3, y en la cual (ii) están presentes al menos los residuos S340 y S341 del bucle rico en serina entre MBD3 y MBD4, y (iii) están presentes los MBD 4-6; y (d) una secuencia 3'-ITR de AAV.

2. El constructo de ácido nucleico recombinante según la reivindicación 1, en donde la secuencia promotora se selecciona de una secuencia promotora de transtiretina (TTR), una secuencia promotora de β-actina de pollo (CBA), una secuencia promotora del gen temprano inmediato de citomegalovirus (CMV), una secuencia promotora de globulina de unión a tiroxina (TBG), una secuencia promotora de alfa-1 antitripsina (A1AT) y una secuencia promotora CAG.

3. El constructo de ácido nucleico recombinante según la reivindicación 1 o 2, en donde la secuencia 5'-ITR y/o la secuencia 3'-ITR son de AAV2.

4. El constructo de ácido nucleico recombinante según una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde el constructo de ácido nucleico recombinante comprende además una o más secuencias potenciadoras seleccionadas de una secuencia potenciadora de transtiretina (enTTR), una secuencia potenciadora del gen temprano inmediato del citomegalovirus (CMV), una secuencia potenciadora de β-actina de pollo (CBA), una secuencia potenciadora En34 y una secuencia potenciadora de apolipoproteína (ApoE).

5. El constructo de ácido nucleico recombinante según la reivindicación 4, en donde la secuencia potenciadora está ubicada aguas arriba de la secuencia promotora.

6. El constructo de ácido nucleico recombinante según una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en donde el constructo de ácido nucleico recombinante comprende además una o más secuencias intrónicas seleccionadas de una secuencia intrónica SV40 Small T, una secuencia intrónica de la subunidad beta de la hemoglobina de conejo (rHBB), una secuencia intrónica S2 de la beta globina IV humana, una secuencia intrónica quimérica de βglobina/IgG y una secuencia intrónica hFIX.

7. El constructo de ácido nucleico recombinante según una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en donde el constructo de ácido nucleico recombinante comprende además una secuencia de la señal de poliadenilación seleccionada de una secuencia de señal de poliadenilación de SV40, una secuencia de la señal de poliadenilación de la hormona de crecimiento bovina (BGH) y una secuencia de la señal de poliadenilación de la beta-globina de conejo.

8. El constructo de ácido nucleico recombinante según una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en donde: a. la secuencia de repetición terminal invertida 5' (ITR) del AAV comprende la secuencia de ácido nucleico establecida en SEQ ID NO:2;

b. el constructo de ácido nucleico recombinante comprende una secuencia potenciadora de SEQ ID NO:3; c. la secuencia promotora comprende la secuencia de ácido nucleico establecida en SEQ ID NO:12;

d. la secuencia de ácido nucleico que codifica la ATP7B humana truncada comprende la secuencia de ácido nucleico establecida en SEQ ID NO:1 o SEQ ID NO:15; y

e. la secuencia AAV 3'-ITR comprende la secuencia de ácido nucleico establecida en SEQ ID NO:2.

9. El constructo de ácido nucleico recombinante según una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, que comprende una secuencia de ácido nucleico que es al menos un 80 % idéntica a la secuencia de ácido nucleico establecida en SEQ ID NO: 14.

10. El constructo de ácido nucleico recombinante según la reivindicación 9, que comprende la secuencia de ácido nucleico establecida en SEQ ID NO:14.

11. Una partícula de virus adenoasociado recombinante (rAAV) que comprende un constructo de ácido nucleico

recombinante según una cualquiera de las reivindicaciones 1-7 o 9-10.

12. La partícula de rAAV según la reivindicación 11, en donde el rAAV es del serotipo AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAVrh10 o AAVhu37.

13. Una célula huésped que comprende un constructo de ácido nucleico recombinante según una cualquiera de las reivindicaciones 1-10 o una partícula de rAAV según una cualquiera de las reivindicaciones 11-12.

14. Una composición que comprende la partícula de rAAV de una cualquiera de las reivindicaciones 11-12, y un portador farmacéuticamente aceptable.

15. Un método para fabricar un rAAV que codifica una ATP7B humana truncada para su uso en el tratamiento de la enfermedad de Wilson que comprende administrar un vector que comprende el constructo de ácido nucleico recombinante de una cualquiera de las reivindicaciones 1-10 a un cultivo de células huésped eucariotas y recolectar el rAAV del cultivo de células eucariotas.