ES3070243T3 - Uso de exosomas vegetales para mejorar la viabilidad y la capacidad de crecimiento capilar de células cutáneas - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere al uso de exosomas vegetales como producto para mejorar la viabilidad y, mediante la estimulación de los folículos pilosos, potenciar el crecimiento del cabello en las células de la piel. El objetivo de la invención es revitalizar y fortalecer la piel y el cabello debilitados que han perdido su vitalidad, detener la caída del cabello, acelerar su crecimiento mediante la estimulación de los folículos pilosos y regular la apariencia de arrugas y manchas causadas por el envejecimiento de la piel. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

[0001] DESCRIPCIÓN

[0002] Uso de exosomas vegetales para mejorar la viabilidad y la capacidad de crecimiento capilar de células cutáneasCampo técnico de la invención

[0003] La presente invención se refiere al uso de exosomas vegetales como un producto que tiene el efecto de mejorar la viabilidad y, mediante la estimulación de los folículos pilosos, mejorar el crecimiento capilar en células cutáneas.Estado de la técnica anterior

[0004] Las células de mamífero incluyen pequeñas estructuras vesiculares denominadas exosomas. Cuando estos exosomas se aíslan de células sanas, pueden utilizarse para devolver las células que están dañadas o sometidas a un cierto estrés y que no pueden completar su autorregeneración a su estado sano anterior [1]. Recientemente, el uso de células madre en terapias basadas en células es también uno de los estudios más prometedores. Se afirma que el uso de los exosomas liberados por estas células tendrá efectos positivos sobre la cicatrización de heridas y el crecimiento/fortalecimiento capilar en la aplicación clínica [2].

[0005] Las vesículas son pequeños sacos que participan en el transporte y almacenamiento de sustancias dentro de la célula y están separados del fluido citoplasmático por al menos una bicapa lipídica. Los exosomas son vesículas que son liberadas por muchos organismos, desde procariotas hasta eucariotas superiores y plantas, y que contienen vesículas de bicapa lipídica de diferentes tamaños [3]. La importancia de estas vesículas reside en la capacidad de transferir información a las otras células con el fin de influir en la función celular. La transferencia de señales a través de exosomas se lleva a cabo por medio de biomoléculas de muchas categorías diferentes, que consisten en proteínas, lípidos, ácido nucleico y azúcares [4].

[0006] Las interacciones funcionales de las vesículas extracelulares con células se descubrieron por primera vez en 1982 al determinarse experimentalmente que las vesículas aisladas de plasma seminal aumentan la motilidad espermática [5]. A partir de este momento, se han realizado estudios en muchos tejidos diferentes hasta la actualidad sobre los desarrollos relacionados con el mecanismo molecular de las vesículas y sobre la aclaración de las cuestiones que permanecían sin resolver.

[0007] La pérdida capilar intensa es un problema que puede encontrarse tanto en hombres como en mujeres.

[0008] Existen muchas causas de este problema dependiendo de hormonas, edad, estrés y deficiencia de minerales [6]. Aunque no existe ningún estudio realizado en células con respecto a los efectos de viabilidad y estimulación del crecimiento capilar de los exosomas vegetales relacionados con la piel y el cabello, se han comenzado a estudiar la caracterización de los exosomas vegetales y sus efectos sobre células cancerosas [7].

[0009] El documento de solicitud de patente europea n.º EP3354257, una solicitud en el estado de la técnica, divulga una composición que comprende vesículas extracelulares derivadas de extracto vegetal y se usa para mejorar la piel y prevenir la pérdida capilar. Dicha solicitud divulga los efectos de las vesículas obtenidas pasando el zumo vegetal filtrado a través de diferentes centrifugadoras. El método de aislamiento de exosomas implica aislamiento mediante técnica de ultracentrifugación, que “no se considera puro” en la literatura.

[0010] El documento de solicitud de patente de Estados Unidos n.º US2018256488, una solicitud en el estado de la técnica, divulga una composición para prevenir la pérdida capilar y promover el crecimiento capilar, que contiene vesículas similares a exosomas derivadas de ginseng.

[0011] Los documentos numerados EP2629782A1, WO2017023690A1, WO2017078641A1 y WO2017057881A1 también son documentos conocidos en la técnica relacionados con el uso de exosomas para promover el crecimiento capilar. Otras composiciones que contienen exosomas para prevenir la pérdida capilar o promover el crecimiento capilar se divulgan en WO 2017/052271 A1 y CN 106974221 A.

[0012] Los problemas en las solicitudes en el estado de la técnica pueden enumerarse como sigue:

[0013] • Muchas sustancias utilizadas como promotores del crecimiento capilar son productos químicos y tienen efectos tóxicos.

[0014] • La obtención de los exosomas utilizados como promotores del crecimiento capilar a partir de células animales y su uso no son éticamente apropiados.

[0015] • Los efectos secundarios resultantes del hecho de que los productos que afirman promover el crecimiento capilar y el rejuvenecimiento de la piel sean productos químicos se extienden a enfermedades cardíacas e insuficiencia renal.

[0016] • Las dosis elevadas utilizadas para obtener un resultado eficaz son tóxicas e irritantes para la piel.

[0017] Resumen de la invención

[0018] El objetivo de la invención es permitir revitalizar y fortalecer la piel y el cabello no sanos que han perdido su vitalidad, detener la pérdida capilar, proporcionar un crecimiento capilar más rápido mediante la estimulación de los folículos pilosos, y proporcionar un efecto regulador en la mejora de efectos tales como arrugas y manchas de la edad causados por el envejecimiento de las células cutáneas.

[0019] Descripción detallada de la invención

[0020] “Uso de exosomas vegetales para mejorar la viabilidad y la capacidad de crecimiento capilar de células cutáneas”, desarrollado para cumplir los objetivos de la presente invención, se ilustra en las figuras adjuntas, en las que:

[0021] Figura 1. es una representación gráfica de la evaluación del efecto de la administración de los exosomas obtenidos de ajo a células cutáneas a diferentes concentraciones durante 24 horas sobre la viabilidad celular usando el ensayo MTS.

[0022] Figura 2. es una representación gráfica de la evaluación del efecto de la administración de los exosomas obtenidos de piña a células cutáneas a diferentes concentraciones durante 24 horas sobre la viabilidad celular usando el ensayo MTS.

[0023] Figura 3. es una representación gráfica de la evaluación del efecto de la administración de los exosomas obtenidos de granada a células cutáneas a diferentes concentraciones durante 24 horas sobre la viabilidad celular usando el ensayo MTS.

[0024] Figura 4. es una representación gráfica de la evaluación del efecto de la administración de exosomas de ajo-piñagranada a concentraciones no tóxicas durante 24 horas sobre la viabilidad celular usando el ensayo MTS. Figura 5. es una representación gráfica de la evaluación de la administración de las mezclas obtenidas a partir de exosomas vegetales y exosoma de células madre a células cutáneas sobre los niveles de expresión génica de TGF-B 1.

[0025] Figura 6. es una representación gráfica de la evaluación de la administración de las mezclas obtenidas a partir de exosomas vegetales y exosoma de células madre a células cutáneas sobre los niveles de expresión génica de WNT5a.

[0026] Figura 7. es una representación gráfica de la evaluación de la administración de las mezclas obtenidas a partir de exosomas vegetales y exosoma de células madre a células cutáneas sobre los niveles de expresión génica de Shh.

[0027] La presente invención se refiere a exosomas vegetales como un producto que tiene el efecto de mejorar la viabilidad y, mediante la estimulación de los folículos pilosos, mejorar el crecimiento capilar en células cutáneas, según la reivindicación 1. La presente invención también se refiere a un método para el aislamiento de los exosomas vegetales, según la reivindicación 5, así como a usos no terapéuticos y terapéuticos según las reivindicaciones 6 y 7, respectivamente.

[0028] Dentro del alcance de la invención, se pretende mejorar la viabilidad y la capacidad de crecimiento capilar de células cutáneas, y para este propósito se usan exosomas de origen vegetal. Los efectos de los exosomas vegetales de la presente invención pueden variar según la planta de la que se aísle el exosoma.

[0029] Los exosomas vegetales pueden aislarse mediante muchos métodos tales como aislamiento por separación en dos fases, centrifugación graduada, ultrafiltración, métodos cromatográficos, aislamiento basado en polímeros y aislamiento mediante microperlas.

[0030] Entre las diferentes aplicaciones enumeradas anteriormente para aislar exosomas de plantas, el aislamiento con un sistema líquido de dos fases, que proporciona el aislamiento de exosomas más puro, constituye el alcance de la invención. Dentro del alcance de la invención, los exosomas se aíslan de piña, granada y ajo.

[0031] El sistema líquido de dos fases se utiliza para el aislamiento de exosomas a partir de lisado vegetal, comprendiendo dicho sistema las etapas de retirar las partículas de gran tamaño y las impurezas resultantes de la desintegración vegetal mediante centrifugación realizada entre 2.000 g y 10.000 g durante 5-20 minutos, filtrar para retirar las partículas de tamaño igual o superior a 220 nanómetros, y separar la mezcla homogénea de exosomas-proteína obtenida. Los exosomas se limpian de proteínas no exosómicas, grasas celulares y otras impurezas utilizando la tendencia química de la fase PEG hacia las proteínas y de la fase DEX (dextrano) hacia las membranas estructuradas de fosfolípidos en el sistema líquido de dos fases.

[0032] Dentro del alcance de la invención, no solo se divulga el efecto de un exosoma vegetal, sino el uso de concentraciones específicas de 3 plantas.

[0033] Se observa que los efectos de los exosomas vegetales cuando se usan solos no son tan elevados como cuando se usan en combinación. En otras palabras, ningún exosoma vegetal es suficiente para promover el crecimiento capilar y la vitalidad de la piel. Además, el alcance de la invención implica el efecto no solo de promover el crecimiento capilar, sino también la vitalidad y el rejuvenecimiento de células cutáneas. En consecuencia, el alcance de la invención implica mezclar los exosomas vegetales en una solución como diversos productos de cuidado personal tales como cremas y champús, según la reivindicación 5.

[0034] El hecho de que los exosomas vegetales de la presente invención tengan efectos de mejora de la viabilidad y promoción del crecimiento capilar sobre células de la piel y del cabello indica que pueden servir como reguladores para revitalizar y fortalecer la piel y el cabello no sanos donde las células de la piel y del cabello han perdido su vitalidad, detener la pérdida capilar, proporcionar un crecimiento capilar más rápido y mejorar efectos tales como arrugas y manchas de la edad causados por el envejecimiento de las células cutáneas.

[0035] Las dosis eficaces de los exosomas vegetales dentro del alcance de la invención son las siguientes.

[0036] Las proporciones de composición en una combinación triple son las siguientes:

[0037] - Piña: 1 miligramo - 1 nanogramo

[0038] - Ajo: 10 miligramos - 1 nanogramo

[0039] - Granada: 1 miligramo - 1 nanogramo

[0040] Además, se contempla y discute dentro del alcance de la invención que la combinación de los exosomas vegetales extraídos de estas plantas puede usarse con otros exosomas extraídos de plantas.

[0041] Las ventajas de usar los exosomas vegetales de la presente invención para mejorar la viabilidad y la capacidad de crecimiento capilar de células cutáneas pueden enumerarse como sigue:

[0042] • La mezcla de exosomas vegetales que se usa mejora la regeneración de los folículos pilosos en las células cutáneas.

[0043] • Mejora la viabilidad y regeneración de las células cutáneas.

[0044] • Induce el crecimiento capilar en los folículos pilosos.

[0045] • Desempeña un papel en la eliminación de arrugas en la piel y en la recuperación de la piel envejecida, ya que mejora la viabilidad celular.

[0046] • La dosis especificada en esta mezcla tiene un efecto sustancial en la eliminación de signos de envejecimiento, arrugas y manchas de la edad.

[0047] • Permite mejorar la viabilidad de las células capilares y un crecimiento capilar más rápido y sano mediante la estimulación de los folículos pilosos.

[0048] • Al mismo tiempo, la mezcla de exosomas vegetales permite el recrecimiento del cabello, ya que el folículo piloso latente se vuelve activo, puesto que la mezcla proporciona un aumento en el gen TGFB1.

[0049] • El hecho de que el producto sea de origen vegetal aumenta su usabilidad.

[0050] ESTUDIOS EXPERIMENTALES

[0051] Se prefiere usar un sistema líquido de dos fases para separar la mezcla homogénea de exosomas-proteína obtenida como resultado de las etapas de preparación. Los exosomas se limpian de proteínas no exosómicas, grasas celulares y otras impurezas utilizando la tendencia química de la fase PEG hacia las proteínas y de la fase DEX hacia las membranas estructuradas de fosfolípidos en el sistema líquido de dos fases. La fase DEX formada por medio de las concentraciones de los polímeros que se usan en la solución separa los exosomas. Los exosomas aislados se marcaron mediante los anticuerpos de los marcadores de superficie CD9, CD63 y HSP70 que son portados por los exosomas, y los exosomas que portaban estos marcadores se midieron mediante un dispositivo de citometría de flujo. Al mismo tiempo, las dimensiones de los exosomas aislados se midieron por medio de un dispositivo Zeta Sizer, y los resultados son los que se observan en las Figuras 1-3.

[0052] Se realizó un análisis de toxicidad para determinar los efectos de los exosomas vegetales sobre la viabilidad de células cutáneas. Después de sembrar las células en placas de cultivo de 96 pocillos (Corning Glasswork, Corning, NY) a 5000 células/pocillo en medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) que contenía 10 % de suero fetal bovino empobrecido en exosomas (Invitrogen) y 1 % de PSA (Biological Industries, Beit Haemek, Israel) en el medio de cultivo, los niveles de viabilidad de las células se midieron en los días 1, 2 y 3. La viabilidad celular se midió usando el método de 3-(4,5-dimetil-tiazol-2-il)-5-(3-carboxi-metoxi-fenil)-2-(4-sulfo-fenil)-2H-tetrazolio (MTS) (CellTiter96 AqueousOne Solution; Promega, Southampton, UK). Se añadieron 10 µl de solución MTS sobre las células dentro de un medio de 100 µl y se incubaron a 37 °C en oscuridad durante 2 horas. Después del proceso de incubación, se observó la viabilidad celular realizando una medición de absorbancia mediante un dispositivo lector de placas ELISA (Biotek, Winooski, VT) a una longitud de onda de 490 nm.

[0053] Al mismo tiempo, se midieron los niveles de expresión de los genes relacionados con la viabilidad celular y el crecimiento capilar con el fin de determinar el efecto de los exosomas en la promoción de la viabilidad y el crecimiento capilar. Las células cultivadas pueden perder sus propias propiedades y adquirir nuevas propiedades. Estas propiedades pueden estar tanto a nivel morfológico como a nivel de expresión génica. Se aplicó el método de PCR en tiempo real para observar los cambios en el nivel de expresión génica. Se aislaron ARN totales y se sintetizó ADNc a partir de las células que se sembraron en placas de cultivo de 6 pocillos (Corning Glasswork, Corning, NY) a 50.000 células/pocillo en medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM). Los ADNc sintetizados se mezclaron con cebadores en el producto de mezcla Fermentas Maxima SYBR Green de manera que el volumen final fuera de 20 µl, y los niveles de expresión de los genes se analizaron usando un dispositivo BIO-RAD.

[0054] Como también puede observarse en las figuras, las dosis de los exosomas vegetales requeridas para inducir el crecimiento capilar se determinaron según los resultados de los ensayos de toxicidad y viabilidad celular mostrados en las Figuras 1-4. En estas figuras, se determinan las dosis que mejoran la viabilidad de las células cutáneas a un nivel máximo. Al mismo tiempo, en las Figuras 5-8, se examinaron los efectos de la aplicación de exosomas vegetales sobre los niveles de expresión de los genes Sonic hedgehog (Shh) [8], que se usa en la determinación del folículo piloso en la célula cutánea, WNT5a [9], que aumenta la regeneración del folículo piloso, y TGFB 1, que es responsable del crecimiento de los folículos pilosos, y se ha demostrado que la mezcla de exosomas vegetales que se usa es eficaz sobre estos genes.

[0055] REFERENCIAS

[0056] [1]. Beach, A., Zhang, H. G., Ratajczak, M. Z., & Kakar, S. S. (2014). Exosomes: an overview of biogenesis, composition and role in ovarian cancer. Journal of ovarian research, 7(1), 1-11.

[0057] [2]. Levi, S. K., Yeo, M. S. W., Chen, T. S., & Lai, R. C. (2011). U.S. Patent Application 13/879,905.

[0058] [3]. Ludwig, A. K. and B. Giebel (2012). "Exosomes: small vesicles participating in intercellular communication." Int J Biochem Cell Biol 44(1): 11-15.

[0059] [4]. Iraci, N., T. Leonardi, F. Gessler, B. Vega and S. Pluchino (2016). "Focus on Extracellular Vesicles: Physiological Role and Signalling Properties of Extracellular Membrane Vesicles." Int J Mol Sci 17(2): 171.

[0060] [5]. Stegmayr, B. and G. Ronquist (1982). "Promotive effect on human sperm progressive motility by prostasomes." Urol Res 10(5): 253-257.

[0061] [6]. Norwood, O. T. (1975). Male pattern baldness: classification and incidence. Southern medical journal, 68(11), 1359-1365.

[0062] [7]. Raimondo S, Naselli F, Fontana S, et al. Citrus limon-derived nanovesicles inhibit cancer cell proliferation and suppress CML xenograft growth by inducing TRAIL-mediated cell death. Oncotarget.2015;6(23):19514-19527.

[0063] [8]. Paladini, Rudolph D., et al. "Modulation of hair growth with small molecule agonists of the hedgehog signaling pathway." Journal of investigative dermatology 125.4 (2005): 638-646.

[0064] [9]. Xing Y, Ma X, Guo H, Deng F, Yang J, Li Y. Wnt5a Suppresses β-catenin Signaling during Hair Follicle Regeneration. International Journal of Medical Sciences.2016;13(8):603-610. doi:10.7150/ijms.15571.

[0065] [10]. Mori, Osamu, Hiroshi Hachisuka, and Yoichiro Sasai. "Effects of transforming growth factor β1 in the hair cycle." The Journal of dermatology 23.2 (1996): 89-94.

Claims (7)

1. REIVINDICACIONES

1. Exosomas vegetales en una combinación triple que comprende 1 miligramo - 1 nanogramo de exosomas vegetales aislados de planta de piña, 10 microgramos - 1 nanogramo de exosomas vegetales aislados de planta de ajo, y 1 miligramo - 1 nanogramo de exosomas vegetales aislados de planta de granada, adecuados para mejorar la viabilidad y el crecimiento capilar en células cutáneas.

2. Exosomas vegetales según la reivindicación 1, caracterizados porque se aíslan mediante un método de aislamiento seleccionado de un grupo que comprende los métodos de aislamiento de separación en dos fases, centrifugación graduada, ultrafiltración, métodos cromatográficos, aislamiento basado en polímeros y aislamiento mediante microperlas.

3. Exosomas vegetales según la reivindicación 2, caracterizados porque se aíslan mediante el método de aislamiento por sistema líquido de dos fases.

4. Exosomas vegetales según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizados porque se mezclan en una solución como productos de cuidado personal.

5. Método para el aislamiento de los exosomas vegetales según la reivindicación 1 con un sistema líquido de dos fases, que se realiza para el aislamiento de los exosomas vegetales según la reivindicación 1 a partir de lisado vegetal, que comprende las etapas de:

- retirar las partículas de gran tamaño y las impurezas resultantes de la desintegración vegetal mediante centrifugación realizada entre 2.000 g y 10.000 g durante 5-20 minutos,

- filtrar para retirar las partículas de tamaño igual o superior a 220 nanómetros, y

- separar la mezcla homogénea de exosomas-proteína obtenida.

6. Uso no terapéutico de exosomas vegetales según la reivindicación 1 para mejorar la viabilidad y promover el crecimiento capilar en células cutáneas.

7. Exosomas vegetales según la reivindicación 1 para su uso en el tratamiento de células cutáneas para mejorar la viabilidad y promover el crecimiento capilar.