ES3059313T3 - Compositions and methods for the selective detection of tumor-derived viral dna - Google Patents

Abstract

La presente divulgación proporciona métodos y composiciones de combinaciones de cebadores y sondas de oligonucleótidos modificados, modificados estructuralmente con ácidos nucleicos bloqueados, agentes extintores y colorantes, eficaces para detectar el virus del papiloma humano (VPH) derivado de tumores y el virus de Epstein-Barr (VEB) derivado de tumores y, especialmente, para distinguir el ADN viral derivado de tumores del ADN viral derivado de partículas virales infecciosas. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

[0001] DESCRIPCIÓN

[0002] Composiciones y métodos para la detección selectiva de ADN viral derivado de tumores

[0003] REFERENCIA CRUZADA A LA SOLICITUD RELACIONADA CAMPO

[0004] Esta divulgación se relaciona con la detección de ácidos nucleicos virales en fluidos corporales con el propósito de detectar cáncer o precáncer.

[0005] ANTECEDENTES

[0006] Se sabe que los virus promueven el desarrollo de cánceres. Por ejemplo, la infección con cepas de alto riesgo del virus del papiloma humano (VPH) se asocia con cánceres de cuello uterino, cabeza/cuello, ano, vulva o pene. Otros ejemplos de virus asociados con el desarrollo de cáncer incluyen el virus de la hepatitis B (VHB), el virus de la hepatitis C (VHC), el virus linfotrópico T humano 1 (HTLV1), el virus de Epstein-Barr (VEB), el citomegalovirus (CMV), el retrovirus endógeno humano tipo K (HERV-K), el virus de células de Merkel, el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) y el virus del herpes del sarcoma de Kaposi (VHSK). Dado que el ADN tumoral circulante (ADNtc) es liberado por las células cancerosas moribundas, estos ácidos nucleicos virales pueden ser detectables en la sangre de pacientes con el tipo de cáncer correspondiente.

[0007] Si bien existe un interés significativo en detectar ácidos nucleicos virales en fluidos corporales con el fin de detectar el cáncer, existen dos desafíos importantes asociados con este concepto. En primer lugar, la cantidad de ADN derivado de tumores circulante (ADNtc) en sangre, orina o saliva es extremadamente baja, a menudo del orden de unas pocas moléculas por mL de sangre. En segundo lugar, los ácidos nucleicos virales presentes en la circulación comúnmente no derivan de virus asociados a tumores, sino de viriones liberados de tejidos no tumorales. Esto se establece por el hallazgo de que se han identificado secuencias de ADN de muchos tipos diferentes de virus en la sangre de voluntarios sanos (Moustafa et al., PLoS Pathog. 2017 13(3):e1006292). Dado este hallazgo, la detección de secuencias virales en la circulación es, por sí sola, insuficiente para concluir que un paciente tiene un cáncer asociado con ese virus, ya que la secuencia viral detectada bien puede derivar de tejidos normales, no tumorales dentro del paciente.

[0008] Por ejemplo, cualquier secuencia viral detectada en una muestra de sangre podría estar asociada únicamente con la infección viral en sí y no tener relación con la carga tumoral en el huésped. Este importante factor de confusión plantea un desafío significativo para el uso del ADN viral circulante como marcador específico para la detección del cáncer. Las personas con ADN viral detectable en la circulación podrían simplemente estar infectadas con el virus y no presentar cáncer ni precáncer.

[0009] En consonancia con esto, se han descrito métodos basados en PCR para detectar ADN de VPH en la circulación de pacientes con preneoplasia o cánceres asociados al VPH, pero estos métodos también detectan ADN de VPH en la sangre de una proporción sustancial de pacientes que no tienen un diagnóstico de cáncer VPH+ (Bodaghi et al., J Clin Microbiol.

[0010] 2005 43(11):5428-5434; Cocuzza et al., PLoS One. 2017 12(11):e0188592; Ferreira et al., Pathol Res Pract. 2017 213(7):759-765; Chen et al., J Med Viral.200981(10):1792-1796). Por lo tanto, dado que la presencia del virus VPH en la circulación de una persona podría deberse a una infección de tejidos normales, su detección no indica necesariamente que una persona tenga un cáncer asociado al VPH. Debido a que los métodos de detección por PCR disponibles actualmente no pueden distinguir entre el ADN del VPH derivado de tumores y el ADN del VPH derivado de tejido normal infectado con el virus, carecen de la especificidad suficiente para permitir la detección temprana de cánceres asociados al VPH.

[0011] Por ejemplo, los métodos basados en PCR para la detección del VPH han demostrado una sensibilidad de solo alrededor del 54 % para detectar pacientes con cánceres asociados al VPH, lo cual es insuficiente para ser clínicamente útil para distinguir a los pacientes que necesitan una evaluación adicional de aquellos que no la necesitan (Jensen et al., Clin Otolaryngol. 15 de mayo de 2018; Higginson et al., Int J Radiat Oneal Biol Phys. 201593(3):S78-S-79; Cao et al., Int J Radiat Oncol Biol Phys. 201282(3):e351-358; Dahlstrom et al., Cancer. 2015121(19):3455-3464). CN 110592279 A describe una composición, un kit de reactivos y un método para detectar el VPH.

[0012] RESUMEN

[0013] La presente invención se define mediante las reivindicaciones independientes. Las reivindicaciones dependientes describen formas de realización adicionales de la invención.

[0014] La presente divulgación proporciona métodos y composiciones de combinaciones de cebadores y sondas de oligonucleótidos de ADN, modificados estructuralmente con ácidos nucleicos bloqueados, extintores y Tintes, eficaces para detectar ADN viral derivado de tumores, por ejemplo, VPH, y, especialmente, para distinguir el ADN viral derivado de tumores del ADN viral derivado de partículas virales infecciosas.

[0015] Los métodos de amplificación de ADN y las composiciones de cebadores/sondas estructuralmente modificados que se describen en este documento detectan cuantitativamente ADN viral tumoral en una muestra. Los métodos y composiciones descritos distinguen entre ADN viral tumoral y ADN viral de origen no tumoral, por ejemplo, de partículas virales infecciosas. En particular, se describen métodos y composiciones para detectar o monitorizar una neoplasia maligna asociada al virus del papiloma humano (VPH) en un sujeto. Dichos métodos implican la detección de la presencia o ausencia de al menos un ADN tumoral circulante del VPH de un rango de tamaño específico en una muestra del sujeto. También se proporcionan composiciones y kits para llevar a cabo estos métodos.

[0016] En un aspecto, la divulgación proporciona composiciones para detectar el virus del papiloma humano tipo 16 (VPH16) derivado de tumor en una muestra de un sujeto, en donde una composición incluye (o consiste en) una tríada, por ejemplo, tres, de conjuntos de cebadores/sondas de oligonucleótidos modificados que incluyen: conjuntos de cebadores/sondas numerados 3, 5 y 7 como se muestra en la Tabla 14 para VPH16; en donde el conjunto de cebadores/sondas de la tríada numerada 3 como se muestra en la Tabla 14 para VPH16 está configurado para producir una primera señal de amplicón, en donde el conjunto de cebadores/sondas de la tríada numerada 5 como se muestra en la Tabla 14 para VPH16 está configurado para producir una segunda señal de amplicón, en donde el conjunto de cebadores/sondas de la tríada numerada 7 como se muestra en la Tabla 14 para VPH16 está configurado para producir una tercera señal de amplicón. Como se describió anteriormente, si se seleccionan tres conjuntos de cebadores/sondas numerados 3, 5 y 7 de una tabla, por ejemplo, la Tabla 14, el conjunto 3 es el "primer conjunto de cebadores/sondas", el conjunto 5 es el "segundo conjunto de cebadores/sondas" y el 7 es el "tercer conjunto de cebadores/sondas". El número más pequeño del conjunto siempre corresponde al primer conjunto y el más grande al tercero; por lo tanto, el número del medio siempre corresponde al segundo conjunto.

[0017] En diversas formas de realización, las composiciones descritas en este documento pueden incluir además uno o más grupos reporteros, como Tintes reporteros, p. ej., FAM, HEX, VIC, Cy5TM o Cy5.5. Por ejemplo, la sonda de detección 5 de la Tabla 14 puede conjugarse con el grupo reportero HEX, y las sondas de detección 3 y 7 de la Tabla 14 pueden conjugarse con el grupo reportero FAM. En otro ejemplo, la sonda de detección 7 de la Tabla 14 puede conjugarse con el grupo reportero FAM.

[0018] En otro aspecto, la divulgación proporciona métodos para detectar el virus del papiloma humano tipo 16 (VPH16) derivado de un tumor en una muestra de un sujeto, incluyendo los métodos proporcionar tríadas de cualquiera de los conjuntos de cebadores/sondas de oligonucleótidos modificados de cualquiera de las composiciones descritas anteriormente como se recita en los conjuntos de cebadores/sondas numerados 3, 5 y 7 en la Tabla 14; fraccionar una pluralidad de fragmentos de ADN de VPH de la muestra en gotitas a una concentración en la que solo 0 o 1 molécula de los fragmentos de ADN está presente en cada gotita; amplificar el ADN de VPH en cada gotita con la tríada de conjuntos de cebadores/sondas para producir señales de amplicón; y detectar en cada gotita cualquier señal de amplicón; en donde la detección dentro de una gotita del segundo amplicón, pero no del primero o tercer amplicón, indica que el fragmento de ADN de VPH fraccionado en la gotita es un fragmento de ADN de VPH derivado de un tumor.

[0019] En todos los métodos descritos en este documento, los fragmentos de ADN se pueden fraccionar en microgotas mediante emulsificación y/o el ADN se puede amplificar utilizando un método basado en PCR.

[0020] En todos los métodos descritos en este documento, la muestra puede ser una muestra de sangre, saliva, gárgaras u orina, por ejemplo, una muestra de sangre.

[0021] En otros aspectos, la divulgación proporciona métodos para detectar VPH16 derivado de tumor, en una muestra de un sujeto utilizando una composición de oligonucleótidos de cebadores y sondas que incluye una tríada de conjuntos de cebadores/sondas numerados 3, 5 y 7 de la Tabla 14, en donde el conjunto de cebadores/sondas numerado 3 como se muestra en la Tabla 14 para VPH16, que consiste en dos cebadores y una sonda, está configurado para producir una primera señal de amplicón, en donde el conjunto de cebadores/sondas numerado 5 como se muestra en la Tabla 14 para VPH16, que consiste en dos cebadores y una sonda, está configurado para producir una segunda señal de amplicón, en donde el conjunto de cebadores/sondas numerado 7 como se muestra en la Tabla 14 para VPH16, que consiste en dos cebadores y una sonda, está configurado para producir una tercera señal de amplicón; fraccionar fragmentos de ADN de una muestra del sujeto en gotitas a una concentración en donde solo 0 o 1 fragmentos de ADN están presentes en cada gotita; amplificar el ADN en cada gota con la serie de conjuntos de cebadores/sondas para producir las señales de amplicón; y detectar en cada gota el número de señales de amplicón, en donde la detección del segundo amplicón pero no del primero o del tercer amplicón es una indicación de que el sujeto tiene VPH16 derivado de tumor.

[0022] Se conocen métodos para la fragmentación de ADN en gotitas para PCR digital, que incluyen el fraccionamiento en microgotitas mediante emulsificación. En algunas formas de realización, el ADN se fracciona según su tamaño antes de realizar la emulsificación en microgotitas. Esto puede hacerse, por ejemplo, para aislar diversos fragmentos de ADN para su cuantificación por tamaño.

[0023] Los fragmentos de ADN se pueden amplificar utilizando cualquier método conocido, como un método PCR o un método no PCR.

[0024] En algunas formas de realización, el sujeto nunca ha sido diagnosticado ni ha padecido una neoplasia maligna asociada al VPH o al VEB. En otras formas de realización, el sujeto ha recibido tratamiento previo para una neoplasia maligna asociada al VPH.

[0025] Los métodos descritos también pueden utilizarse para monitorizar el tratamiento. Por lo tanto, se describe un método para monitorizar el cáncer o la neoplasia maligna asociada al VPH en un sujeto, que consiste en cuantificar el ADN viral del VPH libre de células tumorales en muestras de sangre recogidas en dos o más momentos durante el tratamiento de un sujeto para la neoplasia maligna asociada al VPH mediante los métodos descritos. En algunas de estas formas de realización, la presencia del ADN viral del VPH libre de células tumorales en muestras recogidas posteriormente puede indicar que el sujeto en tratamiento para un cáncer o una neoplasia maligna asociada al VPH tendrá una mayor probabilidad de recurrencia de dicha neoplasia. Asimismo, en algunas de estas formas de realización, la rápida eliminación o ausencia de dicho ADN viral del VPH libre de células tumorales en muestras recogidas posteriormente puede indicar que el sujeto en tratamiento para la neoplasia maligna asociada al VPH tendrá una menor probabilidad de recurrencia de dicha neoplasia. En estos casos, el método también puede implicar además tratar al sujeto con una reducción en la radioterapia y/o quimioterapia si el sujeto muestra una eliminación rápida o una ausencia de las secuencias de ADN libre de células derivadas del tumor del VPH en muestras recolectadas en puntos posteriores durante el curso del tratamiento. Según aspectos del método descrito, el análisis longitudinal de ácidos nucleicos virales de origen tumoral en sangre puede utilizarse para la detección temprana de cánceres positivos para el virus en personas que no presentan síntomas relacionados con su malignidad o en quienes los médicos aún no han identificado dichos síntomas. Como se demuestra en este documento, el método descrito permite niveles de sensibilidad y especificidad inalcanzables previamente para la detección de ácidos nucleicos virales de origen tumoral circulantes, lo cual es aplicable a pacientes con cánceres positivos para el VPH+.

[0026] En algunas formas de realización, los métodos descritos se pueden aplicar para determinar la probabilidad de diagnóstico inicial o recurrencia de un cáncer asociado a un virus, que comprende detectar la presencia o ausencia de al menos un marcador de ácido nucleico tumoral circulante para el virus relevante en muestras de sangre recolectadas de un sujeto en un solo punto de tiempo o longitudinalmente a lo largo del tiempo.

[0027] En algunas formas de realización, los métodos descritos se pueden aplicar para seleccionar tratamientos para el carcinoma de células escamosas orofaríngeo (OPSCC) u otro cáncer asociado a virus, que comprende detectar la presencia o ausencia de al menos un ADN del virus del papiloma humano (VPH) derivado de tumor circulante en muestras recolectadas antes de comenzar el tratamiento y/o en varios puntos en el tiempo durante el tratamiento de un sujeto diagnosticado con OPSCC o que está siendo tratado por OPSCC, en donde la presencia y/o cantidad de dicho ADN del VPH derivado de tumor circulante en muestras recolectadas en puntos posteriores en el tiempo es indicativa de que el sujeto que está siendo tratado por OPSCC tendrá una mayor probabilidad de recurrencia de OPSCC.

[0028] Alternativamente, la eliminación rápida o la ausencia de dicho ADN del VPH circulante derivado del tumor en muestras recolectadas en puntos posteriores en el tiempo es indicativa de que el sujeto que está siendo tratado para OPSCC tendrá una menor probabilidad de recurrencia de OPSCC, y tratar al sujeto con una reducción de la radioterapia y/o quimioterapia si el sujeto muestra una rápida eliminación o una ausencia de dicho marcador de ácido nucleico tumoral circulante para VPH en un punto específico en el tiempo después de iniciar la terapia contra el cáncer.

[0029] Los detalles de una o más formas de realización de la invención se exponen en los dibujos adjuntos y en la descripción que figura a continuación. Otras características, objetivos y ventajas de la invención se desprenderán de la descripción, los dibujos y las reivindicaciones.

[0030] DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS FIGS.1A y 1B: FIG.1A) Ensayo de doble fragmento de VPH16 para detectar ADN viral tumoral. Se muestran los gráficos de detección de fluorescencia por PCR digital para la detección simultánea de dos fragmentos distintos del genoma de VPH16. Se muestran ejemplos para los controles positivos simples, el control positivo de doble fragmento, el control de genoma de VPH intacto y dos muestras de ADN plasmático de pacientes. Se muestran las puertas utilizadas para cuantificar las gotas positivas simples y dobles, como se describe en los métodos.FIG.1B) El análisis de 12 muestras de ADN plasmático de pacientes con cáncer orofaríngeo VPH+ mediante este ensayo demuestra uniformemente la presencia de ADN viral tumoral, indicado por la abundancia de ambos fragmentos en gotas positivas simples y la muy rara coocupación de ambos objetivos en la misma gota (a diferencia del control de genoma intacto).

[0031] FIG.2:Análisis de una gran cohorte de muestras de sangre de pacientes mediante el análisis de sangre para VPH descrito en el Ejemplo 1. No se detectó ADN viral tumoral de VPH en 30 voluntarios sanos ni en 50 pacientes con cánceres negativos para VPH (de mama y de páncreas). Por el contrario, 95/102 pacientes con diagnóstico de cáncer de orofaringe positivo para VPH presentaron ADN tumoral circulante en plasma antes del tratamiento, según el análisis de sangre descrito. También se indica el número observado de copias de ADN del VPH detectadas por el análisis, lo que destaca el rango dinámico de la prueba. Con base en estos datos, las estimaciones de especificidad y sensibilidad del análisis son del 100 % y del 93 %, respectivamente, en el momento del diagnóstico inicial.

[0032] FIGS.3A-3D: FIG.3A) Esquema de los puntos temporales en los que se tomaron muestras de sangre en una cohorte de pacientes con cáncer orofaríngeo antes, durante y después de recibir quimiorradioterapia (QRT).FIG.3B) Dos patrones del perfil plasmático de ctVPH16 observados después de iniciar la QRT. En algunos pacientes (líneas rojas), los niveles de VPHADNtc son más altos antes del tratamiento y disminuyen después de iniciar la terapia. En otros casos (líneas azules), los niveles de VPHADNtc aumentan poco después de comenzar el tratamiento, posiblemente debido a un pico en la muerte de células cancerosas. En todos los casos, los niveles de VPHADNtc se reducen notablemente al final de la QRT, lo que indica que los niveles de VPHADNtc se correlacionan con el volumen de cáncer activo en los pacientes.FIG.

[0033] 3C) Un subconjunto de pacientes presenta una cinética de depuración rápida de VPHADNtc durante la QRT, con >95 % de VPHADNtc depurado para la semana 4 de la QRT. FIG. 3D) Otro subconjunto de pacientes presenta una cinética retardada de depuración del VPHADNtc después de la CRT, lo que puede estar correlacionado con una respuesta deficiente o retrasada a la CRT.

[0035] FIG.4A-F: Un subgrupo de 20 pacientes con OPC VPH+ se sometió a un análisis de secuenciación de nueva generación (NGS) de su tumor primario, así como a análisis de VPHADNtc de su sangre para investigar la posible correlación entre estos ensayos.FIG.4A) Se observó una fuerte correlación entre el ensayo de dPCR de VPHADN descrito en el Ejemplo 1, aplicado a la muestra de biopsia tumoral, y el número de copias de VPH tumoral evaluado mediante NGS. Esto valida tanto el ensayo de VPHADN como la NGS utilizando ensayos ortogonales en las mismas muestras.FIG.4B) Existe una correlación estadísticamente significativa entre el número de copias de VPH tumoral por genoma celular y el VPHADNtc en sangre antes del tratamiento, normalizado al volumen tumoral ("densidad de VPHADNtc"). Esto indica que el nivel de VPHADNtc detectado en sangre se correlaciona con el número de copias de VPH en el tumor asociado.FIG. 4C) Se desarrolló un proceso de análisis bioinformático para distinguir entre cánceres con VPH+ que presentan evidencia de integración del VPH en el genoma humano y aquellos cánceres con VPH puramente episomal, utilizando los datos de NGS tumorales.FIG.4D) Se muestra un gráfico de circos que muestra los reordenamientos observados en un cáncer con VPH episomal (izquierda) y VPH integrado (derecha). El ejemplo con VPH integrado que se muestra aquí presenta un sitio de integración que se asigna a una región del cromosoma 8 (véanse las líneas negras oscuras).FIG.4E) Un mayor número de copias de VPH tumoral se correlaciona con una mayor probabilidad de VPH no integrado (solo episomal).FIG.

[0036] 4F) Los niveles más altos de VPHADNtc en sangre también se correlacionan con una mayor probabilidad de VPH no integrado (solo episomal) en el cáncer asociado. Por lo tanto, el VPHADNtc también puede proporcionar información sobre el estado del genoma del VPH en el cáncer asociado, es decir, si está integrado o episomal.

[0038] FIG. 5A-8: FIG. 5A)Esquema para la estratificación de pacientes según su perfil de VPHADNtc. Los pacientes con abundante ADNtc de VPH16 pretratamiento que se elimina rápidamente (>95 % para el día 28) se clasifican con un perfil de VPHADNtc favorable. El resto de los pacientes se clasifican con un perfil de VPHADNtc desfavorable.FIG. 5B) Se observa un perfil de VPHADNtc favorable en aproximadamente el ~30 % de los pacientes con enfermedad clínicamente favorable (<T4 y <=10 paquetes-año de consumo de tabaco) y en aproximadamente el ~30 % de los pacientes con enfermedad clínicamente desfavorable (T4 o >10 paquetes-año de consumo de tabaco).

[0040] FIG. 6A-8: FIG. 6A)Proporción de pacientes en cada subgrupo con disección cervical positiva después del tratamiento (es decir, enfermedad persistente regional), recurrencia regional y metástasis a distancia. Los pacientes con factores de riesgo clínicos desfavorables y un perfil de VPHADNtc desfavorable presentaron el mayor riesgo de eventos adversos de la enfermedad.FIG. 6B)Análisis de Kaplan-Meier de la supervivencia libre de enfermedad regional (persistente o recurrente) estratificada por riesgo clínico y perfiles de VPHADNtc. Los pacientes con un perfil favorable de ADNtc de VPH16 presentaron un control regional de la enfermedad del 100 %, independientemente del historial de consumo de tabaco (5 pacientes eran fumadores empedernidos). Por el contrario, los pacientes con mayor riesgo clínico y un perfil desfavorable de VPHADNtc presentaron un control regional de la enfermedad significativamente reducido. P: prueba de rango logarítmico bilateral para una tendencia.

[0042] FIG. 7: La prueba de VPHADNtc descrita aquí se aplicó a una cohorte de 73 pacientes que completaron el tratamiento para el cáncer de orofaringe VPH+. Estos pacientes no presentaban evidencia de enfermedad y eran clínicamente asintomáticos. Se les monitoreó con el análisis de sangre de VPHADNtc en cada visita de seguimiento. 60 de los 73 pacientes presentaron niveles indetectables de VPHADNtc en todas las visitas de seguimiento, y ninguno de ellos desarrolló recurrencia de la enfermedad durante el período de seguimiento. Por el contrario, 13 de los 73 pacientes desarrollaron un análisis de sangre de VPHADNtc positivo durante el período de seguimiento clínico. 9 de estos 13 pacientes también desarrollaron recurrencia clínicamente evidente de la enfermedad. El análisis de sangre de VPHADNtc fue positivo hasta 6 meses antes de la identificación de la recurrencia de la enfermedad en una exploración radiológica diagnóstica. Los 4 pacientes restantes con un análisis de sangre positivo están siendo monitorizados estrechamente para detectar una posible recurrencia de la enfermedad.

[0044] FIG.8:Ejemplo de caso del estudio de vigilancia de VPHADNtc. Este paciente era clínicamente asintomático y se creía libre de cáncer. En junio de 2017, dio positivo en un análisis de sangre de VPHADNtc. Poco después, fue examinado por un oncólogo, quien no encontró evidencia de enfermedad. Tres meses después, fue examinado nuevamente por un médico, quien no identificó evidencia de recurrencia de la enfermedad. Sin embargo, el paciente refirió dolor de cuello y hombros, que se consideró de origen musculoesquelético. Se solicitó una resonancia magnética de cuello y hombros, y en este examen, 4 meses después del resultado positivo del análisis de sangre, se identificó un ganglio linfático aislado anormalmente agrandado, que posteriormente se biopsia y fue compatible con cáncer orofaríngeo recurrente positivo para VPH.

[0045] FIG.9:Forma de realización representativa del método para detectar ADN viral del VPH de origen tumoral mediante un ensayo utilizando los conjuntos de cebadores/sondas en tríada presentados en las Tablas 14, 15, 16, 17, 18, 19 y . Se muestran los gráficos de detección de fluorescencia por PCR digital para una reacción de PCR digital multiplexada para detectar ADN de VPH16 de origen tumoral en una muestra de sangre de un paciente que incluye los conjuntos de cebadores y sondas modificados 3, 5 y 7 de la Tabla 14, donde la sonda de detección 5 está conjugada con HEX y las sondas de detección 3 y 7 están conjugadas con FAM.

[0046] DESCRIPCIÓN DETALLADA

[0047] Antes de detallar la presente divulgación, debe entenderse que no se limita a las formas de realización particulares descritas y, por lo tanto, puede variar. También debe entenderse que la terminología utilizada en este documento se utiliza únicamente para describir formas de realización particulares y no pretende ser limitativa, ya que el alcance de la presente divulgación estará limitado únicamente por las reivindicaciones adjuntas.

[0048] Cuando se proporciona un rango de valores, se entiende que cada valor intermedio, redondeado a la décima de la unidad del límite inferior, a menos que el contexto indique claramente lo contrario, entre el límite superior e inferior de dicho rango y cualquier otro valor indicado o intermedio dentro de dicho rango, está comprendido en la divulgación. Los límites superior e inferior de estos rangos menores pueden incluirse independientemente en los rangos menores y también están comprendidos en la divulgación, sujetos a cualquier límite específicamente excluido en el rango indicado. Cuando el rango indicado incluye uno o ambos límites, los rangos que excluyen uno o ambos de dichos límites incluidos también se incluyen en la divulgación.

[0049] Salvo que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos utilizados en este documento tienen el mismo significado que el que comúnmente entiende un experto en la materia a la que pertenece esta divulgación. Si bien cualquier método o material similar o equivalente a los descritos en este documento también puede utilizarse en la práctica o el ensayo de la presente divulgación, a continuación se describen métodos y materiales útiles.

[0050] La cita de cualquier publicación en esta especificación se refiere a su divulgación anterior a la fecha de presentación y no debe interpretarse como una admisión de que la presente divulgación no pueda anteceder a dicha publicación en virtud de dicha divulgación previa. Además, las fechas de publicación proporcionadas podrían diferir de las fechas de publicación reales, lo cual podría requerir confirmación independiente.

[0051] Como resultará evidente para los expertos en la materia tras la lectura de esta divulgación, cada una de las formas de realización individuales descritas e ilustradas en este documento tiene componentes y características discretas que pueden separarse o combinarse fácilmente con las características de cualquiera de las otras formas de realización sin apartarse del alcance de la presente divulgación. Cualquier método descrito puede ejecutarse en el orden de los eventos mencionados o en cualquier otro orden lógicamente posible.

[0052] Las formas de realización de la presente divulgación emplearán, a menos que se indique lo contrario, técnicas de química, biología y similares, que están dentro del conocimiento de la técnica.

[0053] Los ejemplos se presentan para proporcionar a los expertos en la materia una descripción completa de cómo realizar los métodos y cómo fabricar y utilizar las composiciones y sondas aquí descritas y reivindicadas. Se ha procurado garantizar la precisión de las cifras (p. ej., cantidades, temperatura, etc.), pero deben tenerse en cuenta algunos errores y desviaciones. Salvo indicación contraria, las partes se expresan en peso, la temperatura se expresa en ºC y la presión es igual o cercana a la atmosférica. La temperatura y la presión estándar se definen como 20 ºC y 1 atmósfera.

[0054] Antes de describir en detalle las formas de realización de la presente divulgación, debe entenderse que, salvo indicación contraria, esta no se limita a materiales, reactivos, materiales de reacción, procesos de fabricación o similares, ya que estos pueden variar. Asimismo, debe entenderse que la terminología utilizada en este documento se utiliza únicamente para describir formas de realización específicas y no pretende ser limitativa. En la presente divulgación, los pasos también pueden ejecutarse en una secuencia diferente cuando sea lógicamente posible.

[0055] Debe tenerse en cuenta que, tal como se utilizan en la especificación y las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un", "una" y "el/la" incluyen referentes plurales a menos que el contexto indique claramente lo contrario.

[0056] En el presente documento, el término "virus del papiloma humano" o "VPH" se refiere a virus pequeños, sin envoltura y de ADN bicatenario que infectan el epitelio cutáneo o mucoso. Según los expertos en la materia, se conocen más de 100 genotipos de VPH. Los VPH mucosotrópicos de transmisión sexual se subdividen en de alto riesgo (p. ej., VPH16 y VPH18) o de bajo riesgo (VPH6 y VPH11).

[0057] En este documento, las neoplasias malignas asociadas al VPH incluyen las de cabeza y cuello (laringe, cavidad oral, orofaringe, amígdalas y esófago), tejido respiratorio, mama, piel, cérvix, vulva, pene y ano. Los términos «malignidad» y «cáncer» se utilizan indistintamente.

[0058] En el presente documento, "detectar" o "detección" se refiere a la prueba, el cribado o la determinación de la presencia o ausencia de al menos un marcador tumoral de ácido nucleico para el VPH en una muestra. Dicha detección puede llevarse a cabo mediante los métodos descritos en el presente documento, incluidos los conocidos en la técnica aplicables a esta tecnología, por ejemplo, la amplificación de ácidos nucleicos, la detección basada en hibridación, los microarrays y la secuenciación de nueva generación.

[0059] También como se usa en este documento, los términos "tratar", "tratando" o "tratamiento" pueden referirse a cualquier tipo de acción que imparta un efecto modulador, que, por ejemplo, puede ser un efecto beneficioso y/o terapéutico, a un sujeto afligido con una condición, trastorno, enfermedad o dolencia, incluyendo, por ejemplo, mejoría en la condición del sujeto (por ejemplo, en uno o más síntomas), retraso en la progresión del trastorno, enfermedad o dolencia, retraso en la aparición de la enfermedad, trastorno o dolencia, y/o cambio en los parámetros clínicos de la condición, trastorno, enfermedad o dolencia, etc., como sería bien conocido en la técnica.

[0060] En el presente documento, el término "monitoreo" se refiere a la evaluación de la eficacia terapéutica de un tratamiento para pacientes con cáncer. En el presente documento, el término "vigilancia" se refiere a la detección de una neoplasia maligna asociada a un virus en sujetos, que pueden o no tener un cáncer clínicamente diagnosticado o sintomático. Según se utiliza en el presente documento, un sujeto tiene una mayor probabilidad de presentar alguna característica o resultado clínico (p. ej., recurrencia o progresión) si la probabilidad de que el sujeto presente dicha característica o resultado supera una probabilidad o valor de referencia. La probabilidad de referencia puede ser la probabilidad de la característica o resultado en la población general de sujetos o pacientes relevantes. Por ejemplo, si la probabilidad de recurrencia en la población general de cáncer orofaríngeo es del X % y, según los métodos, se ha determinado que un paciente en particular tiene una probabilidad de recurrencia del Y %, y si Y > X, entonces el paciente tiene una mayor probabilidad de recurrencia. Alternativamente, se puede determinar un umbral o valor de referencia y comparar la probabilidad de recurrencia de un paciente en particular con dicho umbral o valor de referencia.

[0061] En el presente documento, "muestra" se refiere a una muestra biológica que contiene un marcador de ácido nucleico tumoral para el VPH. La muestra puede ser tejido, células o cualquier fluido extraído del cuerpo humano, por ejemplo, sangre, plasma, orina, saliva, etc. En formas de realización particulares, la muestra es una muestra de sangre. Por consiguiente, la muestra puede ser sangre completa o sus componentes, como suero o plasma.

[0062] También se describen en este documento métodos para la detección, el tratamiento y la vigilancia de neoplasias malignas asociadas al virus del papiloma humano y kits para lograrlo.

[0063] También se describen en este documento métodos para cuantificar ácidos nucleicos virales en el sistema circulatorio que se derivan específicamente de tumores, y para distinguir estos ácidos nucleicos virales derivados de tumores de otras fuentes de ácidos nucleicos virales circulantes.

[0064] Se describen aquí métodos de amplificación de ADN para cuantificar fragmentos de ADN diana en una muestra según su tamaño. Esto puede utilizarse, por ejemplo, para detectar ADN viral tumoral en una muestra de sangre y distinguirlo de ADN viral de mayor tamaño procedente de fuentes no tumorales. En particular, se describen aquí métodos para detectar, monitorizar o tratar una neoplasia maligna asociada al virus del papiloma humano (VPH) en un sujeto, que implican la detección de la presencia o ausencia de al menos un ADN tumoral circulante del VPH en una muestra del sujeto. También se proporcionan kits para lograrlo.

[0065] El método descrito se puede realizar en miles de microgotas (también denominadas en el presente documento gotas) generadas, por ejemplo, mediante emulsificación o partición de gotas de agua en aceite, como se describe en Hindson et al., Anal Chem.15 de noviembre de 2011; 83(22):8604-8610, Pinheiro et al., Anal Chem.17 de enero de 2012; 84(2):1003-1011 y Kanagal-Shamanna, Methods Mol Biol.2016; 1392:33-42, o cualquier otro método conocido por los expertos en la materia para separar una muestra en particiones discretas o definidas volumétricamente para el análisis del ADN derivado de tumores frente al ADN no derivado de tumores presente en las particiones/muestra. En el caso de las microgotas, el tamaño de las gotas puede ser de escala micro, nano, pico o femto.

[0066] Como se describe en este documento, las microgotas se generan de tal manera que cada una contiene como máximo un único ácido nucleico viral diana. En las formas de realización donde solo se detectan dos regiones distintas del ácido nucleico viral, una microgota que contenga el ácido nucleico viral diana será positiva simple (es decir, positiva para una de las señales de detección) o positiva doble (es decir, positiva para ambas señales de detección). Como se describe en este documento, el número relativo de microgotas positivas simples y doblemente positivas, así como de gotas doblemente positivas, proporciona información cuantitativa que permite determinar cuantitativamente las cantidades relativas de ADN viral tumoral y no tumoral en la muestra.

[0067] En las formas de realización donde la PCR se utiliza para detectar dos regiones físicamente distintas, se incluye un par de cebadores directo e inverso correspondiente a cada región detectada. En algunas formas de realización, la detección puede realizarse mediante PCR digital, PCR digital de gotas, PCR de emulsión o PCR de microgotas, según los procedimientos que apreciaría un experto en la materia. Como se describe en el presente documento, las microgotas que contienen ácidos nucleicos virales circulantes de origen tumoral presentan menos regiones de ácido nucleico viral detectadas positivamente en comparación con las microgotas que contienen ácidos nucleicos virales circulantes de origen no tumoral. En el caso más simple, donde solo se seleccionan dos regiones diferentes del ácido nucleico viral para la detección, el método descrito identifica las microgotas que contienen ADN viral circulante de origen no tumoral como aquellas que son positivas para ambas señales de detección empleadas para las diferentes regiones diana (doble positivo); por el contrario, en este caso más simple, las microgotas que contienen ácido nucleico viral circulante de origen tumoral son positivas solo para una señal de detección, pero no para ambas simultáneamente.

[0069] A modo de ejemplo, si las regiones de ácido nucleico diana para la detección comprenden fragmentos de aproximadamente 70-100 pb, dos o más regiones diana separadas por 100 pb nunca estarían presentes en la misma molécula de ADN viral si esta se derivara de ADN tumoral circulante. En este caso, la detección simultánea de ambos fragmentos diana dentro de la misma microgota se debe a la coocupación, dentro de la misma microgota, de dos moléculas de fragmentos diana distintas, cada una con una de las regiones diana para la detección. Por lo tanto, si las muestras analizadas contienen ADN viral no tumoral, habrá una mayor frecuencia de microgotas que den positivo para dos o más fragmentos diana de lo que se esperaría según las frecuencias de cada región diana analizada individualmente.

[0071] Por ejemplo, una medición cuantitativa de la proporción de fragmentos de ADN viral no derivados de tumores en la muestra es [fracción (gotas doblemente positivas para ambas señales de detección) - fracción (gotas positivas solo para la señal de detección 1) * fracción (gotas positivas solo para la señal de detección 2)]. De esto se deduce que la fracción de ADN viral derivado de tumores en la muestra es [1 - [fracción (gotas doblemente positivas para ambas señales de detección) -fracción (gotas positivas solo para la señal de detección 1) * fracción (gotas positivas solo para la señal de detección 2)]]. La medida cuantitativa correspondiente del ADN viral derivado del tumor sería [#(gotas positivas solo para la señal de detección 1)+#(gotas positivas solo para la señal de detección 2)]*[proporción de fragmentos de ADN viral derivado del tumor] = [#(gotas positivas solo para la señal de detección 1)+#(gotas positivas solo para la señal de detección 2)] [1-fracción (gotas positivas para ambas señales de detección) fracción (gotas positivas solo para la señal de detección 1) * fracción (gotas positivas solo para la señal de detección 2)]. Estas fórmulas se proporcionan como ejemplos ilustrativos de cómo los datos de la señal de detección sin procesar se pueden convertir en mediciones de ADN viral derivado del tumor y no derivado del tumor en la muestra, con el entendimiento de que hay otras fórmulas que podrían utilizarse para el mismo propósito.

[0073] Los métodos descritos también pueden aplicarse en casos en los que se detectan tres o más regiones, cada una con su propia señal de detección, en cada microgota u otra cámara de microrreacción paralelizada. En este contexto, la fórmula matemática para la cuantificación del ADN viral tumoral y no tumoral puede generalizarse basándose en el razonamiento descrito anteriormente para dos regiones amplificadas.

[0075] Si bien los ejemplos anteriores consideraron regiones de ADN viral detectadas de tamaño ~70-100 pb separadas por al menos aproximadamente 50 pb, aproximadamente 60 pb, aproximadamente 70 pb, aproximadamente 80 pb, aproximadamente 90 pb o aproximadamente 100 pb, debe entenderse que tanto el tamaño de los fragmentos de ADN detectados como su distancia pueden variar y no son fijos en relación con los métodos descritos.

[0077] Volviendo a la forma de realización en la que se detectan dos regiones diferentes, las microgotas doblemente positivas pueden surgir ocasionalmente de la coincidencia de dos fragmentos más pequeños de ácido nucleico viral dentro de una sola microgota, cada uno conteniendo solo una región específica, a diferencia de la medición deseada de un fragmento más grande que abarque ambas regiones. En algunas formas de realización, esta posibilidad puede descartarse, o cuantificarse su grado de ocurrencia, comparando las frecuencias relativas de las gotas doblemente positivas y simples, y confirmando que la frecuencia de las gotas doblemente positivas se aproxima al producto de las frecuencias de las simples positivas, y su prevalencia se reduce al cuadrado del factor de dilución al volver a analizarse a una concentración menor.

[0079] En algunas formas de realización, los ácidos nucleicos aislados de muestras de sangre se emulsionan en microgotas, de modo que la gran mayoría de estas contienen uno o ninguno de los ácidos nucleicos virales que se pretende detectar. En este documento se proporcionan métodos experimentales para determinar el volumen correcto de las microgotas y los factores de dilución de la muestra de sangre. Tras la emulsificación, se emplean métodos de detección de ácidos nucleicos, que pueden incluir métodos basados en PCR, para detectar dos o más regiones del ácido nucleico viral diana físicamente separadas entre sí. En algunas formas de realización, cada región viral que se pretende detectar se asocia con una señal de detección única, por ejemplo, un color fluorescente único.

[0081] También se describen en este documento métodos para detectar VPHADNtc en pacientes con VPH-OPSCC. Los métodos generalmente implican la detección de la presencia de ADN viral tumoral mediante una amplificación de ácidos nucleicos, como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), en un contexto emulsionado, donde se amplifican al menos dos regiones distintas para distinguir entre el ADN viral tumoral, fragmentado, y los viriones intactos no tumorales, cuyo ADN no está fragmentado. También se describen en el presente documento sondas y cebadores de ácidos nucleicos, así como kits que los contienen, para su uso en dicho método.

[0083] También se describen en este documento métodos para identificar el pronóstico de individuos con OPSCC asociado al VPH que pueden tratarse con éxito mediante quimiorradioterapia desintensificada (CRT), métodos para identificar biomarcadores tumorales específicos que predicen la recaída o recurrencia del OPSCC asociado al VPH después del tratamiento y métodos para identificar el pronóstico de individuos con OPSCC asociado al VPH que están en riesgo de recaída o recurrencia después del tratamiento.

[0084] Los sujetos adecuados para ser tratados por los métodos descritos incluyen, pero no se limitan a, sujetos mamíferos. Los mamíferos incluyen, pero no se limitan a, caninos, felinos, bovinos, caprinos, equinos, ovinos, porcinos, roedores (p. ej., ratas y ratones), lagomorfos, primates, humanos y similares, y mamíferos en útero. Cualquier sujeto mamífero que necesite ser tratado o desee tratamiento es adecuado. Se pueden tratar sujetos humanos de cualquier género (por ejemplo, masculino, femenino o transgénero) y en cualquier etapa de desarrollo (es decir, neonato, lactante, juvenil, adolescente, adulto, anciano). Los sujetos pueden ser de cualquier raza o etnia, incluyendo, pero no limitado a, caucásicos, afroamericanos, africanos, asiáticos, hispanos, indios, etc., y combinaciones de los mismos. Cabe señalar además que sujeto y paciente se usan indistintamente.

[0085] En formas de realización particulares, el sujeto nunca ha sido diagnosticado ni ha padecido una neoplasia maligna asociada a un virus. En otras formas de realización, el sujeto puede estar diagnosticado, padecer, padecer o estar en riesgo de padecer una neoplasia maligna asociada a un virus. En algunas formas de realización, el sujeto ha recibido tratamiento previo para una neoplasia maligna asociada a un virus. En otras formas de realización, el sujeto puede estar en remisión de una neoplasia maligna asociada a un virus. En algunas formas de realización, el sujeto es fumador. En algunas formas de realización, el sujeto es no fumador.

[0086] Detección de VPHADNtc

[0087] Los métodos para determinar el nivel de ácido nucleico biomarcador, por ejemplo, un VPHADNtc, tal como ADNtc de VPH16, en una muestra pueden implicar el proceso de amplificación de ácido nucleico, por ejemplo, por PCR, reacción en cadena de la ligasa (LCR), sistemas de amplificación basados en transcripción, (TAS) replicación de secuencia autosostenida (3SR), amplificación basada en secuencia de ácido nucleico (NASBA), amplificación por desplazamiento de cadena (SDA) y amplificación de ADN ramificado (bDNA), replicasa Q-Beta, replicación de círculo rodante, amplificación de círculo rodante o cualquier otro método de amplificación de ácido nucleico, seguido de la detección de las moléculas amplificadas utilizando cualquier técnica como lo apreciaría una persona experta en la materia.

[0088] En algunas formas de realización, el método de detección de ácidos nucleicos puede llevarse a cabo en microgotas u otra cámara de microrreacción para que el método de detección pueda ejecutarse de forma altamente paralelizada. En algunas formas de realización, las microgotas o cámaras de microrreacción pueden contener 0 o 1 copia de la región de ADN viral objetivo para la detección.

[0089] En las formas de realización que implican PCR en emulsión, una secuencia de ácido nucleico o polinucleótido diana se dispersa típicamente en microgotas. En algunas formas de realización, es esencial que los ácidos nucleicos diana se emulsionen a una concentración tal que cada microgota (o gota) contenga una o ninguna copia de la molécula diana. En el caso del ADN plasmático o sérico aislado de muestras de sangre de pacientes, el nivel de dilución adecuado se puede determinar evaluando la abundancia de una región genómica de control y asegurando que la frecuencia de microgotas positivas se mantenga por debajo del 10 % (<10 %). La región genómica de control detecta ADN humano (es decir, no viral) y sirve como control de calidad para la muestra (ya que muchas muestras negativas no presentarán ninguna señal positiva en el ensayo), y también se utilizará para establecer que la concentración de fragmentos de ADN sea adecuada (ni demasiado baja ni demasiado alta).

[0090] Dentro de cada microgota, también se aplican los principios de la PCR convencional, donde la molécula diana se amplifica mediante la reacción con al menos un cebador oligonucleotídico o un par de cebadores oligonucleotídicos. El o los cebadores hibridan con una región complementaria del ácido nucleico diana y una ADN polimerasa los extiende para amplificar la secuencia diana. En condiciones suficientes para obtener productos de amplificación de ácidos nucleicos basados en la polimerasa, un fragmento de ácido nucleico de un tamaño domina los productos de reacción (la secuencia polinucleotídica diana, que es el producto de amplificación). El ciclo de amplificación se repite para aumentar la concentración del ácido nucleico o polinucleótido diana dentro de cada microgota. La reacción puede realizarse en cualquier termociclador de uso común para PCR.

[0091] Los métodos para preparar una reacción de PCR son bien conocidos por los expertos en la materia. Cualquier ADN polimerasa, nucleósido trifosfato, tampón, aditivo/potenciador de la reacción y condiciones de amplificación (ciclos de desnaturalización, hibridación y polimerización) conocidos, tal como apreciaría un experto en la materia, pueden utilizarse en la reacción de PCR.

[0092] En algunas formas de realización, la reacción incluye una sonda de hidrólisis específica de secuencia, conjugada con una molécula fluorescente y una molécula inhibidora de la fluorescencia en la mezcla de reacción para permitir la detección de la amplificación exitosa de la molécula diana en cada gota. La composición química de las sondas específicas puede variar, pero se sigue un método establecido por expertos en la materia para la detección de la amplificación de ácidos nucleicos basada en síntesis.

[0093] La preparación de una emulsión de la reacción de PCR puede lograrse de diversas maneras, apreciadas por los expertos en la materia. Una metodología eficaz utiliza un chip microfluídico fabricado que mezcla la reacción acuosa de PCR con una solución lipídica a presión controlada para generar microgotas de tamaño uniforme. El método descrito es aplicable a cualquier método para obtener una mezcla de reacción de PCR particionada que permita la detección simultánea de dos o más moléculas diana de ácido nucleico viral.

[0094] Tras la preparación de una mezcla de reacción de PCR, debidamente emulsionada o dividida en gotitas, esta se somete a condiciones de reacción de extensión del cebador ("condiciones suficientes para proporcionar productos de amplificación de ácidos nucleicos basados en la polimerasa"), es decir, condiciones que permiten la extensión del cebador mediada por la polimerasa mediante la adición de nucleótidos al extremo de la molécula del cebador, utilizando la cadena molde como plantilla. Los ciclos de desnaturalización, hibridación y polimerización pueden realizarse según las condiciones (p. ej., número de ciclos, temperaturas y duración) que considere un experto en la materia.

[0095] Los ciclos de desnaturalización, recocido y polimerización pueden realizarse mediante un dispositivo automatizado, comúnmente conocido como termociclador. Los termocicladores que pueden emplearse se describen en otras publicaciones del presente documento, así como en las patentes estadounidenses n.º 5.612.473; 5.602.756; 5.538.871; y 5.475.610.

[0096] En otras formas de realización, se pueden utilizar aplicaciones no basadas en PCR para detectar una secuencia de ácido nucleico diana, por ejemplo, donde dicha diana puede estar inmovilizada en un soporte sólido. Los métodos para inmovilizar una secuencia de ácido nucleico en un soporte sólido son conocidos en la técnica y se describen en Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc., y en los protocolos proporcionados por los fabricantes, por ejemplo, para membranas: Pall Corporation, Schleicher & Schuell; para microesferas magnéticas: Dynal; para placas de cultivo: Costar, Nalgenunc; y para otros soportes.

[0097] El experto en la materia comprenderá otros procedimientos de amplificación de ácidos nucleicos, como, entre otros, LCR, TAS, 3SR, NASBA, SDA, bDNA y amplificación isotérmica. El método descrito no se limita al uso de la amplificación por PCR, sino que incluye el uso de cualquier método de amplificación de ácidos nucleicos u otros procedimientos que puedan ser útiles en la amplificación de las secuencias para la detección o cuantificación de la presencia o expresión de una o más de las secuencias de ácidos nucleicos particulares descritas en este documento.

[0098] Las variaciones en las cantidades exactas de los diversos reactivos y en las condiciones para la PCR u otro procedimiento de amplificación adecuado (por ejemplo, condiciones del tampón, tiempos de ciclado, etc.) que conducen a resultados de amplificación o detección/cuantificación similares son conocidas por un experto en la materia y se consideran equivalentes.

[0099] La detección de la presencia de moléculas diana en una muestra/microgota no está particularmente limitada y puede lograrse mediante cualquier técnica que un experto en la materia pueda apreciar. En algunas formas de realización, la detección puede incluir la hibridación de la molécula diana con una sonda específica para la diana, como una sonda de ácido nucleico, unida a un marcador fluorescente. En otras formas de realización, el marcador puede ser un marcador no fluorescente. La naturaleza del marcador, fluorescente o no fluorescente, no está particularmente limitada y puede ser cualquier marcador o etiqueta que un experto en la materia pueda apreciar.

[0100] La detección y distinción de particiones (gotas) que contienen una molécula diana de particiones sin moléculas diana es un paso crucial en la PCR digital. Esto puede lograrse mediante diversas técnicas consolidadas. En algunas formas de realización, las microgotas se analizan individualmente mediante un canal microfluídico y un detector de fluorescencia. Como alternativa, se pueden implementar técnicas avanzadas de microscopía para contar gotitas positivas y negativas. El método descrito puede implementarse con cualquier método de detección de ácidos nucleicos.

[0101] Si bien algunos de los métodos descritos en este documento se han implementado mediante PCR digital, en principio, pueden utilizarse con cualquier método de detección de ácidos nucleicos capaz de detectar ácidos nucleicos individuales y distinguir el tamaño de los fragmentos detectados. Por ejemplo, estos métodos pueden incluir la hibridación de moléculas diana no amplificadas con una sonda fluorescente o no fluorescente, entre otros. En cualquiera de estas formas de realización, los métodos descritos pueden aplicarse para distinguir los ácidos nucleicos virales de origen tumoral en circulación de otras fuentes no malignas de ácido nucleico viral circulante y viriones intactos. Aspectos particulares de los métodos descritos son la detección simultánea, en una reacción particionada, de al menos dos fragmentos de ADN separados por una distancia definida en el genoma viral. La presencia de ambas dianas en particiones separadas indica la presencia de ácido nucleico viral tumoral en un fluido corporal, como la sangre, y una mayor frecuencia de co-ocupación de ambos fragmentos en la misma partición indica la presencia de ácidos nucleicos virales no malignos.

[0102] La presente invención se describe con más detalle en los siguientes ejemplos, que se ofrecen únicamente a título ilustrativo, ya que numerosas modificaciones y variaciones resultarán evidentes y comprensibles para los expertos en la materia. A continuación, se presentan ejemplos de cómo la aplicación de este método específico y sensible para la detección de ácidos nucleicos virales tumorales en un fluido corporal, como la sangre, puede utilizarse para predecir el pronóstico del paciente durante el tratamiento del cáncer e identificar a los pacientes con mayor riesgo de recurrencia de la enfermedad entre una cohorte de pacientes clínicamente asintomáticos y considerados en remisión.

[0103] Se han descrito diversas formas de realización de la invención. La descripción se describe con más detalle en los siguientes ejemplos, que no limitan el alcance de la invención descrita en las reivindicaciones.

[0104] EJEMPLOS

[0105] Ejemplo 1: Ensayo de PCR digital para detectar ADN viral del VPH en ADN libre circulante

[0106] Se presenta aquí una forma de realización de los métodos descritos que utiliza PCR en emulsión digital para detectar ADN viral del VPH de origen tumoral en el ADN circulante libre aislado de sangre. Los detalles metodológicos descritos en este ejemplo, por ejemplo, los métodos de amplificación y detección de ácidos nucleicos utilizados, se incluyen únicamente para establecer que la invención se ha llevado a la práctica. Los detalles metodológicos proporcionados en este ejemplo, relacionados únicamente con esta forma de realización particular, no deben interpretarse como limitantes de la invención, tal como se describe en las reivindicaciones y el resumen de este documento.

[0107] Materiales

[0108] Reactivos: Tubos BCT de ADN sin células, RUO (catálogo de Streck n.° 218962); Kit de ácidos nucleicos circulantes QIAamp™, catálogo n.° 55114; dPCR Supermax® Bio-Rad n.° 186-3024; Placas de PCR Eppendorf™ 96-Well twin.tec™; catálogo de Fisher Scientific n.° E951020362; Puntas de pipeta (catálogo de Bio-Rad n.° 186-4121 o n.° 186-4120); Cartucho (catálogo de Bio-Rad n.° 186-4109 o n.° 186-4108); Lámina de sellado (catálogo de Bio-Rad n.° 181-4040); Opcional: VacConnectors® (Qiagen n.° de cat./ID: 19407). Este conector adicional es útil en caso de que algo salga mal con los conectores disponibles en el kit de ácidos nucleicos circulantes QIAamp, catálogo n.º 55114; Albúmina de suero bovino (BSA); Kit de ensayo Qubit™ dsDNA HS (número de catálogo de Thermo Fisher Scientific: n.º Q32851); Tubos de ensayo Qubit™ (número de catálogo de Thermo Fisher Scientific: n.º Q32856); Tubos cónicos para centrífuga Falcon® de 15 mL (n.º de catálogo de Corning n.º 352096); Tubos cónicos para centrífuga Falcon™ de 50 mL (n.º de catálogo de Corning n.º 352098); Pipetas serológicas desechables estériles de 5 mL, 10 mL y 25 mL (cualquier buena marca); Tubos PCR estériles (cualquier buena marca); Puntas de filtro estériles para capacidad de 2 µI, 10 µI, 200 µI y 1200 µI (cualquier buena marca); cebadores y sondas.

[0109] Instrumentos: Microcentrífuga (apta para tubos Eppendorf de 1,5 mL, p. ej., Eppendorf 5424 Microcentrífuga); Centrífuga (apta para tubos Falcon de 15 mL, p. ej., Centrífuga Eppendorf 5810 R); Fluorímetro Qubit (Thermo Fisher Scientific, n.º de catálogo Q33226); Termociclador de 96 pocillos profundos (termociclador C1000 Touch™ de Bio-Rad con módulo de reacción de 96 pocillos profundos n.º 1851197); Bloque calefactor para secar tubos Eppendorf de 1,5 mL (catálogo de Denville Scientific n.º 10540); Baño de agua (debe tener espacio suficiente para incubar veinticuatro tubos cónicos para centrífuga de 50 mL, ya que se pueden procesar 24 muestras a la vez); Generador de gotas automatizado (catálogo de Bio-Rad n.º 186-4101); Lector de gotas Bio-Rad QX200™, n.° de catálogo 1864003; controlador de pipeta portátil Pipet-Aid® XP (Drummond Scientific, n.° de catálogo 4-000-101); pipeta (capacidad: 2 µI, 10 µI, 20 µI, 200 µI y 1000 µI; cualquier buena marca); pipeta de 8 canales (cualquier buena marca, por ejemplo, Eppendorf, n.° de catálogo 3125000010). Métodos

[0110] Recolección de sangre: La sangre se recolecta en tubos Cell-Free DNA BCT, RUO (catálogo Streck n.° 218962).

[0111] Extracción de plasma: La sangre recolectada del paso I debe procesarse idealmente el mismo día para extraer el plasma. El mismo tubo puede centrifugarse a 2000 x g durante 10 min a temperatura ambiente (TA). El sobrenadante se transfiere a nuevos tubos cónicos para centrífuga Falcon™ de 15 mL. Se debe tener cuidado de evitar tomar la capa blanquecina intermedia debajo del plasma. Centrifugue el tubo nuevamente durante 10 min a 2000 x g a TA. A continuación, el sobrenadante se transfiere a nuevos tubos cónicos para centrífuga Falcon™ de 15 mL. El plasma se mantiene en un congelador a -80 ºC hasta su uso posterior. NOTA: a veces, la centrifugación de 10 min no conduce a una separación clara de la capa de plasma. En tal situación, la muestra debe centrifugarse durante otros 10 min antes de extraer el plasma. O, alternativamente, la centrifugación en el primer paso puede realizarse durante 15-20 min. Registre la muestra si el plasma se ve rojo. A veces, se requiere un procesamiento adicional de la muestra durante el paso de PCR debido a la hemólisis. La sangre debe desecharse con cloro al 10 % o esterilizarse en autoclave o de acuerdo con cualquier otro protocolo aprobado por la institución o empresa.

[0112] Extracción de ADN libre de células plasmáticas (cfDNA): Las muestras de plasma almacenadas se descongelan a 37 ºC en un baño de agua durante aproximadamente 5 min. Se utiliza un kit de Qiagen (QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit, Catálogo n.º 55114) para extraer el ADN siguiendo el protocolo del fabricante con las siguientes modificaciones: Se puede utilizar en el protocolo el vacío estándar disponible en el laboratorio; El cfDNA se eluye en 2 pasos: primero con 100 µI de tampón de elución y luego con 75 µI de tampón de elución si el volumen de plasma es superior a 3 mL. La elución se puede realizar en un volumen menor si el volumen de plasma recogido es menor para evitar una dilución excesiva del cfDNA; y se observó que la incubación de la columna durante 3 min tras añadir el tampón de elución (como se sugiere en el protocolo) no conduce a la extracción completa del cfDNA. Generalmente, una incubación de 30 min a 1 h a TA suele seguir a ambos pasos de elución. El cfDNA se cuantifica con un fluorímetro Qubit. (Nota: Generalmente, 2 µI del eluido son suficientes para la cuantificación). El cfDNA eluido se almacena en un congelador a -20 ºC hasta su uso posterior. Nota: El cfDNA recuperado en la primera elución se utiliza para todos los experimentos y cálculos. El cfDNA recuperado en la segunda elución solo se utiliza si se agota el cfDNA de la primera elución. Si se requiere un cfDNA más concentrado para cualquier propósito, como la NGS, la muestra se puede concentrar mediante vacío rápido.

[0113] dPCR: La dPCR implica tres pasos: generación de gotas, PCR y lectura de gotas.

[0114] Generación de gotas: Prepare una reacción de 25 µI para cada muestra personalizada según la siguiente composición (Reactivos: dPCR Supermax® Bio-Rad, catálogo n.° 186-3024; se puede usar cualquier agua de grado PCR libre de nucleasas; otros reactivos como el cebador directo, el cebador inverso y la sonda son diseñados por el usuario)

[0116]

[0118] Las secuencias de cebadores y sondas para el ensayo VPHADNtc que se describen aquí son las siguientes:

[0120]

[0122] La mezcla de trabajo de los cebadores se ensambla combinando 22,5 µL de cada uno de los cuatro cebadores (concentración de 100 µM) en un tubo y agregando 10 µL de agua libre de nucleasas para lograr una concentración final de 22,5 µM para cada cebador.

[0123] La mezcla de trabajo de la sonda se ensambla combinando 6,25 µL de cada sonda (concentración de 100 µM) en un tubo y agregando 87,5 µL de agua libre de nucleasas para lograr una concentración final de 6,25 µL para cada sonda.

[0124] Se cargan aproximadamente 22-23 µI de la mezcla de reacción anterior en una placa de 96 pocillos (placas PCR Eppendorf™ 96-Well twin.tee™, catálogo científico Fisher n.° E951020362) utilizando pipetas multicanal (Nota: el instrumento utiliza solo 20 µI de cada pocillo. Se agrega un volumen adicional para evitar cualquier error de pipeteo). Las gotas se generan utilizando un generador de gotas automatizado (catálogo Bio-Rad n.° 186-4101) siguiendo el protocolo del fabricante.

[0125] Los reactivos necesarios en este paso son puntas de pipeta (catálogo Bio-Rad n.º 186-4121 o n.º 186-4120) y cartuchos (catálogo Bio-Rad n.º 186-4109 o n.º 186-4108). La placa de muestra se sella con una lámina de sellado (catálogo Bio-Rad n.º 181-4040) siguiendo el protocolo del fabricante. Nota: El volumen de cfDNA agua debe ser de 4,3 µI. Generalmente, no hay problema al usar 4,3 µI de muestra de cfDNA en la reacción, pero a veces el número de copias del alelo es demasiado alto y resulta en la estría de la gota positiva a través del eje y muchas gotas positivas duales. En tales casos, la ejecución debe repetirse utilizando menos muestra y el volumen restante se puede ajustar con agua. La dilución proporciona una mejor cuantificación de la frecuencia alélica en tales casos. Se ha observado una relación lineal de 5 órdenes de magnitud en el número de copias de VPH16, que varía entre 5 y 50000 copias por reacción de 20 µI. Es importante sellar bien la placa. Si no se sella correctamente, la muestra se evaporará durante la PCR.

[0126] PCR: El termociclado de PCR se realizó utilizando el protocolo descrito a continuación.

[0129]

[0131] Todos los pocillos deben observarse visualmente después de la PCR y antes de leer la placa en el lector de gotas. El número de copias observado durante la lectura de gotas puede ser incorrecto si hay pocillos donde la muestra se evaporó debido a un sellado inadecuado. Es recomendable dejar la placa en el termociclador durante unos 15-20 minutos después de la PCR. Esto permite que la temperatura de la placa descienda de forma más controlada y evita la malformación de las gotas.

[0132] En ocasiones, la deformación de las gotas debido a la corriente estática puede evitarse tocando con la mano otra superficie metálica antes de retirar la placa del termociclador. Esto debería convertirse en una práctica habitual para una mejor reproducibilidad de los resultados. La placa de PCR puede conservarse durante la noche después de la PCR y la lectura puede realizarse al día siguiente si el tiempo es limitado. Sin embargo, lo ideal es terminar todo en un día.

[0133] Lectura de gotas:El lector de gotas (Bio-Rad QX200™, n.° de catálogo 1864003) se utiliza para leer la señal en gotas siguiendo el protocolo del fabricante. Nota: Desecho de residuos de aceite: La composición del aceite del lector de gotas es propiedad de Bio-Rad. Un perfil de residuos típico contiene aceites fluorados (95 %), agua (5 %), lejía (<0,5 %), proteínas,

[0134] ácidos nucleicos y Tinte fluorescente (< 0,1 %). Se debe planificar una eliminación adecuada en consecuencia.

[0135] Análisis de datos:Los cálculos del número de copias deben realizarse siguiendo las instrucciones del fabricante. En la Figura 1A se muestra un ejemplo de la lectura del ensayo dPCR VPHADNtc. Se establecieron los siguientes parámetros para el cálculo de las gotas FAM-positivas simples, HEX-positivas simples y FAM+HEX doblemente positivas. En el canal FAM, se utiliza un valor de corte de 700 para separar las gotas negativas de las positivas. De igual manera, en el canal HEX, se utiliza un valor de corte de 3000 para separar las gotas negativas de las positivas. Las gotas FAM+HEX doblemente positivas son aquellas con una intensidad de fluorescencia >700 en el canal FAM y >3000 en el canal HEX. Las gotas doblemente negativas tienen una fluorescencia FAM <700 y una fluorescencia HEX <3000.

[0136] La estadística de Poisson se utiliza para calcular las copias de cada fragmento en la reacción individualmente, utilizando la siguiente fórmula:

[0137] #copias=#gotas totales * En (#gotas totales/#gotas de señal negativa).

[0138] Esto se calcula primero para el fragmento 1 (FAM positivo) y para el fragmento 2 (HEX positivo).

[0139] Se han realizado extensos ensayos de control para determinar el nivel de ruido experimental. Con base en estos controles, se utilizaron los siguientes criterios para determinar el número de copias del fragmento diana en la reacción de ensayo.

[0140]

[0143] Estos valores de número de copias se pueden usar para calcular la frecuencia de una gota que posee el fragmento objetivo: Pr (frag) = (#gotas positivas/#gotas totales). La frecuencia de gotas doblemente positivas que se esperan si la muestra consiste en ADN viral tumoral circulante fragmentado se estima como: Pr (doble positivo) = Pr (frag1) * Pr (frag2). Por el contrario, si Pr (doble positivo) > 2 * Pr (frag1) * Pf (frag2), entonces se consideró que la muestra contenía ADN viral no fragmentado que no se deriva del tumor. Si Pr (doble positivo) > Pr (frag1) o Pr (doble positivo) > Pr (frag2) se interpretó que la muestra es negativa para ácidos nucleicos virales circulantes derivados del tumor. Si Pr (frag1) y Pr (frag2) > 2* Pr (doble positivo), la muestra se consideró positiva para ácidos nucleicos virales circulantes de origen tumoral, aunque existe evidencia de la coexistencia de ácidos nucleicos virales no tumorales. Los datos brutos de este ensayo, aplicados a controles experimentales y ADN plasmático de una cohorte de 12 pacientes con cáncer orofaríngeo positivo para VPH, se muestran en la Figura 1A-1B.

[0145] Para el ensayo VPH16 F1, se estableció un valor de corte de 700 en el eje Y (canal FAM). Cualquier gota por encima de 700 se considera positiva para VPH16. Para el ensayo VPH16 F2, se estableció un valor de corte de 3000 en el eje X (canal Hex). Cualquier gota por encima de 3000 se considera positiva para VPH16 F2. Ocasionalmente, los patrones de lectura de dPCR presentan un aspecto inusual. Esto puede deberse a una muestra defectuosa (ADNcf no analizable) o a una ejecución dPCR defectuosa. Dicha muestra debe repetirse para corregir el problema. Los datos de dichas muestras no pueden usarse para interpretación. Si la calidad de la muestra no mejora con ninguna de las estrategias disponibles, la muestra debe categorizarse como ADN no analizable o muestra defectuosa. Algunas estrategias para mejorar la calidad de la muestra son las siguientes. La presencia de heparina en la muestra de sangre puede interferir con la reacción de dPCR. Tratar la muestra con Bacteroides Heparinase I (New England Biolabs cat no. #P0735S) usando el protocolo del fabricante mejora la calidad de la muestra. La hemólisis excesiva a veces interfiere con la dPCR. Se ha observado una mejora en la lectura del ensayo añadiendo 0,4 % de albúmina de suero bovino Algunos de los diagramas de puntos representativos de muestras defectuosas se proporcionan como un archivo separado con soluciones sugeridas.

[0147] Utilizar una secuencia genómica endógena como control positivo para la reacción de dPCR es esencial para validar la calidad de la muestra. La detección mediante dPCR de una secuencia diana en el genESR1se utilizó como control positivo para la calidad de la muestra. El ensayo se describe a continuación:

[0150]

[0151]

[0155]

[0157] Flujo de trabajo para el análisis de muestras de ADN plasmático:

[0158] 1) Pruebe las muestras utilizando el ensayo dPCR de control genómico ESR1, para evaluar el ADN amplificable y la concentración de la muestra.

[0159] 2) Pruebe las muestras para el ensayo de fragmento dual VPH16 (VPH16ZENv2)

[0160] 4) Si la muestra es negativa para VPH16, realice el ensayo multiplexado de VPH (VPHmultiplexado_v1).

[0161] 5) Realice el ensayo dúplex para conocer la variante específica del VPH.

[0162] Ejemplo 2: Ensayo de dPCR multiplexado para detectar cinco subcepas distintas de VPH (VPHmultiplexado_v1)Los métodos descritos se aplicaron a subcepas de un virus determinado. Si bien la presente realización se refiere a subcepas del virus VPH, el método puede aplicarse fácilmente a otras subcepas virales mediante técnicas establecidas, conocidas por los expertos en la materia. Las variantes incluidas en la forma de realización descrita del método son VPH16, VPH18, VPH31, VPH33 y VPH35.

[0163] La sonda VPH16 fue etiquetada con FAM-Zen mientras que las demás con HEX (versión LNA).

[0164]

[0166] Mezcla de reacción

[0167] Mezcla de cebadores: Mezcle un volumen igual de 10 cebadores a 100 µM cada uno (cada cebador diluido 1:10 en la mezcla). Mezcla de sondas: Mezcle 6,25 µl de cada una de las cinco sondas en un tubo y añada

[0168] 68,75 µI de agua (la concentración final será de 6,25 µM cada uno en un volumen de 100 µI).

[0170]

[0171]

[0173] Advertencia: Una sonda LNA<TM>-FAM también fue diseñado para amplificar la región común en todas las variantes de VPH16 conocidas con los mismos cebadores (n.º 283 y 285). No se utilizó en el ensayo multiplexado.

[0174] 413_VPH16_LNA_FAM-SondaComún:CA(+C)A(+C)(+G)(+T)A(+G)(+A)CAT (SEQ ID NO:22)

[0175] Ejemplo 3: Ensayo Duplex dPCR para detectar variantes VPH específicas (VPH_18&33_v1 y VPH_31&35_v1)Este ensayo fue diseñado para conocer la identidad de variantes de VPH específicas en las muestras del paciente.

[0178]

[0180] Mezcla de reacción

[0181] Mezcla de cebadores: Mezcle 22,5 µl de cada uno de los cuatro cebadores y añadir 10 µl de agua (22,5 µM para cada cebador en la mezcla). Mezcla de sondas: Mezcle 6,25 µl de ambas sondas en un tublo y añadir 87,5 µl de agua (la concentración final será de 6,25 µM cada uno en un volumen de 100 µI).

[0182]

[0186]

[0188] Ejemplo 4: Aplicación a muestras de sangre de pacientes en ensayos clínicos prospectivos

[0189] Se analizaron muestras de sangre de voluntarios sanos, cáncer no asociado al virus y cáncer VPH+. El número de copias de ADN del VPH circulante en tumores, medido mediante la tecnología de ensayo descrita en el Ejemplo 1, se muestra en la Figura 2. Estos datos indican que la prueba de sangre VPHADNtc tiene una especificidad del 100 % y una sensibilidad del 93 % para identificar pacientes con cáncer VPH+.

[0190] Se analizaron muestras de sangre de pacientes inscritos en dos ensayos clínicos prospectivos de fase II. El método descrito para la detección específica del ADN viral del VPH de origen tumoral en sangre se integró en el diseño de ambos ensayos clínicos. Los hallazgos de estos estudios clínicos longitudinales ilustran la aplicabilidad y utilidad del método descrito tanto para la personalización del tratamiento del paciente como para la vigilancia del cáncer.

[0191] Resumen de la cohorte de pacientes y del diseño del ensayo clínico.Se completaron dos ensayos clínicos prospectivos de fase II que evaluaron la eficacia de un régimen de quimiorradioterapia desintensificada en el carcinoma epidermoide de células escamosas (CCE) de bajo riesgo. En el estudio LCCC 1120 (NCT01530997), 45 pacientes recibieron tratamiento con TRC desintensificada. Los pacientes elegibles tenían CCE con VPH+ o positivo para p16, T0 - T3, N0 -N2c, M0 y < 10 paquetes-año de consumo de tabaco. Los pacientes recibieron 60 Gy de Intensity.

[0192] Radioterapia modulada (IMRT) con cisplatino intravenoso semanal concurrente (30 mg/m²). Todos los pacientes se sometieron a una biopsia del sitio primario y a una disección selectiva del cuello para abarcar el nivel o niveles ganglionares que fueron positivos antes del tratamiento, dentro de las 4 a 14 semanas posteriores a la CRT. El criterio de valoración principal de LCCC 1120 fue la tasa de pCR, que fue del 86 % (37/43), y el control del cáncer a 3 años y la supervivencia general fueron del 100 % y el 95 %, respectivamente. Además de un excelente control del cáncer, el paciente tuvo menos toxicidad y reportó una excelente calidad de vida y una menor carga sintomática en comparación con la CRT de atención estándar (70 Gy). En un estudio de fase 2 de segunda generación (LCCC 1413, NCT02281955), se utilizó una PET/CT postratamiento de 12 semanas para guiar el uso de la biopsia/disección del cuello (es decir, la evaluación quirúrgica posterior a la CRT no fue obligatoria, sino guiada por imágenes). De los 113 pacientes inscritos, 82 tuvieron un seguimiento mínimo de 1 año, y el control actuarial del cáncer y la supervivencia global a 2 años en estos 82 pacientes fueron del 90 % y el 95 %, respectivamente (de nuevo, excelentes resultados). Los pacientes siguen reportando una buena recuperación de su calidad de vida al año, lo que respalda la idea de que la desescalada de la dosis puede mejorar la relación terapéutica. Actualmente se está llevando a cabo un estudio de fase 2 de tercera generación (LCCC 1612, NCT03077243), en el que se han inscrito 53 de los 120 pacientes previstos. Se analizaron prospectivamente muestras de sangre de 113 pacientes para detectar ADN viral del VPH plasmático derivado del tumor.

[0194] Los niveles de ADN viral del VPH de origen tumoral en sangre, cuantificados mediante el método descrito, se correlacionan significativamente con el ADN viral del VPH en tumores primarios.En 63 pacientes con VPH-OPSCC, se cuantificaron prospectivamente los niveles seriados de ADN viral del VPH de origen tumoral (antes y semanalmente durante la RT) en muestras de sangre de los pacientes utilizando el método descrito (Figura 3A). Cuarenta y nueve pacientes tenían ADN viral del VPH de origen tumoral detectable en la circulación antes del tratamiento. En los 49 pacientes, los niveles de ADN viral del VPH circulante habían disminuido significativamente en la semana 6 (Figura 3B) tras el inicio de la quimiorradioterapia, disminuyendo a niveles indetectables en la mayoría (90 %, n = 44/49) de los pacientes al final del régimen terapéutico. En todos los pacientes, los niveles máximos de ADN viral del VPH de origen tumoral en sangre oscilaron entre 10 copias/mL y ~30000 copias/mL. Además, se observó una cinética de depuración distinta del ADN viral del VPH de origen tumoral en la sangre durante el tratamiento con TRC. En un grupo, la cinética de depuración fue rápida (Figura 3C), con una depuración de más del 95 % del ADN viral del VPH de origen tumoral máximo en la sangre para el día 28 de terapia. En un segundo grupo, se observó una depuración tardía del ADN viral del VPH de origen tumoral en la sangre (Figura 3D), lo cual podría estar asociado con una respuesta deficiente o tardía al tratamiento.

[0196] El método descrito se validó aún más correlacionando los niveles de ADN viral del VPH derivado del tumor en la sangre con el análisis de tumores primarios coincidentes en una cohorte de 20 pacientes (Figura 4). Las copias de ADN del VPH normalizadas en el material de la biopsia del tumor se correlacionan fuertemente con las copias de ADN del VPH medidas por secuenciación de próxima generación (Figura 4A). Además, la cantidad de ADN viral del VPH derivado del tumor en la sangre se correlaciona significativamente con el número de copias de ADN del VPH en la biopsia del tumor coincidente, después de normalizarse a la carga tumoral general en el paciente (Figura 4B). Utilizando la secuenciación de próxima generación, se identificaron cánceres con integración del VPH en el genoma de la célula cancerosa (Figura 4C-4D). Un mayor número de copias de ADN del VPH en el material de la biopsia del tumor se correlacionó con una alta probabilidad de ADN del VPH episomal (no integrado) en el tumor primario coincidente (Figura 4E). De igual manera, un mayor número de copias de ADN viral del VPH de origen tumoral en sangre se correlacionó con una mayor probabilidad de ADN del VPH episomal (no integrado) en el tumor primario compatible (Figura 4F). Estos hallazgos validan los métodos descritos al establecer que la cuantificación del ADN viral en sangre mediante dichos métodos se correlaciona significativamente con las mediciones de ADN viral en el tejido tumoral compatible. Estas observaciones también demuestran que el método descrito puede monitorizar la presencia y la eliminación del ADN viral del VPH de origen tumoral en el análisis longitudinal de muestras de sangre de pacientes.

[0198] Predicción del riesgo clínico en pacientes con cáncer.El método descrito se aplicó para monitorizar el ADN viral del VPH de origen tumoral en sangre antes y durante el tratamiento en 63 pacientes incluidos en el ensayo clínico descrito anteriormente. Un perfil favorable se definió como niveles pico ADNtc de VPH16 abundantes de ADN viral del VPH de origen tumoral en sangre (>200 copias/mL) y una rápida cinética de depuración (< 2 % del valor máximo en la semana 4) (Figura 5A).18 de los 63 pacientes evaluables (29 %) presentaron un perfil favorable (Figura 5B), y ninguno de estos 18 pacientes presentó recurrencia (independientemente del consumo de tabaco) (Figura 6A-B). Un perfil desfavorable se definió como (i) ADN viral del VPH derivado del tumor indetectable antes del tratamiento en la sangre, (ii) valores pico bajos de ADN viral del VPH derivado del tumor en la sangre (≥200 copias/mL), o (iii) >2 % del valor pico en la semana 4 (40 Gy) (Figura 5A-B). Sorprendentemente, los pacientes con un perfil favorable mostraron un control de la enfermedad del 100 % en no fumadores (60 Gy) y fumadores empedernidos (60-70 Gy). Por el contrario, los fumadores empedernidos (>10 paquetes/año) con un perfil desfavorable tuvieron una tasa de control regional de la enfermedad muy pobre del 45 % a los 12 meses después de completar la terapia (Figura 6A-B). Estas observaciones demuestran la utilidad clínica de aplicar el método descrito para cuantificar el ADN viral derivado del tumor en la sangre como un biomarcador para predecir el riesgo clínico entre los pacientes con cáncer asociado al virus. Además, estos hallazgos indican que se puede utilizar una evaluación en tiempo real del ADN viral circulante derivado del tumor para personalizar la intensidad de la terapia para los pacientes en función de su riesgo inferido.

[0200] Detección temprana de la recurrencia del cáncer de mama con VPH+ en pacientes sanos, asintomáticos y considerados libres de enfermedad mediante los procedimientos clínicos existentes.El programa de vigilancia habitual después de la quimiorradioterapia consiste en exámenes clínicos (exploración física y nasofaringolaringoscopia con fibra óptica) cada 2 a 6 meses durante los primeros 5 años. La mayoría de los oncólogos de cabeza y cuello también realizan PET/TC cada 6 a 12 meses. Actualmente no existen análisis de sangre de vigilancia disponibles para pacientes con carcinoma epidermoide de células escamosas asociado al VPH. La disponibilidad de una prueba de vigilancia sanguínea altamente sensible ayudaría a la detección temprana de la recurrencia del cáncer (antes de los hallazgos clínicos o radiográficos) y mejoraría el valor de la vigilancia del cáncer en esta población al reducir la frecuencia de las visitas al consultorio y el uso de costosos estudios de imágenes radiológicas. Hasta la fecha, 73 pacientes han sido vigilados prospectivamente con OPSCC asociado al VPH (Figura 7). Se obtuvieron muestras de sangre en cada visita de seguimiento, independientemente de los hallazgos clínicos. El ADNtc de VPH16 plasmático se ha vuelto detectable en el seguimiento después del tratamiento en 13 pacientes (mediana de copias/mL y rango), de los cuales 9 han tenido evidencia clínica/radiográfica de recurrencia del cáncer. Estos pacientes con ADNtc de VPH16 detectable después del tratamiento eran asintomáticos y se les realizaron exámenes radiográficos que confirmaron recurrencias de cáncer muy tempranas y de bajo volumen. Un ejemplo de caso ilustrativo se presenta en la Figura 8. Aquí, el paciente ya había completado la terapia con intención curativa y estaba completamente asintomático sin evidencia de enfermedad. Sin embargo, en junio de 2017, dio positivo en la prueba de ADN viral del VPH derivado del tumor en sangre. Poco después, fue examinado por un oncólogo y se determinó que no presentaba evidencia de enfermedad. Tres meses después, tuvo otra visita de seguimiento y el oncólogo no identificó ninguna evidencia de recurrencia de la enfermedad en el examen físico. Sin embargo, el paciente reportó dolor en el cuello y los hombros, que se creyó de origen musculoesquelético. Se solicitó una resonancia magnética de cuello y hombros, y en este examen, 4 meses después del análisis de sangre inicial positivo, se identificó un ganglio linfático aislado anormalmente agrandado en el cuello. Posteriormente, se realizó una biopsia de esta masa anormal, que resultó ser un cáncer orofaríngeo recurrente para VPH+.

[0202] Hay 4 pacientes en el estudio que tienen ADN del VPH detectable en la sangre utilizando los métodos descritos, pero no presentan evidencia clínica/radiográfica de enfermedad y están siendo monitoreados de cerca para la recurrencia. No se han detectado recurrencias de cáncer en pacientes con ADNtc de VPH16 indetectable. En resumen, el valor predictivo negativo y el valor predictivo positivo del ensayo de ADNtc de VPH16 plasmáti

[0203] son del 100 % y del 70 %, respectivamente. Estas observaciones sugieren que el VPHADNtc plasmático es exquisitamente específico y sensible para la detección temprana del cáncer asociado al VPH. La aplicación del método descrito como parte de la atención clínica puede mejorar la efectividad y reducir el costo de la vigilancia del cáncer para pacientes con cáncer orofaríngeo asociado al VPH.

[0205] Ejemplo 5: ADN de VPH16 circulante en plasma como biomarcador para el tratamiento del OPSCC asociado al VPH

[0207] El estudio RTOG 0129 demostró que las exposiciones influyen en el riesgo clínico del cáncer orofaríngeo. Los pacientes VPH+ tienden a tener una buena evolución, mientras que los pacientes VPH negativos con un amplio historial de consumo de tabaco tienen una mala evolución. La mayoría de los estudios, incluido el RTOG 0129, también muestran un pronóstico intermedio para los cánceres VPH+ que se desarrollan en fumadores empedernidos. Esto se muestra en la FIG.8.

[0208] Los biomarcadores genéticos pueden mejorar la estratificación del riesgo clínico. Por ejemplo, un subconjunto de tumores en no fumadores con VPH+ puede ser excepcionalmente sensible al tratamiento, mientras que puede haber fumadores con cánceres con VPH+ que presenten una biología más similar a la del VPH, y otros que presenten una biología más similar a la del tabaco. Los biomarcadores podrían identificar estos subgrupos mejor que los parámetros clínicos por sí solos.

[0210] El VPHADNtc plasmático se detecta en la mayoría de los pacientes con carcinoma escamoso de células encefálicas asociado al VPH. Por lo tanto, el VPHADNtc puede ser un biomarcador de la carga tumoral y, con la misma importancia, de la cinética de respuesta. El VPHADNtc tumoral circulante plasmático también puede orientar las decisiones sobre quién es adecuado para la terapia desescalada del carcinoma escamoso de células encefálicas asociado al VPH.

[0212] Se ha desarrollado un ensayo de PCR digital para el ADN del VPH-16 que presenta: alta especificidad, ya que no detecta de forma cruzada los VPH-18, -31, -33 ni 35, y una señal de fondo muy baja; lineal en más de 5 órdenes de magnitud en el número de copias (5-50.000 copias); preciso y con una reproducibilidad excepcional; y ultrasensible, capaz de detectar tan solo 6 copias del VPH-16 con una sensibilidad de ~80 %. Esto se muestra en las FIGS.1A y 1B. La FIG.1A muestra un ejemplo de lectura en este ensayo, en donde las gotas positivas indican la presencia de moléculas individuales de ADN de VPH16, bien separadas de las gotas negativas en una reacción. La FIG.1B muestra el intervalo de confianza del 95 % de una regresión lineal, que demuestra una linealidad y precisión excepcionales, con la variabilidad del ensayo como un problema solo en el rango de 10 copias diana. Este ensayo puede detectar tan solo 6 moléculas diana de ADN de VPH16 utilizando un umbral de ensayo que no produce falsos positivos.

[0214] Una población de estudio que incluyó a 64 pacientes con carcinoma epidermoide de células escamosas (CCEP) positivo para VPH, comprobado mediante biopsia, que sobreexpresaron p16 (IHQ) o fueron positivos para VPH en ISH. Todos los pacientes recibieron quimiorradiación definitiva (sin quimioterapia de inducción). Cincuenta y cuatro pacientes (84 %) participaron en un ensayo prospectivo de desintensificación de la terapia de resincronización cardíaca (IMRT de 60 Gy cisplatino 30 mg/m² semanal). De estos, 46 pacientes presentaron una respuesta clínica favorable (<T4 y < 10 paquetesaño de consumo de tabaco) y 18 presentaron una respuesta clínica desfavorable (T4 o > 10 paquetes-año de consumo de tabaco). Ningún paciente presentó enfermedad N3 o M1. Se recogieron muestras de sangre para la investigación antes del tratamiento, semanalmente durante la terapia de resincronización cardíaca y en las visitas clínicas posteriores al tratamiento (se analizaron aproximadamente 450 muestras de sangre).

[0216] Se midieron los niveles plasmáticos de ADNtc de VPH16 durante la quimiorradioterapia. El ADNtc de VPH16 plasmático responde a la TRC y, en la mayoría de los casos, se elimina tras el tratamiento. Se evaluó su potencial como biomarcador de la eficacia del tratamiento y la correlación de los niveles máximos de ADNtc de VPH16 con el consumo de tabaco, la carga de enfermedad y el número de copias del VPH tumoral. Este régimen se muestra en la FIG. 10, y los niveles normalizados de ADNtc de VPH16 se representan en la FIG.3A.

[0217] Se detectó ADN plasmático de ctVPH16 en el 77 % de los pacientes, y la FIG.11 indica el valor máximo de cada paciente. Como se muestra en la FIG. 11, se observó un amplio rango de valores, desde tan solo 10 copias por mL hasta 30.000 copias por mL. También hubo un 23 % de pacientes sin ADN de VPH16 detectable en plasma. Además, no se observó ninguna correlación significativa entre la cantidad de VPH16 en plasma y el estado de consumo de tabaco.

[0219] Sin embargo, los niveles plasmáticos de ctVPH16 no mostraron una correlación significativa con la carga de enfermedad, como se muestra en la FIG.3C. Se exploraron diversas maneras de correlacionar la carga de enfermedad con los valores máximos de ADN de VPH16, pero no se encontró ninguna. No obstante, al analizar un subgrupo de 25 pacientes en quienes se había correlacionado la secuenciación tumoral con el ADN de VPH16 plasmático, se identificó una correlación modesta, pero estadísticamente significativa, entre el VPH16 tumoral circulante plasmático y el número de copias de VPH16 en el tumor, como se muestra en la FIG.3D. Por lo tanto, el número de copias de VPH16 en plasma de un paciente en particular puede reflejar el número de copias de VPH en su tumor y tener implicaciones pronósticas más allá del estadio de la enfermedad y el historial de consumo de tabaco.

[0221] A continuación, se centró la atención en los pacientes negativos al VPH16 y se desarrollaron ensayos de PCR digital para las cuatro cepas alternativas de VPH más comunes. Este análisis se muestra en FIG.12. De hecho, entre los no fumadores habituales, todos los pacientes negativos al VPH16 presentaron valores detectables de VPH 18/31/33 o 35 en plasma. Entre los fumadores habituales se observó un patrón significativamente diferente. Un número ligeramente menor de pacientes fueron positivos al VPH16. Sin embargo, entre los pacientes negativos al VPH16, solo alrededor del 1/3.º presentó variantes del VPH detectables, y el resto dio negativo para las cinco cepas del VPH. Aún más preocupante, dos de estos cuatro pacientes presentaron una disección cervical positiva después del tratamiento, y un paciente también dio positivo para una mutación p53 en el tumor. Entre los no fumadores no se observó un aumento de eventos de la enfermedad con cepas alternativas del VPH; sin embargo, entre los fumadores solo hubo dos pacientes, pero uno de ellos desarrolló una recurrencia regional poco después de completar la TRC. Por lo tanto, parece existir un efecto interactivo entre la negatividad al VPH16 y el consumo de tabaco.

[0223] También se observó una cinética de depuración variable entre los pacientes con alta expresión de VPH16. Como se muestra en la FIG.13, algunos pacientes presentaron una depuración exponencial del ADN de VPH16, mientras que otros presentaron un patrón cinético más complejo con una depuración plasmática retardada. Esto se cuantificó midiendo la cantidad de ADN del VPH en plasma presente en la semana 4 en relación con el valor máximo de VPH. Para la paciente con mayor porcentaje de eliminación, este valor es del 0 %, y para la paciente con menor porcentaje de eliminación, del 39 %. La mediana del 5 % se utilizó para estratificar a las pacientes según su cinética de eliminación rápida o retardada.

[0224] En resumen, se definieron grupos de riesgo de VPH16 tumoral circulante plasmático. Esto se muestra en la FIG.14. Los pacientes con riesgo favorable presentaron una cinética de eliminación rápida de VPH16 abundante. El resto de los pacientes presentaron perfiles desfavorables de VPH16 tumoral circulante, ya sea por cinética retardada, bajo número de copias, positividad para variantes del VPH o VPH indetectable. Tanto en fumadores como en no fumadores, aproximadamente el 30 % de los pacientes presentó un perfil de VPH16 tumoral circulante favorable, mientras que el 70 % fue desfavorable. Cabe destacar el 20 % de los fumadores en quienes no se detectaron las 5 cepas de VPH más comunes.

[0226] Como se muestra en la FIG.4, los pacientes con un perfil favorable de VPH-16 tumoral circulante no presentaron eventos de enfermedad regional, independientemente de su consumo de tabaco. Sin embargo, en los casos de pacientes con un perfil desfavorable de VPH-16 tumoral circulante, el consumo de tabaco tuvo un impacto importante. Los pacientes no fumadores intensos aún tuvieron una buena evolución, con un 90 % de control de la enfermedad regional. Sin embargo, los pacientes fumadores intensos o la minoría con enfermedad T4 tuvieron un control regional deficiente cuando también presentaron perfiles plasmáticos desfavorables de VPH-16 tumoral circulante.

[0228] En resumen, el ADN plasmático de ctVPH16 revela heterogeneidad genética entre los pacientes con OPSCC asociado al VPH. 4/18 (22 %) pacientes con >10 paquetes-año de consumo de tabaco o enfermedad T4 y OPSCC p16+ fueron negativos para VPH-16/18/31/33/35. Aproximadamente el 30 % de los OPSCC asociados al VPH tienen un perfil ctVPH16 favorable (es decir, >200 copias/mL y cinética de eliminación rápida) perfiles desfavorables de ctVPH16 (es decir, eliminación baja/indetectable o retardada) se asocian fuertemente con la falla regional de la enfermedad en fumadores empedernidos. La evaluación de los perfiles de ctVPH16 puede ayudar a orientar la intensidad del tratamiento en no fumadores y fumadores que reciben tratamiento para el OPSCC asociado al VPH.

[0230] Ejemplo 6: Aplicación a la vigilancia del cáncer en un estudio clínico longitudinal de pacientes que no presentan ninguna evidencia clínica de cáncer después de la terapia.

[0232] Se realizó un estudio prospectivo con 73 pacientes diagnosticados previamente con una neoplasia maligna VPH+, pero que se consideraron sin evidencia de enfermedad tras un tratamiento curativo. Se realizó una prueba de sangre para el VPH a estos pacientes durante un seguimiento rutinario. Ninguno de los pacientes con resultado negativo en la prueba de sangre desarrolló un nuevo cáncer VPH+ ni una recurrencia del cáncer VPH+ previo. Por el contrario, 9 de 13 pacientes con resultado positivo en la prueba de sangre para el VPH fueron diagnosticados con un cáncer VPH+.

[0233] La FIG.7 muestra los resultados de las pruebas de sangre para VPH. Las muestras negativas se distinguen claramente de las positivas. La FIG. 8 muestra el resumen del caso de una paciente que dio positivo en la prueba de sangre para VPH, pero que no presentó ninguna anomalía ni evidencia de enfermedad en una visita de seguimiento con el oncólogo, y que presentó una recurrencia de la enfermedad varios meses después del seguimiento.

[0234] En la FIG. 7 se muestra un resumen de los resultados clínicos. Estos resultados demuestran la eficacia predictiva del análisis de sangre para el VPH. De los 73 pacientes del estudio, 60 dieron negativo en el análisis de sangre para el VPH, y ninguno presentó recurrencia de la enfermedad. Por el contrario, de los 13 pacientes que dieron positivo en el análisis de sangre para el VPH, 9 presentaron recurrencia de la enfermedad, mientras que los 4 restantes se encuentran bajo estrecha vigilancia para detectar la recurrencia.

[0235] Ejemplo 7: Composiciones de oligonucleótidos modificados y métodos para la detección de VPH16 derivado de tumores

[0236] En la Tabla 14 a continuación se proporcionan cebadores y sondas para la detección del VPH16 de origen tumoral, donde el signo "+" significa un ácido nucleico bloqueado. El ADN de VPH16 de origen tumoral se puede detectar y distinguir de fuentes no tumorales utilizando tres conjuntos de cebadores/sondas de la Tabla 14 en una sola reacción de PCR digital multiplex, donde la sonda central tiene un color de detección distinto al de las otras dos sondas (límite). Las dos sondas límite pueden o no tener el mismo color. El ADN de los conjuntos de cebadores/sondas se modifica para incluir extintores, fracciones de Tinte y ácidos nucleicos bloqueados. En este ejemplo, las gotas que son dan resultados positivos para la etiqueta de detección de la sonda central y negativos para la etiqueta de detección de las sondas límite/distales contienen ADN viral derivado del tumor.

[0237] La FIG.9 representa los resultados de una reacción de PCR digital multiplexada para detectar ADN de VPH16 derivado de tumor en una muestra de sangre de un paciente que incluye los conjuntos de sondas cebadoras modificadas 3, 5 y 7 de la Tabla 14, donde la sonda de detección 5 está conjugada con HEX y las sondas de detección 3 y 7 están conjugadas con FAM.

[0238] Como otro ejemplo, los conjuntos de sondas cebadoras modificadas 4, 7 y 10 de la Tabla 14 podrían utilizarse para la reacción de PCR digital multiplexada para detectar ADN de VPH16 derivado de tumores, donde la sonda de detección 7 se conjuga con FAM y las sondas de detección 4 y 10 con HEX. Alternativamente, la sonda de detección 7 podría conjugarse con FAM, la sonda 4 con HEX y la sonda 10 con una fracción de detección diferente.

[0239] En algunas formas de realización, los conjuntos de cebadores/sondas pueden seleccionarse de modo que no haya dos conjuntos consecutivos en la Tabla 14. A modo de ilustración, los ejemplos de tríadas en esta forma de realización sin conjuntos de cebadores/sondas consecutivos incluyen {1, 3, 5}, {1, 3, 8}, {4, 6, 9}, ... {14, 16, 18}. Ejemplos de tríadas con un conjunto de sondas de cebador consecutivas incluyen {1, 2, 5} y {10, 12, 13}.

[0240] A los efectos de esta solicitud, la PCR digital se refiere a cualquier método que los expertos en la materia entiendan, en el que las reacciones de PCR se dividen en varias subreacciones para su análisis. La división puede ser en gotas, micropocillos o cualquier otra partición utilizada para la PCR digital.

[0241] Se debe entender que HEX y FAM se utilizan únicamente con fines ilustrativos y de claridad en todos los ejemplos.

[0242]

[0243] Continuación

[0244]

[0245] Continuación

[0248]

[0250] Ejemplo 8: Composiciones modificadas de oligonucleótidos y métodos para la detección de VPH18 derivado de tumores

[0251] En la Tabla 15 a continuación se proporcionan cebadores y sondas para la detección del VPH18 de origen tumoral, donde el "+" significa un ácido nucleico bloqueado. El ADN del VPH18 de origen tumoral se puede detectar y distinguir de fuentes no tumorales utilizando tres conjuntos de cebadores/sondas de la Tabla 15 en una sola reacción de PCR digital multiplex, donde la sonda central tiene un color de detección distinto al de las otras dos sondas (límite). Las dos sondas límite pueden o no tener el mismo color. El ADN de los conjuntos de cebadores/sondas se modifica para incluir extintores, fracciones de Tinte y ácidos nucleicos bloqueados. En este ejemplo, las gotas que dan resultados positivos para la etiqueta de detección de la sonda central y negativos para la etiqueta de detección de las sondas límite/distales contienen ADN viral derivado del tumor.

[0252] Por ejemplo, los conjuntos de sondas cebadoras modificadas 4, 7 y 10 de la Tabla 15 podrían utilizarse para la reacción de PCR digital multiplexada para detectar ADN de VPH18 derivado de tumores, donde la sonda de detección 7 se conjuga con FAM y las sondas de detección 4 y 10 con HEX. Alternativamente, la sonda de detección 7 podría conjugarse con FAM, la sonda 4 con HEX y la sonda 10 con una fracción de detección diferente.

[0253] En algunas formas de realización, los conjuntos de cebadores/sondas pueden seleccionarse de modo que no haya dos conjuntos consecutivos en la Tabla 15. A modo de ilustración, los ejemplos de tríadas en esta forma de realización sin conjuntos de cebadores/sondas consecutivos incluyen {1, 3, 5}, {1, 3, 8}, {4, 6, 9}, ... {14, 16, 18}. Ejemplos de tríadas con un conjunto de sondas de cebador consecutivas incluyen {1, 2, 5} y {10, 12, 13}.

[0254] A los efectos de esta solicitud, la PCR digital se refiere a cualquier método que los expertos en la materia entiendan, en el que las reacciones de PCR se dividen en varias subreacciones para su análisis. La división puede ser en gotas, micropocillos o cualquier otra partición utilizada para la PCR digital.

[0255] Se debe entender que HEX y FAM se utilizan únicamente con fines ilustrativos y de claridad en todos los ejemplos.

[0256]

[0257] Continuación

[0258]

[0259] Continuación

[0262]

[0264] Ejemplo 9: Composiciones modificadas de oligonucleótidos y métodos para la detección de VPH31 derivado de tumores

[0265] En la Tabla 16 a continuación se presentan cebadores y sondas para la detección del VPH31 de origen tumoral, donde el signo "+" significa un ácido nucleico bloqueado. El ADN del VPH31 de origen tumoral se puede detectar y distinguir de fuentes no tumorales utilizando tres conjuntos de cebadores/sondas de la Tabla 16 en una sola reacción de PCR digital multiplex, donde la sonda central tiene un color de detección distinto al de las otras dos sondas (límite). Las dos sondas límite pueden o no tener el mismo color. El ADN de los conjuntos de cebadores/sondas se modifica para incluir extintores, fracciones Tintes y ácidos nucleicos bloqueados. En este ejemplo, las gotas que dan positivo para la etiqueta de detección de la sonda central y negativo para la etiqueta de detección de las sondas límite/distales contienen ADN viral de origen tumoral.

[0266] Por ejemplo, los conjuntos de sondas cebadoras modificadas 4, 7 y 10 de la Tabla 16 podrían utilizarse para la reacción de PCR digital multiplexada para detectar ADN de VPH31 derivado de tumores, donde la sonda de detección 7 se conjuga con FAM y las sondas de detección 4 y 10 con HEX. Alternativamente, la sonda de detección 7 podría conjugarse con FAM, la sonda 4 con HEX y la sonda 10 con una fracción de detección diferente.

[0267] En algunas formas de realización, los conjuntos de cebadores y sondas pueden seleccionarse de modo que no haya dos conjuntos consecutivos en la Tabla 16. A modo de ilustración, los ejemplos de tríadas en esta forma de realización sin conjuntos de cebadores y sondas consecutivos incluyen {1, 3, 5}, {1, 3, 8}, {4, 6, 9}, ... {13, 15, 17}. Ejemplos de tríadas con un conjunto de sondas de cebador consecutivas incluyen {1, 2, 5} y {10, 12, 13}.

[0268] A los efectos de esta solicitud, la PCR digital se refiere a cualquier método que los expertos en la materia entiendan, en el que las reacciones de PCR se dividen en varias subreacciones para su análisis. La división puede ser en gotas, micropocillos o cualquier otra partición utilizada para la PCR digital.

[0269] Se debe entender que HEX y FAM se utilizan únicamente con fines ilustrativos y de claridad en todos los ejemplos.

[0270] Continuación

[0271]

[0272] Continuación

[0273]

[0274] Continuación

[0277]

[0279] Ejemplo 10: Composiciones modificadas de oligonucleótidos y métodos para la detección de VPH33 derivado de tumores

[0280] En la Tabla 17 a continuación se presentan cebadores y sondas para la detección del VPH33 tumoral, donde el signo "+" indica un ácido nucleico bloqueado. El ADN del VPH33 tumoral puede detectarse y distinguirse de fuentes no tumorales utilizando tres conjuntos de cebadores/sondas de la Tabla 17 en una única reacción de PCR digital multiplex. La sonda central tiene un color de detección distinto al de las otras dos sondas (límite). Las dos sondas límite pueden tener o no el mismo color. El ADN de los conjuntos de cebadores/sondas se modifica para incluir extintores, fracciones de Tinte y ácidos nucleicos bloqueados. En este ejemplo, las gotas que son positivas para la etiqueta de detección de la sonda central y negativas para la etiqueta de detección de las sondas límite/distales contienen ADN viral tumoral.

[0281] Por ejemplo, los conjuntos de sondas de cebador modificadas 4, 7 y 10 de la Tabla 17 podrían usarse para la reacción de PCR digital multiplexada para detectar ADN de VPH33 derivado de tumor, donde la sonda de detección 7 está conjugada con FAM y las sondas de detección 4 y 10 están conjugadas con HEX. Alternativamente, la detección 7 podría conjugarse con FAM, la sonda 4 con HEX y la sonda 10 conjugarse con una fracción de detección diferente.

[0282] En algunas formas de realización, los conjuntos de cebadores y sondas pueden seleccionarse de modo que no haya dos conjuntos consecutivos en la Tabla 17. A modo de ilustración, los ejemplos de tríadas en esta forma de realización sin conjuntos de cebadores y sondas consecutivos incluyen {1, 3, 5}, {1, 3, 8}, {4, 6, 9}, ... {11, 13, 15}. Ejemplos de tríadas con un conjunto de sondas de cebador consecutivas incluyen {1, 2, 5} y {10, 12, 13}.

[0283] A los efectos de esta solicitud, la PCR digital se refiere a cualquier método que los expertos en la materia entiendan, en el que las reacciones de PCR se dividen en varias subreacciones para su análisis. La división puede ser en gotas, micropocillos o cualquier otra partición utilizada para la PCR digital.

[0284] Se debe entender que HEX y FAM se utilizan únicamente con fines ilustrativos y de claridad en todos los ejemplos.

[0285]

[0286] Continuación

[0287]

[0288] Ejemplo 11: Composiciones modificadas de oligonucleótidos y métodos para la detección de VPH35 derivado de tumores

[0289] En la Tabla 18 a continuación se presentan cebadores y sondas para la detección del VPH35 tumoral, donde el signo "+" indica un ácido nucleico bloqueado. El ADN del VPH35 tumoral se puede detectar y distinguir de las fuentes no tumorales utilizando tres conjuntos de cebadores/sondas de la Tabla 18 en una única reacción de PCR digital multiplex. La sonda central tiene un color de detección distinto al de las otras dos sondas (límite). Las dos sondas límite pueden tener o no el mismo color. El ADN de los conjuntos de cebadores/sondas se modifica para incluir extintores, fracciones de Tinte y ácidos nucleicos bloqueados. En este ejemplo, las gotas que son positivas para la etiqueta de detección de la sonda central y negativas para la etiqueta de detección de las sondas límite/distales contienen ADN viral tumoral.

[0290] Por ejemplo, los conjuntos de sondas cebadoras modificadas 4, 7 y 10 de la Tabla 18 podrían utilizarse para la reacción de PCR digital multiplexada para detectar ADN de VPH35 derivado de tumores, donde la sonda de detección 7 se conjuga con FAM y las sondas de detección 4 y 10 con HEX. Alternativamente, la sonda de detección 7 podría conjugarse con FAM, la sonda 4 con HEX y la sonda 10 con una fracción de detección diferente.

[0291] En algunas formas de realización, los conjuntos de cebadores/sondas pueden seleccionarse de modo que no haya dos conjuntos consecutivos en la Tabla 18. A modo de ilustración, se muestran ejemplos de tríadas en esta forma de realización sin conjuntos de sondas de cebador consecutivos incluyen {1, 3, 5}, {1, 3, 8}, {4, 6, 9}, ... {12, 14, 16}. Ejemplos de tríadas con un conjunto de sondas de cebador consecutivas incluyen {1, 2, 5} y {10, 12, 13}.

[0292] A los efectos de esta solicitud, la PCR digital se refiere a cualquier método que los expertos en la materia entiendan, en el que las reacciones de PCR se dividen en varias subreacciones para su análisis. La división puede ser en gotas, micropocillos o cualquier otra partición utilizada para la PCR digital.

[0293] Se debe entender que HEX y FAM se utilizan únicamente con fines ilustrativos y de claridad en todos los ejemplos.

[0296]

[0297] Continuación

[0298]

[0299] Continuación

[0302]

[0305] Ejemplo 12: Composiciones modificadas de oligonucleótidos y métodos para la detección de VPH45 derivado de tumores

[0306] En la Tabla 19 a continuación se presentan cebadores y sondas para la detección del VPH45 tumoral, donde el signo "+" indica un ácido nucleico bloqueado. El ADN del VPH45 tumoral se puede detectar y distinguir de las fuentes no tumorales utilizando tres conjuntos de cebadores/sondas de la Tabla 19 en una única reacción de PCR digital multiplex. La sonda central tiene un color de detección distinto al de las otras dos sondas (límite). Las dos sondas límite pueden tener o no el mismo color. El ADN de los conjuntos de cebadores/sondas se modifica para incluir extintores, fracciones de Tinte y ácidos nucleicos bloqueados. En este ejemplo, las gotas que son positivas para la etiqueta de detección de la sonda central y negativas para la etiqueta de detección de las sondas límite/distales contienen ADN viral tumoral.

[0307] Por ejemplo, los conjuntos de sondas cebadoras modificadas 4, 7 y 10 de la Tabla 19 podrían utilizarse para la reacción de PCR digital multiplexada para detectar ADN de VPH45 derivado de tumores, donde la sonda de detección 7 se conjuga con FAM y las sondas de detección 4 y 10 con HEX. Alternativamente, la sonda de detección 7 podría conjugarse con FAM, la sonda 4 con HEX y la sonda 10 con una fracción de detección diferente.

[0308] En algunas formas de realización, los conjuntos de cebadores/sondas pueden seleccionarse de modo que no haya dos conjuntos consecutivos en la Tabla 19. A modo de ilustración, se muestran ejemplos de tríadas en esta forma de realización sin conjuntos de sondas de cebador consecutivos incluyen {1, 3, 5}, {1, 3, 8}, {4, 6, 9}, ... {13, 15, 17}. Ejemplos de tríadas con un conjunto de sondas de cebador consecutivas incluyen {1, 2, 5} y {10, 12, 13}.

[0309] A los efectos de esta solicitud, la PCR digital se refiere a cualquier método que los expertos en la materia entiendan, en el que las reacciones de PCR se dividen en varias subreacciones para su análisis. La división puede ser en gotas, micropocillos o cualquier otra partición utilizada para la PCR digital.

[0310] Se debe entender que HEX y FAM se utilizan únicamente con fines ilustrativos y de claridad en todos los ejemplos.

[0312]

[0313] Continuación

[0314]

[0315] Continuación

[0318]

[0320] Ejemplo 13: Composiciones modificadas de oligonucleótidos y métodos para la detección de EBV derivado de tumores

[0321] En la Tabla 20 a continuación se proporcionan cebadores y sondas para la detección del VEB de origen tumoral, donde el signo "+" significa un ácido nucleico bloqueado. El ADN del VEB de origen tumoral se puede detectar y distinguir de fuentes no tumorales utilizando tres conjuntos consecutivos de cebadores/sondas de la Tabla 20 en una sola reacción de PCR digital multiplex.

[0322] La sonda central tiene un color de detección distinto al de las otras dos sondas (de límite). Ambas sondas de límite pueden tener o no el mismo color. En este ejemplo, las gotas que dan positivo para la etiqueta de detección de la sonda central y negativo para la etiqueta de detección de las sondas de límite/distal contienen ADN viral de origen tumoral.

[0323] Por ejemplo, los conjuntos de sondas de cebador modificados 4, 5 y 6 de la Tabla 20 podrían utilizarse para la reacción de PCR digital multiplexada para detectar ADN del VEB derivado de tumores, donde la sonda de detección 5 se conjuga con FAM y las sondas de detección 4 y 6 se conjugan con HEX. Alternativamente, la sonda de detección 5 podría conjugarse con FAM, la sonda 4 con HEX y la sonda 6 con una fracción de detección diferente.

[0324] A modo de ilustración, los ejemplos de tres conjuntos de sondas de cebador consecutivos incluyen {1, 2, 3}, {2, 3, 4}, {3, 4, 5}, ... {15, 16, 17}.

[0325] A los efectos de esta solicitud, la PCR digital se refiere a cualquier método que los expertos en la materia entiendan, en el que las reacciones de PCR se dividen en varias subreacciones para su análisis. La división puede ser en gotas, micropocillos o cualquier otra partición utilizada para la PCR digital.

[0326] Se debe entender que HEX y FAM se utilizan únicamente con fines ilustrativos y de claridad en todos los ejemplos.

[0327]

[0328] Continuación

[0329]

[0330] Continuación

[0331]

[0332] Continuación

[0333]

Claims (6)

1. REIVINDICACIONES MODIFICADAS

1. Una composición para detectar el virus del papiloma humano tipo 16 (VPH16) derivado de un tumor en una muestra de un sujeto, que comprende una tríada de conjuntos de cebadores/sondas de oligonucleótidos modificados que comprenden:

conjuntos de cebadores/sondas numerados 3, 5 y 7 como se muestra en la Tabla 14 para VPH16;

en donde el conjunto de cebador/sonda de la tríada numerada 3 como se muestra en la Tabla 14 para VPH16 está configurado para producir una primera señal de amplicón,

en donde el conjunto de cebador/sonda de la tríada numerada 5 como se muestra en la Tabla 14 para VPH16 está configurado para producir una segunda señal de amplicón,

en donde el conjunto de cebador/sonda de la tríada numerada 7 como se muestra en la Tabla 14 para VPH16 está configurado para producir una tercera señal de amplicón.

2. Un método para detectar el virus del papiloma humano tipo 16 (VPH16) derivado de un tumor en una muestra de un sujeto, comprendiendo el método:

proporcionar al menos la tríada de conjuntos de cebadores/sondas de oligonucleótidos modificados de la composición de la reivindicación 1;

fraccionar una pluralidad de fragmentos de ADN del VPH de la muestra en gotitas a una concentración en la que solo 0 o 1 molécula de los fragmentos de ADN está presente en cada gotita; amplificar el ADN del VPH en cada gotita con la tríada de conjuntos de cebador/sonda para producir señales de amplicón; y

detectar en cada gota cualquier señal de amplicón;

en donde la detección dentro de una gota del segundo amplicón, pero no del primero o del tercer amplicón, indica que el fragmento de ADN del VPH fraccionado en la gota es un fragmento de ADN del VPH derivado del tumor.

3. El método de la reivindicación 2, en el que los fragmentos de ADN se fraccionan en microgotitas mediante emulsificación.

4. El método de cualquiera de las reivindicaciones 2 a 3, en el que el ADN se amplifica utilizando un método basado en PCR.

5. El método de cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4, en el que la muestra es una muestra de sangre, saliva, gárgaras u orina.

6. El método de la reivindicación 5, en el que la muestra es una muestra de sangre.