ES3057697T3

ES3057697T3 - Using infectious nucleic acid to treat cancer

Info

Publication number: ES3057697T3
Application number: ES19767370T
Authority: ES
Inventors: Autumn J Schulze; Stephen James Russell; Noura B Elsedawy
Original assignee: Mayo Foundation for Medical Education and Research; Mayo Clinic in Florida
Current assignee: Mayo Foundation for Medical Education and Research; Mayo Clinic in Florida
Priority date: 2018-03-12
Filing date: 2019-03-12
Publication date: 2026-03-04
Anticipated expiration: 2039-03-12
Also published as: CA3091958A1; JP2024037797A; EP3765048A4; EP3765048A1; EP4682271A2; CN111867609A; WO2019178098A1; JP2021517456A; JP7399868B2; US20250249053A1; US20200405791A1; EP3765048B1; EP4682271A3

Abstract

Este documento proporciona métodos y materiales relacionados con el uso de virus que codifican ácidos nucleicos infecciosos para reducir el número de células cancerosas viables en mamíferos. Por ejemplo, se proporcionan métodos para el uso de ácidos nucleicos infecciosos para tratar el cáncer, ácidos nucleicos virales modificados y métodos para la producción de ácidos nucleicos virales modificados. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

[0001] DESCRIPCIÓN

[0002] Uso de ácido nucleico infeccioso para tratar el cáncer

[0003] Remisión a solicitudes relacionadas

[0004] Esta solicitud reivindica el beneficio de la solicitud de patente de Estados Unidos n.º de serie 62/641.814, presentada el 12 de marzo de 2018.

[0005] Antecedentes

[0006] 1. Campo técnico

[0007] Este documento se refiere a métodos y materiales implicados en el tratamiento del cáncer con ácido nucleico vírico (por ejemplo, ácido nucleico infeccioso que codifica un picornavirus).

[0008] 2. Información antecedente

[0009] El género enterovirus es un miembro de la familiaPicornaviridaey comprende cuatro especies de enterovirus humanos, HEV-A a -D. Los enterovirus son virus pequeños sin envoltura con genomas de ARN monocatenario de sentido positivo que tienen aproximadamente 7500 nucleótidos de longitud. Después de la internalización celular, el virión se descubre y el ARN genómico se traduce inmediatamente en una sola poliproteína grande, que se procesa por la proteasa codificada por el virus (3C) para producir las proteínas de la cápside y las proteínas no estructurales implicadas en la replicación vírica. A partir del ARN vírico de sentido positivo, la ARN polimerasa dependiente de ARN codificada por el virus (RdRp-3D) sintetiza una hebra de ARN de sentido negativo. El ARN de hebra negativa sirve como molde para sintetizar más moléculas de ARN de sentido positivo que pueden traducirse, replicarse o empaquetarse. La descendencia del virus se acumula en el citoplasma hasta que el virus induce la lisis celular, liberando la descendencia al entorno.

[0010] El virus de Coxsackie A21 (CVA21) es un picornavirus HEV-C de origen natural conocido por provocar infecciones de las vías respiratorias altas o, en casos más graves, miositis en seres humanos. Los bebés y los individuos inmunodeprimidos tienen más probabilidades de desarrollar complicaciones más graves. La molécula de adhesión intracelular 1 (ICAM-1) es el receptor principal del virus, y el CVA21 ha demostrado una potente actividad oncolítica contra una diversidad de células cancerosas que expresan ICAM-1. Sin embargo, los ratones inmunodeprimidos portadores de xenoinjertos de melanoma y mieloma humanos desarrollan una miositis mortal de aparición rápida (que se presenta como parálisis flácida de las extremidades) después del tratamiento con CVA21 formulado como partículas víricas o como ácido nucleico infeccioso.

[0011] Ruiz, Autumn J.,et al., Journal of virology 90.8 (2016): 4078-4092, describe el mengovirus deslocalizado por microARN para viroterapia oncolítica.

[0012] El documento WO 2019/014623 describe polinucleótidos que incluyen una secuencia de ácido nucleico que codifica un genoma vírico competente en la replicación, en donde el polinucleótido puede producir un virus competente en replicación cuando se introduce en una célula mediante un vehículo de administración no vírico, y la encapsulación de los polinucleótidos y el uso de los polinucleótidos y/o partículas para el tratamiento y la prevención del cáncer.

[0013] El documento WO 2019/037642 describe el virus ECHO de tipo 25 (ECHO25) o una forma modificada del mismo, o una secuencia genómica o secuencia de ADNc que comprende ECHO25 o la forma modificada del mismo, o una molécula de ácido nucleico de una secuencia complementaria de dicha secuencia genómica o secuencia de ADNc, el uso del mismo para tratar tumores en sujetos y el uso del mismo en la preparación de una composición farmacéutica para tratar tumores en un sujeto.

[0014] El documento WO 2008/103755 describe métodos y materiales relacionados con el uso de ácido nucleico codificante de virus para reducir el número de células cancerosas viables en un mamífero. Por ejemplo, se describen métodos para usar ácido nucleico infeccioso para tratar el cáncer, ácido nucleico vírico manipulado, métodos para generar ácido nucleico vírico manipulado, métodos para identificar ácido nucleico infeccioso para tratar el cáncer, métodos y materiales para controlar la lisis celular mediada por virus, y métodos y materiales para evaluar el control de la lisis celular mediada por virus.

[0015] He, Feng,et al., Journal of virology 89.2 (2015): 908-916, describe que el virus de Coxsackie B3 manipulado para contener dianas de microARN para microARN específicos de músculo presenta una virulencia cardiotrópica atenuada en ratones.

[0016] Elsedawy, Noura, Autumn Ruiz y Stephen Russell, Molecular Therapy 24 (2016): S29 describe el diseño del ARN infeccioso del virus de Coxsackie A21 redirigido por microARN para el tratamiento del cáncer.

[0017] Sumario

[0019] Este documento proporciona métodos y materiales relacionados con el uso de ácido nucleico (por ejemplo, ácido nucleico infeccioso) codificante de virus para reducir el número de células cancerosas viables en un mamífero. Por ejemplo, este documento proporciona métodos para usar ácido nucleico infeccioso para tratar el cáncer, ácido nucleico vírico manipulado y métodos para generar ácido nucleico vírico manipulado.

[0021] La dirección de microARN puede usarse para regular el tropismo de los virus de ARN de sentido positivo. Esta técnica aprovecha los microARN (miARN) específicos de tejido expresados en las células hospedadoras donde la replicación vírica es indeseable (Kellyet al., Nat. Med., 14:1278-1283 (2008); Barneset al., Cell Host Microbe, 4:239-248 (2008); y Ruizet al., J. Virol., 90:4078-4092 (2016)). Las secuencias diana de los miARN pueden insertarse en el genoma vírico de modo que el genoma y los ARNm se reconozcan por los miARN del hospedador y posteriormente se degraden o repriman en la traducción, lo que evita la replicación vírica y la toxicidad. Las células cancerosas a menudo tienen niveles de miARN desregulados, lo que permite la replicación permisiva del virus y la posterior destrucción de las células tumorales.

[0023] Las formas de las moléculas de ARN, incluyendo los genomas víricos, están diseñadas específicamente para regular la estabilidad, las interacciones intramoleculares e intermoleculares y la actividad. Por lo tanto, es razonable especular que la inserción de nucleótidos adicionales (por ejemplo, dianas de miARN) en cualquier lugar del genoma vírico tiene el potencial de alterar significativamente una diversidad de propiedades biológicas del virus. Por ejemplo, las secuencias diana de los microARN pueden insertarse en el genoma vírico en la región UTR 3', y el virus rescatado puede replicarse con una cinética similar a la del virus sin modificar, mantener la actividad oncolítica contra los xenoinjertos humanosin vivoy reducir la toxicidad en los tejidos normales, como se describe en otra parte (Kellyet al., Nat. Med., 14:1278-1283 (2008)). Sin embargo, el rescate de este virus después de la transfección de transcritos de ARN que codifican este genoma vírico modificado se retrasó significativamente.

[0025] Además, los virus de tipo silvestre pueden presentar toxicidad significativa. Por ejemplo, la inyección de transcritos de ARN que codifican el genoma vírico de tipo silvestre en ratones portadores de xenoinjertos de melanoma o mieloma humanos provocó una infección vírica que se propaga que provocó la reducción del tumor y una toxicidad mortal, como se describe en otra parte (Hadacet al., Molecular Therapy, 19(6):1041-1047 (2011)). Por el contrario, la inyección de transcritos de ARN que codifican el genoma vírico dirigido por miARN de Kellyet al.no provocó una infección que se propaga y, por tanto, no tiene valor terapéutico como ácido nucleico infeccioso.

[0027] Como se describe en este documento, los virus oncolíticos dirigidos por microARN se formularon como ácido nucleico infeccioso usando una cadena principal del virus de Coxsackie A21. Se diseñaron diversos mecanismos de inserción alternativos y se construyeron los genomas víricos. Además, se evaluó la cinética de rescate del virus a partir de transcritos de ARN, la cinética de replicación del virus rescatado, la estabilidad de la diana del microARN, la actividad oncolítica y la toxicidad; cada una de ellas en comparación con el genoma sin modificar y el genoma dirigido por miARN de Kellyet al.Cada construcción sometida a prueba presentó cinética de rescate vírico potenciada en comparación con la construcción de Kellyet al.y mantuvo la actividad oncolítica. Además, una de las construcciones sometidas a prueba (denominada CVA21-ΔV<2x>en este documento) mejoró la toxicidad y prolongó significativamente la supervivencia global.

[0029] La construcción CVA21-ΔV<2x>es un ejemplo de genoma vírico dirigido por microARN formulado como ácido nucleico infeccioso que presenta un índice terapéutico aceptable que se validó experimentalmente. Las construcciones proporcionadas en este documento pueden usarse para terapia antineoplásica, vacunación con seguridad potenciada o segregación del crecimiento vírico en diversas células productoras y diana, lo que facilita la fabricación y la evaluación experimental del ciclo vital del virus y la función de las diferentes células en la patogenia. Además, las técnicas para la dirección de microARN proporcionadas en este documento pueden usarse con otros picornavirus que codifican IRES de tipo I.

[0031] En general, un aspecto de este documento destaca una construcción de ácido nucleico que comprende un ácido nucleico infeccioso que comprende un genoma de picornavirus que comprende uno o más elementos de secuencia heterólogos de 20 o más bases, en donde dicho genoma de picornavirus es un genoma de virus de Coxsackie A21, y en donde dicho genoma de picornavirus carece de al menos 20 nucleótidos desde la posición 631 hasta la posición 698 de un genoma de virus de Coxsackie A21 de tipo silvestre, en donde dicho elemento de secuencia heterólogo es un elemento de respuesta a microARN insertado entre la posición 631 y la posición 698 como se encuentra en el genoma del virus de Coxsackie A21 de tipo silvestre, y en donde un elemento diana de microARN de dicho elemento de respuesta a microARN comprende al menos una región de complementariedad con un microARN presente en células no cancerosas, y donde la infectividad específica de la construcción es suficiente para iniciar una infección por picornavirus que se propaga cuando se administra a un mamífero vivo, en donde dicha infectividad específica es la relación entre los virus infecciosos y el total de moléculas de ácido nucleico. El mamífero puede ser un ser humano. La construcción puede formularse como ADN plasmídico. La construcción puede formularse como una molécula de ARN. Al menos uno del uno o más elementos de secuencia heterólogos puede ser un elemento de respuesta a microARN. Un elemento de diana de microARN del elemento de respuesta a microARN puede comprender (o puede consistir esencialmente en o puede consistir en) al menos una región de complementariedad con un microARN presente en células no cancerosas. Al menos uno del uno o más elementos de secuencia heterólogos puede ser un elemento de respuesta a microARN específico de tejido. Al menos uno del uno o más elementos de secuencia heterólogos puede ser un elemento de respuesta a microARN específico de músculo, específico de cerebro o específico de corazón. Al menos uno del uno o más elementos de secuencia heterólogos puede insertarse en la región no codificante 5' del genoma del picornavirus como sustitución de nucleótidos dentro de una región de exploración. El genoma de picornavirus puede comprender un sitio interno de entrada del ribosoma de tipo I. El genoma de picornavirus puede comprender un elemento diana de microARN para miR-133. El genoma de picornavirus puede comprender más de un elemento diana de microARN para miR-133. El genoma de picornavirus puede comprender un elemento diana de microARN para miR-206. El genoma de picornavirus puede comprender más de un elemento diana de microARN para miR-206. El genoma de picornavirus puede comprender más de un elemento diana de microARN para miR-133 y más de un elemento diana de microARN para miR-206. El genoma de picornavirus puede ser un genoma del virus de Coxsackie A21, y el genoma de picornavirus puede carecer de los nucleótidos 631 a 698 de un genoma del virus de Coxsackie A21 de tipo silvestre. En algunos casos, la construcción de ácido nucleico puede ser ADN, y la construcción de ácido nucleico puede codificar una ribozima. La ribozima puede diseñarse para escindir una parte 5' de ARN de una molécula de ARN transcrita a partir de la construcción de ácido nucleico, creando de ese modo un ARN escindido por ribozima. El ARN escindido por ribozima puede tener un extremo 5' sin ribonucleótidos que no estén presentes en un genoma de picornavirus. En algunos casos, la construcción de ácido nucleico puede ser ARN, y la construcción de ácido nucleico puede incluir una ribozima. La ribozima puede diseñarse para escindir una parte 5' del ARN de la construcción de ácido nucleico, creando de ese modo un ARN escindido por ribozima. El ARN escindido por ribozima puede tener un extremo 5' sin ribonucleótidos que no estén presentes en un genoma de picornavirus. En algunos casos, la construcción de ácido nucleico puede ser ADN, y la construcción de ácido nucleico puede incluir un sitio de corte de endonucleasa de restricción. El sitio de corte de la endonucleasa de restricción puede diseñarse para permitir la escisión, por medio de una endonucleasa de restricción, de una parte 3' de dicha construcción de ácido nucleico, creando de ese modo una construcción de ácido nucleico escindida por endonucleasa de restricción. La construcción de ácido nucleico escindida por endonucleasa de restricción puede codificar un virus que tiene un extremo 3' con menos de 10 ribonucleótidos que no están presentes en un genoma de picornavirus (por ejemplo, un genoma de picornavirus que tiene un extremo 3' sin ribonucleótidos que no están presentes en un genoma de picornavirus). En algunos casos, la construcción de ácido nucleico puede ser ADN, la construcción de ácido nucleico puede codificar una ribozima y la construcción de ácido nucleico puede incluir un sitio de corte de endonucleasa de restricción. La ribozima puede diseñarse para escindir una parte 5' de ARN de una molécula de ARN transcrita a partir de la construcción de ácido nucleico, creando de ese modo un ARN escindido por ribozima. El ARN escindido por ribozima puede tener un extremo 5' sin ribonucleótidos que no estén presentes en un genoma de picornavirus. El sitio de corte de la endonucleasa de restricción puede diseñarse para permitir la escisión, por medio de una endonucleasa de restricción, de una parte 3' de la construcción de ácido nucleico, creando de ese modo una construcción de ácido nucleico escindida por endonucleasa de restricción. La construcción de ácido nucleico escindida por endonucleasa de restricción puede codificar un virus que tiene un extremo 3' con menos de 10 ribonucleótidos que no están presentes en un genoma de picornavirus (por ejemplo, un virus tiene un extremo 3' sin ribonucleótidos que no están presentes en un genoma de picornavirus).

[0033] En otro aspecto, este documento destaca una composición para su uso en un método de tratamiento del cáncer al reducir el número de células cancerosas en un mamífero vivo. El método comprende administrar una construcción al mamífero. El mamífero puede ser un ser humano. La construcción se formula como una molécula de ARN. Al menos uno del uno o más elementos de secuencia heterólogos puede ser un elemento de respuesta a microARN. Un elemento de diana de microARN del elemento de respuesta a microARN puede comprender (o puede consistir esencialmente en o puede consistir en) al menos una región de complementariedad con un microARN presente en células no cancerosas. Al menos uno del uno o más elementos de secuencia heterólogos puede ser un elemento de respuesta a microARN específico de tejido. Al menos uno del uno o más elementos de secuencia heterólogos puede ser un elemento de respuesta a microARN específico de músculo, específico de cerebro o específico de corazón. Al menos uno del uno o más elementos de secuencia heterólogos puede insertarse en la región no codificante 5' del genoma del picornavirus como sustitución de nucleótidos dentro de una región de exploración. El genoma de picornavirus puede comprender un sitio interno de entrada del ribosoma de tipo I. El genoma de picornavirus puede ser un genoma de virus de Coxsackie, virus de la poliomielitis, virus ECHO, rinovirus o enterovirus. El genoma de picornavirus puede ser un genoma del virus de Coxsackie A21. El genoma de picornavirus puede comprender un elemento diana de microARN para miR-133. El genoma de picornavirus puede comprender más de un elemento diana de microARN para miR-133. El genoma de picornavirus puede comprender un elemento diana de microARN para miR-206. El genoma de picornavirus puede comprender más de un elemento diana de microARN para miR-206. El genoma de picornavirus puede comprender más de un elemento diana de microARN para miR-133 y más de un elemento diana de microARN para miR-206. El genoma de picornavirus puede ser un genoma del virus de Coxsackie A21, y el genoma de picornavirus puede carecer de al menos 20 nucleótidos desde la posición 631 hasta la posición 698 de un genoma del virus de Coxsackie A21 de tipo silvestre. El genoma de picornavirus puede ser un genoma del virus de Coxsackie A21, y el genoma de picornavirus puede carecer de los nucleótidos 631 a 698 de un genoma del virus de Coxsackie A21 de tipo silvestre. Las células cancerosas pueden ser células de melanoma, mieloma, de cáncer pancreático, de próstata, de vejiga, de pulmón no microcítico o de mama. La etapa de administración puede provocar una reducción del número de células no cancerosas presentes en el mamífero que experimentan lisis celular después de la etapa de administración, en comparación con el número de células no cancerosas que experimentan lisis cuando se administra la construcción comparable a un mamífero comparable. La etapa de administración puede provocar un número similar o un aumento del número de células cancerosas presentes en el mamífero vivo que experimentan lisis celular después de la etapa de administración, en comparación con el número de células cancerosas que experimentan lisis cuando se administra la construcción comparable a un mamífero comparable.

[0034] En otro aspecto, este documento destaca un método para generar ARN infeccioso que comprende un genoma de picornavirus que comprende uno o más elementos de secuencia heterólogos de 20 o más bases, en donde dicho genoma de picornavirus es un genoma de virus de Coxsackie A21, y en donde dicho genoma de picornavirus carece de al menos 20 nucleótidos desde la posición 631 hasta la posición 698 de un genoma de virus de Coxsackie A21 de tipo silvestre, en donde dicho elemento de secuencia heterólogo es un elemento de respuesta a microARN insertado entre la posición 631 y la posición 698, como se encuentra en el genoma del virus de Coxsackie A21 de tipo silvestre, en donde la infectividad específica de dicho ARN infeccioso es suficiente para iniciar una infección por picornavirus que se propaga cuando se administra a un mamífero vivo, donde la infectividad específica del ARN infeccioso es suficiente para iniciar una infección por picornavirus que se propaga cuando se administra a un mamífero vivo. El método comprende proporcionar una construcción de ADN que codifica el ARN infeccioso, donde la construcción de ADN codifica una ribozima, y donde la construcción de ácido nucleico incluye un sitio de corte por endonucleasa de restricción; y poner en contacto la construcción de ADN con una endonucleasa de restricción en condiciones donde se elimina al menos una parte de la construcción de ADN, produciendo de ese modo una construcción de ADN escindida por endonucleasa de restricción; y donde la construcción de ADN escindida por endonucleasa de restricción codifica un ARN infeccioso que tiene ARN que no es de picornavirus ubicado en un extremo 5', y donde la ribozima escinde el ARN que no es de picornavirus ubicado en el extremo 5' para generar el ARN infeccioso. El ARN infeccioso codificado por la construcción de ADN escindida por endonucleasa de restricción puede incluir un extremo 3' con menos de 10 ribonucleótidos que no están presentes en un genoma de picornavirus. El ARN infeccioso codificado por la construcción de ADN escindida por endonucleasa de restricción puede incluir un extremo 3' sin ribonucleótidos que no estén presentes en un genoma de picornavirus. El ARN infeccioso puede incluir un extremo 5' sin ribonucleótidos que no estén presentes en el genoma de picornavirus.

[0035] En otro aspecto, este documento destaca un modelo inmunocompetente que puede infectarse por ácido nucleico infeccioso que codifica un virus, donde el modelo inmunocompetente incluye una célula de ratón que expresa ICAM-1 humana. La célula de ratón puede ser una célula B16-F10 de melanoma murino.

[0036] La expresión "infectividad específica", como se usa en este documento, se refiere a la relación entre los virus infecciosos y el total de moléculas de ácido nucleico (es decir, el número de unidades formadoras de placas obtenidas a partir de un número de

[0037] La expresión "región de exploración", como se usa en este documento, se refiere al espacio entre los sitios AUG inactivos o crípticos en los sitios internos de entrada del ribosoma y el AUG auténtico. Los ribosomas explorar esta región antes del inicio de la traducción. Este espacio en general varía de 35-160 nucleótidos en picornavirus.

[0038] Salvo que se definan de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados en este documento tienen el mismo significado que el comprendido habitualmente por un experto en la materia a la que pertenece esta invención. Aunque pueden usarse métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en este documento para poner en práctica la invención, a continuación se describen métodos y materiales adecuados. En caso de conflicto entre la presente memoria descriptiva y una referencia mencionada en este documento, prevalecerá la presente memoria descriptiva, incluyendo las definiciones. Además, los materiales, métodos y ejemplos son ilustrativos únicamente y no están destinados a ser limitantes.

[0039] Los detalles de una o más realizaciones de la invención se exponen en los dibujos adjuntos y en la descripción a continuación. Otras características, objetos y ventajas de la invención serán evidentes a partir de la descripción y los dibujos, y a partir de las reivindicaciones.

[0040] Descripción de los dibujos

[0041] Figura 1. Representación esquemática de posibles sitios de inserción localizados en UTR para el elemento de respuesta (RE) a microARN. (A) Secuencias de elementos de respuesta que deslocalización muscular. Parte superior = SEQ ID NO: 1; parte inferior = SEQ ID NO:2. Las construcciones 1X contienen una copia cada una, y las construcciones 2X contienen dos copias cada una de las secuencias diana complementarias a miR-133 (subrayadas) y miR-206 (en cursiva). (B) Diagrama del genoma CVA21 con los sitios de inserción RE analizados. Están marcados los dominios I a VI en la UTR 5' y los sitios de inserción de elementos de respuesta. El sitio AUG críptico en el dominio VI está representado por una línea doble. (C) Izquierda: Modelo de estructura secundaria del ARN para la UTR 3' de CVA21<WT>y ubicación del RE construido por Kellyet al.(SEQ ID NO:3). Derecha: Modelo de estructura secundaria para construcciones CVA21-3'TR (SEQ ID NO:4). Los residuos implicados en la formación del "dominio kissing" se muestran con líneas de interconexión. Los residuos replicados para formar el TR están marcados. (D) Nomenclatura de todas las construcciones CVA21 dirigidas por microARN analizadas.

[0042] Figura 2. La transfección del ARN infeccioso miRT-CVA21 produce descendencia vírica a tasas similares a las del ARN de CVA21 de tipo silvestre. (A) Panel superior: Células H1-HeLa 72 horas después de la transfección con 2,5 µg de ARN infeccioso que codifica CVA21 o miRT-CVA21. Panel inferior: Células H1-HeLa 24 horas después de la infección con lisados aclarados recogidos de células transfectadas. (B-C) Producción a lo largo del tiempo de virus infeccioso en células H1-HeLa (B) y células Mel624 (C) transfectadas con 1 µg de ARN infeccioso que codifica CVA21 o miRT-CVA21. Los experimentos se repitieron al menos por triplicado. Los datos se representan como la concentración vírica media /- desviación típica.

[0043] Figura 3. La localización de RE dentro de la UTR 5' potencia la regulación del tropismo vírico. (A) Curva de crecimiento en una etapa de miRT-CVA21 sin modifica y nuevo. (B) Parte superior: Viabilidad de las células 24 horas después de la infección a una MOI de 1 con miRT-CVA21 sin modificar o nuevo de células H1-HeLa pretratadas con 100 nM de miméticos de miARN (marcados en el eje x). Parte inferior: Concentraciones víricas de los sobrenadantes recogidos de las infecciones correspondientes. Los experimentos se realizaron por triplicado y los datos se representan como la viabilidad media o concentración vírica media /- desviación típica.

[0044] Figura 4. El tratamiento con ARN de CVA21-ΔV(2x) produce una regresión tumoral completa sin provocar toxicidad. (A) Mediciones del volumen y el peso del tumor de ratones SCID portadores de tumores Mel624 subcutáneos después del tratamiento IT con solución salina (n= 5) o 30 µg de transcritos de ARN codificantes de CVA21 (n =5), CVA21-3'miRT (n =5), CVA21-ΔV(1x) (n =5), CVA21-ΔV(2x) (n =5), CVA21-686(2x) (n =5) o CVA21-3'TR(1x) (n =4). (B) Proporción de ratones que desarrollan toxicidad en cada grupo y porcentaje global de supervivencia. (C) Gráficos de supervivencia de Kaplan-Meier de los ratones tratados. La significación estadística de la supervivencia entre los ratones tratados con solución salina y los tratados con ARN de CVA21-ΔV(2x) se comparó usando una prueba de orden logarítmico. (D) Cargas víricas en sueros recogidos el día 7 después de la terapia de los ratones tratados. Las líneas horizontales representan las concentraciones víricas medias.

[0045] Figura 5. La actividad oncolítica del ARN de CVA21-ΔV(2x) es dependiente de la dosis. (A) Mediciones del volumen y el peso del tumor de ratones SCID portadores de tumores Mel624 subcutáneos después de una sola inyección IT de solución salina (n= 4), 1 µg (n= 5), 4 µg (n= 5), 8 µg (n= 5), 16 µg (n= 5) o 32 µg (n= 5) de ARN de CVA21-ΔV(2x). (B) Cargas víricas en sueros recogidos el día 9 después de la administración de ARN de ratones tratados en A. (C) Gráficos de supervivencia de Kaplan-Meier de los ratones tratados.

[0046] Figura 6. Citotoxicidad de CVA21 y CVA21-ΔV(2x) en un panel de líneas celulares tumorales. Se sembraron 1 x 10<4>células por pocillo de células melanoma humano Mel624 (A), de próstata humana DU145 (B), de adenocarcinoma ductal pancreático humano Panc1 (C), de mieloma humano U266, RPMI-8226, MM-1, Kas6.1, JJN-3 o Arh77 (D) en placas de histocultivo de 96 pocillos. Las células se infectaron con CVA21 o CVA21-ΔV(2x) a una MOI de 0,001, 0,01, 0,1, 1 o 10 durante 2 horas a 37 °C en medios sin suero. Después de la infección, se retiraron los medios y el virus no incorporado y se remplazaron con 100 µl de medio de crecimiento completo, y las células se incubaron a 37 °C. A las 72 horas después de la infección, se ensayó la proliferación de las células usando un kit de bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazolil-2)-2,5-difeniltetrazolio (MTT) (ATCC, Manassas, VA). Panel de mieloma (n =5). Todas las demás líneas (n =3). Los datos se representan como el porcentaje medio de viabilidad celular normalizado a células infectadas simuladas /- desviación típica.

[0047] La figura 7 es una lista de secuencias del ADN que codifica el ácido nucleico infeccioso del CVA21 de tipo silvestre y el ARN codificado (SEQ ID NO:5).

[0048] La figura 8 es una lista de secuencias del ADN que codifica el ácido nucleico infeccioso del CVA21-ΔV(1x) y el ARN codificado (SEQ ID NO:6). miRT(1x) está subrayado.

[0049] La figura 9 es una lista de secuencias del ADN que codifica el ácido nucleico infeccioso del CVA21-ΔV(2x) y el ARN codificado (SEQ ID NO:7). miRT(2x) está subrayado.

[0050] La figura 10 es una lista de secuencias del ADN que codifica el ácido nucleico infeccioso del CVA21-686(2x) y el ARN codificado (SEQ ID NO:8). miRT(2x) está subrayado.

[0051] La figura 11 es una lista de secuencias del ADN que codifica el ácido nucleico infeccioso del CVA21-3'TR(1x) y el ARN codificado (SEQ ID NO:9). miRT(1x) está subrayado.

[0052] La figura 12 es una lista de secuencias del ADN que codifica el ácido nucleico infeccioso del CVA21-3'TR(2x) y el ARN codificado (SEQ ID NO:10). miRT(2x) está subrayado.

[0053] Figura 13. Estructuras secundarias de ARN previstas de las regiones no codificantes de CVA21 deslocalizadas por microARN frente a las no modificadas. Las interacciones de pseudonudos previstas se representan mediante líneas entre bucles. Las estructuras secundarias de ARN se generaron usando el servidor internético IPknot (rtips.dna.bio.keio.ac.jp/ipknot/) disponible a través de la Escuela de Posgrado de Ciencias de la Información del Instituto de Ciencia y Tecnología de Nara (Japón). Las predicciones de la región no codificante 5' abarcan el dominio VI y la región de exploración, y se predijeron usando el nivel 2 (pseudonudos internos), el modelo de puntuación CONTRAfold con refinamientos. Las predicciones de la región no codificante 3' abarcan la unión entre3Dy toda la región no codificante 3' con una cola de poli A de 20 nucleótidos de longitud, y se predijeron usando el nivel 3 (de pseudonudos con pseudonudos internos) de predicción, el modelo de puntuación CONTRAfold, con refinamientos. Las predicciones de la región no codificante 5' incluyen (A) CVA21 sin modificar; (B) CVA21-ΔV(2x); y (C) CVA21-686(2x). Predicción de la región no codificante 3' para (D) CVA21; (E) CVA21-3'miRT; y (F) CVA21-TR(2x).

[0055] Figura 14. Los extremos auténticos del genoma vírico potencian la tasa de recuperación del virus a partir de transcritos de ARN derivadosin vitroque codifican CVA21-ΔV(2x). (A) Se transfectaron 1 x 10<5>células por pocillo de H1-HeLa con 0,5 µg de transcritos de ARN derivadosin vitroque codifican CVA21-ΔV(2x) con o sin una ribozima en el extremo 5' del genoma (Rz-CVA21-ΔV(2x)), ya sea un sitio de enzima de restricción (CVA21-ΔV(2x)-3'NheI) o una ribozima diferente (CVA21-ΔV(2x)-3'Rz) en el extremo 3' directamente adyacente a la cola de poli A, o una combinación de la ribozima 5' y el sitio de la enzima de restricción (Rz-CVA21-ΔV(2x)-3'NheI) o la ribozima (Rz-CVA21-ΔV(2x)-3'Rz) en el extremo 3'. A las 24 horas después de la transfección, las células se tiñeron con azul tripano y se obtuvieron imágenes de CPE. (B) La viabilidad de las células tratadas como se describe en (A) se determinó usando un kit de bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazolil-2)-2,5-difeniltetrazolio (MTT) (ATCC, Manassas, VA). (C) Producción a lo largo del tiempo de virus infeccioso en células H1-HeLa transfectadas con 0,5 µg de ARN infeccioso que codifica las construcciones descritas en (A). El experimento se realizó por duplicado y los datos se representan como concentraciones víricas medias ± desviaciones típica.

[0057] Figura 15. Transcritos de ARN derivadosin vitroque codifican CVA21-ΔV(2x) con modificaciones auténticas de los extremos provocan una infección oncolítica que se propaga. Los ratones CB-17 SCID portadores de xenoinjertos subcutáneos Mel624 se trataron por vía intratumoral con solución salina (n= 5), 30 µg (n= 5) o 1 µg (n =6) CVA21-ΔV(2x), 30 µg (n= 6) o 1 µg (n =6) de Rz-CVA21-ΔV(2x)-3'NheI, o 30 µg (n= 6) o 1 µg de ARN Rz-CVA21-ΔV(2x)-3'Rz. (A) Volúmenes (líneas negras) y pesos (líneas grises) del tumor de todos los ratones tratados. (B) Concentraciones víricas en sueros recogidos el día 2 o el día 7 después de la administración de ARN de los ratones tratados en A. Todos los puntos de datos corresponden a animales distintos.

[0059] Figura 16. CVA21-ΔV(2x) puede replicarse en células B16-F10 que expresan de forma estable la molécula de adhesión intracelular humana 1 (hICAM-1), un receptor para CVA21. Las células B16-F10-hICAM-1 o las células parentales B16-F10 se infectaron con CVA21-ΔV(2x) a una MOI de 1. A las 24 horas después de la infección, se determinó la concentración vírica total. La replicación de CVA21-ΔV(2x) se potenció significativamente en las células que expresaban hICAM-1 en comparación con la línea celular parental (p= 0,029). El experimento se realizó por triplicado y los datos se representan como concentraciones víricas medias ± desviaciones típicas.

[0061] Figura 17. Las reacciones de transcripciónin vitrode CVA21-ΔV(2x) pueden cambiarse de escala a niveles de miligramos y mantener una integridad similar. Se realizaron simultáneamente reacciones a pequeña escala (10 µl) y a gran escala (1 ml) y se purificaron usando precipitación con cloruro de litio. Se procesó 1 µg de ARN purificado de cada reacción en un RNA FlashGel (Lonza). Carril 1. 10 µl reacción n.º 1. Carril 2. 1 ml reacción n.º 1. Carril 3.10 µl reacción n.º 2. Carril 4. 1 ml reacción n.º 2. Los rendimientos totales de cada reacción fueron 150,55 µg; 7,1768 mg; 146,55 µg; y 7,3192 mg, respectivamente.

[0063] Descripción detallada

[0065] Este documento proporciona métodos y materiales para usar ácido nucleico (por ejemplo, ácido nucleico infeccioso) que codifica un virus (por ejemplo, un picornavirus que tiene un genoma que incluye un sitio interno de entrada del ribosoma de tipo I) para reducir el número de células cancerosas viables en un mamífero. Por ejemplo, este documento proporciona métodos para usar ácido nucleico infeccioso que codifica un virus para reducir el número de células cancerosas viables en un mamífero. El ácido nucleico proporcionado en este documento puede codificar cualquier virus apropiado y usarse para reducir el número de células cancerosas viables en un mamífero. En algunos casos, un virus codificado por el ácido nucleico proporcionado en este documento puede replicarse dentro de una célula cancerosa. En algunos casos, puede usarse ácido nucleico infeccioso que codifica un picornavirus. Un picornavirus puede ser un enterovirus (por ejemplo, enterovirus bovino, enterovirus humano A, enterovirus humano B, enterovirus humano C, enterovirus humano D, enterovirus humano E, virus de la poliomielitis, enterovirus porcino A y enterovirus porcino B), un rinovirus (por ejemplo, rinovirus humano A y rinovirus humano B), un cardiovirus (por ejemplo, el virus de la encefalomiocarditis y el theilovirus), un aftovirus (por ejemplo, el virus de la rinitis equina A y el virus de la fiebre aftosa), un hepatovirus (por ejemplo, el virus de la hepatitis A), un parechovirus (por ejemplo, el parechovirus humano y el virus ljungan), un erbovirus (por ejemplo, el virus de la rinitis equina B), un kobuvirus (por ejemplo, el virus Aichi) o un teschovirus (por ejemplo, el teschovirus porcino 1-7 y el teschovirus porcino). En algunos casos, el ácido nucleico infeccioso proporcionado en este documento puede codificar un virus de Coxsackie A21 (Shafrenet al., Clin. Cancer Res., 10(1 Pt. 1):53-60 (2004)), el virus de Coxsackie B3 (Suskindet al., Proc. Soc. Esp. Biol. Med., 94(2):309-318 (1957)), el virus de la poliomielitis de tipo III (Pond y Manuelidis, Am. J. Pathol., 45:233-249 (1964)), el virus ECHO I (Shafrenet al., Int. J. Cancer, 115(2):320-328 (2005)) o un virus de la encefalomiocarditis de tipo E (Adachiet al., J. Neurooncol., 77(3):233-240 (2006)).

[0067] El ácido nucleico (por ejemplo, ácido nucleico infeccioso) que codifica un virus puede ser cualquier ácido nucleico apropiado (por ejemplo, ADN, ARN o una combinación de los mismos). En algunos casos, el ácido nucleico que codifica un virus puede ser una construcción de ácido nucleico. Por ejemplo, una construcción de ácido nucleico que codifica un virus puede ser ADN plasmídico. Por ejemplo, una construcción de ácido nucleico que codifica un virus puede ser una molécula de ARN.

[0069] En algunos casos, el ácido nucleico (por ejemplo, ácido nucleico infeccioso) proporcionado en este documento puede codificar un picornavirus que tiene un genoma que incluye un sitio interno de entrada del ribosoma de tipo I. Los enterovirus y los rinovirus tienen IRES de tipo I. Ejemplos de picornavirus que tienen un genoma que incluye un sitio interno de entrada del ribosoma de tipo I incluyen, sin limitación, virus de Coxsackie (por ejemplo, virus de Coxsackie A21), virus de la poliomielitis, virus ECHO, enterovirus (por ejemplo, enterovirus 70) y rinovirus.

[0071] El ácido nucleico (por ejemplo, ácido nucleico infeccioso) que codifica un virus (por ejemplo, un picornavirus tal como el virus de Coxsackie A21) proporcionado en este documento puede administrarse directamente a las células cancerosas (por ejemplo, mediante administración intratumoral) o puede administrarse de forma sistémica (por ejemplo, mediante administración intravenosa, intraperitoneal, intrapleural o intraarterial). La cantidad de ácido nucleico infeccioso administrada a un mamífero puede variar de aproximadamente 10 ng a aproximadamente 1 mg (por ejemplo, de 100 ng a 500 µg, de aproximadamente 250 ng a aproximadamente 250 µg, de aproximadamente 500 ng a aproximadamente 200 µg, o de aproximadamente 1 µg y aproximadamente 100 µg) por kg de peso corporal. En algunos casos, puede administrarse de aproximadamente 100 ng a aproximadamente 500 µg de ácido nucleico infeccioso que codifica un virus (por ejemplo, un picornavirus tal como el virus de Coxsackie A21) como una sola dosis intratumoral. En algunos casos, la cantidad de ácido nucleico infeccioso administrada a un mamífero puede ser igual a un número de copias del genoma del virus de aproximadamente 3x10<10>a aproximadamente 3x10<14>copias del genoma (por ejemplo, entre aproximadamente 3x10<10>y aproximadamente 3x10<13>, entre aproximadamente 3x10<10>y aproximadamente 3x10<12>, entre aproximadamente 3x10<11>y aproximadamente 3x10<14>, entre aproximadamente 3x10<11>y aproximadamente 3x10<13>, o entre aproximadamente 3x10<11>y aproximadamente 3x10<12>copias del genoma). Por ejemplo, el ácido nucleico infeccioso proporcionado en este documento puede administrarse en una cantidad tal que se administren aproximadamente 3x10<11>copias del genoma del virus a un mamífero. En algunos casos, la cantidad de ácido nucleico infeccioso administrada puede variar entre aproximadamente 3x10<10>y aproximadamente 3x10<14>copias del genoma del virus por kg de peso corporal.

[0073] El ácido nucleico (por ejemplo, ácido nucleico infeccioso) que codifica un virus (por ejemplo, un picornavirus tal como un virus de Coxsackie A21) puede diseñarse para que carezca de una o más (por ejemplo, una, dos, tres, cuatro o más) secuencias de nucleótidos contiguas de 10 o más nucleótidos de longitud presentes en una versión de tipo silvestre de ese virus. Por ejemplo, el ácido nucleico infeccioso que codifica un virus (por ejemplo, un picornavirus tal como un virus de Coxsackie A21) puede carecer de al menos 10 (por ejemplo, al menos 10, 20, 30, 40, 50, 60 o más) nucleótidos contiguos normalmente encontrados entre el dominio VI de la UTR 5' y el sitio de inicio de la traducción (por ejemplo, el sitio de inicio AUG) de la poliproteína vírica. Cuando el ácido nucleico infeccioso codifica un virus de Coxsackie A21, el ácido nucleico infeccioso puede carecer de al menos 10 (por ejemplo, al menos 10, 20, 30, 40, 50, 60 o más) nucleótidos contiguos desde la posición 631 hasta la posición 698, como se encuentra en el genoma del virus de Coxsackie A21 de tipo silvestre. En algunos casos, el ácido nucleico infeccioso que codifica un virus de Coxsackie A21 puede diseñarse para que carezca de todos los nucleótidos desde la posición 631 hasta la posición 698, como se encuentra en el genoma del virus de Coxsackie A21 de tipo silvestre.

[0075] Como se describe en este documento, el ácido nucleico (por ejemplo, ácido nucleico infeccioso) que codifica un virus (por ejemplo, un picornavirus tal como un virus de Coxsackie A21) puede diseñarse para que contenga un elemento diana de microARN, de modo que un microARN correspondiente (miARN, miARN específicos indicados como miR-n.º) presente dentro de una célula no cancerosa pueda reducir la expresión génica del virus, la replicación del virus o la estabilidad del virus en esa célula no cancerosa. Los microARN son ARN reguladores pequeños, de 21-23 nucleótidos, altamente conservados, que pueden mediar la represión traduccional o, en algunos casos, la destrucción del ARNm por escisión inducida por RISC. Los microARN están presentes dentro de muchas células de mamífero y pueden tener una distribución en el tejido específica de tejido. Por tanto, los microARN pueden usarse para modular el tropismo de un virus replicante y proporcionar una estrategia de dirección para cualquier virus. La capacidad del ácido nucleico infeccioso que codifica un virus (por ejemplo, un picornavirus tal como un virus de Coxsackie A21) de provocar la lisis de células no cancerosas puede reducirse usando un elemento diana de microARN que tenga al menos una región que sea complementaria a un microARN presente en las células no cancerosas. Por ejemplo, el virus de Coxsackie A21 de tipo silvestre puede infectar células musculares. Por tanto, los elementos diana de microARN que son complementarios a los microARN presentes en las células musculares pueden incorporarse al ácido nucleico infeccioso del virus de Coxsackie A21 para reducir la lisis de las células musculares. Asimismo, la seguridad de las vacunas puede mejorarse modulando el tropismo de un virus. Por ejemplo, puede incorporarse un elemento diana de microARN neuronal y/o cerebral en un virus de la poliomielitis para reducir la incidencia de poliomielitis inducida por una vacuna oral contra la poliomielitis.

[0077] Esta misma estrategia puede usarse para reducir la lisis de células no cancerosas por otros ácidos nucleicos víricos. Por ejemplo, los elementos diana de microARN que tienen al menos una región que es complementaria a los microARN establecidos en la tabla 1 pueden usarse para reducir la lisis celular del tejido indicado para los virus enumerados, así como para otros virus. Otros ejemplos de elementos diana de microARN que pueden diseñarse para reducir la lisis celular mediada por virus incluyen, sin limitación, aquellos que tienen al menos una región complementaria a un microARN específico de tejido enumerado en la tabla 2. En algunos casos, el ácido nucleico infeccioso proporcionado en este documento puede codificar un virus y contener un elemento diana de microARN que tiene al menos una región complementaria a un microARN específico de tejido clasificado. Los elementos diana de microARN pueden tener una complementariedad completa con un microARN. En algunos casos, un elemento diana de microARN puede contener emparejamientos incorrectos en su complementariedad con un microARN, siempre que contenga complementariedad completa con una secuencia inicial (por ejemplo, pares de bases 2-7) del microARN. Véase, por ejemplo, Limet al., Nature, 433(7027):769-73 (2005)).

[0079] Tabla 1. Silenciamiento por medio de elementos diana de microARN incorporados.

[0082]

[0083]

[0085] Tabla 2. MicroARN clasificados específicos de teido.

[0086]

[0087]

[0088]

[0089]

[0092] Pueden usarse técnicas de clonación molecular para insertar elementos diana de microARN en ácido nucleico (por ejemplo, ácido nucleico infeccioso) que codifica un virus (por ejemplo, un picornavirus, tal como un virus de Coxsackie A21). Un ácido nucleico infeccioso proporcionado en este documento puede contener un elemento diana de microARN o múltiples elementos diana de microARN (por ejemplo, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, 15, 20, 25, 30 o más elementos diana de microARN). Por ejemplo, un ácido nucleico infeccioso proporcionado en este documento puede incluir dos elementos diana de microARN diferentes, tal como uno que sea una diana de miR-133 y uno que sea una diana de miR-206. En algunos casos, un ácido nucleico infeccioso proporcionado en este documento puede incluir dos o más elementos diana de microARN idénticos. Por ejemplo, un ácido nucleico infeccioso proporcionado en este documento puede incluir dos elementos diana de microARN que son cada uno una diana de miR-133 o dos elementos diana de microARN que son cada uno una diana de miR-206. En algunos casos, un ácido nucleico infeccioso proporcionado en este documento puede incluir dos o más (por ejemplo, dos, tres, cuatro o más) elementos diana de microARN que son cada uno una diana de miR-133 y dos o más (por ejemplo, dos, tres, cuatro o más) elementos diana de microARN que son cada uno una diana de miR-206.

[0094] Como se describe en este documento, uno o más (por ejemplo, uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis o más) elementos diana de microARN pueden insertarse en el ácido nucleico (por ejemplo, ácido nucleico infeccioso) que codifica un virus (por ejemplo, un picornavirus tal como un virus de Coxsackie A21) entre el dominio VI de la UTR 5' y el sitio de inicio de la traducción (por ejemplo, el sitio de inicio AUG) de la poliproteína vírica. Cuando el ácido nucleico infeccioso codifica un virus de Coxsackie A21, el ácido nucleico infeccioso puede incluir uno o más (por ejemplo, uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis o más) elementos diana de microARN insertados entre la posición 631 y la posición 698, como se encuentra en el genoma del virus de Coxsackie A21 de tipo silvestre. En algunos casos, un ácido nucleico infeccioso que codifica un virus (por ejemplo, un picornavirus tal como un virus de Coxsackie A21) proporcionado en este documento puede carecer de al menos 10 (por ejemplo, al menos 10, 20, 30, 40, 50, 60 o más) nucleótidos contiguos normalmente encontrados entre el dominio VI de la UTR 5' y el sitio de inicio de la traducción (por ejemplo, el sitio de inicio AUG) para la poliproteína vírica y puede incluir dentro de esta misma ubicación uno o más (por ejemplo, uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis o más) elementos diana de microARN. En algunos casos, el ácido nucleico infeccioso que codifica un virus de Coxsackie A21 puede diseñarse para que carezca de todos los nucleótidos desde la posición 631 hasta la posición 698, como se encuentra en un genoma de virus de Coxsackie A21 de tipo silvestre (por ejemplo, la cepa Kuykendall CVA21), y puede incluir, en lugar de esos nucleótidos eliminados, uno o más (por ejemplo, uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis o más) elementos diana de microARN. En las figuras 8 y 9 se exponen ejemplos de dicho ácido nucleico infeccioso. Otros ejemplos de ácido nucleico infeccioso proporcionados en este documento se exponen en las figuras 10 y 11.

[0096] En algunos casos, los elementos diana de microARN que son complementarios a los microARN que se expresan de forma ubicua en las células normales con expresión limitada en las células cancerosas pueden usarse para dirigir la lisis celular a las células cancerosas y no a las células no cancerosas. Por ejemplo, cuando se usa ácido nucleico que codifica un virus para tratar la leucemia linfocítica de linfocitos B, el ácido nucleico (por ejemplo, ácido nucleico infeccioso) puede diseñarse para que contenga elementos diana de microARN complementarios a los microARN que se expresan de forma ubicua en el tejido normal, mientras que se regulan por disminución en las células de leucemia linfocítica de linfocitos B. Ejemplos de dichos microARN incluyen, sin limitación, miR-15 y miR-16.

[0097] El ácido nucleico (por ejemplo, ácido nucleico infeccioso) que codifica un virus (por ejemplo, un picornavirus tal como un virus de Coxsackie A21) puede diseñarse para incluir una ribozima o un ácido nucleico que codifica una ribozima. Por ejemplo, en algunos casos, un ARN infeccioso que codifica un virus (por ejemplo, un picornavirus tal como un virus de Coxsackie A21) puede diseñarse para que incluya una ribozima diseñada para escindir una parte del ARN de sí mismo y, en algunos casos, un ADN infeccioso que codifica un virus (por ejemplo, un picornavirus tal como un virus de Coxsackie A21) puede diseñarse para que incluya una secuencia de ADN que codifica una ribozima diseñada para escindir una parte del ARN de la molécula de ARN transcrita a partir del ADN infeccioso. Dicha ribozima puede ser una ribozima en cabeza de martillo, una ribozima del virus de la hepatitis delta, una ribozima en horquilla, una ribozima satélite Varkud, una ribozima glmS, una ribozima Twister, una ribozima hermana Twister, una ribozima Hatchet, una ribozima Pistol o una ribozima sintética. Una ribozima puede diseñarse para eliminar cualquier parte de ARN de un ARN infeccioso. Por ejemplo, una ribozima puede diseñarse para eliminar una parte del extremo 5' o una parte del extremo 3' del ARN de un ARN infeccioso que codifica un virus. En algunos casos, el ácido nucleico infeccioso (ADN o ARN) que codifica un virus (por ejemplo, un picornavirus tal como un virus de Coxsackie A21) puede diseñarse para incluir (a) ácido nucleico que codifica una primera ribozima en el caso de ADN o una primera ribozima en el caso de ARN y (b) ácido nucleico que codifica una segunda ribozima en el caso de ADN o una segunda ribozima en el caso de ARN. En dichos casos, la primera ribozima puede diseñarse para eliminar una parte del extremo 5' de ARN de un ARN infeccioso que codifica un virus y la segunda ribozima puede diseñarse para eliminar una parte del extremo 3'. En algunos casos, después de la escisión por endonucleasa de restricción del ácido nucleico que codifica un virus, un virus codificado por el ácido nucleico que codifica un virus puede incluir secuencias codificantes víricas con menos de 88 (por ejemplo, menos de 63, o menos de 10, tal como 5, 4, 3, 2, 1 o 0) nucleótidos no víricos (por ejemplo, cerca de los extremos auténticos). En algunos casos, el ARN infeccioso resultante que codifica un virus después de la escisión por ribozima puede incluir secuencias codificantes víricas sin secuencias no víricas (por ejemplo, extremos auténticos).

[0098] El ácido nucleico (por ejemplo, ácido nucleico infeccioso) que codifica un virus (por ejemplo, un picornavirus tal como un virus de Coxsackie A21) puede diseñarse para incluir un sitio de corte por endonucleasa de restricción. Por ejemplo, el ácido nucleico (por ejemplo, ADN) que codifica un virus (por ejemplo, un picornavirus tal como un virus de Coxsackie A21) puede diseñarse para incluir un sitio de corte por endonucleasa de restricción diseñado para escindir una parte de ácido nucleico del ácido nucleico infeccioso. En algunos casos, el ADN (por ejemplo, ADN infeccioso) que codifica un virus (por ejemplo, un picornavirus tal como un virus de Coxsackie A21) puede diseñarse para incluir una secuencia de ADN de modo que el ADN infeccioso incluya un sitio de corte por endonucleasa de restricción que pueda escindirse por una endonucleasa de restricción que corta el ARN en ese sitio de corte por endonucleasa de restricción. En algunos casos, el ARN (por ejemplo, ARN infeccioso) que codifica un virus (por ejemplo, un picornavirus tal como un virus de Coxsackie A21) puede diseñarse para incluir un sitio de corte por endonucleasa de restricción que pueda escindirse por una endonucleasa de restricción que corta el ARN y/o el ADN en ese sitio de corte por endonucleasa de restricción. Puede usarse cualquier sitio de corte por endonucleasa de restricción apropiado y cualquier endonucleasa de restricción que pueda cortar el ácido nucleico en ese sitio de corte por endonucleasa de restricción. En la tabla 3 se proporcionan ejemplos de sitios de corte por endonucleasas de restricción y endonucleasas de restricción que pueden cortar el ácido nucleico en esos sitios de corte por endonucleasa de restricción.

[0100] Tabla 3. Emparejamiento de endonucleasa de restricción/sitio de corte. R es una purina (A o G). Y es una pirimidina (A o T).

[0103]

[0106] Puede diseñarse un sitio de corte por endonucleasa de restricción de modo que la escisión en ese sitio de corte elimine cualquier parte de ácido nucleico del ácido nucleico (por ejemplo, ácido nucleico infeccioso) que codifica un virus (por ejemplo, un picornavirus tal como un virus de Coxsackie A21). Por ejemplo, un sitio de corte por endonucleasa de restricción puede colocarse para eliminar una parte del extremo 5' y/o una parte del extremo 3' de ácido nucleico del ácido nucleico que codifica un virus. En algunos casos, el ácido nucleico infeccioso que codifica un virus (por ejemplo, un picornavirus tal como un virus de Coxsackie A21) puede diseñarse para incluir uno, dos, tres, cuatro o más sitios de corte por endonucleasa de restricción. Por ejemplo, un primer sitio de corte por endonucleasa de restricción puede colocarse para eliminar una parte del extremo 5' de ARN de un ARN infeccioso que codifica un virus y un segundo sitio de corte por endonucleasa puede colocarse para eliminar una parte del extremo 3'. Cuando se incluyen dos o más sitios de corte por endonucleasa de restricción, los sitios de corte pueden ser iguales (por ejemplo, dos sitios de corte NheI), de modo que la misma endonucleasa de restricción (por ejemplo, NheI) corte esos sitios, o los sitios de corte pueden ser diferentes (por ejemplo, un sitio de corte NheI y un sitio de corte que no sea un sitio de corte NheI), de modo que diferentes endonucleasas de restricción (por ejemplo, NheI y un sitio de corte que no sea un sitio de corte NheI) corten los diferentes sitios. En algunos casos, después de la escisión por endonucleasa de restricción del ácido nucleico que codifica un virus, un virus codificado por el ácido nucleico que codifica un virus puede incluir secuencias codificantes víricas con menos de 88 (por ejemplo, menos de 63, o menos de 10, tal como 5, 4, 3, 2, 1 o 0) nucleótidos no víricos (por ejemplo, cerca de los extremos auténticos). En algunos casos, el ARN infeccioso resultante que codifica un virus después de la escisión por endonucleasa de restricción puede incluir secuencias codificantes víricas sin secuencias no víricas (por ejemplo, extremos auténticos).

[0108] En algunos casos, el ácido nucleico (por ejemplo, ácido nucleico infeccioso) que codifica un virus (por ejemplo, un picornavirus tal como un virus de Coxsackie A21) puede diseñarse para incluir una combinación de una o más ribozimas en el caso de ARN infeccioso (o una combinación de secuencias que codifican una o más ribozimas y uno o más sitios de corte por endonucleasa de restricción en el caso de ADN infeccioso). Por ejemplo, el ácido nucleico que codifica un virus puede incluir una secuencia de ADN que codifica una ribozima diseñada para eliminar una parte del extremo 5' del virus codificado, y puede incluir un sitio de corte por endonucleasa de restricción diseñado para escindirse por una endonucleasa de restricción para eliminar una parte del extremo 3' del ácido nucleico, de modo que el virus codificado no contenga secuencias no víricas (por ejemplo, extremos auténticos).

[0110] En algunos casos, cuando se usa uno o más sitios de corte por endonucleasa de restricción, la o las endonucleasas de restricción que pueden cortar esos sitios de corte por endonucleasa de restricción pueden añadirse de forma exógena a una solución que contenga el ácido nucleico (por ejemplo, ácido nucleico infeccioso, tal como ARN infeccioso) a escindir. Por ejemplo, puede añadirse una endonucleasa de restricción añadida de forma exógena a una solución que contenga el ácido nucleico infeccioso a escindir en condiciones que permitan que la endonucleasa de restricción escinda el ácido nucleico infeccioso. En algunos casos, una solución que incluye una endonucleasa de restricción y ácido nucleico infeccioso a escindir puede incubarse durante aproximadamente 60 minutos a aproximadamente 300 minutos (por ejemplo, durante aproximadamente 60 minutos a aproximadamente 240 minutos, durante aproximadamente 60 minutos a aproximadamente 200 minutos, durante aproximadamente 60 minutos a aproximadamente 180 minutos, durante aproximadamente 60 minutos a aproximadamente 150 minutos, durante aproximadamente 60 minutos a aproximadamente 120 minutos, durante aproximadamente 60 minutos a aproximadamente 100 minutos, durante aproximadamente 60 minutos a aproximadamente 90 minutos, durante aproximadamente 90 minutos a aproximadamente 300 minutos, durante aproximadamente 100 minutos a aproximadamente 300 minutos, durante aproximadamente 120 minutos a aproximadamente 300 minutos, durante aproximadamente 150 minutos a aproximadamente 300 minutos, durante aproximadamente 180 minutos a aproximadamente 300 minutos, durante aproximadamente 200 minutos a aproximadamente 300 minutos, durante aproximadamente 240 minutos a aproximadamente 300 minutos, durante aproximadamente 90 minutos a aproximadamente 240 minutos, durante aproximadamente 120 minutos a aproximadamente 210 minutos, durante aproximadamente 150 minutos a aproximadamente 180 minutos, durante aproximadamente 60 minutos a aproximadamente 90 minutos, durante aproximadamente 90 minutos a aproximadamente 120 minutos, durante aproximadamente 120 minutos a aproximadamente 150 minutos, durante aproximadamente 150 minutos a aproximadamente 180 minutos durante aproximadamente 180 minutos a aproximadamente 210 minutos, durante aproximadamente 210 minutos a aproximadamente 240 minutos, o durante aproximadamente 240 minutos a aproximadamente 270 minutos) para permitir que la endonucleasa de restricción escinda el ácido nucleico infeccioso. En algunos casos, una solución que incluye una endonucleasa de restricción y ácido nucleico infeccioso a escindir puede incubarse a aproximadamente 37 °C hasta aproximadamente 60 °C (por ejemplo, a aproximadamente 37 °C, a aproximadamente 42 °C, a aproximadamente 45 °C, a aproximadamente 50 °C o a aproximadamente 55 °C) para permitir que la endonucleasa de restricción escinda el ácido nucleico infeccioso. Por ejemplo, cuando la endonucleasa de restricción es NheI, una solución que incluye NheI y ácido nucleico infeccioso a escindir puede incubarse durante aproximadamente 60 minutos a aproximadamente 180 minutos a aproximadamente 37 °C para permitir que la NheI escinda el ácido nucleico infeccioso. En algunos casos, después de incubar una solución que contiene una endonucleasa de restricción añadida de forma exógena y un ácido nucleico infeccioso a escindir en condiciones que permiten que la endonucleasa de restricción escinda el ácido nucleico infeccioso, el ácido nucleico infeccioso escindir puede aislarse de la solución. Puede usarse cualquier técnica apropiada para aislar el ácido nucleico infeccioso escindido de la solución. Por ejemplo, puede usarse precipitación con etanol o purificación en columna para aislar el ácido nucleico infeccioso escindido de la solución.

[0112] Cuando se administra a un mamífero ácido nucleico (por ejemplo, ácido nucleico infeccioso) que codifica un virus (por ejemplo, un picornavirus tal como un virus de Coxsackie A21) para tratar el cáncer (por ejemplo, leucemia linfocítica de linfocitos B), también puede administrarse al mamífero uno o más tratamientos adicionales contra el cáncer. El uno o más tratamientos adicionales contra el cáncer pueden incluir cualquier tratamiento adecuado contra el cáncer. En algunos casos, un tratamiento contra el cáncer puede incluir cirugía. En algunos casos, un tratamiento contra el cáncer puede incluir radioterapia. En algunos casos, un tratamiento contra el cáncer puede incluir la administración de uno o más agentes antineoplásicos, tales como quimioterápicos, inhibidores del punto de control (por ejemplo, inhibidores de CTLA-4, inhibidores de PD-1 e inhibidores de PD-L1), virus oncolíticos, genoterapias, inhibidores de la histona desacetilasa (HDAC), antimicrobianos, inmunoterapias, vacunas, inhibidores de proteína cinasa, miméticos del segundo activador de caspasas derivado de mitocondria (SMAC) y/o terapias holísticas. Un agente antineoplásico puede ser cualquier tipo apropiado de molécula (por ejemplo, un polipéptido tal como un anticuerpo o una molécula pequeña). Ejemplos de agentes antineoplásicos incluyen, sin limitación, ipilimumab, nivolumab, pembrolizumab, atezolizumab, avelumab, durvalumab, cemiplimab, spartalizuma, talimogene laherparepvec (T-vec), tricostatina A (TSA), panobinostat, entinostat, romidepsina, vorinostat , givinostat, adavosertib, afatinib, axitinib, bosutinib, cetuximab, cobimetinib, crizotinib, cabozantinib, dasatinib, entrectinib, erdafitinib, erlotinib, fostamatinib, gefitinib, ibrutinib, imatinib, lapatinib, lenvatinib, mubritinib, nilotinib, pazopanib, pegaptanib, ruxolitinib, sorafenib, sunitinib, vandetanib, vemurafenib y combinaciones de los mismos. Por ejemplo, un mamífero que tiene cáncer (por ejemplo, leucemia linfocítica de linfocitos B) puede tratarse administrando ácido nucleico que codifica un picornavirus, tal como un virus de Coxsackie A21, y administrando uno o más inhibidores del punto de control (por ejemplo, inhibidores de CTLA-4, inhibidores de PD-1 y/o inhibidores de PD-L1).

[0113] En casos donde un mamífero que tiene cáncer se trata con ácido nucleico (por ejemplo, ácido nucleico infeccioso) que codifica un virus (por ejemplo, un picornavirus tal como un virus de Coxsackie A21) y se trata con uno o más tratamientos contra el cáncer (por ejemplo, se administra uno o más agentes antineoplásicos), los tratamientos contra el cáncer pueden administrarse al mismo tiempo o de forma independiente. Por ejemplo, el ácido nucleico que codifica un virus puede administrarse en primer lugar y el uno o más tratamientos contra el cáncer pueden administrarse en segundo lugar, o viceversa.

[0114] También se proporcionan en este documento modelos inmunocompetentes que pueden infectarse con ácido nucleico (por ejemplo, ácido nucleico infeccioso) que codifica un virus (por ejemplo, un picornavirus tal como un virus de Coxsackie A21). Por ejemplo, las células que expresan un receptor de virus (por ejemplo, ICAM-1) pueden infectarse con ácido nucleico infeccioso que codifica un virus (por ejemplo, un picornavirus tal como un virus de Coxsackie A21). Cuando el receptor de virus es ICAM-1, la ICAM-1 puede ser de cualquier fuente. Por ejemplo, una ICAM-1 puede ser una ICAM-1 humana. En algunos casos, un modelo inmunocompetente no expresa de forma endógena un receptor de virus. Un modelo inmunocompetente que expresa un receptor de virus puede expresar el receptor de virus de forma estable o puede expresar de forma transitoria el receptor de virus. En algunos casos, un modelo inmunocompetente descrito en este documento puede usarse para replicar el virus codificado por el ácido nucleico que codifica un virus. En algunos casos, un modelo inmunocompetente descrito en este documento puede usarse como modelo para evaluar y/o supervisar la especificidad de la infección (por ejemplo, después de la producción del virus).

[0115] En algunos casos, un modelo inmunocompetente que puede infectarse por ácido nucleico (por ejemplo, ácido nucleico infeccioso) que codifica un virus puede ser una célula (por ejemplo, una línea celular) que puede expresar (por ejemplo, está diseñada para expresar) un receptor de virus (por ejemplo, ICAM-1, tal como ICAM-1 humana). Puede usarse cualquier célula apropiada para generar un modelo inmunocompetente descrito en este documento. En algunos casos, una célula usada para generar un modelo inmunocompetente descrito en este documento puede obtenerse de un mamífero (por ejemplo, puede ser una célula primaria). En algunos casos, una célula usada para generar un modelo inmunocompetente descrito en este documento puede obtenerse de una línea celular (por ejemplo, una línea celular de mamífero, tal como células B16-F10 de melanoma murino).

[0116] En algunos casos, un modelo inmunocompetente que puede infectarse por ácido nucleico (por ejemplo, ácido nucleico infeccioso) que codifica un virus puede ser un modelo animal no humano (por ejemplo, un modelo de ratón) que tiene una o más células que pueden expresar (por ejemplo, están diseñadas para expresar) un receptor de virus (por ejemplo, ICAM-1). Puede usarse cualquier animal no humano apropiado generar un modelo inmunocompetente descrito en este documento. En algunos casos, un animal no humano usado para generar un modelo inmunocompetente descrito en este documento puede ser un mamífero (por ejemplo, un ratón o una rata).

[0117] Puede usarse cualquier método apropiado para generar un modelo inmunocompetente descrito en este documento. Cuando un modelo inmunocompetente es una célula, puede introducirse ácido nucleico que codifica un receptor de virus en una célula, de modo que la célula exprese el receptor de virus. Por ejemplo, puede transducirse un vector lentivírico que codifica un receptor de virus en una célula, de modo que la célula exprese el receptor de virus. Cuando un modelo inmunocompetente es un animal no humano, puede introducirse ácido nucleico que codifica un receptor de virus en una o más células dentro del animal no humano, de modo que el receptor de virus se exprese por una o más células dentro del animal no humano. La invención se describirá adicionalmente en los siguientes ejemplos, que no limitan el alcance de la invención descrita en las reivindicaciones.

[0118] Ejemplos

[0119] Ejemplo 1 - Generación de ácido nucleico infeccioso que puede usarse para tratar el cáncer

[0120] Los enterovirus y los rinovirus usan un sitio interno de entrada del ribosoma (IRES) de tipo I para regular la traducción vírica. La estructura del IRES del virus de la poliomielitis se predijo y validó mediante digestión/sondeo químico y análisis mutagénico (Riveraet al., Virology, 165:42-50 (1988); Pilipenkoet al., Virology, 168:201-209 (1989); Skinneret al., J. Mol. Biol., 207:379-392 (1989); y Burrillet al., J. Virol., 87:11670-11683 (2013)). El CVA21 es un virus similar al virus de la poliomielitis y comparte una homología relativa de un 86 % con el IRES del virus de la poliomielitis. La UTR 5' del virus de la poliomielitis contiene seis dominios (I a VI). El dominio I forma una estructura de hija de trébol que es necesaria para la síntesis tanto de la hebra positiva como de la negativa (Andinoet al., Cell, 63:369-380 (1990); Andinoet al., EMBO J., 12:3587-3598 (1993); Bartonet al., EMBO J., 20:1439-1448 (2001); y Vogtet al., PLoS Pathog., 6:e1000936 (2010)). Los dominios II a VI están implicados en la actividad del IRES. La replicación y la traducción víricas requieren interacciones complejas de ARN-ARN y ARN-proteína, incluyendo el reclutamiento de factores de acción entransdel IRES del hospedador (ITAF) y factores de inicio (Leeet al., Trends Microbiol., 25:546-561 (2017)). La alteración de estos dominios puede provocar fenotipos de atenuación o mortales para el virus. Similar al virus de la poliomielitis, el CVA21 tiene un sitio AUG críptico en el dominio VI implicado en la carga del ribosoma (Vermaet al., J. Gen. Virol., 92:2310-2319 (2011)). El inicio de la traducción en el sitio AUG primario depende de la exploración del ribosoma a través de un conector variable largo denominado "región de exploración".

[0122] El ácido nucleico infeccioso se diseñó para que incluyera un elemento de respuesta (RE) a microARN situado dentro de esta región de exploración. El RE se diseñó para que careciera de sitios AUG que pudieran iniciar la traducción antes del AUG auténtico.

[0124] La miositis mortal era la toxicidad principal que debía eliminarse para elevar el perfil de seguridad del CVA21 a un nivel suficiente para el tratamiento de pacientes inmunodeprimidos. Los RE proporcionados en este documento se dirigieron a eliminar la replicación vírica dentro de los tejidos musculares. Se seleccionaron miR-133 y miR-206. Están muy enriquecidos en los tejidos musculares y se ha demostrado anteriormente que eliminan la toxicidad cuando se insertan en la UTR 3' del CVA21, como se describe en otra parte (Kellyet al., Nat. Med., 14:1278-1283 (2008)).

[0126] Una sola diana de microARN es suficiente para regular por disminución la replicación vírica, sin embargo, hay un número significativo de variables que influyen en la eficacia de la dirección. Además, los virus de ARN pueden acumular mutaciones rápidamente debido a la baja fidelidad de la RdRp, lo que puede provocar la pérdida de la funcionalidad de los RE poco después de la infección. Por lo tanto, los RE se diseñaron para que codificaran una copia cada uno (miRT-1x) o dos copias cada uno (miRT-2x) de secuencias complementarias a miR-133 y miR-206. Las secuencias de los RE se muestran en la figura 1A. Se insertaron sitios AscI en pGEM-CVA21 en las ubicaciones deseadas para los RE, sea mediante PCR de extensión por solapamiento, mutagénesis dirigida al sitio o sintetizando fragmentos del genoma seguido de subclonación en la construcción de longitud completa (pGEM-CVA21). Todos los RE se insertaron en el genoma vírico mediante hibridación de oligonucleótidos Ultramer que codifican el RE flanqueado por las secuencias salientes generadas durante una digestión enzimática con AscI, seguida de ligamiento en los vectores de longitud completa apropiadamente digeridos y purificados con AscI.

[0128] Se generaron tres construcciones diferentes que codificaban RE en la UTR 5'. La primera implicaba en insertar un 2x-RE en la región de exploración en la posición del nucleótido 686 (CVA21-686(2x)). Además, se generaron dos construcciones donde que se eliminaron los residuos 631 a 698 dentro de la región de exploración variable y se añadieron los RE. El primero contenía un RE miRT-1x (CVA21-ΔV(1x)) y el otro contenía un RE miRT-2x (CVA21-ΔV(2x)). La figura 1B representa el genoma vírico de CVA21, los elementos estructurales de las UTR y los sitios de inserción de RE sometidos a prueba.

[0130] La mayoría de las secuencias diana de microARN celulares sometidas a prueba previamente están ubicadas dentro de la UTR 3' de los ARNm diana. En función de un modelo verificado experimentalmente de la UTR 3' del virus de la poliomielitis (Pilipenkoet al., EMBO J., 15:5428-5436 (1996)), se pensaba que la estructura secundaria de la UTR 3' del CVA21 (un virus similar al virus de la poliomielitis) contenía dos horquillas (Y y X) cuyos bucles forman una interacción de pseudonudos conocida como "dominio kissing" (van Ooijet al., J. Gen. Virol., 87:689-695 (2006)). Estas estructuras incluían el origen de la replicación (oriR) para la síntesis de la hebra negativa. La desestabilización del dominio kissing en otros enterovirus inhibía gravemente la síntesis del ARN vírico, lo que provocaba mutantes sensibles a la temperatura o fenotipos mortales (van Ooijet al., J. Gen. Virol., 87:689-695 (2006); Melcherset al., J. Virol., 71:686-696 (1997); Wanget al., Nucleic Acids Res., 27:485-490 (1999); y Melcherset al., RNA, 6:976-987 (2000)). En el virus de la poliomielitis y el virus de Coxsackie B3, el pase en serie de los virus desestabilizados provocó retromutantes en donde se restableció la interacción de pseudonudos (Pilipenkoet al., EMBO J., 15:5428-5436 (1996); y van Ooijet al., J. Gen. Virol., 87:689-695 (2006)). La eliminación de los dos dominios también provocó el truncamiento de la cola de poli(A) (van Ooijet al., Nucleic Acids Res., 34:2953-2965 (2006)). Se recuperaron virus a partir de estos mutantes de eliminación, sin embargo, adquirieron tramos de poli(AU) correspondientes a señales de poliadenilación celulares. Las longitudes de los dominios X e Y estaban muy conservadas entre los enterovirus, y se demostró que el dominio Y debía tener 12 pb en combinación con un tallo de 8 pb para el dominio X. Además, los dos pares de bases más distales del dominio Y con respecto al "dominio kissing" tenían que ser pares CG de Watson y Crick (Melcherset al., J. Virol., 71:686-696 (1997)). La longitud de las regiones conectoras entre los dos bucles de tallo era importante para la orientación correcta de las hélices y su capacidad de interactuar. Por último, también se sugirió la existencia de un dominio S en donde la cola de poli(A) forma pares de bases con un tramo de cuatro residuos de uridina anterior al codón de terminación en el gen3D. Este dominio cerraba la estructura oriR, creando una estructura de UTR 3' más rígida (Pilipenkoet al., Nucleic Acids Res., 20:1739-1745 (1992)). Por lo tanto, tener una UTR 3' apropiadamente plegada implicaba garantizar el acoplamiento y la orientación correctos de las proteínas asociadas con el complejo ribonucleoproteínico implicado en la síntesis de la hebra de sentido negativo.

[0132] El panel izquierdo de la figura 1C muestra el modelo de estructura secundaria deloriRde CVA21 y la ubicación del RE usado en la construcción de Kellyet al.(CVA21-3'miRT) en la posición nucleotídica 7343. La inserción en este sitio alteró la longitud del dominio Y, interfirió con los pares de bases CG distales y probablemente alteró la región conectora entre los dominios X e Y, interfiriendo con la orientación de las hélices. Todos los residuos de la UTR 3' y varios de la secuencia codificante estaban implicados en el mantenimiento de la estructura deoriR, limitando los posibles sitios de inserción para los RE. Para evitar cualquier alteración estructural, se insertó un sitio de restricción AscI seguido de un elemento de repetición terminal (TR) directamente posterior al codón de parada. Este elemento TR incluía los nucleótidos 7325 a 7340, que contenían los cuatro residuos de uridina que se cree que están implicados en el dominio S. Se planteó la hipótesis de que el TR separaría la estructura de oriR del RE insertado en el sitio AscI, manteniendo al mismo tiempo la secuencia codificante (figura 1C, derecha). Se generaron construcciones que contenían tanto miRT-1x (CVA21-3'TR(1x)) como miRT-2x (CVA21-3'TR(2x)).

[0134] Se verificó la integridad del inserto de diana de microARN en todas las construcciones mediante la secuenciación de la región del inserto.

[0136] Cinética de rescate del virus a partir de transcritos de ARN

[0138] Un objetivo era obtener ácido nucleico infeccioso que pudiera nuclearse en una infección vírica que se propaga a partir del ácido nucleico infeccioso dirigido a una tasa similar a la del virus sin modificar. Para analizar la capacidad de los ARN infecciosos dirigidos de producir descendencia vírica, se transfectaron células H1-HeLa (ATCC, Manassas, VA) que no expresan miR-133 o miR-206 con ARN infeccioso que codifica cada miRT-CVA21. El ARN infeccioso se preparó linealizando el ADN plasmídico que codifica el miRT-CVA21 sin modificar con la endonucleasa de restricción MluI-HF (New England Biolabs, Ipswich, MA), seguido de precipitación con etanol y resuspensión en agua sin nucleasas. Se transcribió 1 µg de ADN linealizado en transcritos de ARN usando el kit de transcripción Ambion MEGAscript T7, y el ARN se purificó usando el kit de limpieza de transcripción MEGAclear (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA); ambos de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El tamaño y la integridad de los transcritos se verificaron procesando el ARN en un RNA FlashGel (Lonza, Basilea, Suiza). Se sembraron 4 x 10<5>células por pocillo en placas de histocultivo de 6 pocillos, 24 horas antes de la transfección. Cada pocillo se transfectó con 2,5 µg de ARN T7 purificado usando el kit de transfecciónTransIT-mRNA (Mirus Bio LLC, Madison, WI). Una vez observados efectos citopáticos (CPE), las células se rasparon en el sobrenadante y las muestras se recogieron en criotubos individuales. Las muestras se sometieron a 3 ciclos de congelación-descongelación, se aclararon mediante centrifugación a 2500 rpm durante 5 minutos a 4 °C y se filtraron a través de un filtro de jeringa de 0,22 µm. Se usaron 50 µl de lisado aclarado para infectar células H1-HeLa frescas en un pocillo de una placa de histocultivo de 6 pocillos. Las células se infectaron durante 2 horas a 37 °C en medio sin suero. Se retiraron los medios y el virus no incorporado, y se añadieron 2 ml de medio de crecimiento completo fresco por pocillo. A las 24 horas después de la infección, se observaron las células para CPE. Todos los miRT-CVA21, excepto la construcción de Kellyet al., CVA21-3'miRT, generaron suficiente descendencia vírica para producir un CPE visible (figura 2A).

[0140] Para evaluar la tasa a la que se generaba la descendencia vírica a partir de los transcritos de ARN que codificaban estos genomas víricos dirigidos, se realizaron curvas de crecimiento frente al tiempo en células H1-HeLa. Se sembraron 2,5 x 10<5>células H1-HeLa por pocillo en placas de histocultivo de 12 pocillos, 24 horas antes de la transfección. Cada pocillo se transfectó con 1 µg de ARN T7 purificado usando el kit de transfecciónTransIT-mRNA (Mirus Bio LLC, Madison, WI). A las 6 horas después de la transfección, se retiró el medio y se lavaron las células una vez con medio completo. Se añadió 1 ml de medio de crecimiento completo por pocillo y las células se incubaron a 37 °C hasta el momento deseado. A las 6, 12, 24 y 48 horas después de la transfección, las células se rasparon en el sobrenadante y las muestras se recogieron en criotubos individuales y se almacenaron a -80 °C hasta que se recogieron todas las muestras. Las muestras se sometieron a 3 ciclos de congelación-descongelación y se aclararon mediante centrifugación a 2500 rpm durante 5 minutos a 4 °C. Los lisados aclarados se valoraron en células H1-HeLa y se determinó la DIHC<50>por ml de cada muestra usando la ecuación de Spearman-Kärber. La producción de virus a partir de la construcción de Kellyet al., CVA21-3'miRT, se vio gravemente alterada. La tasa de rescate del ARN de CVA21-TR(2x) se retardó ligeramente en comparación con el ARN de CVA21 sin modificar. Todos los demás ARN de miRT-CVA21 rescataron el virus a tasas y niveles similares a los del genoma de ARN sin modificar (figura 2B). Se obtuvieron resultados similares cuando se realizó el estudio temporal en la línea celular de melanoma humano Mel624 (Imanis Life Sciences, Rochester, MN) (figura 2C).

[0142] Caracterización de virus miRT-CVA21

[0144] Para generar reservas de virus, se produjo ARN vírico como se describe anteriormente. Se transfectaron 2,5 µg de ARN por pocillo en células H1-HeLa sembradas en placas de 6 pocillos, como se describe anteriormente. A las 48-72 horas después de la transfección, las células se rasparon en el sobrenadante y se recogieron las muestras. Las muestras se sometieron a 3 ciclos de congelación-descongelación, se aclararon mediante centrifugación a 2500 rpm durante 5 minutos a 4 °C y se filtraron a través de un filtro de jeringa de 0,22 µm. Las células H1-HeLa en un matraz T75 se infectaron con los lisados aclarados a 37 °C en medios sin suero. Dos horas después de la infección, se retiraron los medios y el virus no incorporado, y las células se reabastecieron con medios de crecimiento completos. Una vez observado el CPE, las muestras se procesaron de la misma manera. Las reservas de virus de lisado aclarado se dividieron en alícuotas y se almacenaron a -80 °C. Los virus se valoraron en células H1-HeLa. Se sembraron 1 x 10<4>células por pocillo en placas de histocultivo de 96 pocillos, 24 horas antes de la infección. Se realizaron diluciones en serie de diez veces (de 1 x 10<-2>a 1 x 10<-10>) del virus en medios sin suero, y se añadieron 100 µl de cada dilución a cada uno de los 8 pocillos duplicados. Las células se infectaron durante 2 horas a 37 °C y, a continuación, se retiró el medio y se remplazó por 100 µl de medio de crecimiento completo. Las células se incubaron a 37 °C durante 72 horas y, a continuación, se inspeccionaron visualmente los pocillos para CPE. La DIHC<50>por ml de cada muestra se determinó usando la ecuación de Spearman-Kärber.

[0146] Se realizaron curvas de crecimiento en una etapa para comparar la cinética de replicación del miRT-CVA21 con la del virus sin modificar. Las células H1-HeLa se infectaron con el virus sin modificar o con miRT-CVA21 a una multiplicidad de infección de 3,0 en medio sin suero. Dos horas después de la infección, se lavaron las células y se añadió medio de crecimiento completo. Las muestras se recogieron en momentos específicos después de la transfección (2, 4, 6, 8, 12, 24 y 48 horas) y se almacenaron a -80 °C. Después de completarse todos los puntos temporales, las muestras se congelaron y descongelaron 3 veces, y los restos celulares se eliminaron de los lisados mediante centrifugación a 2500 rpm durante 5 minutos a 4 °C. A continuación, se valoraron los lisados aclarados y se determinaron las concentraciones víricas usando la ecuación de Spearman-Kärber. Todos los miRT-CVA21 se replicaron con una cinética similar a la del virus sin modificar.

[0148] La eficiencia y la especificidad de la dirección por microARN se analizaron midiendo la viabilidad celular y la replicación vírica en células H1-HeLa transfectadas con miméticos de miARN sintéticos complementarios o no complementarios (Dharmacon, Lafayette, CO). Los miméticos se retrotransfectaron en células H1-HeLa usando el kit de transfecciónTransIT-mRNA de acuerdo con el protocolo del fabricante a una concentración de 100 nM cada uno. En resumen, los complejos de transfección se ensamblaron en una placa de 96 pocillos y se incubaron a temperatura ambiente durante 5 minutos. Las células H1-HeLa en matraces T75 se trataron con tripsina, se contaron y se resuspendieron en medios de crecimiento completos a una concentración de 1 x 10<4>células por 90 µl. Se añadieron 90 µl de células por pocillo y las mezclas de células/transfección se incubaron a 37 °C durante 12 horas. Las células se infectaron a una MOI de 1 con cada miRT-CVA21 durante 2 horas a 37 °C en medio sin suero. Después de la infección, se retiraron los medios y el virus no incorporado y se remplazaron con 100 µl de medio de crecimiento completo, y las células se incubaron a 37 °C. A las 24 horas después de la infección, se recogieron los sobrenadantes y se valoraron como se describe anteriormente. Se ensayaron las células para la proliferación usando un kit de bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazolil-2)-2,5-difeniltetrazolio (MTT) (ATCC, Manassas, VA). La replicación de CVA21-3'TR(2x) no estaba regulada por miR-133, miR-206 o una combinación de los dos miméticos. La replicación vírica estaba mínimamente controlada por miR-133 para CVA21-686(2x) y CVA21-ΔV(2x). El microARN-206 era mucho más eficiente en el control de la replicación vírica, provocando un aumento de la viabilidad celular y una disminución de las concentraciones víricas para CVA21-ΔV(1x), CVA21-ΔV(2x), CVA21-686(2x) y CVA21-3'TR(1x). El tropismo del virus se reguló de manera similar en las células H1-HeLa transfectadas con miR-133 y miR-206. No se observaron diferencias en la viabilidad celular y la concentración vírica en las células H1-HeLa transfectadas con el mimético de control miR-142 o las células no transfectadas. Cabe destacar que los virus con RE localizados en la UTR 5' se controlaron más fácilmente que CVA21-3'TR(1x). En función de estos resultados, los análisis no continuaron con la construcción CVA21-3'TR(2x).

[0150] Estabilidad genética in vitro de los elementos de respuesta

[0152] Se evaluó la estabilidad genética de los RE en ubicaciones variables mediante el pase forzado de miRT-CVA21 en células musculares TE671 que expresan miR-133 y miR-206. Las células TE-671 se cultivaron en suero de caballo al 2 % durante 4 días, lo que induce que las células se diferencien en miotubos que expresan niveles más altos de miR-133 y miR-206. Las células TE-671 diferenciadas (dTE-671) en placas de histocultivo de 6 pocillos se infectaron a una MOI de 10 con CVA21-ΔV(1x), CVA21-ΔV(2x), CVA21-686(2x), CVA21-3'TR(1x) o CVA21-3'TR(2x) durante 2 horas a 37 °C en medio sin suero. Después de 2 horas, se retiraron los medios y el virus no incorporado, y las células se lavaron con medios completos. Se añadieron 1,5 ml de medio completo por pocillo y se incubaron las células a 37 °C. A las 24 horas después de la infección, se rasparon las células en el sobrenadante y se recogieron las muestras. Todas las muestras se sometieron a 3 ciclos de congelación-descongelación, y los lisados se aclararon por centrifugación a 2500 rpm durante 5 minutos a 4 °C y se filtraron a través de un filtro de 0,22 µm. El virus de los lisados aclarados se pasó en serie en células dTE-671 siete veces, usando cada vez 1 volumen de lisado aclarado por 2 volúmenes de medio fresco. El ARN vírico se aisló de los lisados aclarados de cada pase con un mini kit de ARN vírico QIAamp (Qiagen, CA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se sintetizó ADNc y se amplificaron las regiones que contenían los RE. Los amplicones se secuenciaron con cebadores internos. Este ensayo se realizó por duplicado. Se observaron mutantes de escape en muestras de CVA21-686(2x) tan pronto como en el segundo pase. Todas las demás infecciones por miRT-CVA21 dieron lugar a mutantes de escape entre los pases 4 y 7.

[0154] Análisis in vivo de la actividad oncolítica

[0156] En función de los resultadosin vitro, no se evaluóin vivola construcción CVA21-3'TR(2x). Se adquirieron ratones CB17 ICR-SCID hembra de 4-5 semanas de edad de Envigo (Huntingdon, Cambridgeshire, Reino Unido). Los ratones se irradiados y, 24 horas después, se les implantó por vía subcutánea 5e6 células Mel624 en el flanco derecho. Cuando los tumores alcanzaron un promedio de 0,5 cm x 0,5 cm, los tumores se trataron con 30 µg de ARN en 50 µl de solución salina por vía intratumoral. Se supervisó de forma rutinaria el volumen del tumor, medido usando un calibre manual, el peso y el estado general de salud. Se extrajo sangre de todos los ratones el día 7 después del tratamiento con ARN. Se anestesió a los ratones mediante inhalación de isoflurano y se extrajo sangre de la vena submandibular en un tubo BD Microtainer con gel separador de suero. Se dejó que la sangre coagulase durante 30 minutos a temperatura ambiente y, a continuación, se separó el suero mediante centrifugación a 8000 rpm durante 5 minutos a 4 °C. Los sueros se almacenaron a -80 °C. El virus en el suero se valoró como se describe para las reservas de virus en células H1-HeLa. Se obtuvieron sueros (extraídos mediante punción cardiaca) y tejido muscular esquelético de todos los ratones en el momento de la eutanasia. Las secciones de músculo esquelético se congelaron rápidamente de forma inmediata y se almacenaron a -80 °C o se fijaron en formol al 10 %. El ARN total se aisló de secciones de tejido congeladas instantáneamente con un mini kit RNeasy Plus Universal (Qiagen, CA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El ARN vírico se aisló de los sueros usando un mini kit de ARN vírico QIAamp (Qiagen, CA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se sintetizó el ADNc y se amplificaron las regiones que contenían los RE usando el sistema de RT-PCR Titan One-Tube (Sigma Aldrich, St. Louis, MO) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los amplicones se secuenciaron con cebadores internos.

[0158] Los volúmenes y pesos de los tumores de todos los ratones a lo largo de la duración del experimento se muestran en la figura 4A. Los ratones tratados con control y los ratones a los que se les administró ARN CVA21-3'miRT presentaron un crecimiento tumoral progresivo y se sacrificaron debido a que el volumen tumoral superaba el 10 % del peso corporal o a la ulceración tumoral. Un ratón tratado con CVA21-3'miRT se encontró en estado moribundo y se sacrificó inmediatamente. El análisis de la secuencia de los genomas víricos en el tejido de músculo esquelético de este ratón reveló reversiones al tipo silvestre. Se observó una rápida regresión tumoral en todos los ratones tratados con ARN CVA21, CVA21-ΔV(1x), CVA21-ΔV(2x), CVA21-686(2x) o CVA21-3'TR(1x). Se observó toxicidad en forma de parálisis de las extremidades posteriores (HLP), muerte súbita (FD) o pérdida de peso excesiva (WL) en todos los ratones tratados con ARN CVA21 y en una proporción de ratones tratados con ARN CVA21-ΔV(1x), CVA21-686(2x) o CVA21-3'TR(1x) en un 60 %, 60 % y 75 %, respectivamente. No se observó toxicidad en los ratones tratados con ARN CVA21-ΔV(2x). Las toxicidades observadas y las proporciones por grupo se muestran en la figura 4B. Todos los ratones tratados con CVA21-ΔV(2x) parecían sanos y sin tumores al final del día 90 del estudio. Los genomas víricos aislados del suero y del músculo esquelético de todos los ratones tratados con CVA21-ΔV(2x) mantuvieron el RE sin mutaciones. La supervivencia global de los ratones tratados con CVA21-ΔV(2x) fue del 100 %, lo que mejora significativamente la supervivencia sobre los ratones tratados con el control, p = 0,002 (figura 4C).

[0160] Como se muestra en la figura 4D, no se recuperó virus infeccioso del suero aislado el día 7 después del tratamiento de los ratones tratados con ARN CVA21-3'miRT. Por el contrario, las concentraciones víricas observadas en los sueros de los ratones tratados con ARN CVA21-ΔV(1x), CVA21-ΔV(2x), CVA21-686(2x) o CVA21-3'TR(1x) estaban a niveles similares a los encontrados en los ratones tratados con ARN CVA21.

[0162] Aumento de la dosis in vivo de ARN CVA21-ΔV(2x)

[0164] Se irradiaron ratones CB17 ICR-SCID hembra de 4-5 semanas de edad de Envigo (Huntingdon, Cambridgeshire, Reino Unido) y, 24 horas después, se les implantaron por vía subcutánea 5e6 células Mel624 en el flanco derecho. Cuando los tumores alcanzaron un promedio de 0,5 cm x 0,5 cm, los tumores se trataron con 1-32 µg de ARN CVA21-ΔV(2x) en 50 µl de solución salina por vía intratumoral. Se supervisó de forma rutinaria el volumen del tumor, medido usando un calibre manual, el peso y el estado general de salud. Se extrajo sangre de todos los ratones el día 9 después del tratamiento con ARN. El tamaño del tumor, el peso, la sangre, el aislamiento del suero, la recogida de tejido y la secuenciación del genoma se midieron, obtuvieron, procesaron y analizaron como se describe para el experimentoin vivoprevio.

[0166] Como se muestra en la figura 5A, los ratones tratados con el control presentaron un crecimiento tumoral progresivo y todos se sacrificaron debido al tamaño del tumor o a la ulceración. De 5 ratones ratones tratados con 1 µg de ARN CVA21-ΔV(2x), 4 también presentaron un crecimiento tumoral progresivo, sin embargo, se observó una regresión tumoral completa en un ratón. Se observó regresión tumoral completa en todos los demás ratones tratados con ARN CVA21-ΔV(2x) a 4 hasta 32 µg. Se observó parálisis de las extremidades posteriores en un solo ratón tratado con ARN CVA21-ΔV(2x) a 8 µg. El análisis de secuencias y el análisis histológico del músculo esquelético no revelaron ninguna mutación en la secuencia del elemento de respuesta o signos de miositis. Otro ratón tratado con 32 µg de ARN CVA21-ΔV(2x) se encontró muerto 78 días después del tratamiento con ARN. La mayoría de los ratones tratados con 4 a 32 µg de ARN CVA21-ΔV(2x) presentaban cargas víricas elevadas en el suero el día 9 después del tratamiento con ARN, sin embargo, algunos no lo hicieron (figura 5B). El análisis de la evolución temporal de las cargas víricas en el suero después del tratamiento con ARN puede usarse para establecer el momento en que se observarán las cargas víricas máximas. Solo se observó viremia en un ratón del grupo de 1 µg, y este ratón presentó una regresión tumoral completa.

[0168] Destrucción tumoral bilateral después de terapia con ARN CVA21-ΔV(2x)

[0170] Se irradia a ratones CB17 ICR-SCID hembra de 4-5 semanas de edad y, 24 horas después, se les implanta por vía subcutánea 5e6 células Mel624 en el flanco derecho y 5e6 células Mel624 en el flanco izquierdo. Cuando los tumores alcanzan un promedio de 0,5 cm x 0,5 cm, se trata a los ratones. A cada ratón se le administra una sola inyección de 2, 10 o 30 µg de ARN CVA21-ΔV(2x) en el tumor del flanco derecho. Se supervisa de forma rutinaria el volumen del tumor, que se mide usando un calibre manual, el peso y el estado general de salud. Se extrae sangre de dos ratones por grupo los días 2, 4, 6, 8 o 10 después del tratamiento. El tamaño del tumor, el peso, la sangre, el aislamiento del suero, la recogida de tejido y la secuenciación del genoma se miden, se obtienen, se procesan y analizan como se describe para los experimentosin vivoprevios.

[0171] Posibles formulaciones de ácido nucleico infeccioso para terapia con CVA21-ΔV(2x)

[0173] Ejemplos de formulaciones de ácido nucleico infeccioso incluyen, aunque sin limitación, clones de ADNc infecciosos o transcritos de ARN que codifican genomas de picornavirus. Las técnicas usadas para sintetizar genomas de ARN vírico a partir de ADNc infeccioso pueden provocar nucleótidos adicionales (que no forman parte del genoma vírico) en los extremos 5' y/o 3'. Se ha demostrado que varios virus de ARN positivo y negativo, incluyendo el virus de la poliomielitis, requieren extremos exactos para una replicación eficiente (Boyeret al., Virology, 198:415-426 (1994); Herold y Andino, J. Virol., 74(14):6394-6400 (2000)). Aunque estos residuos pueden eliminarse durante la replicación, generando los genomas víricos auténticos, su presencia inicial puede tener efectos perjudiciales sobre la infectividad específica del ácido nucleico terapéutico. La terapia con ácido nucleico infeccioso CVA21-ΔV(2x) puede mejorarse empleando mecanismos que generen rápidamente genomas víricos auténticos. Uno de dichos mecanismos es codificar secuencias de ribozima en los extremos 5' y/o 3'. Las ribozimas son moléculas (estructuras) de ARN con propiedades catalíticas. Determinadas ribozimas pueden escindir moléculas de ARN enciso entransen posiciones muy específicas. La codificación de ribozimas en los extremos 5' y/o 3' del genoma vírico en formulaciones de ácido nucleico infeccioso que codifica CVA21-ΔV(2x) puede mejorar aún más la eficacia terapéutica.

[0175] Se generaron tres construcciones diferentes para confirmar esto. La primera incluye una ribozima inmediatamente anterior al genoma CVA21-ΔV(2x) (Rz-CVA21-ΔV(2x)). Esta ribozima está modificada para permitir la escisión encisen los extremos 5' exactos del genoma CVA21-ΔV(2x). La segunda construcción incluye una ribozima diferente inmediatamente posterior al genoma CVA21-ΔV(2x) (CVA21-ΔV(2x)-Rz), de modo que escinde el ARN encisdirectamente posterior a la cola de poli A codificada de CVA21-ΔV(2x). La tercera construcción incluye el genoma CVA21-ΔV(2x) flanqueado por estas dos ribozimas (Rz-CVA21-ΔV(2x)-Rz). Se sintetizan genomas de ARN y se caracteriza su infectividad específica, eficacia/especificidad de dirección, estabilidad genética y eficacia/seguridad terapéutica como se describe anteriormente para el CVA21-ΔV(2x) sin modificar. Un mecanismo para garantizar terminaciones 3' auténticas o casi auténticas es incluir secuencias que codifican un sitio de restricción que puede escindirse por una endonucleasa de restricción directamente adyacente o dentro de 5 residuos nucleotídicos después del extremo 3' codificado (por ejemplo, la cola de poli A). Un sitio de enzima de restricción NheI estaba codificado dentro del ADN que codifica el genoma vírico CVA21-ΔV(2x) directamente adyacente a la cola de poli A codificada. El ADN se linealizó con la endonucleasa de restricción NheI, de modo que los transcritos de ARN derivadosin vitroque codificaban el CVA21-ΔV(2x) contenían 5 nucleótidos no víricos después de la cola de poli A (CVA21-ΔV(2x)3'NheI). Se generó otra construcción con el sitio NheI en el extremo 3' del genoma CVA21-ΔV(2x) junto con una ribozima inmediatamente anterior del genoma CVA21-ΔV(2x) (Rz-CVA21-ΔV(2x)-3'NheI). Se sintetizan genomas de ARN y se caracteriza su infectividad específica, eficacia/especificidad de dirección, estabilidad genética y eficacia/seguridad terapéutica como se describe anteriormente para el CVA21-ΔV(2x) sin modificar.

[0177] Eficacia terapéutica en una diversidad de tipos de tumores

[0179] La terapia con ácido nucleico infeccioso CVA21-ΔV(2x) puede usarse para tratar una diversidad de tipos de cáncer incluyendo, aunque sin limitación, melanoma, mieloma, cáncer de próstata, cáncer de mama, cáncer de pulmón (por ejemplo, cáncer de pulmón no microcítico) y cáncer pancreático. Se sembraron 1 x 10<4>células por pocillo de líneas celulares tumorales representativas de estos tipos de cáncer en placas de histocultivo de 96 pocillos. Las células se infectaron a una MOI creciente entre 0,001 y 1 con CVA21 o CVA21-ΔV2 durante 2 horas a 37 °C en medios sin suero. Después de la infección, se retiraron los medios y el virus no incorporado y se remplazaron con 100 µl de medio de crecimiento completo, y las células se incubaron a 37 °C. A las 72 horas después de la infección, se ensayó la proliferación de las células usando un kit de bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazolil-2)-2,5-difeniltetrazolio (MTT) (ATCC, Manassas, VA). Todas las líneas celulares sometidas a prueba fueron tan susceptibles a CVA21-ΔV2 como a CVA21 (figura 6).

[0181] Este panel de células tumorales se analiza para la susceptibilidad a las formulaciones de ácido nucleico infeccioso que codifica CVA21-ΔV2. Se siembran 6 x 10<4>células por pocillo en placas de histocultivo de 24 pocillos. Los transcritos de ARN que codifican CVA21, CVA21-ΔV2, Rz-CVA21-ΔV2, CVA21-ΔV2-Rz o Rz-CVA21-ΔV2-Rz se transfectan en las células. Cada pocillo se transfecta con 0,5 µg de ARN T7 purificado usando el kit de transfecciónTransIT-mRNA (Mirus Bio LLC, Madison, WI). Se usan controles de transfección sin molde para tener en cuenta los cambios en la viabilidad celular asociados con el protocolo de transfección. A las 24, 48 y 72 horas después de la transfección, se ensayan las células para la proliferación usando un kit de bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazolil-2)-2,5-difeniltetrazolio (MTT) (ATCC, Manassas, VA).

[0183] Ejemplo 2 - Infectividad y estabilidad del ácido nucleico que puede usarse para tratar el cáncer La inserción de un RE 2x en el dominio Y reduce la infectividad específica y elimina la eficacia terapéutica del ARN infeccioso que codifica el genoma CVA21-3'miRT.

[0185] La recuperación del virus infeccioso después de la transfección de 1 µg de ARN infeccioso derivadoin vitroque codifica CVA21-3'miRT se retrasó considerablemente tanto en las células H1-HeLa como en las Mel624 en comparación con el ARN que codifica CVA21 sin modificar (figura 2). Se adquirieron ratones CB17 ICR-SCID hembra de 4-5 semanas de edad de Envigo (Huntingdon, Cambridgeshire, Reino Unido). Los ratones se irradiados y, 24 horas después, se les implantó por vía subcutánea 5e6 células Mel624 en el flanco derecho. Cuando los tumores alcanzaron un promedio de 0,5 cm x 0,5 cm, los tumores se trataron con 30 µg de ARN que codificaba CVA21 sin modificar o CVA21-3'miRT en 50 µl de solución salina por vía intratumoral. Se supervisó de forma rutinaria el volumen del tumor, medido usando un calibre manual, el peso y el estado general de salud. Se extrajo sangre de todos los ratones el día 7 después del tratamiento con ARN. Se anestesió a los ratones mediante inhalación de isoflurano y se extrajo sangre de la vena submandibular en un tubo BD Microtainer con gel separador de suero. Se dejó que la sangre coagulase durante 30 minutos a temperatura ambiente y, a continuación, se separó el suero mediante centrifugación a 8000 rpm durante 5 minutos a 4 °C. Los sueros se almacenaron a -80 °C. El virus en el suero se valoró como se describe para las reservas de virus en células H1-HeLa. Como se muestra en las figuras 4A y D, el ARN que codifica CVA21-3'miRT no presentó ninguna actividad oncolítica ni indujo viremia. La predicción de la estructura secundaria del ARN demuestra la alteración del dominio Y del oriR y la probabilidad reducida de formación de pseudonudos, lo que probablemente contribuye a la infectividad específica reducida del ARN derivadoin vitroy a la falta de eficacia terapéutica (figura 13).

[0187] El remplazo de la región de exploración potencia la estabilidad del elemento de respuesta a microARN.

[0188] En el momento de la eutanasia, se aislaron los genomas víricos del suero y del músculo esquelético de los ratones tratados con CVA21-ΔV(2x) y de los ratones con signos clínicos de toxicidad. Se aisló el ARN vírico o total de las muestras, respectivamente, y se sintetizó el ADNc. Se amplificaron las regiones que contenían los elementos de respuesta a microARN y se secuenciaron los amplicones. Se detectaron retromutantes en el músculo esquelético de un ratón tratado con CVA21-ΔV(1x) que desarrolló parálisis de las extremidades posteriores y en los tres ratones tratados con CVA21-686(2x) que desarrollaron parálisis de las extremidades posteriores. Por el contrario, no se detectaron retromutantes o mutantes de escape en ninguno de los ratones tratados con CVA21-ΔV(2x). Cabe destacar que también se detectaron retromutantes en los dos ratones evaluables tratados con CVA21-TR(1x). En un esfuerzo por determinar la estabilidad de los elementos de respuesta a microARNin vitro,se realizó un pase en serie de cada CVA21 deslocalizado por microARN en células musculares TE671 diferenciadas (dTE-671) que expresan miR-133 y miR-206. Las células dTE671 se infectaron inicialmente a una MOI de 10. A las veinticuatro horas después de la infección, se recogieron las muestras y se infectaron células dTE671 frescas con el 50 % de los lisados aclarados. Se aisló el ARN vírico de los lisados aclarados de siete pases en serie, se sintetizó el ADNc y se amplificaron las regiones que contenían los elementos de respuesta para su secuenciación. En ambos experimentos, se detectaron retromutantes en muestras de CVA21-686(2x) 2-3 pases antes de la detección en muestras de CVA21-ΔV(2x) y CVA21-ΔV(1x). Estos datos indican que la elongación de la región de exploración con la inserción directa del elemento de respuesta a microARN disminuye la estabilidad genética, un efecto que es más pronunciadoin vivo.

[0190] El remplazo de la región de exploración ribosómica con el elemento de respuesta a microARN minimiza la posibilidad de alteraciones estructurales.

[0192] A diferencia del complejo entorno estructural del NCR 3', se prevé que el NCR 5' de CVA21 contenga una región de exploración desordenada directamente posterior al IRES. Se desconoce la función de este dominio en la replicación de CVA21. Aunque se ha demostrado que esta región es prescindible para la replicación del virus de la poliomielitisin vitroein vivo, se ha indicado que se une a un factor de acción entransdel IRES que potencia la traducción del enterovirus 71. El análisis de la estructura secundaria del ARN predijo que la configuración CVA21-ΔV(2x) provocaba el mantenimiento del dominio VI dentro del IRES y, por lo tanto, no debe afectar significativamente a la carga ribosómica y la traducción (figura 13). La inserción dentro del NCR 5' no afecta a la formación de pseudonudos, como es el caso con la inserción en cualquier punto del NCR 3'. Como se muestra en la figura 13D-F, aunque la construcción TR(2x) separa el elemento de respuesta a microARN de los bucles de oriR (dominios Y y X), la interacción de pseudonudos prevista entre el dominio Y y el dominio X sigue perdida, como se representa en las líneas de conexión entre bucles.

[0194] Posibles formulaciones de ácido nucleico infeccioso para terapia con CVA21-ΔV(2x)

[0196] La terapia con ácido nucleico infeccioso CVA21-ΔV(2x) puede mejorarse empleando mecanismos que generen rápidamente genomas víricos auténticos. Uno de dichos mecanismos es codificar secuencias de ribozima en los extremos 5' y 3'. Las ribozimas son moléculas (estructuras) de ARN con propiedades catalíticas. Determinadas ribozimas pueden escindir moléculas de ARN enciso entransen posiciones muy específicas. La codificación de ribozimas en los extremos 5' y/o 3' del genoma vírico en formulaciones de ácido nucleico infeccioso que codifica CVA21-ΔV(2x) puede mejorar aún más la eficacia terapéutica.

[0198] Se generaron cinco construcciones diferentes para probar esta hipótesis. La primera incluía una ribozima inmediatamente anterior al genoma CVA21-ΔV(2x) (Rz-CVA21-ΔV(2x)). Esta ribozima estaba modificada para permitir la escisión encisen los extremos 5' exactos del genoma CVA21-ΔV(2x). La segunda construcción incluía una ribozima diferente inmediatamente posterior al genoma CVA21-ΔV(2x) (CVA21-ΔV(2x)-Rz), de modo que escindirá el ARN encisdirectamente posterior a la cola de poli A codificada de CVA21-ΔV(2x). La tercera construcción incluía un sitio de corte por la enzima de restricción NheI directamente adyacente a la cola de poli A del genoma vírico codificado en el ADN plasmídico. El sitio de corte de NheI se usó para generar transcritos lineales, de modo que solo unos pocos residuos siguieran a la cola de poli A. La cuarta construcción incluía una ribozima en el extremo 5' del genoma CVA21-ΔV(2x) y el sitio de corte de NheI después de la cola de poli A (Rz-CVA21-ΔV(2x)-3'NheI). La quinta construcción incluía el genoma CVA21-ΔV(2x) flanqueado por estas dos ribozimas (Rz-CVA21-ΔV(2x)-3'Rz). Se sintetizaron genomas de ARN y se caracterizó su infectividad específica, eficacia/especificidad de dirección, estabilidad genética y eficacia/seguridad terapéutica como se describe anteriormente para el CVA21-ΔV(2x) sin modificar. Como se muestra en la figura 14, ambas construcciones con extremos dobles auténticos o casi auténticos (es decir, Rz-CVA21-ΔV(2x)-3'Rz y Rz-CVA21-ΔV(2x)-3'NheI, respectivamente) tenían infectividad específica aumentada y efectos citopáticos observados antes después de la transfección de células H1-HeLa en comparación con el ARN CVA21-ΔV(2x) sin modificar. Ambas construcciones presentan actividad oncolítica contra tumores de xenoinjerto Mel624 subcutáneos en ratones CB-17 SCID (figura 15A). Ambas construcciones también pudieron generar infecciones oncolíticas que se propagan, como se presenta por el desarrollo de viremia en los ratones tratados en los días 2 y 7 después de la terapia (figura 15B). Rz-CVA21-ΔV(2x)-3'NheI fue más eficiente que CVA21-ΔV(2x) y Rz-CVA21-ΔV(2x)-3'Rz, y el desarrollo de viremia en ratones tratados con Rz-CVA21-ΔV(2x)-3'NheI fue más constante. Pueden usarse diferentes combinaciones de secuencias codificantes de ribozima y sitios de corte por enzimas de restricción (con enzimas de restricción añadidas de forma exógena diseñadas para cortar en esos sitios de corte) para modular la infectividad específica y el potencial terapéutico de la formulación de ARN infeccioso. Esto puede incluir, aunque sin limitación, el potencial inmunógeno de la construcción en diversos microentornos tumorales y vías de administración.

[0199] La siembra inicial de células tumorales heterogéneas es independiente de la expresión del receptor de virus, pero la propagación y la seguridad siguen dependiendo de la expresión de hICAM-1 y/o del factor acelerador de la descomposición.

[0200] Las células B16-F10 de melanoma murino no son susceptibles a CVA21 porque no expresan los receptores de virus. Se generó una línea celular B16-F10 que expresa hICAM-1 de forma estable por medio de transducción lentivírica, selección con antibióticos, clasificación de células individuales y expansión de una población clonal. La recuperación del virus de esta línea celular B16-F10-hICAM124 horas después de la infección con CVA21-ΔV(2x) a un MOI de 1 se potenció significativamente en comparación con la línea celular parental (figura 16). Este efecto también puede aplicarse a otras líneas celulares que no expresan los receptores para la entrada del virus, para ampliar el repertorio de modelosin vivo. El ácido nucleico infeccioso puede usarse para ampliar la siembra inicial de células tumorales para incluir células que no expresan el receptor de virus, manteniendo al mismo tiempo la especificidad de propagación después de la producción del virus. La especificidad de tipo celular puede modularse aún más mediante la incorporación de diferentes secuencias diana de microARN.

[0201] Las reacciones de transcripción in vitro pueden cambiarse de escala para generar preparaciones clínicas de ARN infeccioso CVA21-ΔV(2x).

[0202] Los estudios preclínicos utilizaron un kit de transcripción de ARNin vitropara generar transcritos de ARN. Cada reacción de 10 microlitros produciría ~100 microgramos de ARN, que se usarían en los estudiosin vivo. Para demostrar la viabilidad de cambiar de escala un método de producción sin kits disponibles en el mercado, se estableció una reacción similar y se cambió de escala a 1 ml (100x), y los transcritos resultantes se purificaron usando precipitación con cloruro de litio. Esta reacción cambiada de escala produjo >7 miligramos de ARN con una integridad similar a la de las reacciones de 10 microlitros, según se observó mediante electroforesis en gel de ARN (figura 17).

[0203] Las modificaciones del ácido nucleico infeccioso derivado in vitro pueden usarse para potenciar la estabilidad en diferentes entornos.

[0204] Pueden usarse diversos mecanismos para potenciar la estabilidad de los ARN en la sangre y la capacidad de traducción después de la internalización dentro de una célula. Estas técnicas incluyen, aunque sin limitación, usar bases modificadas (por ejemplo, N-metilpseudouridina) en la transcripciónin vitropara generar ARN que se asemejen mucho a los ARN normalmente presentes en los hospedadores que se están tratando, mecanismos de adición de caperuza y poliadenilación de los transcritos. Todos estos mecanismos y otros para potenciar la estabilidad, la administración, la captación y la expresión de los agentes terapéuticos basados en ácido nucleico pueden aplicarse a la terapia con ácido nucleico infeccioso. Estos mecanismos también pueden usarse para modular la inmunogenia del ácido nucleico infeccioso en función de cada paciente. Adicionalmente, la administración de ácido nucleico infeccioso puede potenciarse mediante la formación de complejos del ácido nucleico con una diversidad de moléculas portadoras diferentes incluyendo, aunque sin limitación, moléculas basadas en lípidos, basadas en polímeros, basadas en nanopartículas y otras moléculas biosintéticas.

[0205] Ejemplo 3: Costes reducidos y simplificación de la fabricación

[0206] Los protocolos de fabricación varían para cada virus oncolítico, sin embargo, el esquema general de los procedimientos necesarios para producir y purificar grandes cantidades del virus con concentraciones suficientes de partículas infecciosas es similar. Se generan y califican un banco principal de células GMP y un virus principal de siembra. Estas células se siembran y se expanden usando formulaciones de medios optimizadas hasta que se establece un número suficiente de células. Estas células a menudo se siembran en biorreactores grandes para su posterior expansión e infección. El virus se recoge, lo que generalmente requiere la lisis y/o aclarado de los restos celulares, seguido de digestión enzimática de los ácidos nucleicos residuales y purificación del lisado. Los procesos de purificación posteriores pueden incluir diversas etapas de ultrafiltración y diafiltración, y purificación basada en cromatografía (por ejemplo, intercambio iónico y filtración en gel). Esto va seguido de otra etapa de filtración antes del envasado en viales y el almacenamiento. La producción de agentes terapéuticos basados en ARN requiere menos etapas y puede cambiarse de escala para producir mayores rendimientos en volúmenes menores (es decir, biorreactores más pequeños). Las etapas implicadas en la producción de ARN infeccioso son menos y más sencillas. Se crea un banco principal de ADN plasmídico linealizado que codifica el genoma vírico. Este se usa para reacciones de transcripciónin vitro(en general ~1 l por reserva) para producir el ARN infeccioso. Se usa digestión con DNasa para eliminar el ADN plasmídico residual y, a continuación, el ARN infeccioso se purifica por medio de precipitación o filtración en columna. Puede usarse purificación por HPLC o FPLC para eliminar contaminantes adicionales para garantizar la pureza. A diferencia de las terapias actuales basadas en ARNm, los transcritos de CVA21-ΔV(2x) no requieren adición de caperuza o adición de cola, lo que reduce los costes/etapas de síntesis y purificación usando protocolos GMP de transcripciónin vitro. Los virus oncolíticos CVA21 pueden usarse clínicamente en combinación con inmunoterapia.

[0208] Ejemplo 4: Potencial para potenciar la monoterapia con virus

[0210] La formulación del CVA21 como ácido nucleico infeccioso tiene el potencial de potenciar de forma segura su potencia como monoterapia. El ácido nucleico es menos inmunógeno que las partículas víricas, lo que proporciona un mecanismo para evitar los anticuerpos neutralizantes durante la dosificación repetida. La administración de ácido nucleico infeccioso puede infectar las células incluso en presencia de anticuerpos neutralizantes, lo que refuerza la fase oncolítica de la terapia durante las inyecciones repetidas, lo que puede potenciar la eficacia general del tratamiento. Además, el ácido nucleico infeccioso no se limita a las células tumorales que expresan el receptor de virus (por ejemplo, la molécula de adhesión intracelular humana I). La siembra inicial de células tumorales incluirá aquellas células que normalmente son resistentes a la infección vírica, superando la barrera de la heterogeneidad tumoral. Esta estrategia puede aplicarse a otros picornavirus oncolíticos.

[0212] Ejemplo 5: La seguridad mejorada amplía la elegibilidad de los pacientes

[0214] La tolerabilidad del CVA21 se ha demostrado en ensayos clínicos de fase I y II en pacientes con varias neoplasias malignas avanzadas. Sin embargo, los estudios realizados hasta la fecha se han limitado a pacientes con sistemas inmunitarios funcionales. Aunque es poco frecuente en seres humanos, el CVA21 puede provocar miositis, siendo los hospedadores inmunodeficientes particularmente vulnerables. Por tanto, el desarrollo de un CVA21 que no pueda replicarse en células musculares permitirá ampliar los análisis clínicos a pacientes con sistemas inmunitarios deprimidos. El CVA21-ΔV(2x) tiene un elemento de respuesta a microARN que incluye secuencias reconocidas por los microARN enriquecidos en los tejidos musculares. Este elemento reduce la replicación vírica en las células que expresan los microARN afines y mejora la toxicidad observada en ratones inmunodeficientes portadores de tumores subcutáneos tratados con CVA21. Los virus deslocalizados por microARN, incluyendo el CVA21-ΔV(2x), pueden usarse para mejorar la seguridad de las terapias oncolíticas en pacientes inmunodeprimidos.

Claims

1. REIVINDICACIONES

1. Una construcción de ácido nucleico que comprende un ácido nucleico infeccioso que comprende un genoma de picornavirus que comprende uno o más elementos de secuencia heterólogos de 20 o más bases, en donde dicho genoma de picornavirus es un genoma de virus de Coxsackie A21, y en donde dicho genoma de picornavirus carece de al menos 20 nucleótidos desde la posición 631 hasta la posición 698 de un genoma de virus de Coxsackie A21 de tipo silvestre, en donde dicho elemento de secuencia heterólogo es un elemento de respuesta a microARN insertado entre la posición 631 y la posición 698 como se encuentra en el genoma del virus de Coxsackie A21 de tipo silvestre, y en donde un elemento diana de microARN de dicho elemento de respuesta a microARN comprende al menos una región de complementariedad con un microARN presente en células no cancerosas, en donde la infectividad específica de dicha construcción es suficiente para iniciar una infección por picornavirus que se propaga cuando se administra a un mamífero vivo, en donde dicha infectividad específica es la relación entre los virus infecciosos y el total de moléculas de ácido nucleico.

2. La construcción de la reivindicación 1, en donde dicho mamífero es un ser humano.

3. La construcción de una cualquiera de las reivindicaciones 1-2, en donde dicha construcción se formula como ADN plasmídico y/o en donde dicha construcción se formula como una molécula de ARN.

4. La construcción de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde al menos uno de dicho uno o más elementos de secuencia heterólogos se inserta en la región no codificante 5' de dicho genoma de picornavirus como sustitución de nucleótidos dentro de una región de exploración, en donde la región de exploración es el espacio entre sitios AUG inactivos o crípticos en sitios internos de entrada del ribosoma internos y el AUG auténtico.

5. La construcción de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde dicho genoma de picornavirus comprende un elemento diana de microARN para miR-133, y/o en donde dicho genoma de picornavirus comprende más de un elemento diana de microARN para miR-133.

6. La construcción de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en donde dicho genoma de picornavirus comprende un elemento diana de microARN para miR-206, y/o en donde dicho genoma de picornavirus comprende más de un elemento diana de microARN para miR-206.

7. Una composición para su uso en un método de tratamiento del cáncer al reducir el número de células cancerosas en un mamífero vivo, en donde dicho método comprende administrar al mamífero una construcción expuesta en una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en donde dicha construcción se formula como una molécula de ARN.

8. La composición para su uso de la reivindicación 7, en donde dicho mamífero es un ser humano, y/o en donde dichas células cancerosas son células de melanoma, de cáncer de páncreas, de próstata, de vejiga, de pulmón no microcítico, de mieloma o de cáncer de mama.

9. La composición para su uso de una cualquiera de las reivindicaciones 7-8, en donde dicha etapa de administración provoca una reducción del número de células no cancerosas presentes en dicho mamífero que experimentan lisis celular después de dicha etapa de administración, en comparación con el número de células no cancerosas que experimentan lisis cuando se administra dicha construcción comparable a un mamífero comparable.

10. La composición para su uso de una cualquiera de las reivindicaciones 7-9, en donde dicha etapa de administración provoca un número similar o un aumento del número de células cancerosas presentes en dicho mamífero vivo que experimentan lisis celular después de dicha etapa de administración, en comparación con el número de células cancerosas que experimentan lisis cuando se administra dicha construcción comparable a un mamífero comparable.

11. Un método para generar ARN infeccioso que comprende un genoma de picornavirus que comprende uno o más elementos de secuencia heterólogos de 20 o más bases, en donde dicho genoma de picornavirus es un genoma de virus de Coxsackie A21, y en donde dicho genoma de picornavirus carece de al menos 20 nucleótidos desde la posición 631 hasta la posición 698 de un genoma de virus de Coxsackie A21 de tipo silvestre, en donde dicho elemento de secuencia heterólogo es un elemento de respuesta a microARN insertado entre la posición 631 y la posición 698, como se encuentra en el genoma del virus de Coxsackie A21 de tipo silvestre, en donde la infectividad específica de dicho ARN infeccioso es suficiente para iniciar una infección por picornavirus que se propaga cuando se administra a un mamífero vivo, en donde dicha infectividad específica es la relación entre virus infecciosos y el total de moléculas de ácido nucleico, en donde dicho método comprende:

(a) proporcionar una construcción de ADN que codifica dicho ARN infeccioso, en donde dicha construcción de ADN codifica una ribozima, y en donde dicha construcción de ácido nucleico comprende un sitio de corte por endonucleasa de restricción, y

(b) poner en contacto dicha construcción de ADN con una endonucleasa de restricción en condiciones en donde se elimina al menos una parte de dicha construcción de ADN, produciendo de ese modo una construcción de ADN escindida por endonucleasa de restricción,

en donde dicha construcción de ADN escindida por endonucleasa de restricción codifica un ARN infeccioso que tiene ARN que no es de picornavirus ubicado en un extremo 5', y en donde dicha ribozima escinde dicho ARN que no es de picornavirus ubicado en el extremo 5' para generar dicho ARN infeccioso.

12. El método de la reivindicación 11, en donde dicho ARN infeccioso codificado por dicha construcción de ADN escindida por endonucleasa de restricción comprende un extremo 3' con menos de 10 ribonucleótidos que no están presentes en un genoma de picornavirus, o en donde dicho ARN infeccioso codificado por dicha construcción de ADN escindida por endonucleasa de restricción comprende un extremo 3' sin ribonucleótidos que no están presentes en un genoma de picornavirus.

13. El método de la reivindicación 11, en donde dicho ARN infeccioso comprende un extremo 5' sin ribonucleótidos que no estén presentes en un genoma de picornavirus.