ES3055985T3 - Gene therapies for lysosomal disorders - Google Patents

Gene therapies for lysosomal disorders

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ES3055985T3
ES3055985T3 ES20724262T ES20724262T ES3055985T3 ES 3055985 T3 ES3055985 T3 ES 3055985T3 ES 20724262 T ES20724262 T ES 20724262T ES 20724262 T ES20724262 T ES 20724262T ES 3055985 T3 ES3055985 T3 ES 3055985T3
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Laura Heckman
Li Chin Wong
Hsuan-Ni Lin
Franz Hefti
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Abstract

La presente divulgación se refiere a composiciones y métodos para el tratamiento de enfermedades asociadas con una función lisosomal aberrante, como la demencia frontotemporal (DFT). La divulgación también proporciona constructos de expresión que comprenden un transgén que codifica progranulina o una porción de esta. La divulgación proporciona métodos para tratar la DFT mediante la administración de dichos constructos de expresión a un sujeto que los necesite. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

[0001] DESCRIPCIÓN
[0002] Terapias génicas para trastornos lisosómicos
[0003] Campo
[0004] La descripción se refiere al campo de la terapia génica y a los métodos de uso de la misma.
[0005] Antecedentes
[0006] La enfermedad de Gaucher es un error congénito poco frecuente del metabolismo de los glucoesfingolípidos debido a la deficiencia de la β-glucocerebrosidasa (Gcasa, “GBA”) del ácido lisosómico. Los pacientes presentan síntomas y descubrimientos ajenos al SNC incluyendo hepatoesplenomegalia, insuficiencia de la médula ósea que conduce a pancitopenia, trastornos pulmonares y fibrosis y defectos óseos. Además, un número significativo de pacientes padece manifestaciones neurológicas, incluyendo movimientos oculares sacádicos y de la mirada defectuosos, convulsiones, déficits cognitivos, retraso en el desarrollo y trastornos del movimiento incluyendo la enfermedad de Parkinson. Existen varias terapias que abordan la enfermedad periférica y las principales manifestaciones clínicas en la médula ósea y las vísceras hematopoyéticas, incluyendo las terapias de reemplazo enzimático como se describe más adelante, los fármacos de moléculas pequeñas similares a las chaperonas que se unen a la Gcasa defectuosa y mejoran la estabilidad, y la terapia de reducción del sustrato que bloquea la producción del sustrato que se acumula en la enfermedad de Gaucher y provoca síntomas y descubrimientos. Sin embargo, otros aspectos de la enfermedad de Gaucher (en particular los que afectan al esqueleto y al cerebro) parecen refractarios al tratamiento.
[0007] La progranulina (PGRN) es una proteína adicional vinculada a la función lisosómica. La PGRN está codificada por el genGRN. La haploinsuficiencia deGRNen los seres humanos conlleva un riesgo de aproximadamente el 90 % de desarrollar FTD-GRN (demencia frontotemporal con mutación enGRN), una enfermedad neurodegenerativa caracterizada por un deterioro de la función ejecutiva, cambios en el comportamiento y dificultades del lenguaje, acompañada de atrofia de los lóbulos frontal y temporal. No hay tratamientos modificadores de la enfermedad disponibles para los pacientes con FTD.
[0008] Resumen
[0009] En la presente memoria se proporciona un método para tratar a un sujeto que tiene o se sospecha que tiene demencia frontotemporal con una mutación deGRN, comprendiendo el método administrar al sujeto un virus adenoasociado recombinante (rAAV) que comprende: (i) un vector rAAV que comprende un ácido nucleico que comprende un constructo de expresión que comprende un promotor unido operativamente a un inserto transgénico que codifica una proteína PGRN, en donde el inserto transgénico comprende la secuencia de nucleótidos de la Id. de sec. n.º: 68; y (ii) una proteína de la cápside del AAV9. En algunas realizaciones, el rAAV se administra a un sujeto a una dosis que varía de aproximadamente 1 × 10<13>genomas vectoriales (vg) a aproximadamente 7 × 10<14>vg. En algunas realizaciones, el rAAV se administra a través de una inyección en la cisterna magna.
[0010] En algunas realizaciones, el promotor unido operativamente a un inserto transgénico que codifica una proteína PGRN es un promotor de beta actina (CBA) de pollo. En algunas realizaciones, el vector rAAV comprende además un potenciador del citomegalovirus (CMV). En algunas realizaciones, el vector rAAV comprende además un elemento regulador postranscripcional del virus de la hepatitis de la marmota (WPRE). En algunas realizaciones, el vector rAAV comprende además una cola de señal poliA de la hormona del crecimiento bovina. En algunas realizaciones, el ácido nucleico comprende dos secuencias de repeticiones terminales invertidas (ITR) de virus adenoasociados que flanquean el constructo de expresión. En algunas realizaciones, cada secuencia de ITR es una secuencia de ITR de AAV2 de tipo silvestre. En algunas realizaciones, el vector rAAV comprende además una región TRY entre la ITR 5' y el constructo de expresión, en donde la región TRY comprende la Id. de sec. n.º 28. En la presente memoria se proporciona un método para tratar a un sujeto que tiene o se sospecha que tiene demencia frontotemporal con una mutación enGRN(gen de la progranulina), comprendiendo el método administrar al sujeto un rAAV que comprende: (i) un vector rAAV que comprende un ácido nucleico que comprende, en orden de 5' a 3': (a) una ITR de AAV2; (b) un potenciador del CMV; (c) un promotor de CBA; (d) un inserto transgénico que codifica una proteína PGRN, en donde el inserto transgénico comprende la secuencia de nucleótidos de la Id. de sec. n.º: 68; (e) un WPRE; (f) una cola de señal poliA de la hormona del crecimiento bovina; y (g) una ITR de AAV2; y (ii) una proteína de la cápside del AAV9. En algunas realizaciones, el rAAV se administra a un sujeto a una dosis que varía de aproximadamente 1 × 10<13>vg a aproximadamente 7 × 10<14>vg. En algunas realizaciones, el rAAV se administra a través de una inyección en la cisterna magna.
[0011] En algunas realizaciones, el rAAV se administra en una formulación que comprende Tris aproximadamente 20 mM, pH 8,0, MgCl<2>aproximadamente 1 mM, NaCl aproximadamente 200 mM y poloxámero 188 aproximadamente al 0,001 % p/v. En la presente memoria se proporciona una composición farmacéutica que comprende (i) un rAAV que comprende: (a) un vector rAAV que comprende un ácido nucleico que comprende un constructo de expresión que comprende un promotor unido operativamente a un inserto transgénico que codifica una proteína PGRN, en donde el inserto transgénico comprende la secuencia de nucleótidos de la Id. de sec. n.º: 68; y (b) una proteína de la cápside del AAV9; y (ii) Tris aproximadamente 20 mM, pH 8,0, (iii) MgCl<2>aproximadamente 1 mM, (iv) NaCl aproximadamente 200 mM y (v) poloxámero 188 aproximadamente al 0,001 % p/v.
[0012] En la presente memoria se proporciona un rAAV que comprende: (a) un vector rAAV que comprende un ácido nucleico que comprende un constructo de expresión que comprende un promotor unido operativamente a un inserto transgénico que codifica una proteína PGRN, en donde el inserto transgénico comprende la secuencia de nucleótidos de la Id. de sec. n.º: 68; y (b) una proteína de la cápside del AAV9, para su uso en un método de tratamiento de la demencia frontotemporal con una mutación enGRNen un sujeto.
[0013] En la presente memoria se proporciona un método para cuantificar un nivel de proteína PGRN en una muestra de líquido cefalorraquídeo (LCR), comprendiendo el método: (1) diluir la muestra de LCR en una mezcla maestra que contenga ditiotreitol (DTT) y tampón de muestra; (2) cargar la muestra de LCR diluida, un anticuerpo antiprogranulina, un anticuerpo secundario que detecta el anticuerpo antiprogranulina, luminol y peróxido en los pocillos de un cartucho capilar; (3) cargar el cartucho capilar en un instrumento de inmunoensayo de transferencia Western automatizado; (4) utilizar el instrumento de inmunoensayo de transferencia Western automatizado para calcular la intensidad de la señal, el área máxima y la relación señal/ruido; y (5) cuantificar el nivel de proteína progranulina en la muestra de LCR como el área del pico de inmunorreactividad al anticuerpo antiprogranulina. Todas las realizaciones y descripciones que se describen a continuación no forman parte de la presente invención a menos que estén abarcadas por el alcance de las reivindicaciones adjuntas.
[0014] Además, las referencias a métodos de tratamiento mediante terapia, cirugía o diagnósticoin vivodeben interpretarse como referencias a compuestos, composiciones farmacéuticas y medicamentos de la presente invención para su uso en esos métodos.
[0015] Breve descripción de los dibujos
[0016] La Figura 1 es un esquema que representa un vector que comprende un constructo de expresión que codifica la Gcasa (por ejemplo,GBA1o una parte de la misma).
[0017] La Figura 2 es un esquema que representa un vector que comprende un constructo de expresión que codifica la Gcasa (por ejemplo,GBA1o una parte de la misma) y LIMP2 (SCARB2) o una parte de la misma. Las secuencias codificantes de Gcasa y LIMP2 están separadas por un sitio interno de entrada al ribosoma (IRES).
[0018] La Figura 3 es un esquema que representa un vector que comprende un constructo de expresión que codifica la Gcasa (por ejemplo,GBA1o una parte de la misma) y LIMP2 (SCARB2) o una parte de la misma. La expresión de las secuencias codificantes de Gcasa y LIMP2 es impulsada cada una por un promotor diferente.
[0019] La Figura 4 es un esquema que representa un vector que comprende un constructo de expresión que codifica la Gcasa (por ejemplo,GBA1o una parte de la misma), LIMP2 (SCARB2) o una parte de la misma y un ARN interferente para α-Syn. La Figura 5 es un esquema que representa un vector que comprende un constructo de expresión que codifica la Gcasa (por ejemplo,GBA1o una parte de la misma), Prosaposina (por ejemplo,PSAPo una parte de la misma) y un ARN interferente para α-Syn.
[0020] La Figura 6 es un esquema que representa un vector que comprende un constructo de expresión que codifica la Gcasa (por ejemplo,GBA1o una parte de la misma) y Prosaposina (por ejemplo,PSAPo una parte de la misma). Las secuencias codificantes de Gcasa y Prosaposina están separadas por un sitio interno de entrada al ribosoma (IRES). La Figura 7 es un esquema que representa un vector que comprende un constructo de expresión que codifica una Gcasa (por ejemplo,GBA1o una parte de la misma). En esta realización, el vector comprende un elemento promotor de CBA (CBA), que consiste en cuatro partes: el potenciador del CMV (CMVe), el promotor del CBA (CBap), el Exón 1 y el intrón (int) para expresar constitutivamente la secuencia codificante con codones optimizados deGBA1humana. La región 3' también contiene un elemento regulador de WPRE seguido de una cola de poliA de bGH. Se incluyen tres sitios de activación reguladora de la transcripción en el extremo 5' de la región promotora: TATA, RBS e YY1. Las ITR flanqueantes permiten el empaquetamiento correcto de las secuencias intercaladas. Se evaluaron dos variantes de la secuencia ITR 5' (caja insertada); estas tienen varias diferencias de nucleótidos dentro de la región “D” de 20 nucleótidos de la ITR del AAV2 de tipo silvestre. En algunas realizaciones, un vector rAAV contiene la secuencia de nucleótidos del dominio “D” que se muestra en la línea superior. En algunas realizaciones, un vector rAAV comprende un dominio “D” mutante (por ejemplo, un dominio “S”, con los cambios de nucleótidos mostrados en la línea inferior).
[0021] La Figura 8 es un esquema que representa el vector descrito en la Figura 6
[0022] La Figura 9 muestra datos representativos para el suministro de un rAAV que comprende un transgén que codifica una Gcasa (por ejemplo,GBA1o una parte de la misma) en un modelo murino CBE de la enfermedad de Parkinson. El suministro diario por vía i.p. del vehículo de PBS, 25 mg/kg de CBE, 37,5 mg/kg de CBE o 50 mg/kg de CBE (de izquierda a derecha) se inició en P8. La supervivencia (arriba a la izquierda) se comprobó dos veces al día y el peso (arriba a la derecha) se comprobó a diario. Todos los grupos empezaron con n = 8. El comportamiento se evaluó teniendo en cuenta la distancia total recorrida en campo abierto (parte inferior izquierda) en P23 y la latencia hasta caer en el cilindro giratorio (Rotarod) (parte inferior central) en P24. Los niveles de los sustratos de la GCasa se analizaron en la corteza de los ratones de los grupos de tratamiento con PBS y 25 mg/kg de CBE, tanto con (Día 3) como sin (Día 1) abstinencia de CBE. Los niveles agregados de GluSph y GalSph (abajo a la derecha) se muestran como pmol por mg de peso en húmedo del tejido. Se presentan las medias. Las barras de error son SEM. *p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001, valores de p nominales para grupos de tratamiento por regresión lineal.
[0024] La Figura 10 es un esquema que representa un diseño de estudio para la dosis máxima de rAAV en un modelo de ratón CBE. En resumen, el rAAV se administró mediante inyección ICV en P3 y el tratamiento diario con CBE se inició en P8. El comportamiento se evaluó en los ensayos de campo abierto y cilindro giratorio en P24-25 y los niveles de sustrato se midieron en P36 y P38.
[0026] La Figura 11 muestra datos representativos para la evaluación en vida de la dosis máxima de rAAV en un modelo de ratón CBE. En P3, los ratones se trataron con excipiente o con 8,8e9 vg de rAAV-GBA1 mediante suministro ICV. El suministro i.p. diario de PBS o 25 mg/kg de CBE se inició en P8. Al final del estudio, la mitad de los ratones se sacrificaron un día después de su última dosis de CBE en P36 (Día 1), mientras que la mitad restante pasó 3 días de retirada de CBE antes del sacrificio en P38 (Día 3). Todos los grupos de tratamiento (excipiente PBS n = 8, rAAV-GBA1+ PBS n = 7, excipiente CBE n = 8 y variante CBE n = 9) se pesaron diariamente (arriba a la izquierda) y se analizó el peso en P36 (arriba a la derecha). El comportamiento se evaluó a través de la distancia total recorrida en campo abierto en P23 (abajo a la izquierda) y la latencia hasta caer en el cilindro giratorio en P24 (abajo a la derecha), evaluados para cada animal como la mediana en 3 ensayos. Debido a la letalidad, n = 7 para el grupo de excipiente CBE para los ensayos conductuales, mientras que n=8 para todos los demás grupos. Se presentan las medias para todos los animales. Las barras de error son SEM. *p<0,05; ***p<0,001, valores de p nominales para grupos de tratamiento por regresión lineal en los animales tratados con CBE.
[0027] La Figura 12 muestra datos representativos para la evaluación bioquímica de la dosis máxima de rAAV en un modelo de ratón CBE. La corteza de todos los grupos de tratamiento (excipiente PBS n = 8, variante PBS n = 7, excipiente CBE n = 7 y variante CBE n = 9) se usó para medir la actividad de la GCasa (arriba a la izquierda), los niveles de GluSph (arriba a la derecha), los niveles de GluCer (abajo a la izquierda) y los genomas vectoriales (abajo a la derecha) en los grupos antes (Día 1) o después (Día 3) de la retirada de CBE. La biodistribución se muestra como genomas vectoriales por 1 µg de ADN genómico. Se presentan las medias. Las barras de error son SEM. (*)p<0,1; **p<0,01; ***p<0,001, valores de p nominales para los grupos de tratamiento mediante regresión lineal en los animales tratados con CBE, corrigiendo como covariables los días de recogida y el sexo.
[0029] La Figura 13 muestra datos representativos de las correlaciones conductuales y bioquímicas en un modelo de ratón con CBE después de la administración de los grupos de tratamiento con excipiente PBS, excipiente CBE y variante CBE. En todos los grupos de tratamiento, el rendimiento en el cilindro giratorio se correlacionó negativamente con la acumulación de GluCer (A, p=0,0012 mediante regresión lineal), y la acumulación de GluSph se correlacionó negativamente con el aumento de la actividad de la GCasa (B, p=0,0086 mediante regresión lineal).
[0030] La Figura 14 muestra datos representativos de la biodistribución de la variante en un modelo de ratón CBE. Se evaluó la presencia de genomas vectoriales en el hígado, el bazo, el riñón y las gónadas en todos los grupos de tratamiento (excipiente PBS n = 8, variante+ PBS n = 7, excipiente CBE n = 7 y variante+ CBE n = 9). La biodistribución se muestra como genomas vectoriales por 1 µg de ADN genómico. La presencia del genoma vectorial se cuantificó mediante PCR cuantitativa utilizando una curva patrón de referencia del vector; la concentración de ADN genómico se evaluó mediante la medición de la densidad óptica A260. Se presentan las medias. Las barras de error son SEM. *p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001, valores de p nominales para los grupos de tratamiento mediante regresión lineal en los animales tratados con CBE, corrigiendo como covariables los días de recogida y el sexo.
[0032] La Figura 15 muestra datos representativos para la evaluación en vida del rango de dosis de rAAV en un modelo de ratón CBE. Los ratones recibieron el excipiente o una de las tres dosis diferentes de rAAV-GBA1 mediante administración por ICV en P3: 3,2e9 vg, 1,0e10 vg o 3,2e10 vg. En P8, se inició un tratamiento i.p. diario de 25 mg/kg de CBE. Los ratones que recibieron excipiente y CBE o excipiente y PBS sirvieron como controles. Todos los grupos de tratamiento comenzaron con n = 10 (5M/5F) por grupo. Todos los ratones se sacrificaron un día después de su dosis final de CBE (P38-P40). Todos los grupos de tratamiento se pesaron diariamente y su peso se analizó en P36. El rendimiento motor se evaluó a través de la latencia al caer en el cilindro giratorio en P24 y de la latencia al atravesar la viga cónica en P30. Debido a la letalidad temprana, el número de ratones que participaron en los ensayos conductuales fue: excipiente PBS n = 10, excipiente CBE n = 9 y 3,2e9 vg rAAV-GBA1+ CBE n = 6, 1,0e10 vg rAAV-GBA1+ CBE n = 10, 3,2e10 vg rAAV-GBA1+ CBE n = 7. Se presentan las medias. Las barras de error son SEM; * p<0,05; **p<0,01 para valores de p nominales por regresión lineal en los grupos tratados con CBE, con el género corregido según un covariado.
[0033] La Figura 16 muestra datos representativos para la evaluación bioquímica del rango de dosis de rAAV en un modelo de ratón CBE. La corteza de todos los grupos de tratamiento (excipiente PBS n = 10, excipiente CBE n = 9 y 3,2e9 vg rAAV-GBA1+ CBE n = 6, 1,0e10 vg rAAV-GBA1+ CBE n = 10, 3,2e10 vg rAAV-GBA1+ CBE n = 7) se usó para medir la actividad de GCasa, los niveles de GluspH, los niveles de glucER y genomas vectoriales. La actividad de la GCasa se muestra como ng de GCasa por mg de proteína total. Los niveles de GluSpH y GluCer se muestran como pmol por mg de peso en húmedo del tejido. La biodistribución se muestra como genomas vectoriales por 1 µg de ADN genómico. La presencia del genoma vectorial se cuantificó mediante PCR cuantitativa utilizando una curva patrón de referencia del vector; la concentración de ADN genómico se evaluó mediante la medición de la densidad óptica A260. La presencia del genoma vectorial también se midió en el hígado (E). Se presentan las medias. Las barras de error son SEM. **p<0,01; ***p<0,001 para valores de p nominales por regresión lineal en los grupos tratados con CBE, con el género corregido según un covariado.
[0034] La Figura 17 muestra datos representativos para el análisis de viga cónica en la dosis máxima de rAAV-GBA1 en un modelo genético de ratón. El rendimiento motor de los grupos de tratamiento (TS excipiente, n = 5), 4L/PS-NA excipiente (n = 6) y 4L/PS-NA rAAV-GBA1 (n = 5)) se evaluó mediante la prueba de caminata sobre la viga 4 semanas después de la administración de rAAV-GBA1. El total de resbalones y el tiempo activo se muestran como un total de 5 ensayos en diferentes vigas. La velocidad y los resbalones por velocidad se muestran como el promedio de 5 ensayos en diferentes vigas. Se presentan las medias. Las barras de error son SEM.
[0035] La Figura 18 muestra datos representativos de la expresiónin vitrode constructos de rAAV que codifican la proteína progranulina (PGRN). El panel izquierdo muestra una curva patrón del ensayo ELISA de progranulina (PGRN). El panel inferior muestra una respuesta a la dosis de la expresión de PGRN medida mediante un ensayo ELISA en lisados celulares de células HEK293T transducidas con rAAV. MOI = multiplicidad de infección (genomas vectoriales por célula). La Figura 19 muestra datos representativos de la expresiónin vitrode constructos de rAAV que codificanGBA1junto con prosaposina (PSAP),SCARB2y/o uno o más ácidos nucleicos inhibidores. Los datos indican que la transfección de células HEK293 con cada constructo dio como resultado la sobreexpresión de los transgenes de interés en relación con las células transfectadas de forma simulada.
[0036] La Figura 20 es un esquema que representa un vector rAAV que comprende una región “D” ubicada en el “exterior” de la ITR (por ejemplo, proximal al extremo de la ITR en relación con el inserto transgénico o constructo de expresión) (arriba) y un vector rAAV de tipo silvestre que tiene ITR en el “interior” del vector (por ejemplo, próxima al inserto transgénico del vector).
[0037] La Figura 21 es un esquema que representa un vector que comprende un constructo de expresión que codifica GBA2 o una parte del mismo, y un ARN interferente para α-Syn.
[0038] La Figura 22 es un esquema que representa un vector que comprende un constructo de expresión que codifica la Gcasa (por ejemplo,GBA1o una parte de la misma) y Galactosilceramidasa (por ejemplo,GALCo una parte de la misma). La expresión de las secuencias codificantes de la Gcasa y la Galactosilceramidasa está separada por una secuencia peptídica autoescindible en T2A.
[0039] La Figura 23 es un esquema que representa un vector que comprende un constructo de expresión que codifica la Gcasa (por ejemplo,GBA1o una parte de la misma) y Galactosilceramidasa (por ejemplo,GALCo una parte de la misma). La expresión de las secuencias codificantes de la Gcasa y la Galactosilceramidasa está separada por una secuencia peptídica autoescindible en T2A.
[0040] La Figura 24 es un esquema que representa un vector que comprende un constructo de expresión que codifica la Gcasa (por ejemplo,GBA1o una parte de la misma), Catepsina B (por ejemplo,CTSBo una parte de la misma) y un ARN interferente para α-Syn. La expresión de las secuencias codificantes de la Gcasa y la Catepsina B está separada por una secuencia peptídica autoescindible en T2A.
[0041] La Figura 25 es un esquema que representa un vector que comprende un constructo de expresión que codifica la Gcasa (por ejemplo,GBA1o una parte de la misma), Esfingomielina fosfodiesterasa 1 (por ejemplo,SMPD1una parte de la misma) y un ARN interferente para α-Syn.
[0042] La Figura 26 es un esquema que representa un vector que comprende un constructo de expresión que codifica la Gcasa (por ejemplo,GBA1o una parte de la misma) y Galactosilceramidasa (por ejemplo,GALCo una parte de la misma). Las secuencias codificantes de Gcasa y Galactosilceramidasa están separadas por un sitio interno de entrada al ribosoma (IRES).
[0043] La Figura 27 es un esquema que representa un vector que comprende un constructo de expresión que codifica la Gcasa (por ejemplo,GBA1o una parte de la misma) y Catepsina B (por ejemplo,CTSBo una parte de la misma). La expresión de las secuencias codificantes de Gcasa y Catepsina B es impulsada cada una por un promotor diferente. La Figura 28 es un esquema que representa un vector que comprende un constructo de expresión que codifica la Gcasa (por ejemplo,GBA1o una parte de la misma), GCH1 (por ejemplo,GCH1o una parte de la misma) y un ARN interferente para α-Syn. Las secuencias codificantes de la Gcasa y la GCH1 está separada por una secuencia peptídica autoescindible en T2A
[0044] La Figura 29 es un esquema que representa un vector que comprende un constructo de expresión que codifica la Gcasa (por ejemplo,GBA1o una parte de la misma), RAB7L1 (por ejemplo,RAB7L1o una parte de la misma) y un ARN interferente para α-Syn. Las secuencias codificantes de la Gcasa y la RAB7L1 está separada por una secuencia peptídica autoescindible en T2A.
[0045] La Figura 30 es un esquema que representa un vector que comprende un constructo de expresión que codifica la Gcasa (por ejemplo,GBA1o una parte de la misma), GCH1 (por ejemplo,GCH1o una parte de la misma) y un ARN interferente para α-Syn. La expresión de las secuencias codificantes de Gcasa y GCH1 son un sitio interno de entrada al ribosoma (IRES).
[0046] La Figura 31 es un esquema que representa un vector que comprende un constructo de expresión que codifica VPS35 (por ejemplo,VPS35o una porción de la misma) y ARN interferentes para α-Syn y TMEM106B.
[0047] La Figura 32 es un esquema que representa un vector que comprende un constructo de expresión que codifica la Gcasa (por ejemplo,GBA1o una porción de la misma), IL-34 (por ejemplo,IL34o una porción de la misma) y un ARN interferente para α-Syn. Las secuencias codificantes de la Gcasa y la IL-34 está separada por una secuencia peptídica autoescindible en T2A.
[0048] La Figura 33 es un esquema que representa un vector que comprende un constructo de expresión que codifica la Gcasa (por ejemplo,GBA1o una porción de la misma) e IL-34 (por ejemplo,IL34o una porción de la misma). Las secuencias codificantes de Gcasa y IL-34 están separadas por un sitio interno de entrada al ribosoma (IRES).
[0049] La Figura 34 es un esquema que representa un vector que comprende un constructo de expresión que codifica la Gcasa (por ejemplo,GBA1o una porción de la misma) e TREM2 (por ejemplo,TREM2o una porción de la misma). La expresión de las secuencias codificantes de Gcasa y TREM2 es impulsada cada una por un promotor diferente. La Figura 35 es un esquema que representa un vector que comprende un constructo de expresión que codifica la Gcasa (por ejemplo,GBA1o una porción de la misma) e IL-34 (por ejemplo,IL34o una porción de la misma). La expresión de las secuencias codificantes de Gcasa y IL-34 es impulsada cada una por un promotor diferente.
[0050] La Figura 36A y la Figura 36B muestran datos representativos de la sobreexpresión de TREM2 y GBA1 en células HEK293 con respecto a las células transducidas de control, medidos mediante qPCR y ELISA. La Figura 36A muestra datos para la sobreexpresión de TREM2. La Figura 36B muestra datos para la sobreexpresión de GBA1 a partir del mismo constructo. La Figura 37 muestra datos representativos que indican el silenciamiento exitoso delSNCA in vitromediante el ensayo indicador de GFP (arriba) y el ensayo α-Syn (abajo).
[0051] La Figura 38 muestra datos representativos que indican el silenciamiento exitoso delTMEM106B in vitromediante el ensayo indicador de GFP (arriba) y el ensayo α-Syn (abajo).
[0052] La Figura 39 es un esquema que representa una realización de un vector que comprende un constructo de expresión que codifica PGRN.
[0053] La Figura 40 muestra datos para la transducción de células HEK293 utilizando rAAV que tienen ITR con colocación de tipo silvestre (círculos) o alternativa (por ejemplo, “exterior”; cuadrados) de la secuencia “D”. Los rAAV que tenían ITR colocadas en el “exterior” podían transducir células tan eficientemente como los rAAV que tenían ITR de tipo silvestre.
[0054] La Figura 41 es un esquema que representa un vector que comprende un constructo de expresión que codifica la Gcasa (por ejemplo,GBA1o una porción de la misma).
[0055] La Figura 42 es un esquema que representa un vector que comprende un constructo de expresión que codifica la Gcasa (por ejemplo,GBA1o una porción de la misma).
[0056] La Figura 43 es un esquema que representa un vector que comprende un constructo de expresión que codifica la Gcasa (por ejemplo,GBA1o una porción de la misma) y un ARN interferente para α-Syn.
[0057] La Figura 44 es un esquema que representa una realización de un vector que comprende un constructo de expresión que codifica PGRN.
[0058] La Figura 45 es un esquema que representa una realización de un vector que comprende un constructo de expresión que codifica PGRN.
[0059] La Figura 46 es un esquema que representa una realización de un vector que comprende un constructo de expresión que codifica PGRN y un ARN interferente para la proteína tau asociada a los microtúbulos (MAPT).
[0060] La Figura 47 es un esquema que representa un vector que comprende un constructo de expresión que codifica la Gcasa (por ejemplo,GBA1o una porción de la misma) y un ARN interferente para α-Syn.
[0061] La Figura 48 es un esquema que representa un vector que comprende un constructo de expresión que codifica PSAP. La Figura 49 es un esquema que representa un vector que comprende un constructo de expresión que codifica la Gcasa (por ejemplo,GBA1o una porción de la misma).
[0062] La Figura 50 es un esquema que representa un vector que comprende un constructo de expresión que codifica la Gcasa (por ejemplo,GBA1o una porción de la misma) y Galactosilceramidasa (por ejemplo,GALCo una porción de la misma). La Figura 51 es un esquema que representa un plásmido que comprende un vector rAAV que incluye un constructo de expresión que codifica la Gcasa (por ejemplo,GBA1o una porción de la misma), Prosaposina (por ejemplo, PSAP o una porción de la misma) y un ARN interferente para α-Syn.
[0063] La Figura 52A muestra que las líneas de células madre neuronales (NSC) derivadas de iPSC de pacientes con mutaciones en FTD-GRN secretan menos progranulina que las líneas de NSC derivadas de sujetos de control sanos. Las estadísticas se determinaron utilizando una prueba de la t no pareada; * = p < 0,05, ** = p < 0,01, *** = p < 0,001. Los datos se presentan como media ± SEM.
[0064] La Figura 52B muestra los resultados de la transducción de PR006A con un rango de dosis en cultivos neuronales portadores de la mutación FTD-GRN. Las NSC se sembraron a una densidad igual y se diferenciaron en neuronas. El día 7, las neuronas se transdujeron con el excipiente o las cantidades indicadas de PR006A durante 72 horas. La expresión de progranulina secretada se midió a partir del medio celular mediante ELISA y se normalizó a volumen (n = 3-4); media ± SEM). La línea discontinua negra representa los niveles endógenos de progranulina secretada por las neuronas de control (tratadas con excipientes). La progranulina secretada no fue detectable en las neuronas FTD-GRN tratadas con excipientes. Las estadísticas se determinaron utilizando ANOVA seguido de Tukey HSD y la comparación estadística de cada condición a neuronas de control tratadas con excipiente se indica en el gráfico, * = p < 0,05, *** = p < 0,001. LLOQ = límite inferior de cuantificación; MOI = multiplicidad de infección.
[0065] La Figura 52C muestra que el tratamiento con PR006 de cultivos neuronales rescató la maduración defectuosa de una proteasa lisosómica clave, la catepsina D, en cultivos neuronales FTD-GRN. Las NSC se sembraron a concentraciones iguales y se diferenciaron en neuronas. El día 7, las neuronas se transdujeron con el excipiente o PR006A a una MOI de 5,3 x 10<5>durante 72 horas. Las neuronas se lisaron y los lisados se analizaron en el sistema Protein Simple Western Jess con un anticuerpo primario anticatepsina D (CTSD). Se detectaron las bandas correspondientes tanto a la catepsina D madura (matCTSD) como a la procatepsina D (procTSD), y el área bajo la curva se cuantificó para cada banda y se normalizó a una señal interna de normalización de la proteína total. Se determinó la relación matCTSD/procTSD en las neuronas FTD-GRN tratadas con excipiente o PR006A; el eje y representa la relación matCTSD/procTSD como un porcentaje de la proporción de neuronas de control tratadas con excipientes (n = 3); media ± SEM). Las estadísticas se determinaron utilizando una prueba de la t pareada,* = p < 0,05.
[0066] La Figura 52D y la Figura 52F muestran que PR006A reduce la patología de TDP-43 en cultivos neuronales de FTD-GRN. Las NSC se sembraron a concentraciones iguales y se diferenciaron en neuronas. El día 7, las neuronas se transdujeron con el excipiente o PR006A a una MOI de 5,3 x 10<5>y se recogieron 21 días después de la transducción. Figura 52D: Las neuronas se lisaron y la fracción proteica insoluble de Triton-X se aisló y analizó en el sistema Protein Simple Western Jess con un anticuerpo anti-TDP-43 (n.º 12892 -AP-1). Se detectó una banda correspondiente a TDP-43 y se cuantificó el área bajo la curva para cada banda y se normalizó a la concentración total de proteína de la fracción insoluble. El eje y representa la cantidad de TDP-43 insoluble como porcentaje de los niveles tratados con excipientes normalizados por separado para cada línea celular FTD-GRN (n=3; media ± SEM). La Figura 52D muestra que el tratamiento con PR006 disminuyó TDP-43 insoluble, una característica distintiva de la patología de FTD-GRN, en cultivos neuronales de FTD-GRN. Figura 52F: Cuantificación de la señal nuclear de TDP-43 a partir de imágenes de inmunofluorescencia de neuronas derivadas de iPSC tratadas con PR006A. Se determinó la intensidad de la señal de TDP-43 por núcleo en las neuronas FTD-GRN tratadas con excipiente o PR006A; el eje y representa la intensidad de la señal de TDP-43 por núcleo como un porcentaje de la intensidad de la señal de TDP-43 por núcleo de las neuronas de control tratadas con excipientes (n = 145-306 células; media ± SEM). TDP-43 se midió con un anticuerpo anti-TDP-43 (n.º 12892 -AP-1) y el área nuclear se determinó mediante tinción con DAPI. La Figura 52F muestra que el tratamiento con PR006 aumentó los niveles de expresión de TDP-43 nuclear en cultivos neuronales de FTD-GRN hasta niveles de control cercanos a los de tipo silvestre. Las estadísticas se determinaron utilizando una prueba de la t no pareada,** = p < 0,01, *** = p < 0,001. La Figura 52E muestra que las líneas de NSC derivadas de iPSC de pacientes con mutaciones en FTD-GRN expresaron menos progranulina que las líneas de NSC derivadas de sujetos de control sanos. Las estadísticas se determinaron utilizando una prueba de la t no pareada; * = p < 0,05, ** = p < 0,01, *** = p < 0,001. Los datos se presentan como media ± SEM.
[0068] La Figura 52G es una serie de imágenes que muestran que las líneas de células madre neuronales (NSC) de las líneas celulares FTD-GRN humanas y de control humanas se diferenciaron con éxito en cultivos neuronales. Las líneas de NSC de control y FTD-GRN (FTD-GRN n.º 1 y FTD-GRN n.º 2) se diferenciaron en neuronas después de un período de 7 días, como lo indica la morfología celular y la tinción por inmunofluorescencia para los marcadores neuronales (NeuN [red]; MAP2 o Tau (como se indica a la izquierda [verde]). Se usó DAPI (azul) para teñir el núcleo.
[0069] Las Figuras 53A - 53C son una serie de gráficos de barras que representan los resultados de los experimentos que analizan la biodistribución y la expresión de la progranulina en el SNC en un estudio con un modelo de ratón PR006A FTD-GRN con un rango de dosis en adultos. A ratonesGrnKO de 4 meses se les dio PR006A o excipiente mediante administración por ICV. Se sacrificaron 3 meses después del tratamiento con el excipiente (rojo) o PR006A a una dosis de 1,1 x 10<9>vg (2,7 x 10<9>vg/g cerebro), 1,1 x 10<10>vg (2,7 x 10<10>vg/g cerebro) o 1,1 x 10<11>vg (2,7 x 10<11>vg/g cerebro) (azul) para determinar los criterios de valoración bioquímicos en el SNC. Figura 53A: Se evaluó la presencia de genomas vectoriales en la corteza cerebral y la médula espinal, y la biodistribución se muestra como genomas vectoriales por µg de ADNg en una escala logarítmica (n = 8-10/grupo; media ± SEM). La presencia del genoma vectorial se cuantificó mediante qPCR utilizando una curva patrón de referencia del vector. La línea discontinua (a 50 genomas vectoriales/µg de ADNg) representa el umbral para la presencia positiva del vector. Figura 53B: La expresión del ARN deGRNcodificado por PR006A se evaluó mediante RT-PCR cuantitativa (qRT-PCR) en la corteza cerebral (n = 8-10/grupo; media ± SEM). El número de copias deGRN(específico para nuestra secuencia PR006A optimizada con codones) se normalizó a 1 µg de ARN total y se muestra en una escala logarítmica. Figura 53C: Los niveles de proteína progranulina se midieron utilizando un ELISA de progranulina específico para seres humanos en el cerebro y la médula espinal (n = 8-10/grupo; media ± SEM). Los niveles de progranulina tisular se normalizaron con respecto a la concentración total de proteína. El límite inferior de cuantificación (LLOQ) se indica mediante una línea gris discontinua. Para los ensayos de ELISA tisular, los valores de LLOQ (ng/mg) se determinan dividiendo el LLOQ del ensayo (ng/ml) entre el promedio de concentración de proteína total de todas las muestras. Una línea simple correspondiente al color de la leyenda del grupo de tratamiento en el eje x sin barras de error indica que todos los animales de ese grupo tenían un valor de 0. El análisis estadístico se llevó a cabo utilizando ANOVA seguido de la prueba de Dunnett para compararlo con el grupo de ratonesGrnKO tratados con excipientes; * = p < 0,05, ** = p < 0,01, *** = p < 0,001. vg = genomas vectoriales; LLOQ = límite inferior de cuantificación; SC = médula espinal.
[0071] Las Figuras 53D - 53E son una serie de gráficos de barras que representan los resultados de experimentos que analizan la biodistribución del tejido periférico y la expresión de la progranulina en un estudio con un modelo de ratón PR006A FTD-GRN con un rango de dosis en adultos. A ratonesGrnKO de 4 meses se les dio PR006A o excipiente mediante administración por ICV. Se sacrificaron 3 meses después del tratamiento con el excipiente (rojo) o PR006A a una dosis de 1,1 x 10<9>vg (2,7 x 10<9>vg/g cerebro), 1,1 x 10<10>vg (2,7 x 10<10>vg/g cerebro) o 1,1 x 10<11>vg (2,7 x 10<11>vg/g cerebro) (azul) para determinar los criterios de valoración bioquímicos en el hígado, el corazón, el pulmón, el riñón, el bazo y las gónadas. Figura 53D: Se evaluó la presencia de genomas vectoriales y la biodistribución se muestra como genomas vectoriales por µg de ADNg en una escala logarítmica (n = 8-10/grupo; media ± SEM). La presencia del genoma vectorial se cuantificó mediante qPCR utilizando una curva patrón de referencia del vector. La línea discontinua (a 50 genomas vectoriales/µg de ADNg) representa el umbral para la presencia positiva del vector. Figura 53E: Los niveles de proteína progranulina se midieron utilizando un ELISA (n = 8-10/grupo; media ± SEM). Los niveles de progranulina tisular se normalizaron con respecto a la concentración total de proteína. Una línea simple correspondiente al color de la leyenda del grupo de tratamiento en el eje x sin barras de error indica que todos los animales de ese grupo tenían un valor de 0. El análisis estadístico se llevó a cabo utilizando ANOVA seguido de la prueba de Dunnett para compararlo con el grupo de ratonesGrnKO tratados con excipientes; * = p < 0,05, *** = p < 0,001. vg= genomas vectoriales.
[0073] La Figura 53F es un gráfico de barras que representa los resultados de los experimentos que analizaron los niveles de progranulina en el plasma en el estudio con un modelo de ratón PR006A FTD-GRN con un rango de dosis en adultos. A ratonesGrnKO de 4 meses se les dio PR006A o excipiente mediante administración por ICV. Se sacrificaron 3 meses después del tratamiento con el excipiente (rojo) o PR006A a una dosis de 1,1 x 10<9>vg (2,7 x 10<9>vg/g cerebro), 1,1 x 10<10>vg (2,7 x 10<10>vg/g cerebro) o 1,1 x 10<11>vg (2,7 x 10<11>vg/g cerebro) (azul) para determinar los criterios de valoración bioquímicos en el plasma. Los niveles de proteína progranulina se midieron utilizando un ELISA de progranulina específico para seres humanos en el plasma (n = 8-10/grupo; media ± SEM). Los niveles en plasma se muestran en una escala logarítmica. El límite inferior de cuantificación (LLOQ) se indica mediante una línea gris discontinua. El análisis estadístico se llevó a cabo utilizando ANOVA seguido de la prueba de Dunnett para compararlo con el grupo de ratonesGrnKO tratados con excipientes; * = p < 0,05, ** = p < 0,01, *** = p < 0,001. LLOQ = límite inferior de cuantificación. vg = genomas vectoriales.
[0074] Las figuras 53G - 53H son una serie de gráficos de barras que representan los resultados de experimentos que muestran una reducción de los defectos lisosómicos y neuropatológicos en un estudio con un modelo de ratón adulto PR006A FTD-GRN con un rango de dosis en adultos. A ratonesGrnKO de 4 meses se les dio PR006A o excipiente mediante administración por ICV. Se sacrificaron para el análisis 3 meses después del tratamiento con el excipiente (rojo) o PR006A a una dosis de 1,1 x 10<9>vg (2,7 x 10<9>vg/g cerebro), 1,1 x 10<10>vg (2,7 x 10<10>vg/g cerebro) o 1,1 x 10<11>vg (2,7 x 10<11>vg/g cerebro) (azul). La lipofuscinosis se analizó mediante dos métodos independientes: (1) puntuación de las secciones cerebrales teñidas con H&E por un patólogo y (2) cuantificación de la autofluorescencia de la lipofuscina a partir de secciones de IHC. Figura 53G: La acumulación de lipofuscina (gránulos de lipofuscina autofluorescentes) fue puntuada semicuantitativamente en secciones teñidas con H&E en diferentes regiones del cerebro por un patólogo con enmascaramiento certificado por una junta según el siguiente esquema de clasificación: 0 = no se observó lipofuscina; 1 = gránulos muy pequeños de lipofuscina (<2 µm) dispersados a través de la región; 2 = aumento de la densidad de acumulación de gránulos pequeños y/o desarrollo de gránulos más grandes (>2-3 µm); 3 = regiones multifocales con una alta densidad de gránulos de lipofuscina visibles desde una potencia objetivo baja; 4 = acumulación generalizada de lipofuscina. Se muestran las puntuaciones de gravedad de la lipofuscina en las regiones cerebrales de la corteza cerebral, el hipocampo y el tálamo/hipotálamo (n = 8-10/grupo). Figura 53H: Se realizó un análisis IHC de la ubiquitina y se cuantificó en la corteza cerebral, el hipocampo y el tálamo. El tamaño de los objetos inmunorreactivos por encima del umbral (tamaño del objeto inmunorreactivo [µm2]) se muestra para la ubiquitina (n = 8-10/grupo); media ± SEM). Los análisis estadísticos se determinaron mediante ANOVA seguido de la prueba de Dunnett para comparar con el grupo de ratonesGrnKO tratados con excipiente, * = p < 0,05, ** = p < 0,01, *** = p < 0,001. vg = genomas vectoriales; TS = tipo silvestre.
[0076] Las figuras 53I - 53K son una serie de gráficos de barras que representan los resultados de experimentos que muestran una disminución de los marcadores neuroinflamatorios en un estudio con un modelo de ratón PR006A FTD-GRN con un rango de dosis en adultos. A ratonesGrnKO de 4 meses se les dio PR006A o excipiente mediante administración por ICV. Se sacrificaron para el análisis 3 meses después del tratamiento con el excipiente (rojo) o PR006A a una dosis de 1,1 x 10<9>vg (2,7 x 10<9>vg/g cerebro), 1,1 x 10<10>vg (2,7 x 10<10>vg/g cerebro) o 1,1 x 10<11>vg (2,7 x 10<11>vg/g cerebro) (azul). Figura 53I: La expresión génica (niveles de ARNm) deTnfyCd68se midió mediante qRT-PCR en la corteza somatosensorial (media ± SEM; n=8-10/grupo). La expresión génica se normalizó con respecto al gen constitutivoPpib. Figura 53J - Figura 53K: El análisis IHC de Iba1 (Figura 53J) y GFAP (Figura 53K) se realizó y cuantificó en secciones cerebrales fijas en la corteza cerebral, el hipocampo y el tálamo. Se muestra el porcentaje del área de interés que está cubierta por objetos por encima del umbral (área inmunorreactiva [ %]) (media ± SEM; n=8-10/grupo). Los análisis estadísticos se determinaron utilizando ANOVA con ajuste de Dunnett comparando cada grupo con el grupo de ratonesGrnKO tratados con excipiente, * = p < 0,05, *** = p < 0,001. vg = genomas vectoriales; TS = tipo silvestre.
[0077] Las figuras 53L - 53N son una serie de gráficos de barras que representan los resultados de experimentos que muestran una expresión génica disminuida de las vías lisosómicas e inmunitarias en un estudio con un modelo de ratón PR006A FTD-GRN con un rango de dosis en adultos. A ratonesGrnKO de 4 meses se les dio PR006A o excipiente mediante administración por ICV. Se sacrificaron para el análisis 3 meses después del tratamiento con el excipiente (rojo) o PR006A a una dosis de 1,1 x 10<9>vg (2,7 x 10<9>vg/g cerebro), 1,1 x 10<10>vg (2,7 x 10<10>vg/g cerebro) o 1,1 x 10<11>vg (2,7 x 10<11>vg/g cerebro) (azul). La secuenciación del ARN se realizó en muestras de corteza cerebral de ratonesGrnKO tratados con ICV y de ratones TS C57BL/6J de la misma edad (gris). La metodología de análisis de variaciones del conjunto de genes (GSVA) se usó para comparar los niveles de expresión del ARNm de las firmas génicas publicadas anteriormente que están desreguladas en ratonesGrnKO tratados con excipientes en comparación con los ratones TS. Los datos que se muestran son las puntuaciones de actividad A del GSV para conjuntos de genes seleccionados de dos estudios publicados y una vía DISTINTIVA. Figura 53L: Componente celular: Vacuola (GO: 0005773), Figura 53M: Lisosoma y Figura 53N: Sistema de complemento (vía DISTINTIVA) (mediana ± rango; n=8-10/grupo). El análisis estadístico se llevó a cabo utilizando ANOVA seguido de la prueba de Dunnett para compararlo con el grupo de ratonesGrnKO tratados con excipientes mientras se controla para la tasa de error de Tipo I en términos familiares, *** = p < 0,001. GSVA= análisis de la variación del conjunto de genes; vg = genomas vectoriales; TS = tipo silvestre.
[0079] La Figura 54A es una serie de gráficos de barras que representan los resultados de los experimentos que analizan la biodistribución del transgén PR006A cuantificado mediante qPCR. Los niveles de transgenes se analizaron utilizando metodologías de qPCR en los NHP 182 días después de la inyección ICM de cualquiera de los excipientes, una dosis baja de PR006A (6,5 × 10<9>vg/g de cerebro) o una dosis alta de PR006A (6,5 × 10<10>vg/g de cerebro). Cada barra representa el promedio ± SEM de 3 animales por grupo; la línea amarilla indica el límite inferior de cuantificación a 50 vg/µg de ADN.
[0080] La Figura 54B es una serie de gráficos de barras que representan los resultados de experimentos que analizan los niveles de anticuerpos antifármaco contra la progranulina humana. Anticuerpos contra progranulina en muestras de suero y LCR (líquido cefalorraquídeo) de NHP (Non-Human Primate, primate no humano) el Día 29 y el Día 182 después del tratamiento con cualquiera de los excipientes, una dosis baja de PR006A (6,5 x 10<9>vg/g de cerebro) o una dosis alta de PR006A (6,5 x 10<10>vg/g de cerebro). Los datos representan la media ± SEM.
[0082] La Figura 54C es una serie de gráficos de barras que representan los resultados de los experimentos que analizan la expresión del transgén PR006A (GRN).Los niveles de expresión deGRNse determinaron en la corteza del NHP, el hipocampo y el mesencéfalo ventral recogidos el Día 183 mediante RT-qPCR. Los datos se presentan como media ± SEM.
[0083] La Figura 54D es un gráfico de barras que representa los resultados de experimentos que analizan los niveles de progranulina en el LCR cuantificados mediante la plataforma Simple Western™ (Jess). Los niveles de progranulina se determinaron en muestras de LCR de NHP que se recogieron el Día 183, determinadas mediante un análisis Simple Western™ (Jess). Las muestras de LCR de NHP se trataron con excipiente, dosis baja de PR006A (6,5 × 10<9>vg/g de peso cerebral) o dosis alta de PR006A (6,5 × 10<10>vg/g de peso cerebral). Los datos presentados son media ± SEM; Valor de p: *p<0,05, mediante análisis de respuesta de dependencia de la dosis unidireccional utilizando la prueba de la tendencia de Williams.
[0084] La Figura 55 es un gráfico que muestra los resultados de selectividad y especificidad para el ensayo Western Jess automatizado. Los niveles de proteína progranulina en muestras de LCR de pacientes con FTD se detectaron a 58 kDa mediante Jess. Grupo (A): pacientes heterocigotos con FTD y grupos (B) y (C): individuos familiares no portadores o normales. Los datos se presentan como media ± error estándar de la media (SEM). Los valores SEM se muestran como barras de error verticales.
[0086] La Figura 56 es un gráfico que muestra los niveles de progranulina en muestras de LCR de pacientes con FTD detectada mediante ELISA. Grupo (A): pacientes heterocigotos con FTD y grupos (B) y (C): individuos familiares no portadores o normales. Los datos se presentan como media ± error estándar de la media (SEM). Los valores SEM se muestran como barras de error verticales.
[0088] La Figura 57 es una imagen en gel de cada muestra de LCR procesada por duplicado en la plataforma Western automatizada de Jess. Las muestras se analizaron a una dilución de 4 veces utilizando el anticuerpo primario Adipogen PG-359-7. El primer carril son los patrones de peso molecular, y a la derecha está la banda de identificación utilizada para calcular las inmunorreactividades indicadas en el Ejemplo 14.
[0090] Las Figuras 58A - 58B son una serie de gráficos que muestran la medición de los niveles de expresión de PGRN humana. Los niveles de expresión de PGRN humana se determinaron en muestras de LCR de primates no humanos (NHP) que se recogieron el Día 180, utilizando un análisis Simple Western™ (Jess). Los LCR de los NHP tratados con un excipiente (“Excipiente”), dosis baja de PR006A (6,5 x 10<9>vg/g de peso cerebral; dosis “baja”) o alta de PR006 (6,5 x 10<10>vg/g de peso cerebral; “alto”) fueron analizados. Los datos se expresan como área del pico promedio de inmunorreactividad (Figura 58A) o factor de cambio en animales tratados con excipientes (Figura 58B). Cada punto representa una única muestra de LCR de un NHP (media del duplicado técnico) y el recuadro representa el valor medio /- error estándar de los tres NHP individuales.
[0092] Las Figuras 59A - 59C son una serie de gráficos de barras que representan los resultados de los experimentos que analizan la biodistribución y la expresión de la progranulina en el SNC en un modelo de ratón FTD-GRN envejecido después del tratamiento con PR006A. Se recogieron muestras de tejido de ratonesGrnKO de 18 meses de edad 2 meses después de recibir el excipiente ICV (rojo) o 9,7 x 10<10>vg (2,4 x 10<11>vg/g de cerebro) PR006A (azul). Figura 59A: Se evaluó la presencia de genomas vectoriales en la corteza cerebral y la médula espinal (media ± SEM; n=4/grupo). La biodistribución se muestra como genomas vectoriales por 1 µg de ADNg en una escala logarítmica. La presencia del genoma vectorial se cuantificó mediante qPCR utilizando una curva patrón de referencia del vector. La línea discontinua (a 50 genomas vectoriales/µg de ADNg) representa el umbral para la presencia positiva del vector. Figura 59B - Figura 59C: Los niveles de proteína progranulina se midieron utilizando un ELISA en los tejidos del SNC (cerebro y médula espinal (Figura 59B)) y en el líquido cefalorraquídeo (Figura 59C) (media ± SEM; n=4/grupo). Los niveles de progranulina tisular se normalizaron con respecto a la concentración total de proteína y los niveles de progranulina en el líquido cefalorraquídeo se normalizaron con respecto al volumen de fluido. El límite inferior de cuantificación (LLOQ) se indica mediante una línea gris discontinua. Para los ensayos de ELISA tisular, los valores de LLOQ (ng/mg) se determinaron dividiendo el LLOQ del ensayo (ng/ml) entre el promedio de concentración de proteína total de todas las muestras. Una línea roja simple en el eje x sin barras de error indica que todos los animales de ese grupo tenían un valor de 0. Los análisis estadísticos se realizaron utilizando Kruskal-Wallis; * = p < 0,05, ** = p < 0,01, *** = p < 0,001. vg = genomas vectoriales; LLOQ = límite inferior de cuantificación; SC = médula espinal.
[0093] La Figura 59D - la Figura 59E son una serie de gráficos de barras e imágenes que representan los resultados de experimentos que muestran una reducción de los defectos lisosómicos y neuropatológicos en un modelo de ratón FTD-GRN envejecido después del tratamiento con PR006A. Se recogieron muestras de tejido de ratonesGrnKO de 18 meses de edad 2 meses después de recibir el excipiente ICV (rojo) o 9,7 x 10<10>vg (2,4 x 10<11>vg/g de cerebro) PR006A (azul). La lipofuscinosis se analizó mediante la puntuación de las secciones cerebrales teñidas con H&E realizada por un patólogo. Figura 59D: Imágenes representativas de lipofuscina de la región del tálamo/hipotálamo de las secciones del cerebro. Las puntas de flecha blancas indican ejemplos de acumulación de lipofuscina. Se proporciona un resumen de las puntuaciones de gravedad de la lipofuscina en la corteza cerebral, el hipocampo y el tálamo/hipotálamo de las láminas teñidas con H&E de secciones del cerebro que se evaluaron para detectar gránulos de lipofuscina autofluorescentes. La acumulación de lipofuscina fue puntuada semicuantitativamente por un patólogo con enmascaramiento certificado por la junta según el siguiente esquema de clasificación: 0 = no se observó lipofuscina; 1 = gránulos muy pequeños de lipofuscina (<2 µm) dispersados a través de la región; 2 = aumento de la densidad de acumulación de gránulos pequeños y/o desarrollo de gránulos más grandes (>2-3 µm); 3 = regiones multifocales con una alta densidad de gránulos de lipofuscina visibles desde una potencia objetivo baja; 4 = acumulación generalizada de lipofuscina. Figura 59E: Se realizó un análisis IHC de la ubiquitina (n=4/grupo) y se cuantificó en la corteza cerebral, el hipocampo y el tálamo. Se muestra la densidad celular positiva (células/mm<2>) para cada región (media ± SEM). Los análisis estadísticos se determinaron utilizando una prueba de la t, * = p < 0,05, ** = p < 0,01. vg = genomas vectoriales.
[0095] La Figura 59F - la Figura 59I son una serie de gráficos de barras que representan los resultados de experimentos que muestran marcadores de neuroinflamación disminuidos en un modelo de ratón FTD-GRN envejecido después del tratamiento con PR006A. Se recogieron muestras de tejido de ratonesGrnKO de 18 meses de edad 2 meses después de recibir el excipiente ICV (rojo) o 9,7 x 10<10>vg (2,4 x 10<11>vg/g de cerebro) PR006A (azul). Figura 59F: La expresión génica deTnfyCd68se midió mediante qRT-PCR en la corteza somatosensorial (media ± SEM; n=4/grupo). La expresión génica se normalizó con respecto al gen constitutivoPpib. (Figura 59G) La expresión proteica de la citocina proinflamatoria TNFα se midió en la corteza cerebral utilizando un ensayo de citocinas proinflamatorias en ratones Discovery a mesoescala (media ± SEM); n=4/grupo). Las cortezas cerebrales se homogeneizaron y los niveles de expresión de proteínas se normalizaron con respecto a la concentración total de proteínas de los lisados tisulares. Figura 59H - Figura 59I: El análisis IHC de Iba1 (Figura 59H) y GFAP (Figura 59I) se realizó y cuantificó en secciones cerebrales fijas. Se muestra una recopilación de la densidad celular positiva (células/mm<2>) de las tres regiones cerebrales analizadas (corteza cerebral, hipocampo y tálamo) (media ± SEM; n=3-4/grupo). Los análisis estadísticos se realizaron utilizando una prueba de la t, * = p < 0,05. vg = genomas vectoriales.
[0097] La Figura 60 es un gráfico que representa una curva de respuesta a la dosis de células HEK293T transducidas con PR006A (n = 2; media ± SEM). Se transdujo un número igual de células con cantidades variables de PR006A. Después de 72 horas, se midieron los niveles de proteína progranulina en el medio celular utilizando un ensayo ELISA.
[0099] La Figura 61 es un diagrama de un diseño de estudio para la dosis máxima de PR006A en un modelo de ratón FTD-GRN envejecido. Se administraron 10 µl de excipiente (control) o PR006A a una dosis de 9,7 x 10<10>vg (2,4 x 10<11>vg/g de cerebro) mediante inyección ICV a dos cohortes de ratonesGrnKO: (1) 16 meses de edad en el momento de la inyección (n = 4-5/grupo; PRV-2018-027) y (2) 14 meses de edad en el momento de la inyección (n = 1/grupo tratado con excipiente; n=3/grupo gratado con pr006A; PRV-2019-002). Los animales se sacrificaron dos meses después de la inyección. Se recogieron tejidos periféricos y del SNC para analizar la biodistribución del PR006A (qPCR), la expresión de la proteína progranulina (ELISA) y la histopatología (H&E). Se evaluaron la expresión de los marcadores proinflamatorios, la acumulación de lipofuscina y la acumulación de ubiquitina en el cerebro.
[0101] Las Figuras 62A - 62B son gráficos de barras que muestran los resultados para la biodistribución en tejido periférico y la expresión de la progranulina en un modelo de ratón FTD-GRN envejecido después del tratamiento con PR006A. Se recogieron muestras de tejido de ratonesGrnKO de 18 meses de edad 2 meses después de recibir el excipiente ICV (rojo) o 9,7 x 10<10>vg (2,4 x 10<11>vg/g de cerebro) PR006A (azul). Figura 62A: Se evaluó la presencia de genomas vectoriales en el hígado, el corazón, los pulmones, los riñones, el bazo y las gónadas (media ± SEM; n=4/grupo). La biodistribución se muestra como genomas vectoriales por µg de ADNg en una escala logarítmica. La presencia del genoma del vector se cuantificó mediante qPCR utilizando un patrón de referencia del vector. Figura 62B: Los niveles de proteína progranulina se midieron utilizando un ELISA (media ± SEM; n=4/grupo). Los niveles de progranulina tisular se normalizaron con respecto a la concentración total de proteína. Una línea roja simple en el eje x sin barras de error indica que todos los animales de ese grupo tenían un valor de 0. Los análisis estadísticos se realizaron utilizando Kruskal-Wallis; * = p < 0,05, ** = p < 0,01, *** = p < 0,001. vg = genomas vectoriales.
[0103] La Figura 63 es un diagrama de un diseño de estudio para el rango de dosis de PR006A en un modelo de ratón FTD-GRN adulto 10 µl de excipiente (control) o PR006A a una dosis de 1,1 x 10<9>vg (2,7 x 10<9>vg/g cerebro), 1,1 x 10<10>vg (2,7 x 10<10>vg/g cerebro) o 1,1 x 10<11>vg (2,7 x 10<11>vg/g cerebro). PR006A se administró mediante inyección ICV en ratonesGrnKO de 4 meses de edad (n=10/grupo). Los animales se sacrificaron tres meses después de la inyección, cuando los ratones tenían 7 meses de edad. Se recogieron tejidos periféricos y del SNC para analizar la biodistribución del PR006A (qPCR), la expresión de la proteína progranulina (ELISA) y la histopatología (H&E). Se evaluaron la expresión de los marcadores proinflamatorios, la acumulación de lipofuscina, la acumulación de ubiquitina y los cambios en la expresión génica global en el cerebro.
[0105] La Figura 64 es un esquema que representa una realización de un vector vírico adenoasociado recombinante (PR006A) que comprende un constructo de expresión que codifica la progranulina humana. “pb” se refiere a “pares de bases”. “kan” se refiere a un gen que confiere resistencia a la kanamicina. “GRN” se refiere a “progranulina”. “ITR” se refiere a una secuencia de repetición terminal invertida de un virus adenoasociado. “TRY” se refiere a una secuencia que comprende tres sitios de activación reguladores de la transcripción: TATA, RBS e YY1. “CbAP” se refiere a un promotor de β-actina de pollo. “CMVe” se refiere a un potenciador del citomegalovirus. “WPRE” se refiere a un elemento regulador postranscripcional del virus de la hepatitis marmota. “bGH” se refiere a una cola de señal poli A de la hormona del crecimiento bovina. “int” se refiere a un intrón. Las secuencias de nucleótidos de las dos cadenas de PR006A se proporcionan en Id. de sec. n.º 90 y 91.
[0107] Descripción detallada
[0109] La descripción se basa, en parte, en composiciones y métodos para la expresión de combinaciones de ciertos productos génicos (por ejemplo, productos génicos asociados a la enfermedad del SNC) en un sujeto. Un producto génico puede ser una proteína, un fragmento (por ejemplo, una porción) de una proteína, un ácido nucleico interferente que inhibe un gen asociado a una enfermedad del SNC,etc.Un producto génico puede ser una proteína o un fragmento de proteína codificado por un gen asociado a una enfermedad del SNC. Un producto génico puede ser un ácido nucleico interferente (por ejemplo, ARNhc, ARNip, miARN, miARNa,etc.) que inhibe un gen asociado a una enfermedad del SNC.
[0111] Un gen asociado a una enfermedad del SNC se refiere a un gen que codifica un producto génico que está asociado genética, bioquímica o funcionalmente con una enfermedad del SNC, como la FTD (demencia frontotemporal) o la EP (enfermedad de Parkinson). Por ejemplo, las personas que tienen una mutación patógena en el genGRN(que codifica la proteína PGRN) tienen un mayor riesgo de desarrollar FTD en comparación con las personas que no tienen una mutación enGRN.Similarmente, se ha observado que las personas que tienen mutaciones en el genGBA1(que codifica la proteína Gcasa) tienen un mayor riesgo de desarrollar EP en comparación con las personas que no tienen una mutación enGBA1.En otro ejemplo, la EP está asociada a la acumulación de agregados proteicos que comprenden la proteína α-Sinucleína (α-Syn); en consecuencia,SNCA(que codifica α-Syn) es un gen asociado a PD. Un casete de expresión descrito en la presente memoria puede codificar una forma natural o no mutante de un gen asociado a una enfermedad del SNC (o una secuencia codificante del mismo). Los ejemplos de genes asociados a enfermedades del SNC se enumeran en la Tabla 1.
[0113] Tabla 1: Ejemplos de genes asociados a enfermedades del SNC
[0115]
[0116] Además de los pacientes con la enfermedad de Gaucher (que poseen mutaciones en ambos alelos cromosómicos del genGBA1), los pacientes con mutaciones en un solo alelo del GBA1 tienen un riesgo mucho mayor de padecer la enfermedad de Parkinson (EP). La gravedad de los síntomas de la EP, que incluyen dificultad para caminar, temblores en reposo, rigidez y, a menudo, depresión, dificultades para dormir y deterioro cognitivo, se correlaciona con el grado de reducción de la actividad enzimática. Por lo tanto, los pacientes con la enfermedad de Gaucher tienen el recorrido más grave, mientras que los pacientes con una sola mutación leve en laGBA1suelen tener un recorrido más benigno. Los portadores de mutaciones también corren un alto riesgo de padecer otros trastornos relacionados con la EP, como la demencia con cuerpos de Lewy, que se caracteriza por una disfunción ejecutiva, psicosis y un trastorno del movimiento similar a la EP, y la atrofia multisistémica, con deficiencias motoras y cognitivas características. No existen terapias que alteren el recorrido inexorable de estos trastornos.
[0117] Los déficits en enzimas como la Gcasa (por ejemplo, el producto génico del genGBA1), así como las variantes comunes en muchos genes implicados en la función del lisosoma o en el tráfico de macromoléculas al lisosoma (por ejemplo, la proteína 1 de la membrana lisosómica (LIMP), también denominada SCARB2), se han asociado a un mayor riesgo de EP y/o riesgo de enfermedad de Gaucher (por ejemplo, la enfermedad de Gaucher neuronopática, tal como Enfermedad de Gaucher tipo 2 o enfermedad de Gaucher tipo 3). La descripción se basa, en parte, en constructos de expresión (por ejemplo, vectores) que codifican uno o más genes, por ejemplo, Gcasa, GBA2, prosaposina, progranulina (PGRN), LIMP2, GALC, CTSB, SMPD1, GCH1, RAB7, VPS35, IL-34, TREM2, TMEM106B, o una combinación de cualquiera de los anteriores (o porciones de los mismos), asociados a enfermedades del sistema nervioso central (SNC), por ejemplo, la enfermedad de Gaucher, la EP,etc.Las combinaciones de los productos génicos descritos en la presente memoria pueden actuar juntas (por ejemplo, de forma sinérgica) para reducir uno o más signos y síntomas de un Enfermedad del SNC cuando se expresa en un sujeto. En algunos aspectos, la descripción proporciona un ácido nucleico aislado que comprende un constructo de expresión que codifica la progranulina (por ejemplo, el producto génico del genPGRN). En algunas realizaciones, el ácido nucleico aislado comprende una secuencia que codifica la prosaposina que se ha optimizado con codones (por ejemplo, codones optimizados para la expresión en células de mamíferos, por ejemplo, células humanas). En algunas realizaciones, la secuencia de ácido nucleico que codifica la progranulina (PGRN) codifica una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos como se establece en Id. de sec. n.º 67 (por ejemplo, como se establece en la secuencia de referencia NCBI NP_002078.1). En algunas realizaciones, el ácido nucleico aislado comprende la secuencia expuesta en Id. de sec. n.º: 68. En algunas realizaciones, el constructo de expresión comprende repeticiones terminales invertidas (ITR) del virus adenoasociado (AAV), por ejemplo, las ITR de AAV que flanquean la secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína prosaposina.
[0118] En algunas realizaciones, un primer producto génico o un segundo producto génico es la progranulina, o una parte de la misma. En algunas realizaciones, un primer producto génico es la progranulina y un segundo producto génico se selecciona de GBA2, prosaposina, GABA1, LIMP2, GALC, CTSB, SMPD1, GCH1, RAB7, VPS35, IL-34, TREM2 y TMEM106B. En algunas realizaciones, un constructo de expresión codifica (por ejemplo, además de otro producto génico) un ácido nucleico interferente (por ejemplo, ARNhc, miRNA, ARNbc,etc.).En algunas realizaciones, un ácido nucleico interferente inhibe la expresión de la α-sinucleína (α-sinucleína). En algunas realizaciones, un ácido nucleico interferente que se dirige a la α-Sinucleína comprende una secuencia establecida en una cualquiera de la Id. de sec. n.º 20-25. En algunas realizaciones, un ácido nucleico interferente que se dirige a la α-Sinucleína se une a (por ejemplo, se hibrida con) una secuencia establecida en una cualquiera de la Id. de sec. n.º 20-25.
[0119] En algunas realizaciones, un ácido nucleico interferente inhibe la expresión de TMEM106B. En algunas realizaciones, un ácido nucleico interferente que se dirige a TMEM106B comprende una secuencia establecida en Id. de sec. n.º 64 o 65. En algunas realizaciones, un ácido nucleico interferente que se dirige a TMEM106B se une a (por ejemplo, se hibrida con) una secuencia expuesta en Id. de sec. n.º 64 o 65.
[0120] En algunas realizaciones, un constructo de expresión comprende además uno o más promotores. En algunas realizaciones, un promotor es un promotor de beta-actina (CBA) de pollo, un promotor CAG, un promotor CD68 o un promotor JeT. En algunas realizaciones, un promotor es un promotor de ARN pol II (por ejemplo, o un promotor de ARN pol III (por ejemplo, U6,etc.).
[0121] En algunas realizaciones, un constructo de expresión comprende además un sitio interno de entrada al ribosoma (IRES). En algunas realizaciones, un IRES se localiza entre un primer producto génico y un segundo producto génico. En algunas realizaciones, un constructo de expresión comprende además una secuencia codificante de péptidos que se autoescinden. En algunas realizaciones, un péptido autoescindible es un péptido T2A.
[0122] En algunas realizaciones, un constructo de expresión comprende dos secuencias de repetición terminal invertida (ITR) del virus adenoasociado (AAV). En algunas realizaciones, las secuencias de ITR flanquean un primer producto génico y un segundo producto génico (por ejemplo, se disponen de la siguiente manera desde el extremo 5' hasta el extremo 3': ITR-primer producto génico-segundo producto génico-ITR). En algunas realizaciones, una de las secuencias ITR de un ácido nucleico aislado carece de un sitio de resolución terminal funcional (trs). Por ejemplo, en algunas realizaciones, una de las ITR es una ΔITR.
[0123] La descripción se refiere, en algunos aspectos, a vectores de rAAV que comprenden una ITR que tiene una región “D” modificada (por ejemplo, una secuencia D que se modifica con respecto al ITR del AAV2 de tipo silvestre, Id. de sec. n.º 29). En algunas realizaciones, la ITR que tiene la región D modificada es la ITR 5' del vector rAAV. En algunas realizaciones, una región “D” modificada comprende una secuencia “S”, por ejemplo, como se establece en Id. de sec. n.º 26. En algunas realizaciones, la ITR que tiene la región “D” modificada es la ITR 3' del vector rAAV. En algunas realizaciones, una región “D” modificada comprende una ITR 3' en donde la región “D” se coloca en el extremo 3' de la ITR (por ejemplo, en el extremo exterior o terminal de la ITR en relación con el inserto transgénico del vector). En algunas realizaciones, una región “D” modificada comprende una secuencia como se establece en Id. de sec. n.º 26 o 27. En algunas realizaciones, un ácido nucleico aislado (por ejemplo, un vector rAAV) comprende una región TRY. En algunas realizaciones, una región TRY comprende la secuencia establecida en Id. de sec. n.º 28.
[0124] En algunas realizaciones, un ácido nucleico aislado descrito en la descripción comprende o consiste en, o codifica, un péptido que tiene la secuencia expuesta en una cualquiera de la Id. de sec. n.º 1-91.
[0125] En algunos aspectos, la descripción proporciona un vector que comprende un ácido nucleico aislado como se describe en la descripción. En algunas realizaciones, un vector es un plásmido o un vector vírico. En algunas realizaciones, un vector vírico es un vector AAV recombinante (rAAV) o un vector de baculovirus. En algunas realizaciones, un vector rAAV es monocatenario (por ejemplo, ADN monocatenario).
[0126] En algunas realizaciones, la descripción proporciona una célula hospedadora que comprende un ácido nucleico aislado como se describe en la descripción o un vector como se describe en la descripción.
[0127] En algunas realizaciones, la descripción proporciona un virus adenoasociado recombinante (rAAV) que comprende una proteína de la cápside y un ácido nucleico aislado o un vector como se describe en la descripción.
[0128] En algunas realizaciones, una proteína de la cápside es capaz de cruzar la barrera hematoencefálica, por ejemplo, una proteína de la cápside del AAV9 o una proteína de la cápside del AAVrh.10. En algunas realizaciones, un rAAV transduce células neuronales y células no neuronales del sistema nervioso central (SNC).
[0129] En algunos aspectos, la descripción proporciona un método para tratar a un sujeto que padece o se sospecha que tiene una enfermedad del sistema nervioso central (SNC), comprendiendo el método administrar al sujeto una composición (por ejemplo, una composición que comprende un ácido nucleico aislado o un vector o un rAAV) como se describe en la descripción. En algunas realizaciones, la enfermedad del SNC es una enfermedad neurodegenerativa, tal como una enfermedad neurodegenerativa enumerada en la Tabla 12. En algunas realizaciones, la enfermedad del SNC es una sinucleinopatía, tal como una sinucleinopatía enumerada en la Tabla 13. En algunas realizaciones, la enfermedad del SNC es una tauopatía, tal como una tauopatía enumerada en la Tabla 14. En algunas realizaciones, la enfermedad del SNC es una enfermedad de almacenamiento lisosómico, tal como una enfermedad de almacenamiento lisosómico enumerada en la Tabla 15. En algunas realizaciones, la enfermedad de almacenamiento lisosómico es la enfermedad de Gaucher neuronopática, tal como la enfermedad de Gaucher de tipo 2 o la enfermedad de Gaucher de tipo 3. Estas realizaciones no se reivindican y están presentes únicamente con fines ilustrativos.
[0130] En algunas realizaciones, la descripción proporciona un método para tratar a un sujeto que tiene o se sospecha que tiene demencia frontotemporal (FTD), FTD con mutacióntau, FTD con mutaciónC9orf72, lipofuscinosis ceroide, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Alzheimer, degeneración corticobasal, enfermedad de las neuronas motoras o enfermedad de Gaucher, comprendiendo el método administrar al sujeto un rAAV que codifica la progranulina (PGRN), en donde la PGRN está codificada por la secuencia de ácido nucleico en Id. de sec. n.º: 68; y en donde el rAAV comprende una proteína de la cápside que tiene un serotipo AAV9. Estas realizaciones no se reivindican y están presentes únicamente con fines ilustrativos.
[0131] En algunas realizaciones, la descripción proporciona un método para tratar a un sujeto que tiene o se sospecha que tiene FTD con una mutaciónGRN, comprendiendo el método administrar al sujeto un rAAV que codifica la Progranulina (PGRN), en donde la PGRN está codificado por la secuencia de ácido nucleico de la Id. de sec. n.º: 68; y en donde el rAAV comprende una proteína de la cápside que tiene un serotipo AAV9. En algunas realizaciones, el rAAV se administra a un sujeto a una dosis de aproximadamente 3,5 × 10<13>genomas vectoriales (vg), aproximadamente 7,0 × 10<13>vg o aproximadamente 1,4 × 10<14>vg. En algunas realizaciones, el rAAV se administra a través de una inyección en la cisterna magna.
[0132] En algunas realizaciones, una composición comprende un ácido nucleico (por ejemplo, un genoma de rAAV, por ejemplo, encapsidado por proteínas de la cápside del AAV) que codifica dos o más productos génicos (por ejemplo, productos génicos asociados a la enfermedad del SNC), por ejemplo 2, 3, 4, 5 o más productos génicos descritos en esta solicitud. En algunas realizaciones, una composición comprende dos o más (por ejemplo, 2, 3, 4, 5 o más) ácidos nucleicos diferentes (por ejemplo, dos o más genomas de rAAV, por ejemplo, encapsidados por separado por proteínas de la cápside del AAV), cada uno de los cuales codifica uno o más productos génicos diferentes. En algunas realizaciones, se administran dos o más composiciones diferentes a un sujeto, comprendiendo cada composición uno o más ácidos nucleicos que codifican diferentes productos génicos. En algunas realizaciones, diferentes productos génicos están unidos operativamente al mismo tipo de promotor (por ejemplo, el mismo promotor). En algunas realizaciones, diferentes productos génicos están unidos operativamente a diferentes promotores.
[0133] Ácidos nucleicos y vectores aislados
[0134] Un ácido nucleico aislado puede ser ADN o ARN.
[0135] Los aspectos de la descripción se refieren a un ácido nucleico aislado que comprende un constructo de expresión que codifica la proteína progranulina (por ejemplo, el producto génico del genPGRN). La proteína PGRN se refiere a la progranulina, que es una proteína implicada en el desarrollo, la inflamación, la proliferación celular y la homeostasis de las proteínas. En los seres humanos, el genPGRNse ubica en el cromosoma 17. En algunas realizaciones, el genPGRNcodifica un péptido que está representado por la secuencia de referencia NCBI NP_002078.1 (Id. de sec. n.º 67). En algunas realizaciones, un ácido nucleico aislado comprende la secuencia expuesta en Id. de sec. n.º: 68. En algunas realizaciones, el ácido nucleico aislado comprende una secuencia que codifica la PGRN que se ha optimizado con codones. En algunas realizaciones, el ácido nucleico comprende además un promotor de la β-actina (CBA) de pollo y un potenciador del citomegalovirus (CMVe).
[0136] En algunos aspectos, la descripción proporciona un ácido nucleico aislado que comprende un constructo de expresión que codifica un primer producto génico y un segundo producto génico, en donde cada producto génico se selecciona independientemente entre los productos génicos, o partes de los mismos, expuestos en la Tabla 1. Un ácido nucleico o vector aislado (por ejemplo, el vector rAAV) descrito en la descripción puede comprender o consistir en una secuencia expuesta en una cualquiera de la Id. de sec. n.º 1-91. Un ácido nucleico o vector aislado (por ejemplo, el vector rAAV) descrito por la descripción puede comprender o consistir en una secuencia que es complementaria (por ejemplo, el complemento de) una secuencia expuesta en una cualquiera de la Id. de sec. n.º 1-91. Un ácido nucleico o vector aislado (por ejemplo, el vector rAAV) descrito en la descripción puede comprender o consistir en una secuencia que es un complemento inverso de una secuencia expuesta en una cualquiera de la Id. de sec. n.º 1-91. Un ácido nucleico o vector aislado (por ejemplo, el vector rAAV) descrito en la descripción puede comprender o consistir en una parte de una secuencia expuesta en una cualquiera de la Id. de sec. n.º 1-91. Una parte puede comprender al menos el 25 %, el 50 %, el 60 %, el 70 %, el 80 %, el 90 %, el 95 % o el 99 % de una secuencia establecida en una cualquiera de la Id. de sec. n.º 1-91. Una secuencia de ácido nucleico descrita en la descripción puede ser una cadena con sentido de ácido nucleico (por ejemplo, una cadena 5' a 3') o, en el contexto de una secuencia viral, una cadena positiva (+). Una secuencia de ácido nucleico descrita en la descripción puede ser una cadena antisentido de ácido nucleico (por ejemplo, una cadena 3' a 5') o, en el contexto de las secuencias virales, una cadena negativa (-).
[0137] En algunas realizaciones, un producto génico está codificado por una parte codificante (por ejemplo, un ADNc) de un gen de origen natural. En algunas realizaciones, un primer producto génico es una proteína (o un fragmento de la misma) codificada por el genPGRN. En algunas realizaciones, un producto génico es una proteína (o un fragmento de la misma) codificada por otro gen enumerado en la Tabla 1, por ejemplo, el genSCARB2/LIMP2o el genPSAP.Sin embargo, el experto en la técnica reconoce que el orden de expresión de un primer producto génico (por ejemplo, Progranulina) y un segundo producto génico (por ejemplo, LIMP2,etc.) generalmente se puede invertir (por ejemplo, LIMP2 es el primer producto génico y la Progranulina es el segundo producto génico).
[0138] En algunas realizaciones, un constructo de expresión es monocistrónico (por ejemplo, el constructo de expresión codifica una única proteína de fusión que comprende un primer producto génico y un segundo producto génico). En algunas realizaciones, un constructo de expresión es policistrónico (por ejemplo, el constructo de expresión codifica dos productos génicos distintos, por ejemplo, dos proteínas o fragmentos de proteínas diferentes).
[0139] Un vector de expresión policistrónico puede comprender uno o más (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5 o más) promotores. Se puede utilizar cualquier promotor adecuado, por ejemplo, un promotor constitutivo, un promotor inducible, un promotor endógeno, un promotor específico de tejido (por ejemplo, un promotor específico del SNC),etc.En algunas realizaciones, un promotor es un promotor de beta-actina de pollo (promotor CBA), un promotor CAG (por ejemplo, como lo describen Alexopoulou y col. (2008)BMC Cell Biol.9:2; doi: 10.1186/1471-2121-9-2), un promotor CD68 o un promotor JeT (por ejemplo, tal como lo describen Tornøe y col. (2002)Gene297(1-2):21-32). En algunas realizaciones, un promotor está unido operativamente a una secuencia de ácido nucleico que codifica un primer producto génico, un segundo producto génico o un primer producto génico y un segundo producto génico. En algunas realizaciones, un casete de expresión comprende una o más secuencias reguladoras adicionales, que incluyen, pero no se limitan a, secuencias de unión a factores de transcripción, sitios de corte y empalme de intrones, sitios de adición de poli (A), secuencias potenciadoras, sitios de unión a represores o cualquier combinación de las anteriores.
[0140] En algunas realizaciones, una secuencia de ácido nucleico que codifica un primer producto génico y una secuencia de ácido nucleico que codifica un segundo producto génico están separadas por una secuencia de ácido nucleico que codifica un sitio de entrada ribosómico interno (IRES). Los ejemplos de sitios IRES se describen, por ejemplo, por Mokrejs y col. (2006)Nucleic Acids Res.34(Artículo de la base de datos):D125-30. En algunas realizaciones, una secuencia de ácido nucleico que codifica un primer producto génico y una secuencia de ácido nucleico que codifica un segundo producto génico están separadas por una secuencia de ácido nucleico que codifica un péptido autoescindible. Los ejemplos de péptidos autoescindibles incluyen, pero no se limitan a, T2A, P2A, E2A, F2A, BmCPV 2A y BmIFV 2A, y los descritos por Liu y col. (2017)Sci Rep.7: 2193. En algunas realizaciones, el péptido autoescindible es un péptido T2A.
[0141] Desde el punto de vista patológico, los trastornos como la EP y la enfermedad de Gaucher se asocian a la acumulación de agregados proteicos compuestos principalmente por la proteína α-Sinucleína (α-SYN). Por consiguiente, en algunas realizaciones, los ácidos nucleicos aislados descritos en la presente memoria comprenden un ácido nucleico inhibidor que reduce o evita la expresión de la proteína α-SYN. Una secuencia que codifica un ácido nucleico inhibidor puede colocarse en una región no traducida (por ejemplo, intrón, UTR 5', UTR 3',etc.) del vector de expresión.
[0143] En algunas realizaciones, un ácido nucleico inhibidor se coloca en un intrón de un constructo de expresión, por ejemplo, en un intrón corriente arriba de la secuencia que codifica un primer producto génico. Un ácido nucleico inhibidor puede ser un ARN bicatenario (ARNbc), ARNip, ARNhc, microARN (miRNA), miRNA artificial (miARNa) o un aptámero de ARN. En general, un ácido nucleico inhibidor se une a (por ejemplo, se hibrida con) entre aproximadamente 6 y aproximadamente 30 (por ejemplo, cualquier número entero entre 6 y 30, inclusive) nucleótidos contiguos de un ARN diana (por ejemplo, ARNm). En algunas realizaciones, la molécula de ácido nucleico inhibidora es un miARN o un miARNa, por ejemplo, un miARN que se dirige alSNCA(el gen que codifica la proteína α-Syn) oTMEM106B(por ejemplo, el gen que codifica la proteína TMEM106B). En algunas realizaciones, el miARN no comprende ningún emparejamiento erróneo con la región del ARNm deSNCAcon la que se hibrida (por ejemplo, el miARN está “perfeccionado”). En algunas realizaciones, el ácido nucleico inhibidor es un ARNhc (por ejemplo, un ARNhc dirigido aSNCAoTMEM106B). En algunas realizaciones, un ácido nucleico inhibidor es un miARN artificial (miARNa) que incluye una estructura base de miR-155 y una secuencia de acceso deSNCAoTMEM106B.
[0145] El experto en la técnica reconoce que cuando se hace referencia a secuencias de ácidos nucleicos que comprenden o codifican ácidos nucleicos inhibidores (por ejemplo, ARNbc, ARNip, miRNA, miARNa, etc.), uno cualquiera o más de los nucleótidos de timidina (T) o uridina (U) en una secuencia proporcionada en la presente memoria, pueden sustituirse por cualquier otro nucleótido adecuado para el emparejamiento de bases (por ejemplo, mediante un par de bases de Watson-Crick) con un nucleótido de adenosina. Por ejemplo, T puede sustituirse por U y U puede sustituirse por T.
[0147] Un ácido nucleico aislado como se describe en la presente memoria puede existir por sí solo o como parte de un vector. En general, un vector puede ser un plásmido, un cósmido, un fagémido, un cromosoma artificial bacteriano (BAC) o un vector vírico (por ejemplo, vector adenovírico, vector de virus adenoasociado (AAV), vector retrovírico, vector baculovírico,etc.).En algunas realizaciones, el vector es un plásmido (por ejemplo, un plásmido que comprende un ácido nucleico aislado como se describe en la presente memoria). En algunas realizaciones, un vector rAAV es monocatenario (por ejemplo, ADN monocatenario). En algunas realizaciones, el vector es un vector AAV recombinante (rAAV). En algunas realizaciones, un vector es un vector de Baculovirus (por ejemplo, un vector de polihedrosis nuclear deAutographa californica(AcNPV)).
[0148] Normalmente, un vector rAAV (por ejemplo, el genoma del rAAV) comprende un transgén (por ejemplo, un constructo de expresión que comprende uno o más de cada uno de los siguientes elementos: promotor, intrón, secuencia potenciadora, secuencia codificante de proteína, secuencia codificante de ARN inhibitoria, secuencia de cola poli A, etc.) flanqueado por dos secuencias de repetición terminal invertida (ITR) de AAV. En algunas realizaciones, el transgén de un vector rAAV comprende un ácido nucleico aislado como se describe en la descripción. En algunas realizaciones, cada una de las dos secuencias de ITR de un vector rAAV es una ITR de longitud completa (por ejemplo, de aproximadamente 145 pb de longitud y que contiene un sitio de unión aRepfuncional (RBS) y un sitio de resolución terminal (trs)). En algunas realizaciones, una de las ITR de un vector rAAV está truncada (por ejemplo, acortada o no de longitud completa). En algunas realizaciones, una ITR truncada carece de un sitio de resolución terminal funcional (trs) y se utiliza para la producción de vectores AAV autocomplementarios (vectores scAAV). En algunas realizaciones, una ITR truncada es una ΔITR, por ejemplo, tal como lo describen McCarty y col. (2003) Gene Ther.10(26):2112-8.
[0149] Los aspectos de la descripción se refieren a ácidos nucleicos aislados (por ejemplo, vectores de rAAV) que comprenden una ITR que tiene una o más modificaciones (por ejemplo, adiciones, deleciones, sustituciones de ácidos nucleicos,etc.) con respecto a una ITR de AAV de tipo silvestre, por ejemplo, en relación con la ITR de AAV2 de tipo silvestre (por ejemplo, Id. de sec. n.º 29). La estructura de la ITR de AAV2 de tipo silvestre se muestra en la Figura 20. En general, una ITR de tipo silvestre comprende una región de 125 nucleótidos que se autohibrida para formar una estructura palindrómica en forma de T bicatenaria que consiste en dos brazos cruzados (formados por secuencias denominadas B/B' y C/C', respectivamente), una región madre más larga (formada por las secuencias A/A') y una región terminal monocatenaria denominada región “D” (Figura 20). En general, la región “D” de una ITR se coloca entre la región madre formada por las secuencias A/A' y el inserto que contiene el transgén del vector rAAV (por ejemplo, se coloca en el “interior” de la ITR con respecto al extremo de la ITR o próximo al inserto transgénico o al constructo de expresión del vector rAAV). En algunas realizaciones, una región “D” comprende la secuencia establecida en Id. de sec. n.º 27. Se ha observado que la región “D” desempeña un papel importante en la encapsulación de los vectores rAAV por las proteínas de la cápside, por ejemplo, como describen Ling y col. (2015)J Mol Genet Med9(3).
[0151] La descripción se basa, en parte, en el sorprendente descubrimiento de que los vectores rAAV que comprenden una región “D” ubicada en el “exterior” de la ITR (por ejemplo, proximales al extremo de la ITR en relación con el inserto transgénico o el constructo de expresión) son encapsidados de manera eficiente por proteínas de la cápside del AAV que los vectores rAAV que tienen ITR con ITR no modificadas (por ejemplo, de tipo silvestre). En algunas realizaciones, los vectores rAAV que tienen una secuencia “D” modificada (por ejemplo, una secuencia “D” en la posición “exterior”) tienen una toxicidad reducida en relación con los vectores de rAAV que tienen secuencias ITR de tipo silvestre.
[0152] En algunas realizaciones, una secuencia “D” modificada comprende al menos una sustitución de nucleótidos con respecto a una secuencia “D” de tipo silvestre (por ejemplo, Id. de sec. n.º 27). Una secuencia “D” modificada puede tener al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más de 10 sustituciones de nucleótidos con respecto a una secuencia “D” de tipo silvestre (por ejemplo, Id. de sec. n.º 27). En algunas realizaciones, una secuencia “D” modificada comprende al menos 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 o 19 sustituciones de ácido nucleico con respecto a una secuencia “D” de tipo silvestre (por ejemplo, Id. de sec. n.º 27). En algunas realizaciones, una secuencia “D” modificada es entre aproximadamente el 10 % y aproximadamente el 99 % (por ejemplo, el 10 %, el 15 %, el 20 %, el 25 %, el 30 %, el 40 %, el 45 %, el 50 %, el 55 %, el 60 %, el 65 %, el 70 %, el 75 %, el 80 %, el 85 %, el 90 %, el 95 % o el 99 %) idéntica a una secuencia “D” de tipo silvestre (por ejemplo, Id. de sec. n.º 27). En algunas realizaciones, una secuencia “D” modificada comprende la secuencia expuesta en Id. de sec. n.º 26, también denominada secuencia “S” como se describe en Wang y col. (1995) J Mol Biol 250(5):573-80.
[0153] Un vector de ácido nucleico o rAAV aislado como se describe en la descripción puede comprender además una secuencia “TRY”, por ejemplo, como se expone en Id. de sec. n.º 28 o como describen Francois y col., (2005) J. Virol.79(17):11082-11094. En algunas realizaciones, una secuencia TRY se coloca entre una ITR (por ejemplo, una ITR 5') y un constructo de expresión (por ejemplo, un inserto que codifica un transgén) de un vector de ácido nucleico o rAAV aislado.
[0155] En algunos aspectos, la descripción se refiere a vectores de Baculovirus que comprenden un vector de ácido nucleico o rAAV aislado como se describe en la descripción. En algunas realizaciones, el vector de Baculovirus es un vector de polihedrosis nuclear deAutographa californica(AcNPV), por ejemplo, como se describe por Urabe y col. (2002) Hum Gene Ther 13(16):1935-43 y Smith y col. (2009) Mol Ther 17(11):1888-1896.
[0157] En algunos aspectos, la descripción proporciona una célula hospedadora que comprende un ácido nucleico o vector aislado como se describe en la presente memoria. Una célula hospedadora puede ser una célula procariota o una célula eucariota. Por ejemplo, una célula hospedadora puede ser una célula de mamífero, célula bacteriana, célula de levadura, célula de insecto,etc.En algunas realizaciones, una célula hospedadora es una célula de mamífero, por ejemplo, una célula HEK293T. En algunas realizaciones, una célula hospedadora es una célula bacteriana, por ejemplo, una célula deE. coli.
[0158] rAAV
[0160] En algunos aspectos, la descripción se refiere a los AAV recombinantes (rAAV) que comprenden un transgén que codifica un ácido nucleico como se describe en la presente memoria (por ejemplo, un vector rAAV como se describe en la presente memoria). El término “rAAV” generalmente se refiere a partículas víricas que comprenden un vector rAAV encapsidado por una o más proteínas de la cápside del AAV. Un rAAV descrito en la descripción puede comprender una proteína de la cápside que tiene un serotipo seleccionado de AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9 y AAV10. En algunas realizaciones, un rAAV comprende una proteína de la cápside de un huésped no humano, por ejemplo, una proteína de la cápside del AAV de macaco de la India tal como AAVrh.10, AAVrh.39, etc. En algunas realizaciones, un rAAV descrito en la descripción comprende una proteína de la cápside que es una variante de una proteína de la cápside de tipo silvestre, tal como una variante de la proteína de la cápside que incluye al menos 1, 2, 3, 4, 5. 6, 7, 8, 9, 10 o más de 10 (por ejemplo, 15, 20, 25, 50, 100, etc.) sustituciones de aminoácidos (por ejemplo, mutaciones) con respecto a la proteína de la cápside del AAV de tipo silvestre de la que deriva. En algunas realizaciones, una variante de la proteína de la cápside del AAV es una proteína de la cápside del AAV1RX, por ejemplo, como se describe por Albright y col. Mol Ther. 7 de feb de 2018;26(2):510-523. En algunas realizaciones, una variante de la proteína de la cápside es una proteína de la cápside de AAV TM6, por ejemplo, como se describe por Rosario y col. Mol Ther Methods Clin Dev.2016; 3: 16026.
[0161] En algunas realizaciones, los rAAV descritos en la descripción se propagan fácilmente a través del SNC, particularmente cuando se introducen en el espacio del LCR o directamente en el parénquima cerebral. Por consiguiente, en algunas realizaciones, los rAAV descritos en la descripción comprenden una proteína de la cápside que es capaz de cruzar la barrera hematoencefálica (BHE). Por ejemplo, en algunas realizaciones, un rAAV comprende una proteína de la cápside que tiene un serotipo AAV9 o AAVrh.10. La producción de rAAV se describe, por ejemplo, por Samulski y col. (1989) J Virol.
[0162] 63(9):3822-8 y Wright (2009) Hum Gene Ther.20(7): 698-706. En algunas realizaciones, un rAAV comprende una proteína de la cápside que se dirige específica o preferiblemente a las células mieloides, por ejemplo, a las células microgliales.
[0163] En algunas realizaciones, la descripción proporciona un rAAV denominado “PR006A”. El PR006A es un rAAV que suministra un genGRNhumano funcional, lo que conduce a una mayor expresión de la PGRN humana funcional. El inserto vectorial PR006A comprende el elemento promotor de la β-actina (CBA) de pollo, que comprende 4 partes: el potenciador del citomegalovirus (CMV), el promotor del CBA, el exón 1 y el intrón (int) para expresar constitutivamente una secuencia codificante delGRNhumano con codones optimizados (Id. de sec. n.º: 68). La región 3' también contiene un elemento regulador postranscripcional (WPRE) del virus de la hepatitis marmota seguido de una cola de señal de poliadenilación de la hormona del crecimiento bovina. Tres sitios de activación reguladores de la transcripción bien descritos
[0165] se incluyen en el extremo 5' de la región promotora: TATA, RBS e YY1 (véase,por ejemplo, Francois y col., (2005) J. Virol.
[0166] 79(17):11082-11094). Las repeticiones terminales invertidas (ITR) flanqueantes permiten el empaquetamiento correcto de las secuencias intercaladas. La cadena principal contiene el gen que confiere resistencia a la kanamicina, así como una secuencia de relleno para evitar el empaquetamiento inverso. En la Figura 64 se muestra un esquema que representa el vector rAAV. Id. de sec. n.º 90 proporciona la secuencia de nucleótidos de la primera cadena (en orden de 5' a 3') del vector PR006A mostrado en la Figura 64. Id. de sec. n.º 91 proporciona la secuencia de nucleótidos de la segunda cadena (en orden de 5' a 3') del vector PR006A mostrado en la Figura 64. PR006A comprende proteínas de la cápside del AAV9. En algunas realizaciones, un rAAV tal como se describe en la descripción (por ejemplo, que comprende un genoma de rAAV recombinante encapsidado por proteínas de la cápside del AAV para formar una partícula de la cápside del rAAV) se produce en un sistema de expresión vectorial de baculovirus (BEVS). La producción de rAAV utilizando BEVS se describe, por ejemplo, por Urabe y col. (2002) Hum Gene Ther 13(16):1935-43, Smith y col. (2009) Mol Ther 17(11):1888-1896, la patente US-8.945.918, la patente US-9.879.282y la Publicación PCT Internacional WO 2017/184879. Sin embargo, se puede producir un rAAV utilizando cualquier método adecuado (por ejemplo, utilizando genes rep y cap recombinantes). En algunas realizaciones, un rAAV como se describe en la presente memoria se produce en células HEK293 (riñón embrionario humano).
[0167] Composiciones farmacéuticas
[0168] En algunos aspectos, la descripción proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden un ácido nucleico aislado o rAAV como se describe en la presente memoria y un portador farmacéuticamente aceptable. Como se utiliza en la presente descripción, la expresión “farmacéuticamente aceptable” se refiere a un material, tal como un portador o diluyente, que no anula la actividad biológica ni las propiedades del compuesto, y es relativamente no tóxico, por ejemplo, el material puede administrarse a un individuo sin provocar efectos biológicos indeseables ni interactuar de manera perjudicial con ninguno de los componentes de la composición en donde está contenido. Como se utiliza en la presente memoria, la expresión “portador farmacéuticamente aceptable” significa un material, composición o portador farmacéuticamente aceptable, tal como un relleno líquido o sólido, un estabilizador, un agente dispersante, un agente de suspensión, un diluyente, un excipiente, un agente espesante, un disolvente o un material encapsulante, que implica transportar un compuesto útil dentro de la invención dentro o hacia el paciente de tal modo que pueda desempeñar su función prevista. Los ingredientes adicionales que pueden incluirse en las composiciones farmacéuticas utilizadas en la práctica de la invención son conocidos en la técnica y se describen, por ejemplo, en Remington's Pharmaceutical Sciences (Genaro, Ed., Mack Publishing Co., 1985, Easton, PA). Las composiciones (por ejemplo, las composiciones farmacéuticas) proporcionadas en la presente memoria pueden administrarse por cualquier vía, incluyendo enteral (por ejemplo, oral), parenteral, intravenosa, intramuscular, intraarterial, intramedular, intratecal, subcutánea, intraventricular, transdérmica, rectal, intravaginal, intraperitoneal, tópica (tal como en polvos, pomadas, cremas y/o gotas), mucosa, nasal, bucal, sublingual; por instilación intratraqueal, instilación bronquial y/o inhalación; y/o como pulverización oral, pulverización nasal y/o aerosol. Las vías específicamente contempladas son la administración oral, la administración intravenosa (por ejemplo, inyección intravenosa sistémica), la administración regional mediante suministro sanguíneo y/o linfático y/o la administración directa a un sitio afectado. En general, la vía de administración más apropiada dependerá de una variedad de factores que incluyen la naturaleza del agente (por ejemplo, su estabilidad en el entorno del tubo gastrointestinal) y/o el estado del sujeto (por ejemplo, si el sujeto es capaz de tolerar la administración oral). En ciertos casos, el compuesto o la composición farmacéutica descritos en la presente memoria son adecuados para la administración tópica al ojo de un sujeto.
[0169] En algunas realizaciones, la descripción proporciona un producto farmacológico acabado PR006A que comprende el PR006A rAAV descrito anteriormente presentado en solución acuosa. En algunas realizaciones, el tampón de formulación final comprende Tris aproximadamente 20 mM, pH 8,0, MgCl<2>aproximadamente 1 mM, NaCl aproximadamente 200 mM y poloxámero 188 aproximadamente al 0,001 % [p/v]. En algunas realizaciones, el producto farmacológico acabado y el tampón de formulación final son adecuados para la inyección intracisternal magna (ICM). Métodos
[0170] Los aspectos de la descripción se refieren a composiciones para la expresión de uno o más productos génicos asociados a la enfermedad del SNC en un sujeto para tratar enfermedades asociadas al SNC. El uno o más productos génicos asociados a la enfermedad del SNC pueden estar codificados por uno o más ácidos nucleicos aislados o vectores rAAV. En algunas realizaciones, a un sujeto se le administra un único vector (por ejemplo, ácido nucleico aislado, rAAV,etc.) que codifica uno o más (1, 2, 3, 4, 5 o más) productos génicos. En algunas realizaciones, a un sujeto se le administra una pluralidad (por ejemplo, 2, 3, 4, 5 o más) vectores (por ejemplo, ácidos nucleicos aislados, rAAV,etc.), donde cada vector codifica un producto génico diferente asociado a la enfermedad del SNC.
[0171] Una enfermedad asociada al SNC puede ser una enfermedad neurodegenerativa, una sinucleinopatía, una tauopatía o una enfermedad de almacenamiento lisosómico. Los ejemplos de enfermedades neurodegenerativas y sus genes asociados se enumeran en la Tabla 12.
[0172] Una “sinucleinopatía” se refiere a una enfermedad o trastorno caracterizado por la acumulación de alfa-Sinucleína (el producto génico deSNCA) en un sujeto (por ejemplo, con respecto a un sujeto sano, por ejemplo, un sujeto que no tiene una sinucleinopatía). Los ejemplos de sinucleinopatías y sus genes asociados se enumeran en la Tabla 13. Una “tauopatía” se refiere a una enfermedad o trastorno caracterizado por la acumulación de proteína Tau anormal en un sujeto (por ejemplo, en relación con un sujeto sano que no tiene una tauopatía). Los ejemplos de tauopatías y sus genes asociados se enumeran en la Tabla 14.
[0173] Una “enfermedad por almacenamiento lisosómico” se refiere a una enfermedad caracterizada por una acumulación anormal de productos celulares tóxicos en los lisosomas de un sujeto. Los ejemplos de enfermedades de almacenamiento lisosómico y sus genes asociados se enumeran en la Tabla 15.
[0174] Como se utiliza en la presente memoria, “tratar” o “tratamiento” se refieren a (a) prevenir o retrasar la aparición de una enfermedad del SNC; (b) reducir la gravedad de una enfermedad del SNC; (c) reducir o prevenir la aparición de los síntomas característicos de una enfermedad del SNC; (d) y/o prevenir el empeoramiento de los síntomas característicos de una enfermedad del SNC. Los síntomas de la enfermedad del SNC pueden incluir, por ejemplo, disfunción motora (por ejemplo, temblores, rigidez, lentitud de movimiento, dificultad para caminar, parálisis), disfunción cognitiva (por ejemplo, demencia, depresión, ansiedad, psicosis), dificultad con la memoria, disfunción emocional y conductual. La descripción se basa, en parte, en composiciones para la expresión de uno o más productos génicos asociados a la enfermedad del SNC en un sujeto para tratar la demencia frontotemporal (FTD) con mutación en GRN. En algunas realizaciones, el sujeto tiene enfermedad de Alzheimer. En algunas realizaciones, el sujeto tiene FTD y no tiene enfermedad de Alzheimer. El sujeto tiene FTD con mutación enGRN(progranulina). En algunas realizaciones, el sujeto es heterocigoto para una mutación deGRN(por ejemplo, una mutación deGRNpatógena). En algunas realizaciones, una mutación deGRNes una mutación amórfica (por ejemplo, una mutación de aminoácido, un cambio de marco o una mutación en el sitio de empalme, o una deleción génica completa o parcial (exónica)). En algunas realizaciones, una mutación deGRNes una mutación patógena con un efecto perjudicial funcional comprobado. En algunas realizaciones, una mutación deGRNes una mutación patógena de aminoácido. En algunas realizaciones, una mutación deGRNse incluye en la base de datos FTD de Molgen (molgen.ua.ac.be). En algunas realizaciones, una mutación deGRNproduce un bajo nivel de PGRN en plasma (<70 ng/ml) en un sujeto. El sujeto tiene FTD con mutación enGRN.
[0175] En algunas realizaciones, el sujeto tiene FTD sintomática (por ejemplo, una FTD con variante conductual (bvFTD), afasia progresiva primaria (PPA)-FTD, una FTD con síndrome corticobasal o una combinación de síndromes).
[0176] En consecuencia, en algunos aspectos, la descripción proporciona un método para tratar a un sujeto que tiene o se sospecha que tiene FD con mutación enGRN, comprendiendo el método administrar al sujeto una composición (por ejemplo, una composición que comprende un ácido nucleico aislado o un vector o un rAAV) como se describe en la descripción.
[0177] En algunas realizaciones, a un sujeto que tiene enfermedad de Alzheimer y FTD (por ejemplo, FTD con mutación enGRN) se le administra un rAAV que codifica la progranulina (PGRN) o una parte de la misma. En algunas realizaciones, a un sujeto que tiene enfermedad de Alzheimer y FTD (por ejemplo, FTD con mutación enGRN) se le administra un rAAV que codifica PGRN o una parte de la misma, en donde la proteína PGRN está codificada por una secuencia de ácido nucleico con codones optimizados o la secuencia de ácido nucleico en Id. de sec. n.º: 68. En algunas realizaciones, la proteína PGRN comprende la secuencia de aminoácidos de la Id. de sec. n.º 67 o una parte de la misma. En algunas realizaciones, la PGRN que codifica el rAAV comprende una proteína de la cápside que tiene un serotipo AAV9.
[0178] En algunas realizaciones, una composición que comprende un rAAV que codifica PGRN para el tratamiento de FTD (por ejemplo, FTD con mutación enGRN) se administra a un sujeto a una dosis que varía de aproximadamente 1 × 10<12>genomas vectoriales (vg) a aproximadamente 1 × 10<15>vg, o de aproximadamente 1 × 10<13>vg a aproximadamente 7 × 10<14>vg, o de aproximadamente 1 × 10<13>vg a aproximadamente 5 × 10<14>vg, o de aproximadamente 2 × 10<13>vg a aproximadamente 2 × 10<14>vg, o de aproximadamente 3 × 10<13>vg a aproximadamente 2 × 10<14>vg, o de aproximadamente 3,5 × 10<13>vg a aproximadamente 1,4 × 10<14>vg. En algunas realizaciones, una composición que comprende un rAAV que codifica PGRN para el tratamiento de FTD (por ejemplo, FTD con mutación enGRN) se administra a un sujeto a una dosis de aproximadamente 2 × 10<13>vg, aproximadamente 3 × 10<13>vg, aproximadamente 4 × 10<13>vg, aproximadamente 5 × 10<13>vg, aproximadamente 6 × 10<13>vg, aproximadamente 7 × 10<13>vg, aproximadamente 8 × 10<13>vg, aproximadamente 9 × 10<13>vg, aproximadamente 1 × 10<14>vg o aproximadamente 2 × 10<14>vg.
[0179] En algunos aspectos, la descripción proporciona un método para tratar a un sujeto que tiene o se sospecha que tiene FTD (por ejemplo, FTD con mutación enGRN), comprendiendo el método administrar al sujeto una composición que comprende un rAAV que codifica PGRN, en donde la composición se administra a una dosis de aproximadamente 3,5 × 10<13>genomas vectoriales (vg), aproximadamente 7,0 × 10<13>vg o aproximadamente 1,4 × 10<14>vg.
[0180] En algunos aspectos, la descripción proporciona un método para tratar a un sujeto que tiene o se sospecha que tiene FTD (por ejemplo, FTD con mutación enGRN), comprendiendo el método administrar al sujeto una composición que comprende un rAAV que codifica PGRN, en donde la composición se administra a una dosis de aproximadamente 1 × 10<14>genomas vectoriales (vg), aproximadamente 2,0 × 10<14>vg o aproximadamente 4,0 × 10<14>vg.
[0182] En algunas realizaciones, una composición que comprende un rAAV que codifica PGRN para tratar FTD (por ejemplo, FTD con una mutación enGRN) en un sujeto en forma de dosis única, y la composición no se administra al sujeto posteriormente.
[0183] En algunas realizaciones, la composición que comprende el rAAV se suministra mediante una única inyección suboccipital en la cisterna magna. En algunas realizaciones, la inyección en la cisterna magna se realiza bajo guía radiográfica.
[0185] En algunas realizaciones, la descripción proporciona un método para tratar un síntoma de un sujeto que tiene o se sospecha que tiene FTD con una mutaciónGRN, comprendiendo el método administrar al sujeto una composición que comprende un rAAV que codifica la secuencia para la proteína Progranulina (PGRN) funcional, en donde la proteína PGRN está codificada por una secuencia de ácido nucleico con codones optimizados o la secuencia de ácido nucleico de la Id. de sec. n.º: 68. En algunas realizaciones, un síntoma de FTD con la mutación enGRNpuede ser un cambio de personalidad, deterioro de la función ejecutiva, desinhibición, apatía, producción lenta del habla, mal uso de la gramática, agnosia multimodal, afasia semántica o comprensión deficiente de las palabras. En algunas realizaciones, la PGRN que codifica el rAAV comprende una proteína de la cápside que tiene un serotipo AAV9.
[0187] En algunas realizaciones, la descripción proporciona un método para reducir la acumulación de lipofuscina en el cerebro de un sujeto que tiene o se sospecha que tiene FTD con una mutaciónGRN, comprendiendo el método administrar al sujeto una composición que comprende un rAAV que codifica la Progranulina (PGRN) funcional, en donde la proteína PGRN está codificada por una secuencia de ácido nucleico con codones optimizados o la secuencia de ácido nucleico de la Id. de sec. n.º: 68. En algunos aspectos, la descripción proporciona un método para reducir la acumulación de ubiquitina en el cerebro de un sujeto que tiene o se sospecha que tiene FTD con una mutaciónGRN, comprendiendo el método administrar al sujeto una composición que comprende un rAAV que codifica la Progranulina (PGRN) funcional, en donde la proteína PGRN está codificada por una secuencia de ácido nucleico con codones optimizados o la secuencia de ácido nucleico de la Id. de sec. n.º: 68. En algunos aspectos, la descripción proporciona un método para reducir la expresión génica y/o la expresión de proteína de TNFα y/o CD68 en el cerebro de un sujeto que tiene o se sospecha que tiene FTD con una mutaciónGRN, comprendiendo el método administrar al sujeto una composición que comprende un rAAV que codifica la Progranulina (PGRN) funcional, en donde la proteína PGRN está codificada por una secuencia de ácido nucleico con codones optimizados o la secuencia de ácido nucleico de la Id. de sec. n.º: 68. En algunos aspectos, la descripción proporciona un método para aumentar la maduración de la catepsina D en el cerebro de un sujeto que tiene o se sospecha que tiene FTD con una mutaciónGRN, comprendiendo el método administrar al sujeto una composición que comprende un rAAV que codifica la Progranulina (PGRN) funcional, en donde la proteína PGRN está codificada por una secuencia de ácido nucleico con codones optimizados o la secuencia de ácido nucleico de la Id. de sec. n.º: 68. En algunos aspectos, la descripción proporciona un método para aumentar el nivel de la proteína TDP-43 (proteína de unión al ADN de respuesta transactiva de 43 kDa) nuclear en el cerebro de un sujeto que tiene o se sospecha que tiene FTD con una mutaciónGRN, comprendiendo el método administrar al sujeto una composición que comprende un rAAV que codifica la Progranulina (PGRN) funcional, en donde la proteína PGRN está codificada por una secuencia de ácido nucleico con codones optimizados o la secuencia de ácido nucleico de la Id. de sec. n.º: 68. En algunas realizaciones, la descripción proporciona un método para reducir el nivel de la cadena ligera de los neurofilamentos (NFL) en la sangre o el LCR de un sujeto que tiene o se sospecha que tiene FTD con una mutaciónGRN, comprendiendo el método administrar al sujeto una composición que comprende un rAAV que codifica la Progranulina (PGRN) funcional, en donde la proteína PGRN está codificada por una secuencia de ácido nucleico con codones optimizados o la secuencia de ácido nucleico de la Id. de sec. n.º: 68. En algunas realizaciones, la PGRN que codifica el rAAV comprende una proteína de la cápside que tiene un serotipo AAV9.
[0189] Un sujeto es normalmente un mamífero, preferiblemente un ser humano. En algunas realizaciones, un sujeto tiene entre 1 mes y 10 años (por ejemplo, 1 mes, 2 meses, 3 meses, 4 meses, 5 meses, 6 meses, 7 meses, 8 meses, 9 meses, 10 meses, 11 meses, 12 meses, 13 meses, 14 meses, 15 meses, 16 meses, 17 meses, 18 meses, 19 meses, 20 meses, 21 meses, 22 meses, 23 meses, 24 meses, 3, años, 4 años, 5 años, 6 años, 7 años, 8 años, 9 años, 10 años o cualquier edad intermedia). En algunas realizaciones, un sujeto tiene entre 2 años y 20 años. En algunas realizaciones, un sujeto tiene entre 30 años y 100 años. En algunas realizaciones, un sujeto es mayor de 55 años.
[0191] En algunas realizaciones, una composición se administra directamente al SNC del sujeto, por ejemplo, mediante inyección directa en el cerebro y/o la médula espinal del sujeto. Los ejemplos de realizaciones de administración directa del SNC incluyen, pero no se limitan a, inyección intracerebral, inyección intraventricular, inyección intracisternal, inyección intraparenquimatosa, inyección intratecal y cualquier combinación de las anteriores. En algunas realizaciones, una composición se administra a un sujeto mediante inyección intracisternal magna (ICM). En algunas realizaciones, la inyección directa en el SNC de un sujeto da como resultado la expresión del transgén (por ejemplo, la expresión del primer producto génico, el segundo producto génico y, si corresponde, el tercer producto génico) en el mesencéfalo, el cuerpo estriado y/o la corteza cerebral del sujeto. En algunas realizaciones, la inyección directa en el SNC produce la expresión transgénica (por ejemplo, la expresión del primer producto génico, el segundo producto génico y, si corresponde, el tercer producto génico) en la médula espinal y/o el LCR del sujeto.
[0192] En algunas realizaciones, la inyección directa en el SNC de un sujeto comprende la administración mejorada por convección (CED). La administración mejorada por convección es una estrategia terapéutica que implica la exposición quirúrgica del cerebro y la colocación de un catéter de diámetro pequeño directamente en un área diana del cerebro, seguida de la infusión de un agente terapéutico (por ejemplo, una composición o rAAV como se describe en la presente memoria) directamente en el cerebro del sujeto. La CED se describe, por ejemplo, por Debinski y col. (2009) Expert Rev Neurother.9(10):1519-27.En algunas realizaciones, una composición se administra por vía periférica a un sujeto, por ejemplo, mediante inyección periférica. Los ejemplos de inyección periférica incluyen inyección subcutánea, inyección intravenosa, inyección intraarterial, inyección intraperitoneal o cualquier combinación de las anteriores. En algunas realizaciones, la inyección periférica es una inyección intraarterial, por ejemplo, una inyección en la arteria carótida de un sujeto. En algunas realizaciones, una composición (por ejemplo, una composición que comprende un ácido nucleico aislado o un vector o un rAAV) como se describe en la descripción se administra tanto de forma periférica como directa al SNC de un sujeto. Por ejemplo, en algunas realizaciones, a un sujeto se le administra una composición mediante inyección intraarterial (por ejemplo, inyección en la arteria carótida) y mediante inyección intraparenquimatosa (por ejemplo, inyección intraparenquimatosa mediante CED). En algunas realizaciones, la inyección directa en el SNC y la inyección periférica son simultáneas (por ejemplo, ocurren al mismo tiempo). En algunas realizaciones, la inyección directa se produce antes (por ejemplo, entre 1 minuto y 1 semana, o más antes) de la inyección periférica. En algunas realizaciones, la inyección directa se produce después (por ejemplo, entre 1 minuto y 1 semana, o más después) de la inyección periférica.
[0193] En algunas realizaciones, a un sujeto se le administra un inmunosupresor antes (por ejemplo, entre 1 mes y 1 minuto antes) o al mismo tiempo que una composición como se describe en la presente memoria. En algunas realizaciones, el inmunosupresor es un corticosteroide (por ejemplo, prednisona, budesonida, etc.), un inhibidor de mTOR (por ejemplo, sirolimus, everolimus,etc.), un anticuerpo (por ejemplo, adalimumab, etanercept, natalizumab,etc.) o metotrexato.
[0194] La cantidad de composición (por ejemplo, una composición que comprende un ácido nucleico aislado o un vector o un rAAV) como se describe en la descripción administrada a un sujeto variará dependiendo del método de administración. Por ejemplo, en algunas realizaciones, un rAAV como se describe en la presente memoria se administra a un sujeto con un valor entre aproximadamente 10<9>Copias del genoma (GC)/kg y aproximadamente 10<14>GC/kg (por ejemplo, aproximadamente 10<9>GC/kg, aproximadamente 10<10>GC/kg, aproximadamente 10<11>GC/kg, aproximadamente 10<12>GC/kg, aproximadamente 10<12>GC/kg o aproximadamente 10<14>GC/kg). En algunas realizaciones, a un sujeto se le administra un título alto (por ejemplo, >10<12>Copias del genoma GC/kg de un rAAV) mediante inyección en el espacio del LCR o mediante inyección intraparenquimatosa. En algunas realizaciones, un rAAV como se describe en la presente memoria se administra a un sujeto a una dosis que varía de aproximadamente 1 x 10<10>genomas vectoriales (vg) a aproximadamente 1 x 10<17>vg por inyección intravenosa. En algunas realizaciones, un rAAV como se describe en la presente memoria se administra a un sujeto a una dosis que varía de aproximadamente 1 x 10<10>vg a aproximadamente 1 x 10<16>vg por inyección en la cisterna magna. Una composición (por ejemplo, una composición que comprende un ácido nucleico aislado o un vector o un rAAV) tal como se describe en la descripción se puede administrar a un sujeto una o varias veces (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20 o más) veces. En algunas realizaciones, una composición se administra a un sujeto de forma continua (por ejemplo, de forma crónica), por ejemplo, mediante una bomba de infusión.
[0195] Ejemplos
[0196] Ejemplo 1: vectores rAAV
[0197] Los vectores AAV se generan utilizando células, tales como las células HEK293 para la transfección de triple plásmido. Las secuencias ITR flanquean un constructo de expresión que comprende un elemento promotor/potenciador para cada transgén de interés, una señal poli A en 3' y señales postraduccionales tales como el elemento WPRE. Se pueden expresar simultáneamente múltiples productos génicos, tales comoGBA1yLIMP2y/o Prosaposina, mediante la fusión de las secuencias de proteínas; o utilizando un enlazador peptídico 2A, tal como T2A o P2A, que produce 2 fragmentos peptídicos con aminoácidos añadidos debido a la prevención de la creación de un enlace peptídico; o utilizando un elemento IRES; o mediante expresión con 2 casetes de expresión independientes. La presencia de una secuencia intrónica corta que se empalme de manera eficiente, corriente arriba del gen expresado, puede mejorar los niveles de expresión. Los ARNhc y otros ARN reguladores pueden potencialmente incluirse dentro de estas secuencias. Los ejemplos de construcciones de expresión descritas por la descripción se muestran en las Figuras 1-8, 21-35, 39, 41-51 y 64 y en la Tabla 2 a continuación. Tabla 2
[0199]
[0200]
[0202] Ejemplo 2: Ensayos basados en células de la transducción vírica en células deficientes en GBA
[0203] Las células deficientes enGBA1se obtienen, por ejemplo, como fibroblastos de pacientes con GD, monocitos o células hES, o células madre pluripotentes inducidas (iPSC) derivadas de pacientes. Estas células acumulan sustratos como la glucosilceramida y la glucosilesfingosina (GlcCer y GlcSph). El tratamiento de líneas celulares cultivadas de tipo silvestre o mutantes con inhibidores de la Gcasa, tales como CBE, también se utiliza para obtener células deficientes en GBA. Utilizando dichos modelos celulares, los defectos lisosómicos se cuantifican en términos de acumulación de agregados proteicos, tales como la α-Sinucleína con un anticuerpo contra esta proteína o fosfo-αSyn, seguido de obtener imágenes mediante microscopía fluorescente. También se realizan imágenes para detectar anomalías lisosómicas mediante ICC para detectar marcadores proteicos como LAMP1, LAMP2, LIMP1, LIMP2, o utilizando tintes como Lysotracker, o mediante la absorción a través del compartimento endocítico de dextrano fluorescente u otros marcadores. También pueden obtenerse imágenes para detectar la acumulación de marcadores de autofagia debido a una fusión defectuosa con el lisosoma, como en el caso del LC3. La inmunotransferencia y/o ELISA se utilizan para cuantificar la acumulación anormal de estos marcadores. También, la acumulación de sustratos glucolípidos y productos de GBA1 se mide utilizando enfoques estándar. Los criterios de valoración terapéuticos (por ejemplo, la reducción de la patología asociada a EP) se miden en el contexto de la expresión de la transducción de los vectores del AAV, para confirmar y cuantificar la actividad y la función. La Gcasa también se puede cuantificar utilizando medidas de ELISA de proteínas o mediante ensayos de actividad de la Gcasa estándar.
[0204] Ejemplo 3: Ensayos in vivo utilizando ratones mutantes
[0205] Este ejemplo describe ensayosin vivode vectores AAV utilizando ratones mutantes. Los estudiosin vivode los vectores AAV como los anteriores en ratones mutantes se realizan utilizando los ensayos descritos, por ejemplo, por Liou y col. (2006) J. Biol. Chem. 281(7): 4242-4253, Sun y col. (2005) J. Lipid Res. 46:2102-2113, y Farfel-Becker y col. (2011) Dis. Model Mech.4(6):746-752.
[0206] La administración intratecal o intraventricular de los vectores de control del vehículo y AAV (por ejemplo, a una dosis de 2 x 10<11>vg/ratón) se realiza utilizando reservas concentradas de AAV, por ejemplo, a un volumen de inyección de entre 5-10 µl. Se realiza el suministro intraparenquimatoso mediante suministro mejorado por convección.
[0207] El tratamiento se inicia antes de la aparición de los síntomas o después de la aparición. Los criterios de valoración medidos son la acumulación de sustrato en el SNC y el LCR, la acumulación de la enzima Gcasa mediante ELISA y de la actividad enzimática, los criterios de valoración motores y cognitivos, la disfunción lisosómica y la acumulación de monómeros, protofibrillas o fibrillas de α-Sinucleína.
[0208] Ejemplo 4: Modelos químicos de la enfermedad
[0209] Este ejemplo describe ensayosin vivode vectores AAV utilizando un modelo murino de la enfermedad de Gaucher inducido químicamente (por ejemplo, el modelo murino CBE). Los estudiosin vivode estos vectores AAV se realizan en un modelo murino inducido químicamente de la enfermedad de Gaucher, por ejemplo, tal como lo describen Vardi y col. (2016) J Pathol.239(4):496-509.
[0210] La administración intratecal o intraventricular de los vectores de control del vehículo y AAV (por ejemplo, a una dosis de 2 x 10<11>vg/ratón) se realiza utilizando reservas concentradas de AAV, por ejemplo, con un volumen de inyección de entre 5-10 µl. Se realiza el suministro intraparenquimatoso mediante suministro mejorado por convección. La administración periférica se logra mediante inyección en la vena de la cola.
[0211] El tratamiento se inicia antes de la aparición de los síntomas o después de la aparición. Los criterios de valoración medidos son la acumulación de sustrato en el SNC y el LCR, la acumulación de la enzima Gcasa mediante ELISA y de la actividad enzimática, los criterios de valoración motores y cognitivos, la disfunción lisosómica y la acumulación de monómeros, protofibrillas o fibrillas de α-Sinucleína.
[0212] Ejemplo 5: Ensayos clínicos en pacientes con EP, LBD y enfermedad de Gaucher
[0213] En algunas realizaciones, los pacientes que tienen ciertas formas de la enfermedad de Gaucher (por ejemplo, GD1) tienen un mayor riesgo de desarrollar enfermedad de Parkinson (PD) o demencia con cuerpos de Lewy (LBD). Este Ejemplo describe ensayos clínicos para evaluar la seguridad y eficacia de los rAAV como se describe en la descripción, en pacientes que tienen la enfermedad de Gaucher, EP y/o LBD.
[0214] Los ensayos clínicos de dichos vectores para el tratamiento de la enfermedad de Gaucher, la EP y/o el LBD se realizan utilizando un diseño de estudio similar al descrito en Grabowski y col. (1995) Ann. Intern. Med.122(1):33-39.
[0215] Ejemplo 6: Tratamiento de la enfermedad periférica
[0216] En algunas realizaciones, los pacientes que tienen ciertas formas de la enfermedad de Gaucher presentan síntomas de neuropatía periférica, por ejemplo, como se describe en Biegstraaten y col. (2010) Brain 133(10):2909-2919. Este ejemplo describe ensayosin vivode vectores de AAV como se describen en la presente memoria para el tratamiento de la neuropatía periférica asociada a la enfermedad de Gaucher (por ejemplo, enfermedad de Gaucher de tipo 1). En resumen, a los pacientes con enfermedad de Gaucher de tipo 1 identificados con signos o síntomas de neuropatía periférica se les administra un rAAV tal como se describe en la descripción. En algunas realizaciones, los signos y síntomas neuropáticos periféricos del sujeto se controlan, por ejemplo, utilizando los métodos descritos en Biegstraateny col., después de la administración del rAAV.
[0217] Los niveles de productos génicos transducidos descritos en la descripción presentes en pacientes (por ejemplo, en el suero de un paciente, en el tejido periférico (por ejemplo, tejido hepático, tejido del bazo,etc.)) de un paciente se analizan, por ejemplo, mediante análisis de transferencia Western, ensayos funcionales enzimáticos o estudios de imágenes. Ejemplo 7: Tratamiento de las formas del SNC
[0218] Este ejemplo describe los ensayosin vivode los rAAV como se describen en la presente memoria para el tratamiento de las formas del SNC de la enfermedad de Gaucher. En resumen, a los pacientes con enfermedad de Gaucher identificados por tener una forma de la enfermedad de Gaucher en el SNC (por ejemplo, enfermedad de Gaucher de tipo 2 o 3) se les administra un rAAV como se describe en la descripción. Los niveles de los productos génicos transducidos descritos en la descripción presentes en el SNC de los pacientes (por ejemplo, en el suero del SNC de un paciente, en el líquido cefalorraquídeo (LCR) de un paciente o en el tejido del SNC de un paciente) se analizan, por ejemplo, mediante análisis de transferencia Western, ensayos funcionales enzimáticos o estudios de imágenes.
[0219] Ejemplo 8: Terapia génica de la enfermedad de Parkinson en sujetos con mutaciones en GBA1
[0220] Este ejemplo describe la administración de un virus adenoasociado recombinante (rAAV) que codificaGBA1a un sujeto que tiene enfermedad de Parkinson caracterizada por una mutación en el genGBA1.
[0221] El inserto de vector rAAV-GBA1 comprende el elemento promotor de CBA (CBA), que consiste en cuatro partes: el potenciador del CMV (CMVe), el promotor del CBA (CBAp), el Exón 1 y el intrón (int) para expresar de manera constitutiva la secuencia codificante (CDS) con codones optimizados de GBA1 humana (color granate). La región 3' también contiene un elemento regulador postranscripcional (WPRE) del virus de la hepatitis marmota seguido de una cola de señal poli A (bGH poliA) de la hormona del crecimiento bovina. Las ITR flanqueantes permiten el empaquetamiento correcto de las secuencias intercaladas. Se evaluaron dos variantes de la secuencia ITR 5' (Figura 7, caja insertada, secuencia inferior); estas variantes tienen varias diferencias de nucleótidos dentro de la región “D” de 20 nucleótidos de la ITR, lo que se cree que afecta a la eficiencia del empaquetamiento y la expresión. El producto vectorial rAAV-GBA1 contiene la secuencia de nucleótidos del dominio “D” que se muestra en la Figura 7 (caja insertada, secuencia superior). Un vector variante alberga un dominio “D” mutante (denominado dominio “S” en la presente memoria, con los cambios de nucleótidos mostrados mediante sombreado), realizado de manera similar en estudios preclínicos. La cadena principal contiene el gen que confiere resistencia a la kanamicina, así como una secuencia de relleno para evitar el empaquetamiento inverso. En la Figura 8 se muestra un esquema que representa un vector rAAV-GBA1. El vector rAAV-GBA1 se empaqueta en un rAAV utilizando proteínas de la cápside del serotipo AAV9.
[0222] El rAAV-GBA1 se administra a un sujeto como una dosis única mediante una inyección suboccipital guiada por fluoroscopia en la cisterna magna (intracisternal magna); ICM). Un ejemplo de un estudio de régimen de dosificación de rAAV-GBA1 es el siguiente:
[0223] Se administra una dosis única de rAAV-GBA1 a los pacientes (N=12) en uno de los dos niveles de dosis (3e13 vg (dosis baja); 1e14 vg (dosis alta),etc.), que se determinan en función de los resultados de estudios farmacológicos y toxicológicos no clínicos.
[0224] Los estudios iniciales se realizaron en un modelo químico murino que implicaba la administración diaria de conduritol-b-epóxido (CBE), un inhibidor de la GCasa para evaluar la eficacia y la seguridad del vector rAAV-GBA1 y un constructo de la variante S de rAAV-GBA1 (como se describe más adelante). Además, los estudios iniciales se realizaron en un modelo genético de ratón, que porta una mutación homocigota deGBA1y es parcialmente deficiente en saposinas (4L/PS-NA). Se llevan a cabo estudios adicionales de rango de dosis en ratones y primates no humanos (NHP) para evaluar más a fondo la seguridad y eficacia de los vectores.
[0225] Se probaron dos versiones ligeramente diferentes de la repetición terminal invertida (ITR) en 5' en la cadena principal del AAV para evaluar la capacidad de fabricación y la expresión transgénica (Figura 7). Se cree que el dominio “D” de 20 pb dentro de la ITR 5' de 145 pb es necesario para una producción óptima del vector vírico, pero también se ha informado que las mutaciones dentro del dominio “D” aumentan la expresión transgénica en algunos casos. Por lo tanto, además del vector vírico rAAV-GBA1, que alberga un dominio “D” intacto, también se evaluó una segunda forma de vector con un dominio D mutante (denominado dominio “S” en la presente memoria). Tanto rAAV-GBA1 como la variante expresan el mismo transgén. Si bien ambos vectores produjeron virus que fueron eficaces in vivo, como se detalla a continuación, se seleccionó el rAAV-GBA1, que contiene un dominio “D” de tipo silvestre, para su posterior desarrollo.
[0226] Para establecer el modelo CBE de deficiencia de GCasa, a los ratones jóvenes se les administró CBE, un inhibidor específico de la GCasa. A los ratones se les administró CBE mediante inyección i.p. diariamente, comenzando el día 8 posnatal (P8). Se probaron tres dosis diferentes de CBE (25 mg/kg, 37,5 mg/kg, 50 mg/kg) y PBS para establecer un modelo que muestre un fenotipo conductual (Figura 9). Las dosis más altas de CBE provocaron la letalidad de una manera dependiente de la dosis. Todos los ratones tratados con 50 mg/kg de CBE murieron en P23, y 5 de los 8 ratones tratados con 37,5 mg/kg de CBE murieron en P27. No hubo letalidad en los ratones tratados con 25 mg/kg de CBE. Mientras que los ratones a los que se les inyectó CBE no mostraron deficiencias motoras generales en el ensayo de campo abierto (recorrieron la misma distancia y a la misma velocidad que los ratones a los que se les administró PBS), los ratones tratados con CBE mostraron un déficit de coordinación motora y equilibrio, medido mediante el ensayo con cilindro giratorio.
[0227] Los ratones que sobrevivieron hasta el final del estudio se sacrificaron el día después de su última dosis de CBE (P27, “Día 1”) o después de tres días de retirada del CBE (P29, “Día 3”). El análisis de lípidos se realizó en la corteza de ratones a los que se administraron 25 mg/kg de CBE para evaluar la acumulación de sustratos de GCasa en las cohortes del Día 1 y Del día 3. Los niveles de GluSph y GalSph (medidos en conjunto en este ejemplo) se acumularon significativamente en los ratones tratados con CBE en comparación con los controles tratados con PBS, lo que concuerda con la insuficiencia de GCasa.
[0228] Basándose en el estudio descrito anteriormente, se seleccionó la dosis de 25 mg/kg de CBE porque producía déficits conductuales sin afectar a la supervivencia. Para lograr una distribución generalizada del GBA1 en todo el cerebro y la expresión transgénica durante el tratamiento con CBE, el rAAV-GBA1 o el excipiente se administraron mediante inyección intracerebroventricular (ICV) el día 3 posnatal (P3), seguida de un tratamiento diario con CBE IP o PBS iniciado en P8 (Figura 10).
[0229] Los ratones tratados con CBE que recibieron rAAV-GBA1 se comportaron estadísticamente significativamente mejor en la prueba del cilindro giratorio que los que recibieron el excipiente (Figura 11). Los ratones del grupo de tratamiento variante no se diferenciaron de los ratones tratados con excipientes en términos de otras medidas de comportamiento, tales como la distancia total recorrida durante la prueba (Figura 11).
[0230] Al finalizar el estudio en vida, la mitad de los ratones se sacrificaron el día después de la última dosis de CBE (P36, “Día 1”) o después de tres días de la retirada del CBE (P38, “Día 3”) para su análisis bioquímico (Figura 12). utilizando un ensayo enzimático fluorométrico realizado por triplicado biológico, se evaluó la actividad de la GCasa en la corteza. La actividad de GCasa aumentó en los ratones que se trataron con rAAV-GBA1, mientras que el tratamiento con CBE redujo la actividad de la GCasa. De forma adicional, los ratones que recibieron tanto CBE como rAAV-GBA1 tenían niveles de actividad de GCasa similares a los del grupo tratado con PBS, lo que indica que la administración de rAAV-GBA1 es capaz de superar la inhibición de la actividad de GCasa inducida por el tratamiento con CBE. El análisis de lípidos se realizó en la corteza motora de los ratones para examinar los niveles de los sustratos GluCer y GluSph. Ambos lípidos se acumularon en el cerebro de los ratones a los que se les administró CBE, y el tratamiento con rAAV-GBA1 redujo significativamente la acumulación de sustrato.
[0231] Los niveles de lípidos se correlacionaron negativamente tanto con la actividad de la GCasa como con el rendimiento en la prueba del cilindro giratorio en todos los grupos de tratamiento. El aumento de la actividad de la GCasa después de la administración de rAAV-GBA1 se asoció a la reducción del sustrato y la función motora mejorada (Figura 13). Como se muestra en la Figura 14, la biodistribución preliminar se evaluó mediante la presencia del genoma del vector, medida mediante qPCR (con >100 genomas vectoriales por 1 µg de ADN genómico definido como positivo). Los ratones que recibieron rAAV-GBA1, tanto con como sin CBE, dieron positivo para los genomas del vector rAAV-GBA1 en la corteza, lo que indica que el suministro ICV da como resultado la administración de rAAV-GBA1 a la corteza. De forma adicional, se detectaron genomas vectoriales en el hígado, pocos en el bazo y ninguno en el corazón, los riñones o las gónadas. Para todas las medidas, no hubo diferencias estadísticamente significativas entre los grupos del Día 1 y del Día 3. Un estudio más amplio en el modelo CBE exploró más a fondo las dosis eficaces de rAAV-GBA1 en el modelo CBE. utilizando el modelo de dosis de 25 mg/kg de CBE, el excipiente o rAAV-GBA1 se administró por ICV en P3 y el tratamiento diario con PBS o CBE por vía IP se inició en P8. Dada la similitud entre los grupos con y sin abstinencia de CBE observada en los estudios anteriores, todos los ratones se sacrificaron un día después de la dosis final de CBE (P38-40). Se evaluó el efecto de tres dosis diferentes de rAAV-GBA1, dando como resultado los siguientes cinco grupos, con 10 ratones (5M/5F) por grupo:
[0232] Excipiente ICV PBS IP
[0233] Excipiente ICV CBE 25 mg/kg IP
[0234] 3,2e9 vg (2,13e10 vg/g de cerebro) rAAV-GBA1 ICV CBE 25 mg/kg IP
[0235] 1,0e10 vg (6,67e10 vg/g de cerebro) rAAV-GBA1 ICV CBE 25 mg/kg IP
[0236] 3,2e10 vg (2,13e11 vg/g de cerebro) rAAV-GBA1 ICV CBE 25 mg/kg IP.
[0237] La dosis más alta de rAAV-GBA1 rescató el fracaso relacionado con el tratamiento de CBE para aumentar de peso en P37. De forma adicional, esta dosis dio como resultado un aumento estadísticamente significativo en el rendimiento en la prueba del cilindro giratorio y de viga cónica en comparación con el grupo tratado con Excipiente CBE (Figura 15). Se observó letalidad en varios grupos, incluyendo los grupos tratados con excipientes y los tratados con rAAV-GBA1 (Excipiente PBS: 0; Excipiente CBE 25 mg/kg: 1; 3,2e9 vg de rAAV-GBA1+ CBE 25 mg/kg: 4; 1,0e10 vg de rAAV-GBA1+ CBE 25 mg/kg: 0; 3,2e10 vg de rAAV-GBA1+ CBE 25 mg/kg: 3).
[0238] Al finalizar el estudio en vivo, los ratones se sacrificaron para el análisis bioquímico (Figura 16). La actividad de GCasa en la corteza se evaluó por triplicado biológico mediante un ensayo fluorométrico. Los ratones tratados con CBE mostraron una actividad reducida de la GCasa, mientras que los ratones que recibieron una dosis alta de rAAV-GBA1 mostraron un aumento estadísticamente significativo en la actividad de la GCasa en comparación con el tratamiento con CBE. Los ratones tratados con CBE también tenían una acumulación de GluCer y GluSph, los cuales fueron rescatados administrando una dosis alta de rAAV-GBA1.
[0239] Además del modelo químico de CBE establecido, el rAAV-GBA1 también se evalúa en el modelo genético 4L/PS-NA, que es homocigoto para la mutación V394L GD en la Gba1 y también es parcialmente deficiente en saposinas, que afectan a la localización y la actividad de la GCasa. Estos ratones muestran deficiencias de fuerza motora, coordinación y equilibrio, como se evidencia por su rendimiento en los ensayos de prueba de caminata sobre la viga, cilindro giratorio y suspensión de alambre. Normalmente, la esperanza de vida de estos ratones es menos de 22 semanas. En un estudio inicial, se administraron 3 µl del virus con el título máximo por ICV en P23, con una dosis final de 2,4e10 vg (6,0e10 vg/g de cerebro). Con 6 ratones por grupo, los grupos de tratamiento fueron: TS Excipiente ICV
[0240] 4L/PS-NA Excipiente ICV
[0241] 4L/PS-NA 2,4e10 vg (6,0e10 vg/g cerebro) rAAV-GBA1 ICV
[0242] El rendimiento motor mediante la prueba de caminata sobre la viga se evaluó 4 semanas después del suministro de rAAV-GBA1. El grupo de ratones mutantes que recibió rAAV-GBA1 mostró una tendencia a un menor número total de resbalones y menos resbalones por velocidad en comparación con los ratones mutantes tratados con excipiente, restaurando la función motora a niveles cercanos a los del TS (Figura 17). Dado que los fenotipos motores se vuelven más severos a medida que estos ratones envejecen, su rendimiento en esta y otras pruebas de comportamiento se evalúa en momentos posteriores. Al finalizar el estudio en vivo, se evalúan los niveles de lípidos, la actividad de la GCasa y la biodistribución en estos ratones.
[0243] Actualmente se están probando dosis más bajas de rAAV-GBA1 utilizando el modelo CBE, que corresponden a 0,03x, 0,1x y 1x la dosis clínica alta de fase 1 propuesta. Cada grupo incluye 10 ratones (5M/5F) por grupo:
[0244] Excipiente ICV
[0245] Excipiente ICV CBE 25 mg/kg IP
[0246] 3,2e8 vg (2,13e9 vg/g de cerebro) rAAV-GBA1 ICV CBE 25 mg/kg IP
[0247] 1,0e9 vg (6,67e9 vg/g de cerebro) rAAV-GBA1 ICV CBE 25 mg/kg IP
[0248] 1,0e10 vg (6,67e10 vg/g de cerebro) rAAV-GBA1 ICV CBE 25 mg/kg IP.
[0249] Además de los fenotipos motores, se evalúan los niveles de lípidos y la actividad de GCasa en la corteza. También se realizan tratamientos y análisis cronológicos.
[0250] Se inició un estudio de mayor rango de dosis para evaluar los datos de eficacia y seguridad. A 10 ratones 4L/PS-NA (5M/5F por grupo) se les inyectaron 10 µl de rAAV-GBA1. Mediante un cálculo alométrico del peso cerebral, las dosis se correlacionan con 0,15x, 1,5x, 4,4x y 14,5x la dosis clínica alta de fase 1 propuesta. Los grupos de inyección consisten en:
[0251] TS Excipiente ICV
[0252] 4L/PS-NA Excipiente ICV
[0253] 4L/PS-NA 4,3e9 vg (1,1e10 vg/g de cerebro) rAAV-GBA1 ICV
[0254] 4L/PS-NA 4,3e10 vg (1,1e11 g/g/ de cerebro) rAAV-GBA1 ICV
[0255] 4L/PS-NA 1,3e11 vg (3,2e11 vg/g de cerebro) rAAV-GBA1 ICV
[0256] 4L/PS-NA 4,3e11 vg (1,1e12 vg/g de cerebro) rAAV-GBA1 ICV.
[0257] Ejemplo 9: Análisis in vitro de vectores rAAV
[0258] Las construcciones de rAAV se probaronin vitroein vivo.La Figura 18 muestra datos representativos de la expresiónin vitrode constructos de rAAV que codifican la proteína progranulina (PGRN). El panel izquierdo muestra una curva patrón del ensayo ELISA de progranulina (PGRN). El panel inferior muestra una respuesta a la dosis de la expresión de PGRN medida mediante un ensayo ELISA en lisados celulares de células HEK293T transducidas con rAAV. MOI = multiplicidad de infección (genomas vectoriales por célula).
[0259] Se realizó un estudio piloto para evaluar la actividadin vitrode los vectores rAAV que codifican la Prosaposina (PSAP) ySCARB2, solos o junto conGBA1y/o uno o más ARN inhibidores. También se probó un constructo que codifica PSAP y progranulina (PGRN). Los vectores ensayados incluyen aquellos que se muestran en la Tabla 3. “Opt” se refiere a una secuencia de ácido nucleico con codones optimizados para la expresión en células de mamíferos (por ejemplo, células humanas). La Figura 19 muestra datos representativos que indican que la transfección de células HEK293 con cada una de las construcciones dio como resultado la sobreexpresión del producto génico correspondiente en comparación con las células transfectadas simuladamente.
[0260] Se realizó un estudio piloto para evaluar la actividadin vitrode los vectores rAAV que codifican TREM2, solos o junto con uno o más ARN inhibidores. Los vectores ensayados incluyen aquellos que se muestran en la Tabla 3. “Opt” se refiere a una secuencia de ácido nucleico con codones optimizados para la expresión en células de mamíferos (por ejemplo, células humanas). Las Figuras 36A-36B muestra datos representativos que indican que la transfección de células HEK293 con cada una de las construcciones dio como resultado la sobreexpresión del producto génico correspondiente en comparación con las células transfectadas simuladamente.
[0261] Tabla 3
[0264]
[0266] Ejemplo 10: Pruebas de constructos de ARNhc de SNCA y TMEM106B
[0267] Células HEK293
[0268] En este estudio se usó la línea celular 293 de riñón embrionario humano (HEK293) (n.º 85120602, Sigma-Aldrich). Las células HEK293 se mantuvieron en un medio de cultivo (D-MEM [n.º 11995065, Thermo Fisher Scientific] suplementado con suero bovino fetal al 10 % [FBS] [n.º 10082147, Thermo Fisher Scientific]) que contenía penicilina 100 unidades/ml y estreptomicina 100 µg/ml (n.º 15140122, Thermo Fisher Scientific).
[0269] Transfección de plásmidos
[0270] La transfección del plásmido se realizó utilizando el reactivo de transfección Lipofectamine 2000 (n.º 11668019, Thermo Fisher Scientific) según las instrucciones del fabricante. En resumen, las células HEK293 (n.º 12022001, Sigma-Aldrich) se sembraron en placas a una densidad de 3x10<5>células/ml en medios de cultivo sin antibióticos. Al día siguiente, el plásmido y el reactivo Lipofectamine 2000 se combinaron en una solución Opti-MEM (n.º 31985062, Thermo Fisher Scientific). Después de 5 minutos, las mezclas se añadieron al cultivo HEK293. Después de 72 horas, las células se recogieron para la extracción de ARN o proteínas, o se sometieron a los análisis por formación de imágenes. Para los análisis por formación de imágenes, las placas se recubrieron previamente con una solución de poli-L-lisina al 0,01 % (P8920, Sigma-Aldrich) antes de colocar las células en placas.
[0271] Análisis de expresión génica mediante PCR cuantitativa en tiempo real (qRT-PCR)
[0272] Los niveles relativos de expresión génica se determinaron mediante PCR cuantitativa en tiempo real (qRT-PCR) utilizando el kit Power SYBR Green Cells-to-CT (n.º 4402955, Thermo Fisher Scientific) según las instrucciones del fabricante. Los plásmidos candidatos se transfectaron transitoriamente en células HEK293 sembradas en placas de 48 pocillos (7,5 x10<4>células/pocillo) utilizando el reactivo de transfección Lipofectamine 2000 (0,5 µg de plásmido y 1,5 µl de reactivo en 50 µl de solución Opti-MEM). Después de 72 horas, se extrajo el ARN de las células y se usó para la transcripción inversa para sintetizar el ADNc según las instrucciones del fabricante. Para el análisis cuantitativo por PCR, se amplificaron 2~5 µl de productos de ADNc por duplicado utilizando pares de cebadores específicos de genes (concentración final de 250 nM) con Power SYBR Green PCR Master Mix (n.º 4367659, Thermo Fisher Scientific). Las secuencias iniciadoras para los genesSNCA,TMEM106ByGAPDHfueron: 5'- AAG AGG GTG TTC TCT ATG TAG GC -3' (Id. de sec. n.º 71), 5'- GCT CCT CCA ACA TTT GTC ACT T -3' (Id. de sec. n.º 72) forSNCA,5'-ACA CAG TAC CTA CCG TTA TAG CA-3' (Id. de sec. n.º 73), 5'-TGT TGT CAC AGT AAC TTG CAT CA-3' (Id. de sec. n.º 74) paraTMEM106By 5'- CTG GGC TAC ACT GAG CAC C -3' (Id. de sec. n.º 75), 5'- AAG TGG TCG TTG AGG GCA ATG -3' (Id. de sec. n.º 76) paraGAPDH.La PCR cuantitativa se realizó en un sistema de PCR en tiempo real QuantStudio 3 (Thermo Fisher Scientific). Los niveles de expresión se normalizaron mediante el gen constitutivoGAPDHy se calcularon utilizando el método de tomografía computarizada comparativa.
[0273] Análisis de imágenes de fluorescencia
[0274] Los plásmidos indicadores de EGFP, que contienen la UTR 3' del genSNCAhumano corriente abajo de la región codificante del EGFP, se utilizaron para la validación de los plásmidos de desactivación deSNCAy elTMEM106B. Los plásmidos indicadores de EGFP y los plásmidos de inactivación candidatos se transfectaron simultáneamente en células HEK293 sembradas en placas de 96 pocillos recubiertas de poli-L-lisina (3,0 x 10<4>células/pocillo) utilizando el reactivo de transfección Lipofectamine 2000 (0,04 µg de plásmido indicador, 0,06 µg de plásmido de desactivación y 0,3 µl de reactivo en 10 µl de solución Opti-MEM). Después de 72 horas, se midieron las intensidades fluorescentes de la señal de EGFP a 488 nm/emisión a 512 nm utilizando el lector multimodo Varioskan LUX (Thermo Fisher Scientific). Las células se fijaron con PFA al 4 % a TA durante 10 minutos y se incubaron con D-PBS que contenía 40 µg/ml de 7-aminoactinomicina D (7-AAD) durante 30 minutos a temperatura ambiente. Después de lavar con D-PBS, se midieron las intensidades fluorescentes de la señal de 7-AAD a una excitación de 546 nm/emisión de 647 nm utilizando un lector Varioskan para cuantificar el número de células. La señal de EGFP normalizada por cada nivel de señal de 7-AAD se comparó con las muestras de desactivación de control.
[0275] Ensayo de inmunoadsorción enzimática (ELISA)
[0276] Los plásmidos indicadores de α-Sinucleína, que contienen la UTR 3' del genSNCAhumano o del genTMEM106Bcorriente abajo de la región codificante deSNCA, se utilizaron para la validación de los plásmidos inactivados a nivel proteico. Los niveles de proteína α-sinucleína se determinaron mediante ELISA (n.º KHB0061, Thermo Fisher Scientific) utilizando los lisados extraídos de las células HEK293. Los plásmidos candidatos se transfectaron transitoriamente en células HEK293 sembradas en placas de 48 pocillos (7,5 x10<4>células/pocillo) utilizando el reactivo de transfección Lipofectamine 2000 (0,1 µg de plásmido indicador, 0,15 µg de plásmido de desactivación y 0,75 µl de reactivo en 25 µl de solución de Opti-MEM). Después de 72 horas, las células se lisaron en un tampón de ensayo de radioinmunoprecipitación (RIPA) (n.º 89900, Thermo Fisher Scientific) suplementado con un cóctel de inhibidores de proteasa (n.º P8340, Sigma-Aldrich) y se sometieron a ultrasonidos durante unos segundos. Después de la incubación en hielo durante 30 min, los lisados se centrifugaron a 20.000 ×g a 4 °C durante 15 minutos y se recogió el sobrenadante. Se cuantificaron los niveles de proteína. Las placas se leyeron en un lector de placas Varioskan a 450 nm y las concentraciones se calcularon utilizando el software SoftMax Pro 5. Las concentraciones de proteína medidas se normalizaron con respecto a la concentración total de proteína determinada con un ensayo de ácido bicinconínico (n.º 23225, Thermo Fisher Scientific).
[0277] La Figura 37 y la Tabla 4 muestran datos representativos que indican el silenciamiento exitoso delSNCA in vitromediante el ensayo indicador de GFP (arriba) y el ensayo α-Syn (abajo). La Figura 38 y la Tabla 5 muestran datos representativos que indican el silenciamiento exitoso delTMEM106B in vitromediante el ensayo indicador de GFP (arriba) y el ensayo α-Syn (abajo).
[0278] Tabla 4
[0281]
[0283] Tabla 5
[0286]
[0287]
[0289] Ejemplo 11: Colocación de la secuencia “D” de ITR y transducción celular
[0290] Se investigó el efecto de la colocación de la secuencia “D” de ITR en la transducción celular de los vectores rAAV. Las células HEK293 se transdujeron con rAAV que codificaban Gcasa que tenían 1) ITR de tipo silvestre (por ejemplo, secuencias “D” proximales al inserto transgénico y distales al extremo de la ITR) o 2) ITR con la secuencia “D” ubicada en el “exterior” del vector (por ejemplo, la secuencia “D” ubicada proximal al extremo de la ITR y distal al inserto transgénico), como se muestra en Figura 20. Sorprendentemente, los datos indican que los rAAV que tienen la secuencia “D” ubicada en la posición “exterior” conservan la capacidad de empaquetarse y transducir células de manera eficiente (Figura 40). Ejemplo 12: Pruebas in vitro de los rAAV de Progranulina
[0291] La Figura 39 es un esquema que representa una realización de un vector que comprende un constructo de expresión que codifica PGRN. La progranulina se sobreexpresa en el SNC de roedores con deficiencia deGRN, heterocigotos u homocigotos para la deleción del GRN, mediante la inyección de un vector rAAV que codifica la PGRN (por ejemplo, la PGRN con codones optimizados), ya sea mediante inyección intraparenquimatosa o intratecal, tal como en la cisterna magna.
[0292] Los ratones se inyectan a los 2 meses o 6 meses de edad, y envejecen hasta los 6 meses o 12 meses y se analizan para determinar uno o más de los siguientes: nivel de expresión de GRN a nivel de ARN y proteína, ensayos conductuales (por ejemplo, mejora del movimiento), ensayos de supervivencia (por ejemplo, mejora de la supervivencia), marcadores inflamatorios y de microglía, gliosis, pérdida neuronal, lipofuscinosis y/o rescate por acumulación de marcadores lisosómicos, tales como LAMP1. Los ensayos en ratones deficientes en PGRN se describen, por ejemplo, por Arrant y col. (2017) Brain 140: 1477-1465; Arrant y col. (2018) J. Neuroscience 38(9):2341-2358; y Amado y col. (2018) doi:https://doi.org/10.1101/30869.
[0293] Ejemplo 13: Ensayos in vitro e in vivo de rAAV de Progranulina
[0294] Se realizaron ensayosin vitroeinvivo para analizar los efectos de un constructo de rAAV (PR006 (también denominado PR006A); véase la Figura 64) que codifica la proteína progranulina (PGRN). PR006 comprende una cápside que tiene un serotipo AAV9.
[0295] Estudios no clínicosin vitro
[0296] Expresión de progranulina derivada de PR006A en células HEK293T
[0297] Se investigó la capacidad del PR006A para inducir la producción de proteína progranulina en un contexto celular. Las células HEK293T se transdujeron con PR006A en un rango de multiplicidades de infección (MOI) que varían de 2,1 x 10<5>a 3,3 x 10<6>genomas vectoriales (vg)/célula. La transducción de PR006A dio como resultado un aumento robusto y dependiente de la dosis en la expresión y secreción de la proteína progranulina en el medio celular (Figura 60). En un grupo de control negativo tratado solo con el excipiente (el vehículo clínico previsto) se detectaron niveles de proteína progranulina sustancialmente más bajos, que reflejan la expresión derivada del genGRNhumano endógeno. Eficacia en neuronas derivadas de iPSC con FTD-GRN
[0298] Se realizó un ensayo para analizar la eficacia del constructo rAAVin vitroen cultivos neuronales humanos de FTD-GRN (demencia frontotemporal con mutaciónGRN). Las líneas celulares se obtuvieron del National Institute of Neurological Disorders and Stroke (NINDS) Human Cell and Data Repository (NHCDR): Materiales ND50015 (FTD-GRN, M1L), ND50060 (FTD-GRN, R493X) y ND38555 (control, tipo silvestre) (véase la Tabla 6).
[0299] Tabla 6: Resumen de las características de la línea celular iPSC
[0301]
[0302] Para establecer un modelo celular que sea patológicamente relevante para FTD-GRN, las iPSC de cada línea se diferenciaron en células neuronales mediante un protocolo de dos etapas. En la primera etapa, las iPSC se diferenciaron en líneas de células madre neuronales (NSC) en proliferación, que carecían de la expresión de marcadores de pluripotencia (es decir, Oct4 y SSEA1) y obtuvieron la expresión de marcadores de células madre neuronales (es decir, SOX2, Nestina, SOX1 y PAX6), como se detectó mediante el marcaje por inmunofluorescencia.
[0304] Las líneas NSC de control y FTD-GRN se sembraron a una densidad igual y, 48 horas después, se midió la expresión de progranulina mediante un ensayo de inmunoadsorción enzimática (ELISA) en lisados celulares (progranulina intracelular) (Figura 52E) y medios celulares (progranulina secretada) (Figura 52A). La expresión de progranulina se normalizó con respecto a la concentración total de proteína para tener en cuenta las diferencias en el número de células (n=3; media ± SEM). Las líneas NSC con mutaciones heterocigotas en GRN tenían niveles de progranulina intracelular y secretada significativamente más bajos en comparación con las NSC de control, y las NSC FTD-GRN expresaban el ~25-50 % de los niveles de progranulina endógena. Esto sugiere que este modelo de células FTD-GRN recapitula la deficiencia clínica de progranulina observada en pacientes con FTD-GRN, que expresan entre un tercio y la mitad de los niveles plasmáticos normales de progranulina (Finch y col., Brain 132, 583-591 (2009); Ghidoni y col., Neurology 71, 1235-1239, (2008); Sleegers y col., Ann Neurol 65, 603-609 (2009)).
[0306] Las NSC de todas las líneas celulares se diferenciaron en cultivos neuronales. Tras establecer que las NSC derivadas de iPSC muestran una expresión reducida de progranulina, las líneas se diferenciaron en neuronas para generar un tipo de célula clínicamente representativo para los estudios de eficacia no clínicos de PR006A. Las NSC se sembraron en medios de diferenciación neuronal, se diferenciaron terminalmente en neuronas posmitóticas durante un período de 7 días y a continuación se evaluaron para determinar la expresión de marcadores neuronales (es decir, MAP2, NeuN, Tau, Tuj1, NF-H) mediante inmunofluorescencia (Figura 52G). Tanto las líneas NSC derivadas de iPSC de Control como las de FTD-GRN se diferenciaron de manera eficiente en neuronas utilizando este protocolo.
[0308] Se utilizaron cultivos neuronales derivados de iPSC con FTD-GRN para evaluar la eficacia de PR006Ain vitro.Las neuronas FTD-GRN se trataron con excipiente o PR006A a MOI de 2,7 x 10<5>, 5,3 x 10<5>o 1,1 x 10<6>vg/célula. La transducción de PR006 dio como resultado una expresión robusta y dependiente de la dosis de la progranulina secretada, medida mediante ELISA, en todas las líneas celulares (Figura 52B). Las neuronas de control y FTD-GRN tratadas con excipientes se evaluaron para determinar los niveles de progranulina endógena. Las neuronas de control expresaron progranulina secretada endógena, mientras que no se detectó progranulina secretada en las neuronas FTD-GRN (Figura 52B). El análisis de regresión lineal confirmó una correlación significativa entre la dosis de PR006A y los niveles de progranulina en ambas líneas celulares FTD-GRN (p=3,5 x 10<-13>). Estos resultados demuestran que el tratamiento con PR006A da como resultado una secreción elevada de progranulina en el modelo neuronal FTD-GRN.
[0310] Se sabe que la progranulina estimula la maduración de la proteasa lisosómica catepsina D (CTSD), cuya pérdida de función también se ha implicado en los trastornos de almacenamiento lisosómico y la neurodegeneración. La CTSD se expresa como una proproteína de longitud completa inactiva (procTSD) que se procesa proteolíticamente en una proteasa madura enzimáticamente activa (matCTSD). Se ha informado que la progranulina actúa como una chaperona molecular que se une a ProcTSD para mejorar su maduración en la proteasa MattSD. En cultivos neuronales FTD-GRN, la transducción de PR006 rescató la maduración defectuosa de la catepsina D (Figura 52C). Las neuronas control, FTD-GRN n.º 1 y FTD-GRN n.º 2 se transdujeron con PR006A o un excipiente. Se usó una MOI de 5,3 x 10<5>PR006A para los experimentos de eficacia ya que restauró los niveles de progranulina a al menos 2 veces los de las células de control (Figura 52B). Para evaluar la eficacia, se midieron los niveles de expresión de procTSD y matCTSD en los lisados celulares utilizando la plataforma automatizada Simple Western™ (Jess) (Figura 52C). Las neuronas FTD-GRN tratadas con excipientes tenían una proporción más baja de matCTSD a procTSD en comparación con las neuronas de control tratadas con excipientes; el tratamiento con PR006A aumentó significativamente la proporción en ambas líneas neuronales FTD-GRN (Figura 52C). En las neuronas de control, la proporción entre matCTSD y procTSD no se alteró significativamente con el tratamiento con PR006A. Estos descubrimientos demuestran que PR006A restaura un fenotipo relacionado con la función lisosómica en las neuronas FTD-GRN.
[0312] En las neuronas normales, la proteína TDP-43 (proteína de unión al ADN de respuesta transactiva de 43 kDa) se localiza en el núcleo. En los cerebros post mortem de pacientes con FTD-GRN, se observa la agregación de TDP-43 en el citoplasma de las neuronas y se reduce la acumulación nuclear de TDP-43. Las neuronas FTD tienen una disminución de la TDP-43 nuclear, lo que provoca agregación y toxicidad posterior en las neuronas. Dado que los ratonesGrnKO no recapitulan completamente esta patología de TDP-43, las neuronas derivadas de células madre pluripotentes inducidas (iPSC) son un valioso modelo de FTD-GRN para estudiar la biología de TDP-43. Se ha descrito una disminución de la acumulación de TDP-43 en el núcleo y un aumento de la acumulación de TDP-43 insoluble en las neuronas derivadas de iPSC de pacientes con FTD-GRN, en comparación con las neuronas de control que no portan una mutación enGRN, como se describe por Valdez y col. (Human Molecular Genetics 26, 4861-4872 (2017)). La transducción PR006A de cultivos neuronales de ambas líneas portadoras de la mutación FTD-GRN revirtió las anomalías de TDP-43, lo que dio como resultado una disminución de TDP-43 insoluble (medida utilizando la plataforma Simple Westem™ (Jess) (Figura 52D)) y un aumento de la localización nuclear de TDP-43 (medida mediante inmunofluorescencia (Figura 52F)).
[0313] En resumen, la transducción de PR006 restauró la maduración defectuosa en la enzima lisosómica, la catepsina D, y mejoró la patología anormal de la TDP-43 en las neuronas FTD-GRN.
[0314] Estudios no clínicosin vivo
[0315] Eficacia y biodistribución en ratones envejecidos con Grn inactivado
[0316] La eficacia de PR006Ain vivoy la dosis máxima de PR006A se evaluaron en el modelo de ratón con el genGrn(progranulina) inactivado (KO,knockout). En el modelo de ratónGrnKO utilizado en estos estudios (B6(Cg)-Grntm1.1Aidi
/J (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME), los exones 1-4 se eliminan del gen diana de la progranulina (Grn) (Yin y col., J Exp Med 207, 117-128 (2010)). Estos animales tienen una pérdida completa de progranulina, muestran fenotipos dependientes de la edad que incluyen alteraciones lisosómicas, acumulación de lipofuscina neuronal, acumulación de ubiquitina, microgliosis y neuroinflamación y, por lo tanto, se utilizan ampliamente para modelar FTD-GRN. Se hicieron todos los intentos para eliminar el sesgo del estudio; los ratones se asignaron a grupos de tratamiento que estaban equilibrados en cuanto al género y el peso corporal, y personal cualificado llevó a cabo una evaluación con enmascaramiento de los criterios de valoración experimentales.
[0317] En los estudios iniciales, PR006A se administró a ratonesGrnKO envejecidos en una dosis de 9,7 x 10<10>vg (2,4 x 10<11>vg/g de cerebro), que era la dosis más alta posible en el momento del estudio debido a las limitaciones del volumen de inyección y al título físico del lote de virus utilizado para el estudio. Se utilizaron ratones de edad avanzada, ya que muchos de los fenotipos relacionados con FTD-GRN, incluyendo inflamación del SNC y microgliosis, se desarrollan de manera dependiente de la edad, y la manifestación más pronunciada de los fenotipos se produce entre los 12-24 meses de edad.
[0318] En los estudios con ratonesGrnKO envejecidos, PR006A se administró mediante una única inyección intracerebroventricular (ICV).10 µl de excipiente (el vehículo clínico previsto; Tris 20 mM pH 8,0, NaCl 200 mM y MgCl<2>1 mM Pluronic F68 al 0,001 %) o PR006A 9,7 x 10<10>vg (2,4 x 10<11>vg/g de cerebro [basado en un peso de cerebro de ratón adulto de 400 mg]) se suministró mediante inyección ICV en dos cohortes de ratonesGrnKO envejecidos: (1) 16 meses de edad en el momento de la inyección (n=4/grupo; PRV-2018-027; Figura 61) y (2) 14 meses de edad en el momento de la inyección (planeado n=3/grupo; PRV-2019-002; Figura 61). Los animales se sacrificaron dos meses después de la inyección. En el estudio PRV-2018-027, se administró una dosis única de PR006A a ratones de 16 meses con los siguientes grupos de tratamiento:
[0321]
[0323] Debido a desviaciones imprevistas del estudio (errores en el genotipado y pérdida prematura de animales), en el estudio PRV-2019-002 (cohorte de 14 meses) se inscribió solo a 1 ratón en el grupo tratado con excipientes, en lugar del previsto n=3. El bajo número de muestras imposibilitó el análisis estadístico y, por lo tanto, este estudio está excluido de un análisis adicional aquí. Sin embargo, los descubrimientos del estudio fueron comparables a los del estudio PRV-2018-027.
[0324] Biodistribución y expresión de progranulina: La biodistribución se determinó midiendo la presencia del genoma vectorial mediante un ensayo de qPCR que cumple con los estándares actuales de sensibilidad a la PCR del U.S. Food and Drug Administration Center for Biologics Evaluation and Research (CBER) / Office of Tissues and Advanced Therapies (OTAT) (con >50 genomas vectoriales por 1 µg de ADN genómico definidos como positivos). Todos los ratones que recibieron PR006A dieron positivo para genomas vectoriales en la corteza cerebral y la médula espinal, lo que indica que la administración de ICV da como resultado con éxito la transducción de PR006A en el cerebro y el SNC (Figura 59A). ICV PR006A dio como resultado niveles significativos de proteína progranulina humana en el SNC (cerebro, médula espinal) de los ratonesGrnKO, mientras que, como era de esperar, la progranulina humana no fue detectable en los ratones que recibieron el excipiente (Figura 59B). Dado que la progranulina es principalmente una proteína secretada, la expresión en el LCR puede considerarse un sustituto de la producción de proteínas en el cerebro y representa un posible criterio de valoración traduccional para los pacientes con FTD-GRN que tienen niveles reducidos de progranulina en el LCR. Se pudo detectar progranulina humana en el LCR de los ratones tratados con PR006A, pero debido al pequeño volumen de muestra y a las limitaciones técnicas para obtener un volumen suficiente de LCR en ratones, las mediciones del nivel de progranulina en el LCR estuvieron por debajo del límite inferior de cuantificación (LLOQ) del ensayo (Figura 59C).
[0325] La administración ICV también dio como resultado una amplia presencia del genoma del vector y niveles de proteína progranulina en los tejidos periféricos, incluyendo hígado, corazón, pulmones, riñones, bazo y gónadas (Figura 62A-Figura 62B). Además, se detectaron niveles significativos de progranulina humana en el plasma de los ratonesGrnKO tratados con PR006A. Como era de esperar, no se detectó progranulina humana en los ratonesGrnKO tratados con excipientes.
[0326] Acumulación de lipofuscina: La acumulación de lipofuscina neuronal, un material autofluorescente denso en electrones que se acumula progresivamente con el tiempo en los lisosomas de las células posmitóticas y es un indicador de disfunción lisosómica, es un fenotipo característico de los ratonesGrnKO que depende de la edad. La acumulación de lipofuscina se evaluó mediante dos métodos independientes en secciones cerebrales adyacentes: (1) en un enfoque más clínico, un patólogo con enmascaramiento puntuó la acumulación de lipofuscina en el cerebro en una escala de 0 (no se observó lipofuscina) a 4 (acumulación generalizada de lipofuscina) y (2) en un enfoque más cuantitativo, la autofluorescencia de la lipofuscina se detectó mediante inmunohistoquímica (IHC) y se cuantificó automáticamente. Los ratonesGrnKO mostraron lipofuscinosis sustancial en todo el cerebro, y el tratamiento con ICV PR006A redujo la gravedad de la puntuación de lipofuscina en la corteza cerebral, el hipocampo y el tálamo (Figura 59D). La cuantificación de la acumulación de lipofuscina a partir de imágenes de IHC también detectó una disminución de la lipofuscinosis con el tratamiento con PR006A en las tres regiones del cerebro. Dado que las inclusiones positivas a la ubiquitina son una característica patológica definitoria de los pacientes con FTD-GRN que también se acumulan en el modelo de ratónGrnKO de manera dependiente de la edad, se realizó y se cuantificó IHC en las regiones cerebrales de interés (corteza cerebral, hipocampo, tálamo) para evaluar la acumulación de ubiquitina. El tratamiento con PR006A redujo significativamente la acumulación de ubiquitina en ratonesGrnKO (Figura 59E). Estos descubrimientos sugieren que el PR006A mejora la disfunción lisosómica en el modelo de ratónGrnKO de FTD-GRN.
[0328] Neuroinflamación: La inflamación crónica del SNC es una característica patológica en el cerebro de los pacientes con FTD-GRN que se recapitula en ratonesGrnKO de una manera dependiente de la edad. La progranulina tiene efectos antiinflamatorios en modelos murinos de FTD-GRN, y la pérdida de progranulina conduce a una regulación positiva de las citocinas proinflamatorias, incluyendo TNFα. En este estudio, el tratamiento con PR006A suprimió los niveles de marcadores inflamatorios en ratonesGrnKO envejecidos. ICV PR006A disminuyó la expresión génica de las citocinas proinflamatoriasTnf(TNFα) y Cd68 (CD68), un marcador de la microglía, en la corteza cerebral (Figura 59F). Los niveles de proteína TNFα también disminuyeron en muestras de corteza cerebral de ratonesGrnKO tratados con PR006A utilizando el ensayo de citocinas proinflamatorias en ratones Mesoscale Discovery (Figura 59G). Para evaluar más a fondo la neuroinflamación, se realizó una inmunohistoquímica (IHC) para Iba1, un marcador de microgliosis, y el GFAP, un marcador de astrocitosis, y se cuantificó en las regiones cerebrales de interés (corteza cerebral, hipocampo, tálamo). El tratamiento con PR006A dio como resultado una tendencia hacia una disminución de la microgliosis (Iba1) pero no afectó a la astrocitosis (GFAP) en ratonesGrnKO (Figura 59H); Figura 59I). En conjunto, estos resultados indican que el tratamiento con PR006A reduce la neuroinflamación en el modelo FTD-GRN de ratónGrnKO envejecido.
[0330] Histopatología: un análisis histopatológico exhaustivo realizado por un patólogo con enmascaramiento certificado por la junta de tinción con hematoxilina y eosina (H&E) del cerebro, la médula espinal torácica, el hígado, el corazón, el bazo, los pulmones y los riñones de todos los ratones de estos estudios no reveló ningún efecto adverso relacionado con el tratamiento con PR006A. La administración del PR006A a ratonesGrnKO dio como resultado una disminución de la incidencia y/o gravedad de los descubrimientos característicos del modelo, incluida una reducción de las puntuaciones de frecuencia y/o gravedad de la necrosis neuronal en la médula y el puente troncoencefálico. Además, hubo una reducción tanto en la incidencia como en la gravedad de la degeneración axonal en la médula espinal torácica con el tratamiento con PR006A. Estos descubrimientos se analizan en detalle en la sección Toxicología a continuación.
[0332] Conclusión: ICV PR006A a una dosis de 9,7 x 10<10>vg (2,4 x 10<11>vg/g de cerebro) dio como resultado una amplia presencia del genoma vectorial en todo el cerebro y los tejidos periféricos en ratonesGrnKO envejecidos. El tratamiento con PR006A aumentó la expresión global de la progranulina. Además, PR006A redujo la acumulación de lipofuscina y ubiquitina en el cerebro, patologías que se sabe que se producen tanto en el modelo de ratónGrnKO como en los pacientes con FTD-GRN. PR006A también redujo la expresión de las citocinas proinflamatorias y la activación de las células inmunitarias en la corteza cerebral, fenotipos que son indicativos de una inflamación crónica del SNC.
[0334] Eficacia en función de la dosis en ratones adultos con Grn inactivado
[0336] Para evaluar más a fondo las dosis eficaces de PR006A, se realizó un estudio más amplio de rango de dosis en ratonesGrnKO adultos. En PRV-2019-004, 10 µl de excipiente (el vehículo clínico previsto; Tris 20 mM pH 8,0, NaCl 200 mM y MgCl<2>1 mM Pluronic F68 al 0,001 %) o PR006A se suministraron a través de ICV a animales de 4 meses de edad. Se utilizaron estos ratones adultos en lugar de los ratonesGrnKO envejecidos porque estos últimos no estaban disponibles en cantidades suficientes para realizar un estudio de rango de dosis. Si bien los ratonesGrnKO adultos tienen un fenotipo más leve que los ratones envejecidos, todavía presentan defectos lisosómicos y cambios neuroinflamatorios y, por lo tanto, son adecuados para evaluar el rango de dosis eficaz de PR006A. Para evaluar la eficacia de PR006A en una amplia gama de dosis víricas, PR006A se administró a 1,1 x 10<11>vg (2,7 x 10<11>vg/g cerebro), la dosis más alta alcanzable en el momento del estudio debido a las limitaciones del volumen de inyección y al título físico del lote de virus utilizado para el estudio, una dosis media de 1,1 x 10<10>vg (2,7 x 10<10>vg/g cerebro), o una dosis baja dosis de 1,1 x 10<9>vg (2,7 x 10<9>vg/g cerebro), con una diferencia logarítmica completa para cada dosis. Los detalles del diseño experimental se dan en la Figura 63.
[0338] Se evaluaron tres dosis de PR006A, con 10 ratones (4M/6F) por grupo:
[0341]
[0344] Los ratones de la misma edad de la misma cepa de origen que los ratonesGrnKO con alelosGrnde tipo silvestre (TS) (C57BL/6J de 7 meses) sirvieron como controles para determinados criterios de valoración de eficacia en este estudio.
[0347]
[0350] Biodistribución y expresión de progranulina: La biodistribución se determinó midiendo la presencia del genoma vectorial mediante un ensayo de qPCR que cumple con los estándares actuales de sensibilidad a la PCR de CBER/(OTAT) (con >50 genomas vectoriales por µg de ADN genómico definidos como positivos). Los ratones que recibieron PR006A fueron positivos para los genomas vectoriales en la corteza cerebral y la médula espinal de una manera dependiente de la dosis, lo que indica que la administración del ICV da como resultado con éxito la transducción de PR006A en el SNC (Figura 53A). El análisis por qRT-PCR deGRNcodificado por PR006A reveló que la dosificación ICV de PR006A dio como resultado una inducción dependiente de la dosis de la expresión del ARNm deGRNhumana en la corteza cerebral (Figura 53 B). El tratamiento con PR006A aumentó los niveles de proteína progranulina humana en el cerebro y la médula espinal (Figura 53C). En el tejido cerebral, se detectaron y cuantificaron los niveles de progranulina humana con la dosis más alta de PR006A; a dosis más bajas, los niveles de progranulina estaban por debajo del límite de detección del ensayo debido al alto nivel de concentración en el cerebro. Sin embargo, basándose en la diferencia logarítmica entre las dosis, la estimación proporcional de los niveles esperados de progranulina a las dosis más bajas estaría muy por debajo del límite inferior de cuantificación (LLOQ) del ensayo en el tejido cerebral. El nivel de progranulina endógena de ratón se midió en ratones de la misma edad y cepa con alelosGrnde tipo silvestre (TS); tanto en la corteza cerebral como en la médula espinal, los niveles de progranulina humana en ratonesGrnKO tratados con PR006A no superaron el nivel de progranulina endógena en ratones TS en ninguna dosis. Dado que se utilizaron diferentes ensayos de detección que empleaban anticuerpos antiprogranulina sin reacción cruzada entre especies para medir la progranulina humana y de ratón, los números absolutos no se pueden comparar con precisión.
[0352] La administración de PR006A también dio como resultado una amplia presencia del genoma del vector y niveles de proteína progranulina en los tejidos periféricos, incluyendo hígado, corazón, pulmones, riñones, bazo y gónadas (Figura 53D; Figura 53E).
[0354] En el plasma, se detectaron niveles significativos de progranulina humana en ratonesGrnKO tratados con PR006A a todos los niveles de dosis (Figura 53F). En línea con lo esperado, no se detectó progranulina humana en los ratonesGrnKO tratados con excipientes. Los niveles de progranulina humana en animales tratados con la dosis media de PR006A estaban en el mismo rango que los niveles de progranulina de ratón medidos en ratones con alelosGrnTS. Dado que se utilizaron diferentes ensayos de detección que empleaban anticuerpos antiprogranulina sin reacción cruzada entre especies para medir la progranulina humana y de ratón, los números absolutos no se pueden comparar con precisión.
[0356] Acumulación de lipofuscina: La acumulación de lipofuscina se evaluó mediante dos métodos independientes en secciones cerebrales adyacentes: (1) en un enfoque más clínico, un patólogo con enmascaramiento puntuó la acumulación de lipofuscina en el cerebro en una escala de 0 (no se observó lipofuscina) a 4 (acumulación generalizada de lipofuscina) y (2) en un enfoque más cuantitativo, la autofluorescencia de la lipofuscina se detectó mediante IHC y se cuantificó automáticamente. Los ratonesGrnKO mostraron lipofuscinosis en todo el cerebro, mientras que los ratones TS no tenían lipofuscina detectable en el cerebro (Figura 53G). La administración ICV de PR006A condujo a una reducción dependiente de la dosis en las puntuaciones de gravedad de la acumulación de lipofuscina intracelular en los cerebros de ratonesGrnKO (Figura 53G). La eficacia de PR006A con respecto a la reducción de la lipofuscinosis podría cuantificarse más fácilmente en las regiones del cerebro que muestran el fenotipo de lipofuscinosis más robusto en el modelo de FTD-GRN en ratonesGrnKO, incluyendo el hipocampo y el tálamo. Además de la puntuación de la lipofuscina realizada por un patólogo, la IHC realizada en las regiones cerebrales de interés (es decir, la corteza cerebral, el hipocampo y el tálamo) para evaluar cuantitativamente la lipofuscinosis detectó una reducción dependiente de la dosis en la cantidad de acumulación de lipofuscina en la corteza cerebral y las regiones del cerebro talámico, con disminuciones significativas con las dosis medias y altas de PR006A. También se realizó una IHC para evaluar la acumulación de ubiquitina en el cerebro, una patología adicional relacionada con FTD-GRN que se presenta en ratonesGrnKO. En comparación con los ratones TS, los ratonesGrnKO mostraron un aumento de ubiquitina en todo el cerebro (Figura 53H). PR006A redujo significativamente el tamaño del objetivo inmunorreactivo a la ubiquitina hasta niveles cercanos al TS en las tres dosis (Figura 53H).
[0358] Neuroinflamación: El tratamiento con PR006A suprimió los niveles de marcadores inflamatorios en el cerebro de ratonesGrnKO adultos. PR006A ICV disminuyó la expresión génica de las citocinas proinflamatoriasTnf(TNFα) yCd68(CD68), un marcador de la microglía, en la corteza en un rango de dosis, de 2,7 x 10<9>vg/g de cerebro a 2,7 x 10<11>vg/g de cerebro (Figura 53I). En línea con los datos publicados, observamos un aumento en la expresión génica de estos marcadores neuroinflamatorios en ratonesGrnKO tratados con excipientes en comparación con ratones de la misma edad con alelosGrnde tipo silvestre (Figura 53I). A diferencia de las observaciones en ratonesGrnKO de 18 meses de PRV-2018-027 y de los informes sobre anomalías de TNFα publicados en la bibliografía, no hubo un aumento significativo de los niveles de proteína TNFα en la corteza cerebral en los ratonesGrnKO adultos de 7 meses tratados con excipientes; de forma adicional, no se observaron cambios significativos con PR006A en ratonesGrnKO. Estos descubrimientos concuerdan con los descubrimientos publicados anteriormente de que los fenotipos neuroinflamatorios robustos no se producen en el modelo de ratónGrnKO hasta los 12-24 meses de edad. La inmunohistoquímica (IHC) se realizó y se cuantificó en las regiones cerebrales de interés (corteza cerebral, hipocampo y tálamo) para evaluar más a fondo la inflamación neuronal mediante la tinción de Iba1, un marcador de microgliosis, y GFAP, un marcador de astrocitosis. Hubo un aumento significativo en la microgliosis (Iba1) y la astrocitosis (GFAP) en todo el cerebro en los ratonesGrnKO en comparación con los ratones TS (Figura 53J - Figura 53K). El tratamiento con PR006A redujo significativamente la microgliosis (Iba1) en las tres dosis (Figura 53J). Se observó una tendencia hacia la disminución de la astrocitosis (GFAP) con la dosis media de PR006A y se observó una disminución significativa de la astrocitosis (GFAP) con la dosis alta de PR006A en la región del cerebro del tálamo (Figura 53K).
[0360] Si bien muchos de los fenotipos de ratones modeloGrnKO aparecen en una etapa avanzada de la vida, los estudios han informado que los ratonesGrnKO muestran cambios generalizados en la expresión génica ya a los 4 meses de edad, incluyendo cambios en las vías relacionadas con los lisosomas y el sistema inmunitario. Por lo tanto, además del análisis de qRT-PCR dirigido descrito anteriormente, se empleó un enfoque transcriptómico para evaluar los cambios en los niveles de ARNm, que se puede evaluar a nivel mundial con tecnologías sensibles y de alto rendimiento (secuenciación de ARN) y que requiere un mínimo de material de muestra. Los presentes inventores realizaron la secuenciación del ARN en las cortezas cerebrales y utilizaron el análisis de variaciones del conjunto de genes (GSVA) (Hanzelmann y col., BMC Bioinformatics 14, 7 (2013)) para determinar qué vías de expresión génica están alteradas en los ratonesGrnKO tratados con excipientes de 7 meses, en comparación con los ratones TS de la misma edad de la misma cepa. Se confirmaron deficiencias en las vías lisosómicas e inmunitarias en ratones que carecían deGrn,como se informó en estudios publicados anteriormente. Se informó de cambios significativos en un subconjunto de los genes “vacuolas” GO TERM (GO:0005773) (contiene 4 genes que, según se informa, están desregulados en ratonesGrnKO descritos por Lui y col. (Cell 165, 921-935 (2016))), el conjunto de “genes lisosómicos” (un subconjunto de 25 genes relacionados lisosómicos que se ha demostrado que están desregulados en ratonesGrnKO descrito por Evers y col. (Cell Reports 20, 2565-2574 (2017))) y el conjunto de genes “Complemento” de la base de datos Gene Set Enrichment Analysis HALLMARK (contiene genes que codifican componentes del sistema del complemento, que forma parte del sistema inmunitario innato). A continuación, los presentes inventores midieron y compararon los niveles de actividad de estos conjuntos de genes con el tratamiento con PR006A (Figura 53L - Figura 53N). El tratamiento con PR006A revirtió de forma dependiente de la dosis las deficiencias del conjunto de genes observadas en los ratonesGrnKO.
[0362] Histopatología: Un análisis histopatológico exhaustivo realizado por un patólogo con enmascaramiento certificado por la junta de tinción con hematoxilina y eosina (H&E) del cerebro, la médula espinal torácica, el hígado, el corazón, el bazo, el riñón, los pulmones y las gónadas de todos los ratones de estos estudios no encontraron evidencia de toxicidad relacionada con el tratamiento con PR006A. Los detalles del análisis de toxicidad se proporcionan en la sección siguiente.
[0363] Conclusión: PR006A ICV a dosis que varían de 2,7 x 10<9>vg/g de cerebro y 2,7 x 10<11>vg/g de cerebro dio como resultado la presencia de un amplio vector genómico en todo el cerebro y los tejidos periféricos de una manera dependiente de la dosis. El tratamiento con PR006A también condujo a la producción de ARNm y proteínas de progranulina en el SNC. Se observó una clara relación de respuesta a la dosis entre PR006A y la disminución de lipofuscinosis, una lectura de la disfunción lisosómica, a lo largo de múltiples regiones del cerebro. Se observó una reducción sólida y estadísticamente significativa de la lipofuscinosis con el nivel de dosis medio y más alto de PR006A. Todas las dosis de PR006A redujeron la acumulación de ubiquitina en el cerebro. Comenzando con la dosis más baja de 2,7 x 10<9>vg/g de cerebro, PR006A redujo la expresión de los marcadores proinflamatorios en el cerebro a nivel de ARN y proteínas.
[0364] Resumen: Estudios no clínicos in vivo
[0365] PR006A transdujo eficazmente ratonesGrnKO, dando como resultado una biodistribución sólida y dependiente de la dosis del transgén y en la producción de ARNm y proteína de progranulina en el SNC. PR006A revirtió de forma dependiente de la dosis las anomalías de la expresión génica en las vías lisosómicas y neuroinflamatorias. PR006A redujo muchos de los fenotipos que se producen en el cerebro de este modelo de ratón FTD-GRN, incluyendo la lipofuscinosis, la acumulación de ubiquitina y la microgliosis. En el estudio de rango de dosis, la dosis más baja de 2,7 x 10<9>vg/g de PR006A cerebral suprimió significativamente la expresión de marcadores inflamatorios en la corteza cerebral. La dosis media de 2,7 x 10<10>vg/g de PR006A cerebral mejoró tanto los defectos lisosómicos (por ejemplo, la lipofuscinosis) como la neuroinflamación, de forma sólida y estadísticamente significativa. La dosis alta de 2,7 x 10<11>g/g de PR006A cerebral aumentó aún más la expresión de progranulina sin evidencia de toxicidad. Tabla 7: Resumen de biodistribución
[0367]
[0369] Farmacología de seguridad
[0370] A lo largo de estos estudios, no hubo eventos adversos que puedan atribuirse al artículo de prueba. Los descubrimientos de seguridad de los análisis histopatológicos y durante la vida de los animales de PRV-2018-027, PRV-2019-002 y PRV-2019-004 se analizan en la sección siguiente.
[0371] Toxicidad por dosis única
[0372] Se llevó a cabo una serie de estudios no clínicos con PR006A para investigar los criterios de valoración de seguridad en ratones y monos. Tres de los estudios se realizaron en un modelo de ratónGrnKO, en donde los criterios de valoración incluyeron evaluaciones neuropatológicas y evaluaron tanto la actividad protectora como la posible toxicidad resultante de la administración del PR006A mediante inyección intracerebroventricular (ICV); la administración de ICM es técnicamente más difícil en ratones. Estos modelos de ratón son representativos de FTD-GRN en los cuales los pacientes tienen una mutación en el genGRNque produce una reducción de los niveles de progranulina. En macacos cangrejeros, también se realizó una neuropatología como parte de un estudio piloto en el cual se inyectó PR006A en la cisterna magna (ICM). Se llevó a cabo un estudio de GLP en macacos cangrejeros en donde se administró PR006A a ICM y los macacos se sacrificaron el Día 7, el Día 30 o el Día 183. El estudio GLP incorporó una lista completa de criterios de valoración clínicos, además de evaluaciones de patología anatómica en una lista completa de tejidos. Para apoyar la administración de una dosis única en la clínica, se realizaron los siguientes estudios de dosis única.
[0373] Dosis máxima de PR006A en un modelo de ratón FTD-GRN envejecido (PRV-2018-027 y PRV-2019-002) Como parte de estos estudios de eficacia en ratonesGrnKO, se realizaron evaluaciones neuropatológicas en ratones tratados con ICV con el excipiente o con PR006A. Los ratonesGrnKO tienen una pérdida total de progranulina y se utilizan ampliamente como modelos de FTD-GRN debido a sus fenotipos dependientes de la edad, que incluyen alteraciones lisosómicas, acumulación de lipofuscina neuronal, microgliosis y neuroinflamación. Los aspectos de las partes de farmacología del estudio se resumen en las secciones anteriores, mientras que los criterios de valoración relacionados con la toxicología evaluados en este estudio se resumen a continuación. Se realizaron dos estudios de PR006A en el modelo de ratónGrnKO envejecido. En el primer estudio (PRV-2018-027), 9 ratonesGrnKO mestizos de 16 meses de edad recibieron la administración ICV de PR006A o excipiente. Los animales se sacrificaron 9 semanas después de la administración. En este estudio se incluyó un único grupo de dosis de PR006A: 10 µl de virus sin diluir, para una dosis total de 9,7 × 10<10>vg (2,4 × 10<11>vg/g cerebro), y el grupo de control se trató con 10 µl de excipiente.
[0374] Tabla 8: Diseño del estudio PRV-2018-027
[0376]
[0378] Diversos criterios de valoraciónpost-mortem, tales como biodistribución, alteraciones lisosómicas y marcadores inflamatorios, se evaluaron como parte de este protocolo de estudio (véase la sección anterior). También se comprobó la supervivencia de los animales dos veces al día y se midió el peso corporal una vez al día. Después de la eutanasia, 2 meses después del tratamiento, se recogieron los tejidos diana, se fijaron gota a gota en paraformaldehído al 4 % enfriado y se almacenaron a 4 °C. Los tejidos de los 8 animales que completaron el estudio fueron recortados, procesados e incrustados en bloques de parafina. A continuación, se seccionaron a ~5 µm, se tiñeron con hematoxilina y eosina (H&E) y se examinaron por un patólogo veterinario certificado por la junta. Durante este estudio, 1 ratón murió prematuramente del grupo de tratamiento; no se registró ninguna anomalía en el animal fallecido durante la necropsia y, por lo tanto, no se conoce la causa de la muerte. No se observaron otras muertes ni anormalidades. Todos los grupos de tratamiento realizaron un seguimiento similar en términos de peso corporal, sin diferencias significativas.
[0379] En el examen histopatológico, no hubo descubrimientos adversos relacionados con el PR006a. Hubo una acumulación generalizada de lipofuscina en el cerebro, lo que concuerda con los descubrimientos esperados en un ratónGrnKO. En los animales tratados con PR006a, hubo una reducción en la gravedad de la puntuación de acumulación de lipofuscina en todas las regiones del cerebro. Los cambios morfológicos también parecieron demostrar una ligera reducción en las puntuaciones de frecuencia y/o gravedad, particularmente con respecto a la necrosis neuronal en la médula y la protuberancia, con el tratamiento con PR006A. Sin embargo, estas tendencias en los cambios morfológicos no fueron tan consistentes como las de las puntuaciones de lipofuscina.
[0380] En la médula espinal torácica, hubo degeneración axonal y, muy raramente (1 de cada 4 animales en cada grupo), se observó una necrosis neuronal mínima. Hubo una pequeña reducción tanto en la incidencia como en la gravedad de la degeneración axonal en los animales tratados con PR006A.
[0381] Los siguientes descubrimientos, que presumiblemente están asociados al ratón con el genGrnhomocigoto inactivado (knockout), parecieron tener una incidencia y/o gravedad reducidas en los animales tratados con PR006A: túbulos dilatados en la médula del riñón, glomerulopatía en el riñón y material extraño en el pulmón (caracterizadas por estructuras lineales, acelulares y de color rosa oscuro, normalmente en las vías respiratorias y con frecuencia asociadas a cuerpos extraños, células gigantes y/o macrófagos). Sería necesaria una cohorte más grande de animales para obtener conclusiones más definitivas.
[0382] Todos los demás descubrimientos histopatológicos observados se consideraron incidentales y/o tuvieron una incidencia y gravedad similares en los animales tratados con excipientes y artículos de ensayo y, por lo tanto, se consideraron no relacionados con la administración de PR006A.
[0383] En el segundo estudio (PRV-2019-002), 5 ratonesGrnKO mestizos de 14 meses de edad recibieron la administración ICV de PR006A o excipiente. Los animales se sacrificaron 8 semanas después de la administración. En este estudio se incluyó un único grupo de dosis de PR006A: 10 µl de virus sin diluir, para una dosis total de 9,7 × 10<10>vg (2,4 × 10<11>vg/g cerebro), y el grupo de control se trató con 10 µl de excipiente.
[0384] Tabla 9: Diseño del estudio PRV-2019-002}
[0386]
[0388] Los animales se analizaron de manera idéntica para estudiar PRV-2018-027. Se comprobó la supervivencia de los animales dos veces al día y se midió el peso corporal una vez al día. Después de la eutanasia, 2 meses después del tratamiento, se recogieron los tejidos diana, se fijaron gota a gota en paraformaldehído al 4 % enfriado y se almacenaron a 4 °C, hasta la evaluación.
[0389] En el SNC, se observaron en el cerebro descubrimientos consistentes con los observados anteriormente en el ratónGrnKO (Yin y col., J Exp Med 207(1):117-128 (2010)). Específicamente, hubo un aumento generalizado en la acumulación de lipofuscina en todo el cerebro. En raras ocasiones también se observó una necrosis neuronal mínima (en el único animal de muerte temprana no tratado y en un animal con el excipiente).
[0390] Debido al bajo número de muestras, no fue posible demostrar una tendencia constante en los descubrimientos relacionados con el tratamiento. No hubo una diferencia constante en la respuesta entre el artículo de prueba (PR006A) y el excipiente. En los tejidos ajenos al SNC, se observaron descubrimientos que se consideraron consistentes con el fenotipo del ratónGrnKO en el riñón (dilatación tubular e infiltrados de células inflamatorias mononucleares) y en el hígado (vacuolación de las células de Kupffer o células del revestimiento sinusoidal y microgranulomas de células de Kupffer) (Yin y col., J Exp Med 207(1):117-128 (2010)).
[0391] Hubo un descubrimiento de “glomerulopatía” en todos los animales que se sometieron a cirugía y se inscribieron en el estudio. Aunque no se encontraron informes publicados sobre este descubrimiento como un cambio asociado a ratonesGrn knockoutestándar, no expuestos, un estudio demostró que loratones con deficiencia de progranulina tratados con una dieta que induce hiperhomocisteinemia, desarrollan un engrosamiento de la membrana basal glomerular y la eliminación del proceso podicitario (Fu y col., Hypertension 69 (2):259-266 (2017)).
[0392] Todos los demás descubrimientos coincidieron con los observados habitualmente en ratones de laboratorio. Debido al bajo número de muestras, no se pudo mostrar ninguna diferencia concluyente relacionada con el tratamiento. Rango de dosis de PR006A en un modelo de ratón FTD-GRN adulto (PRV-2019-004)
[0393] Para evaluar más a fondo la seguridad de PR006A, se realizó un estudio más amplio de rango de dosis en ratonesGrnKO adultos. Un total de 40 ratones de géneros mixtos se dividieron en 4 grupos y se les administró el excipiente o una de las tres dosis de PR006A mediante una única inyección unilateral de ICV en el hemisferio izquierdo; todos los animales, independientemente del grupo de tratamiento, recibieron un volumen de dosis total de 10 µl. Los ratones se trataron a los 4 meses de edad y se sacrificaron 3 meses después del tratamiento. Un grupo de control adicional de tipo silvestre (TS), que incluía ratones C57BL/6J no tratados (la misma cepa de fondo) de aproximadamente 7 meses de edad, también fue sacrificado y sometido a una necropsia similar.
[0394] El estudio se llevó a cabo según el siguiente diseño del estudio:
[0395] Tabla 10: Diseño del estudio PRV-2019-004
[0397]
[0399] Durante el estudio, se comprobó la supervivencia de los animales dos veces al día y se pesaron una vez a la semana. Los ratones se sacrificaron 3 meses después del tratamiento y se realizaron varias evaluacionespost mortempara evaluar la eficacia del PR006A (véase la sección anterior). Además, un patólogo certificado evaluó las secciones teñidas para detectar H&E del cerebro, la médula espinal torácica, el hígado, el corazón, el bazo, los pulmones, los riñones y las gónadas. En el examen histopatológico, no hubo descubrimientos adversos relacionados con el PR006a en ninguno de los ratones, independientemente del grupo de tratamiento.
[0400] Se encontraron descubrimientos consistentes con el fenotipo del ratón modeloGrnKO, tal como la acumulación de lipofuscina intracelular en varias regiones del cerebro: corteza cerebral, núcleos cerebrales, hipocampo, tálamo/hipotálamo, cerebelo y tronco encefálico (particularmente el puente troncoencefálico y la médula). No se observó evidencia clara de cambios morfológicos en las secciones teñidas con H&E (vacuolación de las neuronas y gliosis). La acumulación de pigmento de lipofuscina puede preceder a cambios morfológicos fácilmente detectables y, por lo tanto, sirve como un biomarcador adecuado de eficacia. Si bien todos los grupos de KO homocigotosGrndemostraron acumulación de lipofuscina, hubo diferencias en la gravedad de este descubrimiento entre los grupos de tratamiento. La frecuencia de las puntuaciones más altas de acumulación de lipofuscina fue mayor en el grupo de animales tratados con el excipiente (grupo 1). De los animales tratados con PR006A, la frecuencia de puntuaciones más altas se observó en el Grupo 4 (PR006A a dosis baja); 2,7 × 10<9>vg/g de cerebro), seguido del Grupo 3 (dosis media de PR006A; 2,7 × 10<10>vg/g (cerebro). Las puntuaciones de gravedad más bajas se observaron en el Grupo 2 (dosis alta de PR006A); 2,7 × 10<11>vg/g (cerebro). Estos descubrimientos demuestran una reducción dependiente de la dosis en las puntuaciones de gravedad de la acumulación intracelular de lipofuscina en el cerebro de ratones inactivados homocigotosGrn.Todos los demás descubrimientos histopatológicos se consideraron incidentales y/o tuvieron una incidencia y gravedad similares en los animales tratados con excipientes y artículos de ensayo y, por lo tanto, se consideraron no relacionados con la administración de PR006A.
[0401] Estudio de dosis única de GLP en macacos (PRV-2018-028)
[0403] Diseño del estudio
[0405] El propósito de este estudio de GLP fue evaluar la toxicidad y la biodistribución del artículo de prueba, PR006A, cuando se administró una vez mediante una inyección ICM en macacos cangrejeros con un período de observación de 6 días, 29 días o 182 días después de la administración; los animales se sacrificaron el Día 7, el Día 30 o el Día 183 del estudio. El estudio se diseñó para evaluar 2 niveles de dosis: la dosis más alta es la dosis máxima posible alcanzable con un volumen de 1,2 ml (el volumen más alto con el que se haya tenido experiencia en la administración) de PR006A sin diluir, y una dosis más baja que equivale a una unidad logarítmica inferior a la dosis alta. Las dosis equivalen a una dosis baja de 4,8 × 10<11>vg y una dosis alta de 4,8 × 10<12>vg; con un peso cerebral estimado de 74 g en un macaco cangrejero, la especie de NHP utilizada en este estudio, esto se traduce en aproximadamente 6,5 × 10<9>vg/g de cerebro y 6,5 × 10<10>vg/g de cerebro. El estudio también incluye un grupo de control en donde los animales recibieron solo 1,2 ml de excipiente (Tris 20 mM, pH 8,0, NaCl 200 mM y MgCl<2>1 mM Pluronic F68 al 0,001 % [p/v]). Este estudio usó macacos cangrejeros machos y hembras. El grupo del Día 7 incluyó 1 hembra con la dosis más alta y se diseñó como centinela para detectar la toxicidad temprana; los dos puntos temporales restantes (Día 30 y Día 183) incluyeron 2 machos y 1 hembra en cada dosis. Además de las muestras de múltiples regiones del cerebro, se recogieron muestras de tejido periférico para el análisis de qPCR. Todas las muestras que fueron positivas con qPCR se analizaron para determinar la expresión transgénica. En la Tabla 11 se proporciona un resumen tabulado del diseño de este estudio.
[0408]
[0409]
[0410]
[0412] Los NHP de macaco cangrejero se evaluaron mediante múltiples observaciones y mediciones durante la vida, incluidas la mortalidad/morbilidad (diarias), las observaciones clínicas (diarias), el peso corporal (al inicio y semanalmente después de eso), la inspección visual del consumo de alimentos (a diario), las observaciones neurológicas (al inicio y durante las Semanas 2 y 26), la oftalmoscopia indirecta (al inicio y durante las Semanas 2 y 26) y la medición electrocardiográfica (ECG) (al inicio y durante las Semanas 2 y 26).
[0413] El análisis de los anticuerpos neutralizantes (nAb) contra la cápside del AAV9 se realizó al inicio del estudio y en el momento del sacrificio los Días 7, 30 o 183. La patología clínica, que consistió en hematología, coagulación, química clínica y análisis de orina, se realizó dos veces al inicio del estudio (análisis de sangre; una vez para el análisis de orina) y una vez durante las Semanas 1 y 13 de la fase de dosificación.
[0414] Los animales se sacrificaron y los tejidos se recogieron el Día 7, el Día 30 o el Día 183. Los tejidos indicados en la Tabla 11, si estaban presentes, se recogieron de todos los animales, se pesaron (si era aplicable) y se dividieron en réplicas. Una réplica se conservó en formalina tamponada neutra al 10 % (excepto cuando se requieren fijadores especiales para una fijación óptima) para la evaluación histopatológica (todos los animales). Se recogieron réplicas adicionales para la qPCR y el análisis de la expresión transgénica.
[0415] Seguridad y toxicología
[0416] No hubo muertes no programadas y todos los animales sobrevivieron hasta la necropsia programada. No hubo observaciones clínicas adversas relacionadas con el PR006A, cambios en el peso corporal, observaciones oftálmicas ni descubrimientos en exámenes físicos o neurológicos; un examen macroscópico realizado en la necropsia no mostró anormalidades relacionadas con los fármacos en ninguna de las cohortes. Además, no se observaron cambios relacionados con PR006A en el rango PR, la duración de QRS, el intervalo QT, el intervalo QT (QTc) corregido o la frecuencia cardíaca en hombres o personas de ambos sexos a los que se administraron 6,5 × 10<9>o 6,5 × 10<10>vg/g de cerebro. No se observaron formas de onda de ECG anormales ni arritmias durante la evaluación cualitativa de los ECG.
[0417] Biodistribución
[0418] El análisis de biodistribución del transgén PR006A se realizó utilizando un ensayo basado en qPCR. El Día 183, en el grupo de dosis alta (6,5 × 10<10>vg/g de cerebro), se produjo una transducción generalizada en todo el SNC y la periferia, y todos los tejidos examinados dieron positivo en cuanto a la presencia del vector, con un límite de 50 vg/µg de ADN, el límite inferior de cuantificación para el ensayo de qPCR. Los datos de regiones representativas seleccionadas del Día 183 se muestran en la Figura 54A; los datos del Día 30 no se muestran. El Día 30, en el grupo de dosis alta (6,5 × 10<10>vg/g de cerebro), todos los tejidos del SNC examinados dieron positivo para la transducción, con la excepción del putamen. Los tejidos de los animales tratados con la dosis baja (6,5 × 10<9>vg/g de cerebro) dieron positivo en el SNC el Día 183, pero solo el bazo y el hígado fueron positivos en los tejidos periféricos. Además, la única hembra NHP tratada con la dosis alta de PR006A dio positivo en los ovarios el Día 7, y los machos tratados con la dosis alta dieron positivo en los testículos el Día 30 y el Día 183. La transducción de PR006A fue más sólida en el hígado y los tejidos del sistema nervioso, y consistentemente más baja en los demás órganos periféricos examinados. En el cerebro, la transducción vectorial se estabilizó el Día 183 en comparación con el Día 30, lo que demuestra una transducción sólida y duradera del transgén.
[0419] En los NHP que recibieron administración ICM de PR006A, hubo una respuesta inmunitaria alogénica significativa al producto transgénico, la progranulina, y se detectaron anticuerpos antiprogranulina en muestras de suero y líquido cefalorraquídeo recogidas los Días 30 y 183 después del tratamiento; la respuesta inmunitaria indica que la proteína progranulina humana se expresó en los NHP. Los niveles de anticuerpos antifármacos (ADA) se determinaron utilizando tecnologías de inmunoensayo establecidas. Los datos se ilustran en la Figura 54B.
[0420] La expresión de PR006A (GRN) se midió a nivel de ARNm utilizando un ensayo basado en RT-qPCR y a nivel de proteína utilizando un análisis Simple Western™ (Jess). Simultáneamente con los niveles de transducción de PR006A, se observó expresión del transgén mediante mediciones de ARNm utilizando RT-qPCR en regiones cerebrales seleccionadas (Figura 54C), hígado, gónadas, médula espinal y DRG recogidos el Día 183.
[0421] La expresión del transgén se pudo medir en el cerebro y el hígado a ambas dosis de PR006A, y los niveles de expresión fueron tanto dependientes de la dosis como duraderos. En las gónadas, la expresión solo se pudo medir en los machos con la dosis alta; con ambas dosis en las hembras, la expresión se pudo medir el Día 7 y el Día 30, pero no el Día 183. Para confirmar que la progranulina humana se produjo en los NHP tratados, se evaluaron los niveles de proteína en el LCR en una plataforma Simple Western™ (Jess). Los detalles del método se proporcionan en el Ejemplo 14. El método se calificó midiendo los niveles de progranulina en muestras de líquido cefalorraquídeo de pacientes con FTD-GRN y estableciendo que eran aproximadamente la mitad de los niveles medidos en muestras de líquido cefalorraquídeo de controles humanos sanos y de pacientes con FTD sin una mutación enGRN. Los resultados del LCR indican que los niveles de progranulina se elevan de una manera dependiente de la dosis en los animales tratados con dosis bajas y altas de PR006A (Figura 54D). Estos resultados indican que la transducción amplia y eficaz del PR006A en los NHP tras la administración ICM conduce a un aumento de los niveles de progranulina. Las mediciones de la proteína progranulina se centraron en el líquido cefalorraquídeo porque el ensayo Simple Western™ (Jess) no es adecuado para medir los niveles de progranulina en el tejido cerebral debido al alto nivel de bandas de fondo inespecíficas. Los ensayos disponibles actualmente no miden de manera confiable los niveles de progranulina humana derivada de transgenes en los tejidos de NHP debido a los altos niveles de fondo inespecífico. En general, se cree que los niveles de LCR reflejan las concentraciones cerebrales relevantes y son de particular valor como biomarcadores traslacionales a los estudios clínicos.
[0422] Resumen
[0423] No se han encontrado descubrimientos adversos de seguridad ni problemas de toxicidad en ninguno de los estudios no clínicos, incluido un pequeño estudio piloto sin GLP en NHP y un estudio de GLP en NHP hasta el Día 183, que impidan el inicio de un estudio clínico. Los descubrimientos patológicos en el estudio GLP fueron consistentemente mínimos en cuanto a gravedad, con un número bajo de células afectadas en ambos grupos de dosis. No hubo otros descubrimientos adversos durante la vida opost mortemrelacionados con el PR006a.
[0424] Ensayo de fase 1/2 en sujetos humanos con FTD-GRN
[0425] Los sujetos humanos (n=15) se inscribirán en un ensayo abierto del AAV recombinante PR006. Los criterios de inclusión objetivo comprenden: tiene 30-80 años (inclusive), tiene una mutación patógena en el genGRN, se encuentra en un estadio sintomático de la enfermedad y tiene un uso estable de los medicamentos de base antes de la administración del producto en fase de investigación. Cada sujeto recibirá el producto en investigación en forma de una única inyección ICM (intracisternal magna). El ensayo incluirá una lectura de biomarcadores de 3 meses, una lectura clínica de 12 meses y un seguimiento clínico y de seguridad de 5 años. El ensayo analizará: (1) seguridad y tolerabilidad: (2) biomarcadores clave, que incluyen: progranulina, NfL (cadena ligera de neurofilamentos) e IRM volumétrica (resonancia magnética); y (3) Eficacia: CDR más NACC FTLD (Clinical Dementia RatingmásNational Alzheimer's Coordinating Center Frontal Temporal Lobar Dementia); medidas del comportamiento, la cognición, el lenguaje, la función y la calidad de vida (QoL).
[0426] Tabla 12: Ejemplos de enfermedades neurodegenerativas
[0428]
[0430] Tabla 13: Ejemplos de sinucleinopatías
[0433]
[0435] Tabla 14: Ejemplos de tauopatías}
[0438]
[0439] Tabla 15: Ejemplos de enfermedades de almacenamiento lisosómico
[0441]
[0444] Ejemplo 14: Ensayo occidental automatizado para la detección de progranulina en el líquido cefalorraquídeo
[0445] El propósito de este experimento fue cuantificar los niveles proteicos de la progranulina (PGRN) en el líquido cefalorraquídeo (LCR) utilizando la plataforma Western automatizada Jess de ProteinSimple (San José, CA). Este método de ensayo puede utilizarse para analizar muestras de LCR de primates no humanos (NHP). Para determinar los niveles de expresión de la proteína progranulina humana, el producto transgénico de PR006A, se analizaron muestras de LCR de sujetos primates no humanos en una plataforma Simple Western™ (Jess) utilizando un anticuerpo que detecta específicamente la proteína progranulina humana. La plataforma Simple Western™ es una plataforma automatizada de inmunoensayo por transferencia Western basada en capilares, donde todas las etapas, incluyendo la separación de proteínas, la inmunosonda, el lavado y la detección por quimioluminiscencia, se realizan en un cartucho capilar. Las muestras (a una dilución de 4 veces) y el anticuerpo primario contra la progranulina humana (Adipogen PG-359-7, a una dilución de 10 veces), además de los anticuerpos secundarios y todos los tampones fabricados por ProteinSimple, se cargaron en un cartucho personalizado que se usó en la plataforma Jess. El análisis de datos semicuantitativo se realizó automáticamente después de completar cada ciclo, donde los parámetros como la intensidad de la señal, el área de los picos y la relación señal/ruido se calcularon utilizando el instrumento Jess. Para cada muestra individual, se midió el nivel de progranulina como el área máxima de inmunorreactividad al anticuerpo. Todos los análisis se realizaron con muestras con enmascaramiento.
[0446] El ensayo descrito aquí se realizó en muestras de LCR de un estudio en animales primates no humanos. Las muestras de LCR se analizaron para determinar la presencia y los niveles de la proteína progranulina para estudiar la eficacia de la terapia génica utilizando un constructo rAAV (PR006; véase la Figura 64) que codifica la proteína progranulina (PGRN). En este estudio, el excipiente o el PR006 se suministraron a una dosis baja de PR006 (1,8 x 10<10>vg/g de peso cerebral) o a una dosis alta de PR006 (1,8 x 10<11>vg/g de peso cerebral) mediante inyección intracisternal magna (ICM) en animales NHP. Cada grupo consistía en 3 animales. Se sacrificaron nueve animales NHP el Día 180 después de la infección (Tabla 16) y las muestras de LCR se analizaron mediante el ensayo basado en Jess.
[0447] Tabla 16: Resumen de animal NHP con agrupamiento y dosificación
[0450]
[0452] Tabla 17: Materiales para el ensayo Western automatizado
[0454]
[0456] Se siguieron los siguientes procedimientos para llevar a cabo este método:
[0457] Preparación de soluciones madre:
[0458] 1. Preparar una solución de DTT 400 mM añadiendo 40 µl de agua al tubo transparente del módulo de separación EZ Standard Pack. Mezclar suavemente.
[0459] 2. Para preparar la mezcla maestra, añadir 20 µl de tampón de muestra 10X y 20 µl de DTT 400 mM al tubo de mezcla maestra EZ pink. Mezclar suavemente.
[0460] 3. Para preparar la escalera biotinilada, pipetear 20 µl de agua en el tubo de escalera biotinilada EZ clear con una bolita rosa. Mezclar suavemente.
[0461] 4. Preparar la mezcla de luminol y peróxido añadiendo cantidades iguales de cada uno. Para un ciclo, añadir 200 µl de luminol a 200 µl de peróxido.
[0462] 5. Preparar la dilución de anticuerpos primarios (dilución de 10 veces) mezclando 25 µl de anticuerpo primario y 225 µl de diluyente 2 de anticuerpo.
[0463] Preparación de muestras:
[0464] 1. Las muestras se diluyen en tampón de muestra 0,1X. Preparar un tampón de muestra 0,1X añadiendo 10 µl de tampón de muestra 10X a 990 µl de agua.
[0465] 2. Diluir las muestras según sea necesario. Por ejemplo, las muestras de LCR de NHP se diluyeron 4 veces antes de la adición de la mezcla maestra. Añadir 5 µl de LCR de NHP a 15 µl de tampón de muestra 0,1X.
[0466] 3. Preparar las muestras añadiendo 1X de la mezcla maestra a 4X de la muestra. Para ejecutar duplicados técnicos, preparar un total de 15 µl de muestra más la mezcla maestra por muestra. Por ejemplo, añadir 3 µl de mezcla maestra a 12 µl de muestra diluida. Mezclar suavemente.
[0467] 4. Hervir las muestras a 95 °C durante 5 minutos.
[0468] 5. Hacer girar las muestras brevemente con una minicentrífuga de escritorio. Agitar en vórtice antes de cargar la muestra. Cargar los reactivos y las muestras en el cartucho:
[0469] 1. Pipetear todas las muestras según el mapa del cartucho.
[0470] a. Pipetear 15 µl de mezcla de luminol+peróxido en cada pocillo del carril E.
[0471] b. Pipetear 10 µl de estreptavidina en el primer pocillo del carril D.
[0472] c. Pipetear 10 µl de anticuerpo secundario en los 24 pocillos restantes del carril D.
[0473] d. Pipetear 10 µl de dilución de anticuerpos en el primer pocillo del carril C.
[0474] e. Pipetear 10 µl de la dilución del anticuerpo primario en los 24 pocillos restantes del carril C.
[0475] f. Pipetear 10 µl de diluyente de anticuerpos en todos los pocillos del carril B.
[0476] g. Pipetear 10 µl de escalera EZ preparada hasta el primer pocillo del carril A.
[0477] h. Pipetear 5 µl de la solución de muestra y mezcla maestra para duplicar los carriles del carril A.
[0478] 2. Hacer girar el cartucho a temperatura ambiente a 2500 RPM durante 5 minutos.
[0479] Cargar los capilares y el cartucho en el instrumento:
[0480] 1. Cargar los capilares en la ranura. Asegurarse de que la luz se ponga azul.
[0481] 2. Cargar el cartucho hilado en el instrumento.
[0482] 3. Pulsar el botón de inicio cuando la luz azul deje de parpadear en el instrumento.
[0483] La idoneidad del sistema de ensayo se consideró aceptable si el porcentaje de CV (coeficiente de varianza) para los duplicados era ≤ 30 %.
[0484] Antes de utilizar el ensayo para detectar la progranulina en muestras de LCR de NHP, el ensayo se probó como sigue. La calificación de los ensayos de Jess incluyó la evaluación de la linealidad, selectividad y especificidad de la dilución. Se utilizaron muestras de LCR normales de BioIVT para determinar la linealidad de dilución del ensayo de Jess. Las muestras de LCR de pacientes con demencia frontotemporal (FTD) con la mutación PGRN (obtenidas del National Centralized Repository for Alzheimer's Disease and Related Dementias (NCRAD; Indianápolis, Indiana)) se utilizaron para determinar la selectividad y la especificidad del ensayo de Jess.
[0485] Tabla 18: Resumen de resultados
[0487]
[0488]
[0490] Resultados y análisis
[0491] Linealidad de dilución
[0492] La linealidad de dilución de la proteína PGRN detectada mediante Jess se probó en muestras de LCR de individuos normales disponibles en el mercado (BioIVT). Se midieron los niveles endógenos de PGRN en muestras de líquido cefalorraquídeo para determinar la linealidad de la dilución. Se probaron dos individuos en una dilución en serie de 2 veces que varía de 2 a 64 veces.
[0493] La Tabla 19 informó el área máxima de la proteína PGRN a 58 kDa detectada por Jess y los % de diferencias de cada dilución con respecto a la dilución de 16 veces. Los resultados dentro del rango de linealidad aparecen en negrita (con una diferencia de 100 ± 30 %). Se estableció que la linealidad de la dilución estaba dentro de una dilución de 4 a 16 veces. Tabla 19: Linealidad de dilución en muestras de LCR
[0495]
[0497] En resumen, todas las matrices probadas tenían un rango lineal aceptable que aprobaba los criterios de aceptación de un % de diferencia que es del 0 ± 30 %, aunque el tamaño del rango y la cantidad de dilución variaron entre las matrices. Se estableció que la linealidad de la muestra (MRD) era una dilución de 4 veces. Se estableció que la linealidad de la dilución estaba dentro de una dilución de 4 a 16 veces. En la Tabla 20 se muestra un resumen de MRD y del rango de dilución lineal que supera los criterios de aceptación para el LCR.
[0498] Tabla 20: MRD y rango de dilución lineal del LCR
[0501]
[0503] Selectividad y especificidad
[0504] La selectividad y la especificidad de la proteína PGRN detectadas mediante Jess se probaron en muestras de LCR de las muestras de pacientes con FTD PR006 de NCRAD. Se recogieron tres grupos (grupo A, B y C) de muestras de LCR de pacientes con FTD heterocigotos (grupo A), familiares no portadores (grupo B o C) e individuos normales (grupo B o C). Se analizaron seis muestras para cada grupo. Los grupos de muestras se enumeran en la Tabla 16: información de muestras de LCR de pacientes con FTD.
[0505] Las muestras de LCR se diluyeron 4 veces en un tampón de muestra 0,1X proporcionado por ProteinSimple y se probaron en duplicados técnicos. Se volvieron a analizar las muestras duplicadas con un % de CV de resultado superior al 20 %. Los resultados con un % de CV inferior al 20 % se presentan en la Tabla 22. La Tabla 22 informó del área máxima de la proteína PGRN a 58 kDa detectada mediante Jess y el % de CV entre duplicados. Los resultados mostraron niveles de PGRN aproximadamente dos veces más altos en los grupos B y C en comparación con el grupo A, lo que indica la selectividad y especificidad del ensayo de Jess para determinar los niveles de PGRN en muestras de LCR (Figura 55).
[0506] Tabla 21: Información sobre muestras de LCR de pacientes con FTD
[0508]
[0511] Tabla 22: Resultados de selectividad y especificidad
[0513]
[0514]
[0516] Las muestras de LCR de un estudio de pacientes con FTD (Tabla 21) también se analizaron con un kit de ELISA de PGRN humana (Adipogen, AG-45A-0018YEK-KI01). Los resultados de ELISA (Figura 56) mostraron tendencias similares de los niveles de PGRN entre los grupos a las de Jess y demostraron que el ensayo de Jess es adecuado para su uso en la evaluación de los niveles de PGRN en muestras de LCR.
[0517] En conclusión, se determinó que este ensayo Western Jess automatizado de ProteinSimple era adecuado para su uso en la evaluación de los niveles de PGRN en muestras de LCR de NHP.
[0518] Los datos de Jess para las muestras de LCR de NHP se muestran en la Tabla 23. Cada muestra representa el promedio de dos réplicas técnicas. Se indica el área del pico para la banda de 58 kDa en el carril de muestreo. Los datos se presentan como área del pico media de la réplica técnica y se ajustan las multiplicidades de dilución.
[0519] Tabla 23: Datos de Jess para las muestras de LCR de NHP
[0522]
[0524] El objetivo de este ensayo era confirmar el nivel de expresión de la proteína progranulina (PGRN) tras la transducción de PR006 en las regiones tisulares de interés para el estudio de NHP. Esto se hizo utilizando una plataforma occidental automatizada, en donde se detectó la proteína progranulina utilizando un anticuerpo monoclonal. La expresión de progranulina se pudo medir en el LCR tanto en NHP de control como tratados con PR006; el ensayo no diferencia entre la proteína progranulina endógena y la proteína progranulina inducida por PR006A.
[0525] Esta Solicitud hace referencia a los siguientes documentos: N.º de publicación de Solicitud PCT Internacional WO 2019/070893; N.º de publicación de Solicitud PCT Internacional WO 2019/070891; Solicitud provisional US- con números de serie 62/567.296, presentada el 3 de octubre de 2017, titulada “GENE THERAPIES FOR LYSOSOMAL DISORDERS”; 62/567.311, presentada el 3 de octubre de 2017, titulada “GENE THERAPIES FOR LYSOSOMAL DISORDERS”; 62/567.319, presentada el 3 de octubre de 2017, titulada “GENE THERAPIES FOR LYSOSOMAL DISORDERS”; 62/567.301, presentada el 3 de octubre de 2018, titulada “GENE THERAPIES FOR LYSOSOMAL DISORDERS”; 62/567.310, presentada el 3 de octubre de 2017, titulada “GENE THERAPIES FOR LYSOSOMAL DISORDERS”; 62/567.303, presentada el 3 de octubre de 2017, titulada “GENE THERAPIES FOR LYSOSOMAL DISORDERS”; y 62/567.305, presentada el 3 de octubre de 2017, titulada “GENE THERAPIES FOR LYSOSOMAL DISORDERS”.
[0526] Si bien en la presente memoria se han descrito e ilustrado varias realizaciones de la presente invención, los expertos en la técnica imaginarán fácilmente una variedad de otros medios y/o estructuras para realizar las funciones y/u obtener los resultados y/o una o más de las ventajas descritas en la presente memoria, y se considera que cada una de tales variaciones y/o modificaciones está dentro del alcance de la presente invención. Más generalmente, los expertos en la técnica apreciarán fácilmente que todos los parámetros, dimensiones, materiales y configuraciones descritos en la presente memoria pretenden ser ilustrativos y que los parámetros, dimensiones, materiales y/o configuraciones reales dependerán de la aplicación o aplicaciones específicas para las que se utilicen las enseñanzas de la presente invención. Los expertos en la técnica reconocerán, o podrán determinar, utilizando únicamente la experimentación rutinaria, muchos equivalentes a las realizaciones específicas de la invención descritas en la presente memoria. Por lo tanto, debe entenderse que las realizaciones anteriores se presentan únicamente a modo de ejemplo y que, dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas y sus equivalentes, la invención puede ponerse en práctica de otro modo que no sea el descrito y reivindicado específicamente. La presente invención se refiere a cada característica, sistema, artículo, material y/o método individual descrito en la presente memoria. Además, cualquier combinación de dos o más de tales características, sistemas, artículos, materiales y/o métodos, si tales características, sistemas, artículos, materiales y/o métodos no son inconsistentes entre sí, se incluye dentro del alcance de la presente invención.
[0528] Los artículos indefinidos “un/uno” y “una”, como se utilizan en la presente memoria en la memoria descriptiva y en las reivindicaciones, a menos que se indique claramente lo contrario, deben entenderse en el sentido de “al menos uno”.
[0529] El término “y/o”, como se utiliza en la presente memoria en la memoria descriptiva y en las reivindicaciones, debe entenderse en el sentido de “uno o ambos” de los elementos así unidos, es decir, elementos que están presentes de forma conjunta en algunos casos y presentes de forma disyuntiva en otros casos. Opcionalmente, pueden estar presentes otros elementos distintos de los elementos identificados específicamente por la cláusula “y/o”, ya sea que estén relacionados o no con los elementos identificados específicamente a menos que se indique claramente lo contrario. Por lo tanto, como ejemplo no limitativo, una referencia a “A y/o B”, cuando se utiliza junto con un lenguaje abierto, tal como “que comprende”, puede referirse, en una realización, a A sin B (opcionalmente, incluyendo elementos distintos de B); en otra realización, a B sin A (incluyendo opcionalmente elementos distintos de A); en aun otra realización, tanto a A como a B (incluyendo opcionalmente otros elementos);etc.
[0531] Como se utiliza en la presente memoria en la memoria descriptiva y en las reivindicaciones, debe entenderse que “o” tiene el mismo significado que “y/o” tal como se ha definido anteriormente. Por ejemplo, al separar los elementos de una lista, “o” o “y/o” se interpretarán como inclusivos, es decir, que incluyen al menos uno, pero también incluyen más de uno, de un cierto número o lista de elementos y, opcionalmente, elementos adicionales no enumerados. Solo los términos que indiquen claramente lo contrario, tales como “solo uno de” o “exactamente uno de” o, cuando se utilizan en las reivindicaciones, “que consiste en”, se referirán a la inclusión de exactamente un elemento de un cierto número o lista de elementos. Generalmente, el término “o”, como se utiliza en la presente memoria, solo se interpretará en el sentido de que indica alternativas exclusivas (es decir, “uno u otro pero no ambos”) cuando vaya precedido de términos de exclusividad, tales como “uno cualquiera de”, “solo uno de” o “exactamente uno de”.
[0532] Como se utiliza en la presente memoria en la memoria descriptiva y en las reivindicaciones, la frase “al menos uno”, en referencia a una lista de uno o más elementos, debe entenderse como que significa al menos un elemento seleccionado de uno o más cualesquiera de los elementos de la lista de elementos, pero que no necesariamente incluye al menos uno de todos y cada uno de los elementos enumerados específicamente en la lista de elementos, ni excluye ninguna combinación de elementos de la lista de elementos. Esta definición también permite que, opcionalmente, puedan estar presentes elementos distintos de los elementos identificados específicamente en la lista de elementos a los que se refiere la frase “al menos uno”, ya sea relacionados o no con los elementos específicamente identificados. Por lo tanto, como ejemplo no limitativo, “al menos uno de A y B” (o, de manera equivalente, “al menos uno de A o B” o, de manera equivalente, “al menos uno de A y/o B”) puede referirse, en una realización, a al menos uno, que opcionalmente incluye más de uno, A, sin B presente (y que opcionalmente incluye elementos distintos de B); en otra realización, a al menos uno, que opcionalmente incluye más de uno, B, sin A presente (y que opcionalmente incluye elementos distintos de A); en aun otra realización, a al menos uno, que opcionalmente incluye más de uno, A, y al menos uno, que opcionalmente incluye más de uno, B (y que opcionalmente incluye otros elementos);etc.
[0533] El uso de términos ordinales tales como “primero”, “segundo”, “tercero”,etc.,en las reivindicaciones para modificar un elemento de la reivindicación no implica por sí solo ninguna prioridad, precedencia u orden de un elemento de la reclamación sobre otro ni el orden temporal en donde se realizan los actos de un método, sino que se utilizan simplemente como etiquetas para distinguir un elemento de la reivindicación que tiene un nombre determinado de otro elemento que tiene el mismo nombre (pero para el uso del término ordinal) para distinguir los elementos de la reivindicación.
[0535] También debe entenderse que, a menos que se indique claramente lo contrario, en cualquier método reivindicado en la presente memoria que incluya más de un paso o acción, el orden de los pasos o acciones del método no se limita necesariamente al orden en el que se enumeran los pasos o acciones del método.

Claims (14)

1. REIVINDICACIONES
1. Un virus adenoasociado recombinante (rAAV) que comprende:
(i) un vector rAAV que comprende un ácido nucleico que comprende un constructo de expresión que comprende un promotor unido operativamente a un inserto transgén que codifica una proteína progranulina (PGRN), en el que el inserto transgén comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 68; y (ii) una proteína de la cápside del AAV9,
para su uso en el tratamiento de un sujeto que tiene o se sospecha que tiene demencia frontotemporal con una mutación enGRN.
2. Un rAAV para su uso según la reivindicación 1, en el que el rAAV se administra al sujeto a una dosis que varía de aproximadamente 1 × 10<13>genomas vectoriales (vg) a aproximadamente 7 × 10<14>vg.
3. Un rAAV para su uso según la reivindicación 1 o 2, en el que el rAAV se administra mediante una inyección en la cisterna magna.
4. Un rAAV para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que el promotor es un promotor de beta actina de pollo (CBA).
5. Un rAAV para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el que el vector rAAV comprende además un potenciador del citomegalovirus (CMV).
6. Un rAAV para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en el que el vector rAAV comprende además un elemento regulador postranscripcional del virus de la hepatitis de marmota (WPRE).
7. Un rAAV para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en el que el vector rAAV comprende además una cola de señal poliA de la hormona del crecimiento bovina.
8. Un rAAV para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en el que el ácido nucleico comprende dos secuencias de repeticiones terminales invertidas (ITR) de virus adenoasociados que flanquean el constructo de expresión, preferiblemente, en el que cada secuencia de ITR es una secuencia de ITR del AAV2 de tipo silvestre.
9. Un rAAV para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en el que el vector rAAV comprende además una región TRY entre la ITR 5' y el constructo de expresión, en el que la región TRY comprende la SEQ ID NO: 28.
10. Un rAAV que comprende:
(i) un vector rAAV que comprende un ácido nucleico que comprende, en orden de 5' a 3':
(a) una ITR de AAV2;
(b) un potenciador del CMV;
(c) un promotor de CBA;
(d) un inserto transgén que codifica una proteína PGRN, en el que el inserto transgén comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 68;
(e) un WPRE;
(f) una cola de señal poliA de la hormona del crecimiento bovina; y
(g) una ITR de AAV2; y
(ii) una proteína de la cápside del AAV9,
para su uso en el tratamiento de un sujeto que tiene o se sospecha que tiene demencia frontotemporal con una mutación enGRN.
11. Un rAAV para su uso según la reivindicación 10, en el que el rAAV se administra al sujeto a una dosis que varía de aproximadamente 1 × 10<13>vg a aproximadamente 7 × 10<14>vg.
12. Un rAAV para su uso según la reivindicación 10 u 11, en el que el rAAV se administra mediante una inyección en la cisterna magna.
13. Un rAAV para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1-12, en el que el rAAV se administra en una formulación que comprende Tris aproximadamente 20 mM, pH 8,0, MgCl<2>aproximadamente 1 mM, NaCl aproximadamente 200 mM y poloxámero 188 aproximadamente al 0,001 % p/v.
14. Una composición farmacéutica que comprende
(i) un rAAV que comprende:
(a) un vector rAAV que comprende un ácido nucleico que comprende un constructo de expresión que comprende un promotor unido operativamente a un inserto transgén que codifica una proteína PGRN, en el que el inserto transgén comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 68; y (b) una proteína de la cápside del AAV9; y
(ii) Tris aproximadamente 20 mM, pH 8,0,
(iii) MgCl<2>aproximadamente 1 mM,
(iv) NaCl aproximadamente 200 mM y
(v) poloxámero 188 aproximadamente al 0,001 % p/v.
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