ES3040807T3

ES3040807T3 - Compact reverse flow centrifuge system

Info

Publication number: ES3040807T3
Application number: ES18798992T
Authority: ES
Inventors: Ian Fitzpatrick; David James; Stephen Wilson
Original assignee: Scinogy Products Pty Ltd
Current assignee: Scinogy Products Pty Ltd
Priority date: 2017-05-12
Filing date: 2018-05-11
Publication date: 2025-11-04
Anticipated expiration: 2038-05-11
Also published as: AU2018265771A1; CN110621410B; IL270502B1; KR20200007027A; US12048937B2; SG11201910131YA; IL270502A; EP3621744A1; EP3621744C0; JP7248324B2; NZ758286A; US20250025892A1; AU2018265771B2; JP2020519419A; CA3060604A1; EP3621744B1; EP3621744A4; IL270502B2; KR102657962B1; US20200297911A1

Abstract

Se proporciona una configuración de cámara para una centrífuga de flujo inverso y un sistema de centrífuga de flujo inverso configurado para bajo volumen de fluido y rotación de pequeño radio. El sistema compacto de centrífuga de flujo inverso cuenta con un subsistema reutilizable y un subsistema reemplazable de un solo uso. El subsistema reemplazable comprende una cámara de separación, un colector de suministro de fluido y un soporte giratorio que conecta la cámara de separación con el colector de fluido. El subsistema reemplazable de un solo uso proporciona un entorno cerrado para la ejecución de procesos de centrifugación de flujo inverso. La cámara de separación tiene una sección de contención de fluido sustancialmente cónica conectada a una sección de cuello, y un tubo de inmersión se extiende centralmente a través de la sección de contención de fluido para proporcionar una trayectoria de fluido hasta la punta de la misma. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Sistema centrífugo compacto de flujo inverso

Campo técnico

El campo técnico de la invención es el aparato de centrífuga para aplicaciones biológicas y otras aplicaciones de separación de partículas pequeñas.

Antecedentes

La medicina regenerativa y las terapias celulares avanzadas son tecnologías terapéuticas médicas emergentes que se basan en la manipulación de células vivas de origen humano para crear constructos, generar respuestas inmunogénicas o estimular las respuestas de reparación en el cuerpo del paciente. Si bien algunas de estas técnicas pueden administrar muchas dosis a varios pacientes a partir de una sola fuente de células (productos alogénicos), cada vez se reconoce más que el procesamiento y la administración de células derivadas del paciente o de un donante compatible, son seguros y eficaces. Para producir productos celulares específicos para pacientes o donantes compatibles (productos autólogos), normalmente se requiere un procesamiento en lotes pequeños.

Para obtener la aprobación reglamentaria y hacer que las terapias celulares estén ampliamente disponibles para los pacientes, es necesario que el equipo y el proceso utilizados para preparar los productos celulares se consideren seguros y fiables, además de demostrar la seguridad y eficacia de la terapia en particular. Un sistema cerrado específico para un producto ofrece muchas ventajas para la producción de productos celulares. Dichos sistemas están diseñados para una función dedicada, es decir, un único proceso de producción para un producto celular específico o un conjunto de productos celulares derivados del proceso de producción único. Tales sistemas cerrados para una función dedicada están diseñados para ofrecer un entorno de procesamiento aséptico para el producto médico mediante una estrecha trazabilidad de los materiales y protocolos de esterilización cualificados. Los sistemas de procesamiento aséptico de un solo uso se ensamblan utilizando una gama de componentes desechables comunes (de un solo uso), tal como bolsas y tubos de fluido, etc. El ensamblaje de estos componentes desechables del sistema puede ser complicado y llevar mucho tiempo.

Los sistemas para productos específicos diseñados para productos alogénicos, normalmente manejan lotes relativamente grandes y es posible que no se escalen fácilmente a productos autólogos, donde pueden estar involucradas cantidades muy pequeñas de productos de entrada y salida. Existe la necesidad de sistemas cerrados que puedan utilizarse para la producción de productos celulares en pequeños lotes para terapias celulares autólogas.

Una etapa típica en la producción de los productos celulares utilizados en las terapias celulares, es el lavado y la separación de los componentes de los productos celulares mediante centrifugación. Las técnicas de centrifugación tradicionales requieren que un recipiente con el producto se transfiera manualmente dentro y fuera de un dispositivo de centrifugación separado. Acceder al recipiente para añadir o retirar el producto requiere abrir el recipiente como paso de proceso abierto o acoplarlo y desconectarlo a una vía aséptica. La centrifugación de flujo inverso con flujo de fluido integrado a través del sistema de rotación, se puede utilizar para evitar estas interacciones.

La centrifugación de flujo inverso es una técnica mediante la cual la velocidad de sedimentación de las partículas en un fluido bajo aceleración centrífuga se contrarresta mediante un flujo del medio de soporte. De este modo, las partículas se suspenden como un lecho fluidizado. La centrifugación de flujo inverso es tan suave que las células se pueden cultivar, expandiéndose en el estado de lecho fluidizado. La agregación celular se puede reducir drásticamente. Además, esta técnica permite separar las células muertas de las células vivas debido a las diferentes características de densidad y morfología, lo que hace que la centrifugación de flujo inverso sea la única tecnología disponible actualmente para aumentar la viabilidad de una población celular.

El suministro de un flujo de fluido radial hacia el interior de las células o partículas bajo aceleración centrífuga crea una situación de contraflujo. La aceleración centrífuga experimentada por cada partícula es proporcional a la distancia radial de esa partícula desde el centro de rotación. Para crear un lecho de partículas fluidizadas, es necesario ajustar el caudal de contraflujo para cada radio de rotación. Esto se consigue dando forma a la cámara, normalmente en forma de cono, con la punta del cono apuntando radialmente hacia fuera. El contraflujo se introduce a través de la punta del cono. El flujo de fluido entra en la punta del cono a una velocidad relativamente alta, y la velocidad del flujo de fluido se reduce progresivamente a medida que avanza radialmente hacia adentro debido al aumento de la sección transversal del cono. Históricamente, se ha investigado ampliamente acerca de las formas de las cámaras y las geometrías cónicas específicas para la centrifugación de flujo inverso; gran parte de este trabajo está documentado en el artículo de R. J. Sanderson, K. E. Bird, N. F. Palmer y J. Brenman: “ Design Principles for a Counter Flow Centrifugation Cell Separation Chamber” , Analytical Biochemistry 71,615-622 (1976).

El documento WO 2017/062176 describe una centrífuga de contraflujo de tipo cuerda de saltar con cámaras de separación formadas en una placa, con canales de suministro de fluido también formados en la placa, externos a las cámaras, que se conectan a cada extremo de las cámaras. Un conjunto de mango sostiene la placa y el umbilical para facilitar la inserción de este conjunto en una unidad motora. El motor hace girar todo el conjunto y se impulsa de tal modo que el umbilical tipo cuerda de saltar gire a la mitad de la velocidad de las cámaras de separación.

El documento WO 2011/044237 describe una centrífuga de contraflujo tipo cuerda de saltar con rutas separadas en el umbilical que gira con el conjunto de cámara de separación.

El documento DE 2701976 describe dos cámaras de fluido flexibles lobuladas conectadas que están soportadas en un marco para girar en una centrífuga de contraflujo. Una de las realizaciones proporciona una estructura de suministro con tubos internos para el suministro de fluido a las cámaras flexibles, hacia las puntas exteriores de las cámaras flexibles, desde un puerto en la parte superior de las cámaras, con un puerto de salida de fluido en la parte inferior de las cámaras.

El documento US-2014/0234829 describe una centrífuga de contraflujo tipo cuerda de saltar que utiliza cámaras flexibles soportadas en un marco, que se hace girar en conjunto con el umbilical tipo cuerda de saltar. Algunas realizaciones incluyen tubos que se extienden desde el umbilical hasta la cámara flexible.

La centrifugación de flujo inverso tiene muchas ventajas y se utiliza actualmente en varios sistemas cerrados de funciones dedicadas disponibles en el mercado. Sin embargo, los dispositivos existentes en el mercado son caros de adquirir como instrumentos. Los kits de componentes desechables para dichos sistemas también suelen tener un coste elevado. Operar estos dispositivos también puede ser problemático, ya que los kits desechables suelen ser complejos de cargar, lo que conlleva un alto riesgo de error humano y un funcionamiento incorrecto. Además, muchos de los dispositivos disponibles actualmente tienen una flexibilidad limitada en la configuración del protocolo y del kit para su aplicación a protocolos novedosos de productos celulares. La fabricación de productos médicos complejos en lotes para cada paciente está creando una demanda de dispositivos que puedan manipular productos celulares en sistemas funcionalmente cerrados de un solo uso. Por lo tanto, existe la necesidad de un equipo que pueda utilizarse de forma segura y fiable para el procesamiento en pequeños lotes de un solo uso para permitir la producción de dichos productos celulares específicos para el paciente.

Resumen de la invención

Según un aspecto, se proporciona un sistema centrífugo compacto de flujo inverso tal como se define en la reivindicación 1.

En algunas realizaciones, la primera ruta de comunicación de fluido desde el tubo de inmersión hasta el primer puerto de fluido, se alinea con el eje de rotación a través del acoplamiento giratorio. En una realización, la primera ruta de comunicación de fluido puede proporcionarse mediante un tubo a través de un eje del acoplamiento giratorio.

En algunas realizaciones, la ruta del fluido de elución a través del cuello comprende al menos una ruta de fluido desde el recinto cónico de fluido hasta la ruta de elución en la parte del cuello en comunicación de fluido con la segunda ruta de comunicación de fluido a través del acoplamiento giratorio.

En una realización, la cámara de separación incluye una pared que separa el recinto cónico de fluido de la parte de cuello, teniendo la pared una o más aberturas en la misma formadas para proporcionar la al menos una ruta de fluido hacia la ruta de elución en el cuello.

Las realizaciones pueden comprender además una pluralidad de rutas de fluido desde la ruta del fluido de elución en la parte de cuello a través del acoplamiento giratorio en comunicación de fluido con la segunda ruta de comunicación de fluido.

Se proporcionan realizaciones de un sistema centrífugo compacto de flujo inverso en donde la punta del recinto cónico de fluido incluye una estructura de canalización de fluido que está configurada para provocar la dispersión del fluido introducido por medio del tubo de inmersión a través del recinto cónico de fluido. La estructura de canalización de fluido se puede formar además para mantener el tubo de inmersión en una posición operativa.

En algunas realizaciones, la parte de cono del recinto cónico de fluido tiene una construcción unitaria, por lo que se evitan las uniones en las regiones de máxima aceleración centrífuga.

Las realizaciones se pueden configurar adicionalmente en donde el conjunto de válvulas comprenda un conjunto de accionamiento de la válvula de pinza que comprende una pluralidad de actuadores de válvula de pinza, cada actuador de válvula de pinza configurado para acoplarse a una ruta de fluido del colector, y en donde el colector de suministro de fluido incluye en cada ruta de fluido al menos una parte flexible alineada con uno de los actuadores de la válvula de pinza, por lo que el funcionamiento del actuador de válvula de pinza provoca la apertura o el cierre de la ruta del fluido.

En algunas realizaciones, el colector de suministro de fluido se configura mediante el accionamiento de válvulas y el acoplamiento de recipientes con conexiones de fluido adecuadas para permitir la configuración selectiva de una ruta recirculante de fluido para el establecimiento del lecho fluidizado en la cámara desde el recipiente de suministro de suspensión celular, sin riesgo de pérdidas celulares sistemáticas.

En algunas realizaciones, el colector de suministro de fluido se configura para alinear la parte de acoplamiento de la bomba con la bomba peristáltica cuando el colector está colocado en la carcasa y en el caso de que la carcasa esté configurada para efectuar el acoplamiento operativo de la parte de acoplamiento de la bomba con la bomba peristáltica cuando la carcasa esté cerrada. Por ejemplo, la carcasa puede configurarse de tal modo que la geometría relativa de una puerta de la carcasa y una bisagra de puerta de caja recoja un tubo de la parte de acoplamiento de la bomba para que se acople con los rodillos de la bomba peristáltica para efectuar el acoplamiento operativo con la bomba peristáltica.

Las realizaciones se pueden configurar para un funcionamiento con un radio de rotación bajo y una velocidad de rotación elevada.

En una realización, el sistema centrífugo de flujo inverso se configura para funcionar a velocidades de rotación de hasta 8000 revoluciones por minuto. En esta realización, el recinto cónico de fluido puede tener un volumen de 5 ml a 20 ml. En una realización, el recinto cónico de fluido tiene un volumen de 10 ml. El sistema centrífugo de flujo inverso puede tener un radio de rotación de la punta de 50 a 70 mm. El radio de rotación del eje hasta la punta puede ser de 67 mm. En una realización, la cámara de separación tiene un diámetro de cono de 33 mm y una altura de cono de 38 mm. Una realización puede configurarse para su uso en terapias celulares para permitir la recuperación del volumen de fluido de 2 ml a 10 ml, con la recuperación de hasta 10 millones a 2 mil millones de células dentro de estos volúmenes.

En otra realización, el sistema centrífugo compacto de flujo inverso se configura para funcionar a velocidades de rotación de hasta 200.000 revoluciones por minuto. En esta realización, el recinto cónico de fluido puede tener un volumen de 0,1 ml a 0,5 ml. En una realización, el recinto cónico de fluido tiene un volumen de 0,2 ml. En una realización, el sistema centrífugo de flujo inverso tiene un radio de rotación de la punta de 10 a 30 mm. Esta realización puede utilizarse para abordar la concentración de exozomas (escala de 40 a 200 nm) y microvesículas (escala de 150 a 1000 nm). Las micropartículas se suministran directamente a la región sedimentada en la punta, lo que evita el largo tiempo de sedimentación requerido por la ultracentrifugación.

También se prevén realizaciones que tengan volúmenes en el recinto de fluido en el intervalo de 0,5 a 5 ml. También se prevén realizaciones que tengan un radio de rotación de la punta en el intervalo de 30 a 50 mm.

Según otro aspecto, se dispone una cámara de separación para un sistema centrífugo compacto de flujo inverso, tal como se define en la reivindicación 11.

La primera ruta de comunicación de fluido puede ir desde el tubo de inmersión hasta el primer puerto de fluido alineado con el eje de rotación a través del acoplamiento giratorio. La primera ruta de comunicación de fluido puede disponerse mediante un tubo a través de un eje del acoplamiento giratorio. El tubo puede formar parte del eje en algunas realizaciones.

En una realización, la ruta de fluido de elución comprende al menos una ruta de fluido desde el recinto cónico de fluido hasta la ruta de elución en la parte de cuello, en comunicación de fluido con la segunda ruta de comunicación de fluido a través del acoplamiento giratorio.

En una realización, la cámara de separación incluye una pared que separa el recinto cónico de fluido de la parte de cuello, teniendo la pared una o más aberturas formadas en la misma para proporcionar las una o más rutas de fluido hasta la ruta de elución en el cuello.

Breve descripción de los dibujos

Una realización, que incorpora todos los aspectos de la invención, se describirá ahora solo a manera de ejemplo, con referencia a los dibujos adjuntos, en los cuales

las figuras 1a y 1b muestran ejemplos de dos sistemas centrífugos alternativos de flujo inverso según realizaciones de la presente invención;

la figura 1 c muestra un ejemplo de los componentes del sistema ensamblados dentro de la carcasa para la realización de la figura 1a;

la figura 1 d muestra por separado el subsistema reutilizable y un subsistema (kit) reemplazable de un solo uso para la realización de la figura 1b;

la figura 2 muestra una realización de la cámara de separación;

la figura 3a ilustra los conceptos fundamentales implicados en un proceso de centrifugación de flujo inverso;

la figura 3b ilustra esquemáticamente características geométricas clave de la cámara de separación;

la figura 3c muestra la fuerza aplicada a una partícula para un tamaño de partícula a una velocidad (de suministro de fluido) de bomba y velocidad de rotación establecidas;

la figura 3d es un diagrama de flujo de un ejemplo simple de un proceso de separación que utiliza una centrífuga de flujo inverso;

las figuras 3e y 3f son representaciones esquemáticas de ejemplos de funcionamiento del sistema y flujo de fluido durante el procesamiento;

las figuras 4a a 4f ilustran una realización de una estructura de canalización de fluido formada en la punta de la cámara de separación;

la figura 5 muestra una realización del acoplamiento giratorio;

la figura 6 muestra un ejemplo de la cámara de separación y el colector en una posición operativa en la carcasa de la centrífuga de flujo inverso;

la figura 7 muestra un ejemplo del colector de suministro de fluido;

las figuras 8a y 8b muestran ejemplos de conjuntos de accionamiento de válvulas para las realizaciones del sistema mostradas en las figuras 1a y 1b, respectivamente;

la figura 9 ilustra un proceso de formación de colectores;

la figura 10 ilustra un ejemplo de una interfaz de bomba; y

la figura 11 es un diagrama de bloques ejemplar de los componentes de una realización del sistema.

Descripción detallada

Las realizaciones de la presente invención proporcionan un sistema centrífugo de flujo inverso configurado para un bajo volumen de fluido y un pequeño radio de rotación. Las realizaciones del sistema tienen aplicaciones para el procesamiento a pequeña escala con un protocolo automatizado. Una ventaja del bajo volumen de fluido y el pequeño radio de rotación es que el sistema puede utilizar elevadas velocidades de rotación para aumentar la velocidad de procesamiento de pequeños lotes. El sistema puede configurarse para operación de banco o incorporarse como un componente de un sistema más complejo. Esto puede ser ventajoso para obtener la aprobación reglamentaria para los productos médicos producidos utilizando el sistema. La tecnología de proceso se puede implementar de manera idéntica en un proceso integrado para la fabricación comercial, lo que garantiza la bioequivalencia a los investigadores reglamentarios durante todo el desarrollo clínico. El sistema puede proporcionar un entorno de procesamiento aséptico cerrado para productos médicos mediante el uso de la trazabilidad de los materiales y protocolos de esterilización cualificados.

En las figuras 1a y 1b se ilustra una realización de un sistema centrífugo compacto de flujo inverso. La figura 1c muestra una vista de una carcasa que aloja los componentes ensamblados del sistema de la realización de la figura 1 a. La figura 1 d muestra por separado el subsistema reutilizable 1200 y el kit 1205 de un solo uso para la realización de la figura 1b. Se han utilizado los mismos números de referencia en todas las figuras 1a a 1d. Los componentes del sistema también se ilustran en la figura 12 en forma de diagrama de bloques. El sistema 100 centrífugo compacto de flujo inverso tiene un subsistema reutilizable 1200 y un subsistema 1205 reemplazable de un solo uso. El subsistema reemplazable comprende componentes desechables que pueden preensamblarse y esterilizarse para su carga, lo que simplifica los protocolos de carga. Un preemsablado adicional puede reducir el riesgo de error humano. Esto también puede ofrecer bajos costes operativos al reducir el tamaño y la complejidad de los componentes desechables, en comparación con los kits de componentes desechables comerciales actuales.

El subsistema reutilizable comprende un controlador, un cabezal 135 de motor giratorio, una bomba peristáltica 110 y un conjunto 120 de válvulas, una carcasa 130 aloja estos componentes del sistema. El subsistema reemplazable comprende una cámara 140 de separación, un colector 150 de suministro de fluido y un acoplamiento giratorio 160 que conecta la cámara 140 de separación al colector 150 de fluido. El subsistema reemplazable de un solo uso proporciona un entorno cerrado para la ejecución de los procesos de centrifugación de flujo inverso.

La cámara 140 de separación está configurada para un bajo volumen de fluido y un pequeño radio de rotación. Un ejemplo de una realización de la cámara de separación se ilustra en la figura 2. La cámara 140 de separación tiene una parte 210 de recinto de fluido sustancialmente cónica conectada a una parte 220 de cuello. Un tubo de 230 inmersión se extiende centralmente a través del recinto 210 cónico de fluido desde la punta cónica 240 a través del cuello 220 para proporcionar una ruta 250 de fluido hasta la punta del recinto 240 cónico de fluido. La parte 220 de cuello también incluye una ruta 260 de fluido de elución. La parte 220 de cuello también está configurada para acoplarse al cabezal del motor giratorio para provocar la rotación de la cámara de separación alrededor del eje de rotación. La parte de cuello también está configurada para acoplarse al cabezal 135 del motor, que también puede incluir un mecanismo de bloqueo y estar contrapesada para equilibrar la cámara de separación.

El colector 150 de suministro de fluido comprende un primer puerto 170 de fluido y un segundo puerto 175 de fluido configurados para la comunicación de fluido con la cámara 140 de separación, y una pluralidad de rutas de fluido configuradas para la conexión a los componentes 180 externos de suministro de fluido para el suministro de fluido a, o desde, el primer puerto 170 de fluido y el segundo puerto 175 de fluido. Al menos una de las rutas de fluido está configurada para su conexión al conjunto 120 de válvulas para su apertura o cierre selectivo mediante la operación del conjunto de válvulas. El colector también incluye una parte 190 de acoplamiento de la bomba configurada para permitir el acoplamiento operable entre la bomba peristáltica 110 y las rutas 180 de fluido para ocasionar el flujo de fluido dentro del colector 150 mediante la operación de la bomba peristáltica 110.

Un acoplamiento giratorio 160 conecta la cámara 140 de separación al colector 150 de suministro de fluido. El acoplamiento giratorio está configurado para permitir la rotación de la cámara 140 de separación alrededor de un eje de rotación con respecto al colector 150 de suministro de fluido, mientras el colector de suministro de fluido se mantiene en una posición fija por la carcasa 130. Este acoplamiento giratorio 160 también proporciona una primera ruta 270 de comunicación de fluido entre el tubo 230 de inmersión y el primer puerto 170 de fluido, y una segunda ruta 275 de comunicación de fluido entre la ruta 260 de fluido de elución y el segundo puerto 175 de fluido.

Una ventaja del sistema es que se pueden utilizar los mismos componentes de sistema y la misma funcionalidad de procesamiento en una configuración tipo laboratorio que en un sistema de producción comercial a gran escala.

La configuración de la cámara de separación permite un radio de rotación pequeño y una alta velocidad de rotación. Un ejemplo de la cámara de separación se muestra en la figura 2, la cámara 140 de separación comprende un recinto 210 de fluido sustancialmente cónico y una parte 220 de cuello. Debe apreciarse que, aunque la realización mostrada utilizó un recinto 210 cónico de fluido, es posible que las realizaciones no siempre usen un cono perfecto; se contempla alguna variación en esta estructura dentro del alcance de la presente invención, por ejemplo, se puede utilizar una porción corta de lados rectos cerca del extremo ancho del cono o en la punta, alternativamente, se puede utilizar una estructura cónica escalonada. Un tubo 230 de inmersión se extiende a través del recinto 210 de fluido desde el cuello, para el suministro de fluido a la punta 240 del cono. Se proporciona una ruta 260 de elución a través del cuello 220 y el acoplamiento giratorio 160.

Debe entenderse que el uso de un tubo 230 de inmersión interno es una divergencia significativa con respecto a la arquitectura comercial de centrifugación de flujo inverso, lo que ofrece una ruta de fluido externa a la cámara de separación, y la cámara de separación tiene una entrada en la punta para suministrar el contraflujo de fluido a la cámara de separación. El tubo de inmersión interno y el acoplamiento giratorio permiten reducir el tamaño de los componentes giratorios, en comparación con los sistemas anteriormente conocidos, que requieren rutas de fluido externas hasta la punta de la cámara. Esto permite girar a velocidades más elevadas creando una fuerza centrífuga más alta que los sistemas de ruta de fluido externos, lo que resulta en un rendimiento relativamente elevado para el tamaño de la cámara. Por lo tanto, una ventaja de las realizaciones de la presente cámara de separación es que permite utilizar una sola cámara para procesar un típico tamaño de lote para terapias celulares autólogas. Esto puede ofrecer ventajas en cuanto a reducir los costes de proporcionar dichos tratamientos. Además, poder operar utilizando una fuerza centrífuga más alta también permite los aumentos correspondientes en los intervalos operativos de caudal, lo que aumenta la capacidad de optimizar los ajustes para aislar tipos de células discretos. Las realizaciones permiten una amplia gama de velocidades y caudales de centrífuga, lo que permite la selección del caudal en función del tipo de célula.

La amplia capacidad de intervalos de velocidad de la centrífuga, en una realización, de 50 G a 3000 G (calculada en el radio correspondiente a 1/3 de la altura del cono desde la punta del cono) permite una amplio intervalos de caudales. Por ejemplo, un lecho fluidizado de células estable a 5 ml por minuto a 100 G, mostrará una estabilidad de lecho similar a 150 ml/minuto a 3000 G, lo que permitirá la selección de cualquier caudal dentro de este intervalo para cumplir con los objetivos de alto rendimiento del proceso, permitiendo al mismo tiempo manipulaciones detalladas del flujo de fluido a baja velocidad. En comparación, los sistemas centrífugos a contraflujo comerciales conocidos que admiten kits de un solo uso, ofrecen intervalos de velocidad de centrífuga de hasta 1000 G. En consecuencia, los intervalos operativos son limitados en estos sistemas comerciales. El amplio intervalos de velocidades que permiten las realizaciones de la centrífuga de flujo inverso descrita, también facilita las estrategias de selección diferencial del tipo de célula que aprovechan los principios del contraflujo. Un ejemplo es la separación de células viables de las células no viables, lo que resulta en un aumento de la viabilidad de la población celular, algo único para la centrifugación a contraflujo. Un segundo ejemplo es la separación selectiva de los glóbulos rojos que son difíciles de eliminar, ya que su tamaño y densidad crean una superposición con los criterios de selección de la mayoría de las demás células dentro del intervalo operativo de otros sistemas comerciales. Aprovechando la capacidad de la centrífuga de alta velocidad, las células relativamente densas pero pequeñas pueden retenerse en el lecho fluidizado, mientras las PBMC más grandes de interés se eluyen de la cámara.

La figura 3a ilustra los conceptos fundamentales involucrados en un proceso de centrifugación de flujo inverso; esto se discutirá en el contexto de un proceso como se muestra en el diagrama de flujo de la figura 3d, que concentra una población celular suspendida en el fluido de entrada. En una primera fase del proceso 301, la cámara giratoria y las líneas de fluido circundantes se inundan con fluido de imprimación. La cámara 310 se hace girar 302 alrededor del eje 350 para crear la aceleración centrífuga. El fluido 342 de entrada que contiene las células se bombea 303 ahora a través de la cámara. La velocidad de ese caudal bombeado se selecciona de modo que se forme un lecho fluidizado de las células a medida que entran por la punta del cono 340. El fluido puede ser el fluido de suspensión celular original utilizado para la carga inicial, continuando de este modo introduciendo células en la cámara. La aceleración centrífuga hará que las células se sedimenten hacia el extremo exterior de la cámara 310, al añadir el flujo 342 de fluido en la dirección opuesta a la dirección de sedimentación, las células pueden mantenerse suspendidas. La cámara tiene una forma tal que la velocidad 344 local del fluido se alinea con la aceleración centrífuga 346 en cada radio, para crear una zona 345 de trabajo. Con el caudal, el medio fluido y la velocidad de centrífuga correctos, las células se acumularán en la zona 345 de trabajo y formarán en esa zona un lecho fluidizado 304 estable. Las células que entran en la zona se formarán y unirán al lecho fluidizado 345. Debe apreciarse que, a medida que las células se introducen en la cámara mediante el contraflujo de fluido, estas células se depositarán de manera efectiva en el punto de sedimentación total a medida que entran en la cámara mediante la acción combinada del flujo de fluido y la aceleración centrífuga, por lo que al utilizar este proceso no hay “tiempo de sedimentación” .

Una salida permite que este fluido clarificado 348 salga de la cámara 310. Debe apreciarse que la velocidad de la centrífuga, el caudal y las características del fluido (es decir, la densidad y la viscosidad) permitirán que las células se retengan como un lecho fluidizado que se forma desde la punta del cono. Sin embargo, otras células pueden eluirse fuera de la cámara. En algunos casos, las células grandes o densas pueden formar un pseudogránulo en la punta del cono debido al procesamiento a alta velocidad, lo que puede convertirse en un problema durante el procesamiento a alta velocidad, si no se gestiona adecuadamente. Este problema se puede gestionar, a modo de ejemplo, utilizando un protocolo de procesamiento diseñado para realizar una primera pasada de procesamiento, dirigida a acumular y retirar los materiales pesados o densos, antes de la pasada (o pasadas) de acumulación para la población objetivo. Las pruebas de realizaciones prototipo han demostrado que es posible un rendimiento de recuperación celular extremadamente alto (alrededor del 98 %). Debido a los altos rendimientos, es práctico realizar múltiples pasadas de procesamiento (acumulación). Por lo tanto, los protocolos de procesamiento pueden diseñarse para realizar múltiples pasadas de acumulación, algunas dirigidas a la retirada de residuos y otras a la acumulación y recuperación de la(s) población(es) objetivo.

Una vez que las células se han acumulado en el lecho fluidizado, se utiliza un paso 305 de recuperación para extraer las células como un concentrado en el que se invierte la dirección 342 del flujo de fluido. El lecho celular fluidizado se desplaza hacia la punta 340 del cono y se extrae del cono, a través del mismo canal de fluido que se usó para la entrada de fluido.

La centrifugación de flujo inverso también se puede utilizar para aislar diferentes poblaciones celulares en virtud de su respuesta a las condiciones de la cámara. El aumento del caudal inverso cuando se ha formado un lecho fluidizado, dará como resultado inicialmente que el lecho se expanda, más espacio intercelular entre cada célula y que el lecho se expanda hacia arriba del cono. Algunas células que pueden ser más pequeñas o tener una morfología externa “ más rugosa” , pueden presentar una velocidad de sedimentación diferente, lo que las hace inestables en el lecho fluidizado y que sean expulsadas del cono hacia adentro. El lavado de las células fuera de la cámara de este modo se describe como elutriación, que es un protocolo bien conocido para la selección diferencial de poblaciones celulares.

El proceso experimentado por las células dentro del cono giratorio 210 de este pequeño dispositivo es idéntico al proceso dentro de las implementaciones más grandes de centrifugación de flujo inverso. Como sistema a escala de laboratorio para el desarrollo de procesos de células vivas, este sistema administra el proceso de manera idéntica sin efectos de escala sistemáticos. Esto es importante para el desarrollo de productos terapéuticos formalmente regulados cuando, sin los medios para caracterizar completamente un producto tan complejo como las poblaciones de células vivas, el regulador estima que “el proceso es el producto” . Al cambiar la escala de un proceso, existe el riesgo de que el proceso sea diferente, lo que hace que los reguladores sospechen que el producto y su rendimiento comprobados en los ensayos clínicos son diferentes.

Técnicamente, este sistema puede ofrecer una funcionalidad de procesamiento celular idéntica para un sistema a escala de laboratorio cuando se incorpora a sistemas mayores.

La carcasa 210 cónica de fluido tiene un volumen pequeño, aunque gracias a las ventajas de la centrifugación de flujo inverso, puede soportar concentraciones celulares que superan los 100 millones de células por ml, lo que permite que una sola cámara de carga de 10 ml pueda soportar más de mil millones (1e9) de células, lo que es suficiente para muchos procesos terapéuticos. Estas cifras dependen del tamaño de las células y, a modo de ejemplo, se han procesado más de 2 mil millones de células de ovario de hámster chino (CHO, por sus siglas en inglés) en la cámara de 10 ml con una recuperación superior al 95 %. Una realización que puede soportar estas concentraciones celulares puede tener una capacidad de alrededor de 10 ml. Sin embargo, también se pueden utilizar volúmenes mucho más pequeños, como se explicará más adelante.

El diseño ha colocado intencionadamente la carcasa 210 cónica de fluido en un radio pequeño con respecto al centro (eje) de rotación 280. Esto minimiza intencionadamente la energía cinética en el sistema giratorio en relación con la aceleración centrífuga. La energía cinética aumenta con el cuadrado del radio y el cuadrado de la velocidad de rotación. La aceleración aumenta con el cuadrado de la velocidad de rotación, pero es linealmente proporcional al radio de rotación. Este principio se ha aplicado en realizaciones del sistema para mantener de manera satisfactoria la energía cinética a un nivel bajo y seguro, por ejemplo, menos de 20 julios a 5800 rpm. Esto tiene la ventaja de simplificar aún más el diseño de los instrumentos y consumibles. Esto también puede ofrecer ventajas en el coste de producción de los componentes desechables. Además, hay realizaciones que pueden permitir que la energía cinética se mantenga por debajo de un umbral de regulación para requerir una cualificación formal (o de nivel superior) del dispositivo. De nuevo, esto puede ofrecer ventajas en cuanto a costes. El pequeño tamaño del sistema también puede tener ventajas de usabilidad, ya que es más fácil (y económico) de enviar, almacenar y mover; el sistema puede transportarse fácilmente. El pequeño kit también significa que el instrumento ocupa poco espacio, lo que tiene la ventaja de minimizar el espacio requerido en entornos de laboratorio o sala limpia. Además, el tamaño pequeño del kit también puede ofrecer importantes ventajas a largo plazo en los costes asociados con la fabricación, el envío y el almacenamiento de los componentes consumibles.

La configuración de acoplamiento giratorio y radio de giro bajo permite elevadas tasas de aceleración en relación con otros conocidos sistemas centrífugos comerciales de flujo inverso. Debe apreciarse que en otros sistemas se utiliza una configuración de “cuerda de salto” para garantizar la integridad de la ruta del fluido. Un acoplamiento giratorio puede considerarse una solución inferior a la configuración de “cuerda de salto” . Sin embargo, el acoplamiento giratorio puede permitir un funcionamiento a mayor velocidad y lograr una integridad satisfactoria de la ruta del fluido. Esto también puede presentar la ventaja de reducir la pérdida de células en comparación con las rutas de fluido de contraflujo externas convencionales; esto se debe a que se evitan las estructuras de las rutas de flujo que puedan provocar la acumulación en secciones (es decir, curvas) de la ruta de suministro de fluido de contraflujo. Además, se reduce el daño celular potencial debido al cizallamiento causado por una combinación de fuerzas centrífugas y fuerzas inerciales sobre el flujo del fluido cuando la ruta del fluido cambia de dirección (se curva) alrededor de la cámara de separación, ya que el tubo de inmersión proporciona una ruta de flujo recta hasta la punta de la cámara de separación.

Una ventaja de las tasas de aceleración más elevadas es que permite que las células sean estables en un lecho fluidizado con tasas de flujo inverso más elevadas. Esto permite tasas de rendimiento más elevadas cuando se recolectan células de suspensiones diluidas en el lecho fluidizado. Otros sistemas centrífugos de flujo inverso abordan el rendimiento al proporcionar múltiples cámaras de proceso, hasta 6 funcionando en paralelo. Desde un contexto práctico, la mayor velocidad de rotación permite procesar en un tiempo dado mayores volúmenes de suspensión celular.

Otra ventaja asociada con la reducción del tamaño total es la minimización del volumen atrapado dentro del sistema durante el procesamiento. Esto permite procesar volúmenes muy pequeños con pérdidas mínimas. El sistema permite procesar pequeños volúmenes de entrada, y ofrecer una salida precisa de concentrado de pequeño volumen.

El procesamiento de cantidades muy pequeñas de células puede ser la única opción en las aplicaciones terapéuticas autólogas, en las que cada célula tiene un valor incalculable. Evitar las pérdidas sistemáticas de estas células en el proceso es fundamental. Cuando se forma un lecho fluidizado en la punta de la cámara, el lecho influye en los detalles del flujo dentro de la cámara. Antes de que se forme el lecho, el flujo dentro de la cámara está fuertemente influenciado por los artefactos de flujo de Coriolis. En estas condiciones, las células que entran en la cámara pueden arrastrarse hasta el puerto de elutriación interior, sin formar un lecho. La práctica común es empezar a capturar células con un caudal bajo para fomentar la formación de lechos antes de aumentar progresivamente el caudal.

Con poblaciones de células muy pequeñas que procesar, de 5 a 10 millones de células, por ejemplo, no son aceptables las pérdidas potenciales derivadas de este período de establecimiento del lecho.

La combinación de características contenidas en la realización de diseño facilita una configuración de flujo única para el establecimiento del lecho fluidizado sin pérdidas sistemáticas de estas valiosas células. Haciendo referencia a la figura 3e, el flujo está configurado de tal modo que la suspensión celular, suministrada en la bolsa 395, se arrastre hacia el cono a través de la conexión 396. El fluido clarificado que sale de la cámara 310 se devuelve después a la bolsa 395 de suministro a través de la conexión 397. Las células se recirculan de este modo, lo que permite que el lecho fluidizado se establezca y se acumule. Una vez establecido el lecho, el flujo de salida de la cámara 310 puede dirigirse a la bolsa 398 de residuos cerrando la válvula 393 y abriendo la válvula 399 hasta que la suspensión celular de la bolsa de entrada se extraiga.

Una vez que la suspensión de fluido se introduzca en la ruta del fluido, se puede reconfigurar cambiando las configuraciones de las válvulas y la bomba para continuar con el siguiente paso. Una opción es entrar en un modo de recirculación, como se ilustra en la figura 3f, en donde las válvulas 391 y 392 están abiertas mientras que todas las demás válvulas están cerradas. La bomba continúa haciendo fluir el fluido recirculante a través de la cámara manteniendo las células en el estado de lecho fluidificado. Se puede construir una variedad de estrategias de proceso en torno a este estado operativo de recirculación comprobado.

Las características geométricas clave de un ejemplo de cámara sustancialmente cónica de fluido se resumen en la figura 3b, que ilustra el cono 310 y la conexión 320 de cuello para la ruta de elución (no se muestra); la base 330 del cono es la parte más ancha de la cámara de fluido y se indica el centro 350 de rotación. La figura 3b ilustra que el radio de la punta del cono se mide desde el centro 350 de rotación hasta el punto más distal de la punta 340 del cono, y la altura del cono se mide desde la base 330 del cono hasta la punta 340 del cono. Estas distancias radiales son clave para el cálculo de la aceleración centrífuga (fuerza G) experimentada en el medio fluido para diferentes velocidades de rotación. Los detalles de la forma de la cámara pueden variar entre las realizaciones y son un compromiso. Existe una familia de formas de cámara que pueden ser ideales en función de los detalles de la partícula objetivo y los medios utilizados para el procesamiento. El gráfico mostrado en la figura 3c muestra la fuerza aplicada a una partícula para un tamaño de partícula a una velocidad de bomba (suministro de fluido) y velocidad de rotación establecidas. Este gráfico muestra la influencia del radio (eje x) de la cámara en las fuerzas aplicadas a una partícula (eje y). Este gráfico muestra que la sedimentación 362 de Stokes impulsada por el campo centrífugo 364 se equilibra con el flujo de fluido opuesto local (mostrado por la línea 360 de diferencia). La forma del cono 370 influye en el flujo de fluido. En las zonas 382, 385, donde la fuerza diferencial aplicada a la célula es positiva, las células se impulsarán hacia el centro de rotación. En la zona 380, donde la fuerza diferencial sobre la célula es negativa, las células se impulsarán hacia fuera. Al observar el perfil 370 del cono marcado en el gráfico, la región 385 corresponde a una zona cerca del extremo de la punta del cono, donde la velocidad del fluido entrante es más elevada. La región 382 corresponde a la salida de la cámara, donde el fluido se concentrará en la ruta de elución. La región 380 Lo que se observará en la cámara es la acumulación de células en un lecho fluidizado en la zona 380; un espacio en la parte inferior del cono que corresponde a la región 382, es la zona dentro de la cámara donde las células se desplazarán hacia la acumulación en el lecho fluidizado, que presentará un borde delantero en el punto 390 de equilibrio. Las células forman un lecho fluidizado que crea una influencia estabilizadora localizada.

Una realización prototipo de la cámara (que utiliza la configuración ilustrada en la figura 2) tiene un volumen de 10 ml, una altura del cono de 38 mm, y un radio de 67 mm, que se mide desde el centro 350 de rotación hasta la punta 340 del cono. En esta realización, la relación entre la altura del cono y el radio de la punta del cono es de 0,56. Los resultados de las pruebas del prototipo y los cálculos indican que esta realización puede utilizarse con velocidades de rotación superiores a 7000 rpm o 3000 G a H/3 (1/3 de la altura), lo que es significativamente superior a las de los sistemas comerciales conocidos.

La práctica común para evaluar la función de la centrífuga de flujo inverso es describir la aceleración a 1/3 de la altura de la cámara desde el radio de la punta. Esto refleja la zona en la que se forma el lecho fluidizado que, a su vez, rige el caudal de fluido para equilibrar la velocidad de sedimentación celular. Las realizaciones de la presente invención utilizan un volumen de cámara pequeño y un radio pequeño. Las pruebas de una realización prototipo han indicado que las velocidades de rotación que pueden lograrse utilizando una cámara de separación, tal como se describe con referencia a las figuras 2 y 3b, pueden ser del doble o más de las velocidades de rotación de los sistemas de centrifugación de flujo inverso disponibles actualmente, y tienen una velocidad de rotación de la punta del cono significativamente inferior para una velocidad de rotación que alcanza los 1000 G, respecto a los otros dispositivos.

Como se ha descrito anteriormente, una ventaja del radio pequeño es que la velocidad de desplazamiento de la parte de punta del cono es menor que en una realización que tenga un radio de rotación mayor que gire a la misma velocidad. Por lo tanto, un radio de rotación menor puede producir una aceleración centrífuga equivalente a un sistema objetivo utilizando menos energía cinética. Alternativamente, el sistema de radio menor puede lograr una mayor aceleración de la cámara para la misma energía cinética que un sistema mayor.

Otra ventaja que permite un radio de rotación menor es el aumento del caudal para el fluido de contraflujo. El equilibrio y el establecimiento del lecho fluidizado se logran cuando la aceleración centrífuga relativaCase equilibra con la velocidad del fluido de contraflujoFv.Teniendo en cuenta que los efectos gravitacionales son insignificantes a las velocidades de rotación en cuestión, el equilibrio se puede caracterizar mediante la ecuación 1:

[Ecuación 1]

dondew(rad/s) es la velocidad de la centrífuga,R(mm) es la distancia radial para el eje de rotación,Fr(ml/s) es el caudal del fluido de entrada, yr(mm) el radio del cono a la distancia radial R. En el contexto de la generación de un lecho fluidizado,rpuede tratarse como una constante, por lo que a partir de la ecuación 1 resulta evidente que para una cámara de separación menor, a medida que aumenta la velocidad de rotación (w), se requiere un mayor caudal de entradaFrpara lograr equilibrar y establecer el lecho fluidizado.

Normalmente, el tiempo de procesamiento para establecer el lecho fluidizado de las células y la recuperación de las células, depende del caudal. Como se ha descrito anteriormente, la capacidad de utilizar un radio de rotación menor y velocidades de rotación mayores, requiere un mayor caudal para el fluido de contraflujo, lo que, a su vez, puede dar como resultado un tiempo más rápido de procesamiento. La capacidad de trabajar con caudales mayores puede evitar la necesidad de varias cámaras de proceso, al permitir completar un protocolo que tenga limitaciones de tiempo con el sistema pequeño. Por ejemplo, la recolección de productos celulares de múltiples “fábricas” de cultivos celulares implica el procesamiento de decenas de litros de producto. Una realización de sistema que utilice el diseño de cámara de separación descrito con referencia a la figura 3, puede tener la capacidad de procesar este volumen más rápidamente que todos los sistemas, excepto los sistemas a gran escala. Una ventaja adicional de utilizar mayores velocidades de rotación y caudales es que esto también puede mejorar la estabilidad del lecho fluidizado durante la recuperación celular, lo que permite altas tasas de recuperación.

Aplicando este principio a la consideración de otras realizaciones a menor escala, se puede configurar una realización alternativa con una menor cámara de separación para la separación de exozomas que se encuentren en la escala de 40 a 200 nanómetros. Una realización de este tipo funcionaría a alrededor de 100.000 rpm, en comparación con alrededor de 8.000 rpm para un sistema de 10 ml, tal como se ilustra en la figura 3. El principio de diseño que se aplica es permitir una rotación a muy alta velocidad utilizando un radio de rotación muy bajo. Se prevé que puedan implementarse realizaciones que tengan velocidades de rotación de hasta 200.000 rpm. Por ejemplo, un modelo teórico indica que las condiciones para crear un lecho fluidizado de exosomas de 200 nanómetros, pueden lograrse utilizando una cámara que tenga un radio de punta de 20 mm, una longitud de cono de 10 mm y una velocidad de rotación de alrededor de 100.000 rpm, logrando 200.000 G a H/3 con una velocidad de procesamiento de 5 ml por hora. Se prevé que tales características puedan lograrse utilizando una versión a escala de la presente configuración de cámara. Como se ha descrito anteriormente, una ventaja de la técnica de centrífuga de flujo inverso es la mínima sedimentación, ya que las partículas se introducen de manera efectiva directamente en su posición sedimentada mediante el flujo de contrafluido. Una ventaja de esto es que el tiempo para el procesamiento de separación se vuelve dependiente del tiempo requerido para la introducción de las células/partículas en la cámara de sedimentación a través del contrafluido. Por lo tanto, el tiempo de procesamiento depende del caudal del fluido y de la concentración de partículas en el contrafluido, más que de las características específicas de sedimentación del tipo de partícula. Para la separación de partículas, tales como los exozomas, esto puede ser una ventaja muy significativa. Actualmente no existe ningún sistema centrífugo de flujo inverso disponible para los exozomas. El estado actual de la técnica para separar exozomas utiliza la ultracentrifugación, lo que requiere horas de giro para sedimentar las partículas.

Una preocupación asociada con el pequeño radio de rotación de la cámara de separación es la influencia de las fuerzas de Coriolis sobre las células y el lecho celular fluidizado. Las fuerzas de Coriolis son inerciales y surgen cuando hay un flujo en una dirección radial dentro de un entorno giratorio. Este efecto se puede observar dentro de la cámara de fluido cuando se ve o se registra bajo iluminación estroboscópica. El efecto Coriolis se puede observar cuando una cola de producto celular se arrastra por el borde delantero de la cámara de fluido. Esta cola disminuye rápidamente una vez que se establece el lecho fluidizado. La forma del lecho refleja la reacción de Coriolis. Una preocupación manifiesta es que este comportamiento dé como resultado un aumento de las pérdidas celulares sistemáticas si la cámara está ubicada cerca del centro de rotación. Sin embargo, el análisis realizado por los inventores ha indicado que la relación entre la fuerza de Coriolis y la fuerza centrífuga no se ve afectada por el radio de rotación, y la fuerza de Coriolis como relación de la fuerza centrífuga se reduce al aumentar la velocidad de rotación. El análisis de la física muestra que la relación entre la fuerza de Coriolis y la fuerza centrífuga que actúa sobre una partícula en el cono, es2/w,dondewes la velocidad de rotación.

Las fuerzas ficticias que actúan sobre una partícula de la cámara se pueden caracterizar por:

Pfíct = -2 mil x v B - mil x ( í l x R) - m ^ x R [Ecuación 2]

Dondemes la masa de la partícula,Res la distancia radial, Q el vector de velocidad angular (Q = |w|Q) para la cámara con una magnitud igual a la velocidad de rotación w, yvres la velocidad de la partícula con respecto al sistema giratorio a una distancia radial R. En la ecuación 2, el componente de fuerza de Coriolis se caracteriza por (-2mQ xvr),el componente de fuerza centrífuga se caracteriza por(-mQx (Q x fí)), que también se puede caracterizar como

2R(t),donde R(t) es el vector de posición instantáneo de la partícula, y el componente de Euler (—m— xmw dt R) caracteriza la fuerza debida al cambio de velocidad de rotación. Considerando el funcionamiento a una velocidad de rotación constante, el componente de Euler puede ignorarse.

Observando la influencia comparativa de la fuerza de Coriolis:

Fuerza de Coreolis (—2mil X vR) 2mwR(t) 2 w

Fuerza centrífuga ( -m il X (fl X i?)) m w 2R(t) w 2

[Ecuación 3]

durante la centrifugación de flujo inverso, la velocidad de las partículas en relación con el sistema giratoriovres equivalente a la velocidad tangencial de rotación de la cámara y, por lo tanto, al vector de posición de las partículas R(t). Esto indica que la fuerza de Coriolis es independiente del radio de rotación del sistema. Además, la influencia relativa de la fuerza de Coriolis disminuye al aumentar la velocidad de rotación. La fuerza de Coriolis está influenciada por el caudal de entrada y la geometría del cono, no por el radio R de la punta. Debe apreciarse que una velocidad de rotación constante y un caudal de entrada constante se utilizarán durante la fase del proceso de sedimentación (acumulación en lecho fluidizado). Basándose en la ecuación 1, debe apreciarse que a medida que el radio R de la punta de la cámara de separación se hace más pequeño, el tamaño de la cámara también puede hacerse más pequeño, y la velocidad de rotación aumenta. Con una reducción del tamaño y el volumen de la cámara de separación (reducción del radio R de la punta), el área de la sección transversal del cono también se reducirá, disminuyendo aún más el impacto de la fuerza de Coriolis.

Esto significa que la influencia relativa del efecto Coriolis disminuye al aumentar la velocidad de rotación y es independiente del radio. Por lo tanto, el diseño incorporado en esta invención presenta una configuración mejorada para los diseños de flujo inverso, y sugiere que este enfoque se puede aplicar a aplicaciones en donde se necesiten aceleraciones muy elevadas para la agregación de partículas finas.

La cámara de separación de un solo uso y la estructura de soporte incorporan la aplicación de una variedad de principios físicos, para proporcionar un componente que pueda producirse de manera económica para un solo uso.

En una realización, la configuración fundamental de la cámara de separación es unir un componente de cámara cónica simple a una estructura de chasis que ofrezca interfaces ergonómicas, fluídicas y estructurales. Esta estructura utiliza un cono con una estructura unitaria que después en el extremo ancho se une al chasis de soporte que forma la parte de cuello. Esto coloca la unión más radialmente hacia fuera en la base del cono, relativamente cerca del eje de rotación (en comparación con la punta del cono) y, por lo tanto, en un punto a lo largo de la cámara de separación donde se experimenta una aceleración centrífuga relativamente baja en comparación con la punta del cono. Esta configuración también evita que las uniones se encuentren en lugares donde se experimente una alta presión de fluido. Por ejemplo, la punta del cono normalmente experimentará la presión de fluido más alta. Por lo tanto, la punta unitaria del cono evita las uniones en esta región de alta presión de fluido.

El análisis de la presión dentro del cono giratorio estima una presión hidráulica de 61 psi (4,2 BAR) a una velocidad operativa de 1000 G. La aceleración operativa se calcula a 1/3 de la altura del cono desde el radio de giro en la punta del cono, ya que ahí es donde se forma y se activa el lecho fluidizado, a 2000 G la presión en la punta del cono se estima en 8,4 bar. La geometría compacta puede ser muy beneficiosa para reducir la presión interior de la cámara, por ejemplo, la presión en la punta del conoP = rowx w2 x R /2, donderowes la densidad del fluido,Rel radio de rotación (distancia al eje de rotación), y w la velocidad de rotación. El fluido tiene un vía hacia el centro de rotación, por lo que la presión representa una columna de fluido de todo el radio sometida a una aceleración centrífuga, lo que aumenta progresivamente la fuerza G con el radio. La creación de la fuerza G objetivo en un radio bajo crea una menor presión interna proporcional al radio de rotación.

Al evitar las uniones estructurales en la región de la punta del diseño de cámara monolítica, el producto está sustancialmente menos expuesto que otros productos a las variaciones de fabricación. La unión requerida para conectar el cono al chasis solo es necesaria para soportar la carga masiva procedente de la estructura cónica que soporta la masa de fluido que contiene. Se trata de una carga en el peor de los casos en el intervalo de 500 Newton a 8000 rpm, lo que representa 3900 G frente a la velocidad de trabajo común de 7000 RPM o 3000 G a la altura de trabajo de la realización descrita con referencia a la figura 3.

Este diseño de cámara de separación utiliza una pajita interna (también denominada tubo de inmersión) para la conexión del fluido a la punta del cono. Esto ofrece una serie de beneficios importantes:

• Sin conexión de fluido externa a la región de alta presión del cono, lo que elimina los riesgos de fabricación y manipulación asociados a la configuración de las tuberías externas.

• El patrón de flujo de fluido de las suspensiones celulares que entran en la cámara de fluido no está influenciado por la geometría de la tubería externa, que debe girar sobre sí misma para alinearse con la geometría cónica de la cámara.

• Las líneas de fluido externas y las curvas en U asociadas, dan como resultado que la zona centrífuga más alta se produzca fuera de la cámara de separación. Las partículas pesadas y los agregados celulares se acumulan en la zona centrífuga más alta. En los sistemas comerciales conocidos, esta zona centrífuga más alta se produce fuera de la cámara de separación, por ejemplo, en una curva en una tubería externa cerca de la entrada de fluido en la punta de la cámara de separación. En algunas realizaciones de la presente invención, esta zona centrífuga crítica más alta está dentro de la punta del cono. Cuando el cono es transparente, esta zona centrífuga más alta también se puede observar claramente para una intervención controlada.

• El tubo central de inmersión en el cono se puede crear a partir de un tubo hipodérmico técnicamente preciso, aprobado para el contacto con medicamentos, y fabricado en un volumen suficiente para ser económico. Los tubos hipodérmicos también son un componente bien conocido del flujo de residuos peligrosos para estos productos después de su uso. Esto puede tener ventajas tanto para el coste de producción inicial como para los costes de eliminación de residuos para el componente de la cámara de separación.

El diseño del tubo de inmersión, en combinación con las características en el moldeado del cono, puede crear una geometría de flujo de fluido reproducible y bien controlada en la cámara de fluido. Por ejemplo, al utilizar un ajuste de interferencia entre el tubo de inmersión y los componentes del chasis, las tolerancias de ensamblaje entre las características de moldeado a la longitud de corte del tubo y la unión del cono, se eliminan mediante el reposicionamiento axial del tubo en virtud del ajuste de interferencia. En las figuras 4a a 4f se ilustran realizaciones de una estructura de canalización de fluido formada en la punta de la cámara de separación. La punta 400 del recinto cónico de fluido incluye una estructura de canalización con una parte central 420 para recibir la salida de fluido del tubo 410 de inmersión, y lóbulos 430 espaciados alrededor de la parte central para dispersar el flujo de fluido alrededor del recinto cónico de fluido. La estructura de canalización de fluido también puede configurarse para ayudar a localizar y soportar el tubo 410 de inmersión. Por ejemplo, como se muestra en las figuras 4b y 4f, la parte central 420 está dimensionada para recibir el extremo del tubo 410 de inmersión, que se mantiene en su lugar mediante el ajuste de interferencia, y se refuerza mediante la fuerza centrífuga (que se muestra en las figuras 4c y 4f). En esta realización, la parte central 420 incluye salientes 440 entre los lóbulos 430 a fin de controlar la ubicación axial del tubo de inmersión y garantizar una vía de comunicación de fluido abierta y constante entre el tubo 410 de inmersión y la cámara de fluido. El fluido del tubo de inmersión entra en la parte central 420 y fluye hacia fuera a través de los lóbulos 430, que proporcionan la abertura al recinto de fluido. La realización mostrada utiliza tres lóbulos espaciados uniformemente alrededor de la punta, sin embargo, se pueden utilizar otras estructuras, por ejemplo, 4 o más lóbulos, o una pluralidad de canales radiales espaciados uniformemente. Debe apreciarse que una estructura de este tipo puede simplificar la fabricación y ensamblaje del dispositivo, en particular al reducir la precisión requerida durante el proceso de ensamblaje, para garantizar la colocación correcta del tubo 410 de inmersión.

El fluido se puede recuperar de la cámara invirtiendo el flujo de fluido para extraer el lecho fluidizado (es decir, las células concentradas) a través del tubo 410 de inmersión. Debe apreciarse que es deseable extraer el lecho fluidizado del cono con una perturbación mínima del entorno del medio en el que están suspendidas las células, y minimizando la dilución durante el proceso de recuperación. Las condiciones del proceso dentro del lecho se controlan mediante la velocidad de la centrífuga y el caudal del fluido. Se pueden crear condiciones de lecho fluidificado similares en un intervalo de velocidades haciendo coincidir el caudal. Esto permite que la velocidad de rotación de la centrífuga y el caudal del fluido se ralentice como una acción coordinada (por ejemplo, controlada por el controlador del microprocesador), manteniendo el lecho fluidizado en una condición estable pero a una menor velocidad de proceso, creando condiciones más favorables para el proceso de recuperación. El límite de la concentración en el lecho fluidizado es, en última instancia, evitar el bloqueo de la ruta del fluido durante la etapa de recuperación. La densidad del lecho fluidizado se puede ajustar mediante la bomba de contraflujo antes de la etapa de recuperación, lo que permite optimizar el concentrado en suspensión. La velocidad de procesamiento de la centrífuga de contraflujo se define por la velocidad de la centrífuga en combinación con la velocidad de la bomba de contraflujo. La velocidad de procesamiento se puede ralentizar como una acción coordinada antes de la etapa de recuperación, para minimizar el riesgo de daño celular o pérdida de células de la cámara. Esta ralentización coordinada implica una ralentización controlada de la velocidad de la centrífuga y de la velocidad de la bomba de contraflujo.

Disminuir la rotación centrífuga y el caudal también puede reducir el riesgo de daño celular durante el proceso de recuperación. Para maximizar la recuperación del fluido concentrado, también es deseable tener un espacio muy pequeño entre el tubo de inmersión y el extremo de la punta del cono, para reducir la cantidad de fluido libre de células que puede introducirse en el tubo de inmersión con el último lecho fluidizado, y reducir la dilución hacia el final de la recuperación del lecho fluidizado. La estructura de la punta 400 del cono se puede diseñar para minimizar el espacio a fin de obtener buenos resultados de recuperación. Debe apreciarse que la estructura de canalización para soportar el tubo de inmersión, tal como se muestra en la figura 4, puede ser ventajosa, ya que la estructura del saliente 440 de soporte y el lóbulo 430 reducen el área de acceso alrededor de la entrada del tubo de inmersión para el líquido libre de células detrás del lecho fluidizado. La parte central debe estar completamente ocupada por el fluido del lecho fluidizado hasta que los últimos momentos del lecho fluidizado se extraigan del tubo. Siempre que se controle el caudal para mantener la estabilidad del lecho fluidizado, los lóbulos deben canalizar todo el fluido concentrado hacia el tubo de inmersión por delante del fluido de arrastre libre de células para minimizar la dilución.

Muchos especialistas en bioprocesos se preocupan por garantizar que las células vivas no se expongan a un excesivo cizallamiento en el entorno fluido. El cizallamiento puede provocar la pérdida o daño de las células durante el proceso de producción, lo que reduce de manera efectiva el rendimiento del proceso de producción. Es deseable evitar un alto cizallamiento del fluido, sin embargo, el cizallamiento puede producirse en cualquier sistema en donde se experimenten fuerzas inerciales durante la canalización del fluido. Un atributo importante del proceso de centrifugación de flujo inverso es que puede conseguir recuperaciones celulares extraordinarias (>98 %) de la población celular introducida que se captura en el lecho fluidizado, para su recuperación de la cámara de separación. Por lo tanto, cualquier pérdida sistemática de células después de la separación es motivo de preocupación.

Una característica de las realizaciones de este sistema es el uso de un acoplamiento giratorio entre la centrífuga giratoria y el sistema fluídico externo. Muchos productos de centrífuga de flujo inverso existentes utilizan un dispositivo de tipo cuerda de salto que logra esta conexión giratoria sin el uso de sellos deslizantes. Sin embargo, un dispositivo de este tipo puede ser complejo y aumentar los costes de producción. En las realizaciones del presente sistema, se utiliza un acoplamiento giratorio por motivos de simplicidad y posible reducción de costes. Se requiere una verificación adicional de un acoplamiento giratorio como un dispositivo biológico funcionalmente cerrado para la producción comercial, y los protocolos de validación reglamentaria están bien establecidos para dichos dispositivos, ya que muchos otros productos aceptados en el espacio de bioprocesamiento utilizan acoplamientos giratorios. Esto también puede ofrecer la ventaja de reducir los costes de aprobación reglamentaria, lo que también puede tener un impacto positivo en los costes de los productos. El uso de un acoplamiento giratorio también puede permitir velocidades de rotación más altas que los diseños alternativos de acoplamiento de tipo “cuerda de salto” .

La experiencia ha demostrado que los acoplamientos rotativos mal configurados pueden afectar a la recuperación de las células. En esta realización se han empleado una serie de consideraciones de diseño para abordar los puntos en donde las células puedan experimentar una situación de alto cizallamiento del fluido. Las consideraciones de diseño de esta patente incorporan varios principios.

• El canal de fluido que se conecta al tubo de inmersión es donde una suspensión celular diluida se transfiere a la cámara durante la acumulación en el lecho celular.

• Este canal también es donde la suspensión concentrada se extrae de la cámara hacia el recipiente de destino.

• El acoplamiento giratorio tiene un puerto central alineado directamente con el centro del conjunto giratorio, para transmitir la suspensión celular.

• Por lo tanto, las células solo están expuestas al cizallamiento debido a la desrotación, cuando emergen de la estructura giratoria hacia el cuerpo de acoplamiento giratorio.

En la figura 2 y la figura 5, que muestran el acoplamiento giratorio con más detalle, se ilustra una realización del acoplamiento giratorio y rutas de flujo. El canal 270, 520 de fluido que se comunica con el tubo de inmersión para la carga y la recuperación 250 está alineado con el eje de rotación. Por lo tanto, el canal de fluido para la recuperación celular de la suspensión celular concentrada está ubicado donde las células experimentarán el menor posible esfuerzo cortante cuando se transfieran fuera del entorno giratorio.

La ruta 510 de flujo de elutriación pasa a través de una cánula coaxial hasta el canal 520 de carga y recuperación y una ranura 540 de transición de flujo en un casquillo 530 del acoplamiento giratorio. El casquillo 530 controla la concentricidad de la cánula coaxial y redirige el flujo de suspensión celular radialmente hacia afuera. El casquillo 530 tiene una ranura anular de transición de flujo donde se produce una transición controlada de la suspensión celular que sale de los orificios radiales giratorios a la zona no giratoria. El flujo de fluido desde el extremo interior de gran diámetro de la cámara 210 de fluido, es normalmente un medio clarificado sin población celular, destinado para residuos. Es lógicamente este canal donde el fluido debe desplazarse radialmente hacia fuera y dejar de girar antes de salir del acoplamiento giratorio. Sin embargo, este canal 510 se utiliza en una variedad de aplicaciones en las que las células se expulsan del lecho fluidizado (elutriación) de manera selectiva, o todo el lecho celular se moviliza a través de un circuito de recirculación para mezclar y tomar muestras.

Algunas realizaciones emplean una cavidad 540 que dirige el fluido (y cualquier célula en este) para que se desplace radialmente hacia afuera en un volumen compartido generoso antes de que se dirija a fusionarse en la salida del acoplamiento giratorio. Los detalles de los componentes moldeados dentro del acoplamiento están diseñados para minimizar las zonas de flujo muerto, donde las células pueden acumularse y perderse.

Como se ilustra en la figura 6, el acoplamiento giratorio 620 también asegura la cámara 610 de separación al colector 630 de fluido. Como se muestra con más detalle en la figura 7, el colector moldeado 730 presenta una red 735 de tubos hacia las válvulas y sensores de control de fluido del instrumento. La figura 7 muestra el colector 730 con la cámara 710 de separación conectada, que puede suministrarse como un subsistema desechable estéril. El colector 730 está conectado a una serie de conectores 760 de líneas de fluido externas para la conexión a otros componentes desechables de kit y de suministro de fluido, tales como bolsas de fluido, por ejemplo. La red 735 de tubos del colector 730 está configurada para alinearse con un conjunto de accionamiento de válvulas, tal como se muestra en la figura 8. El conjunto de accionamiento de válvulas comprende una pluralidad de accionadores 810 de válvula de pinza configurados para, cuando se accionan, cerrar la línea de fluido respectiva mediante el pinzamiento de la línea de fluido para cerrarla contra la cubierta 740. Como debe apreciarse, las líneas de fluido preconfiguradas del colector evitan la necesidad de enroscar y montar un complejo de tubos y componentes en el instrumento. Esto puede reducir significativamente los errores del operador. La puerta del instrumento bloquea el colector en su posición y completa la funcionalidad de la válvula de pinza cuando está cerrada.

El colector conecta la red fluídica al acoplamiento giratorio de la centrífuga. Esto crea una estructura que resiste la reacción torsional del acoplamiento con flexibilidad para compensar las variaciones geométricas entre los conjuntos. Proporciona un acoplamiento íntimo entre el entorno de centrifugación y los fluidos estáticos, lo que facilita la capacidad de recuperación de volúmenes muy pequeños. El colector se puede diseñar para protocolos de procesamiento específicos a fin de minimizar el volumen de fluido dentro del sistema. Además, la red de tubos colectores puede diseñarse para permitir que diferentes rutas de fluido se configuren de manera selectiva durante el procesamiento mediante el accionamiento de válvulas en combinación. Por ejemplo, las figuras 3e y 3f ilustran cómo el flujo de fluido puede configurarse de manera selectiva durante el procesamiento, incluida una ruta de fluido que puede configurarse para recircular el fluido del medio a través de la cámara de separación. También debe apreciarse que la apertura y el cierre de las válvulas se automatizan bajo el control del procesador del sistema.

El colector se puede fabricar utilizando un método que puede emplear utillaje de bajo coste. Esto permite desarrollar a bajo coste diferentes configuraciones de procesos para cumplir con los requisitos detallados únicos integrados en muchos protocolos. En una realización, la fabricación del colector se logra mediante un método descrito como formación al vacío de doble lámina. Este proceso se ilustra en la figura 9. Se precalientan dos láminas de polímero de aproximadamente 0,6 mm de espesor y se colocan entre las placas calentadas 910, 920. Se extrae el vacío para capturar y formar las láminas de cada placa de herramienta. Las placas 910, 920 se fijan con abrazaderas y se introduce presión entre las dos láminas perforando la película delgada 935 en las cavidades 930 del cabezal de la herramienta. La lámina formada se puede recortar después para proporcionar el colector 940 formado. La combinación de la temperatura de la herramienta, el precalentamiento del polímero y la presión, une térmicamente los materiales poliméricos. Un objetivo clave es que la herramienta tenga el menor coste posible. El diseño de la herramienta se centra en una operación de mecanizado de una sola cara que se puede completar en una sola configuración en un centro de mecanizado CNC. Las variantes de utillaje para tiradas cortas pueden reducirse aún más en coste haciendo que las cavidades de los cabezales de la herramienta formen parte de la infraestructura de equipo fijo y utilizando insertos 925 de utillaje específicos del proceso para las placas 910, 920. Esta combinación de atributos está diseñada para permitir a los usuarios finales del sistema centrífugo crear configuraciones de colectores específicas del proceso y proporcionarlas a un coste práctico.

El colector fijo puede tener ventajas para la precisión del volumen, ya que hay menos probabilidades de que se produzcan errores o variaciones fruto del ensamblaje humano de los componentes del kit. Esto es importante para el procesamiento de volúmenes pequeños, ya que incluso las variaciones milimétricas en la longitud del tubo pueden tener un impacto significativo en el volumen total de fluido interno del sistema. También se pueden diseñar colectores preformados, fijos y específicos del proceso para minimizar el volumen de fluido interno del sistema. Esto puede permitir mayores concentraciones de recuperación o, en otras palabras, minimizar la dilución de las células concentradas por el fluido del medio, simplemente teniendo menos fluido del medio en el sistema. Esto es muy ventajoso para aplicaciones de bajo recuento de células (u otras partículas) de pequeño volumen.

El colector moldeado también soporta la interfaz de la bomba, como se ilustra en la figura 10. Sec conecta un tubo especializado 750 para la bomba peristáltica al colector a través de conectores moldeados. Cuando el colector 730 se carga en el instrumento, el tubo yace de manera natural adyacente a los rodillos de 1010 la bomba. Una característica de la puerta 1030 del instrumento, en combinación con la geometría 1020 de la bisagra de la puerta, recoge el tubo de la bomba peristáltica y lo presiona contra el conjunto de rodillos de la bomba cuando la puerta se cierra. Esto elimina los errores en la carga de la bomba peristáltica. La característica de interfaz 1030 de bomba conectada a la puerta captura el tubo de la bomba peristáltica y lo sujeta a los rodillos de accionamiento de la bomba con un aplastamiento controlado.

Como se ilustra en la figura 11, el sistema 1100 incluye un controlador 1110, tal como un microprocesador programable alojado dentro del subsistema reutilizable 1200, para controlar las operaciones del motor 1150, la bomba 1120, 1160 y los actuadores 1140 del conjunto 1145 de válvulas. El controlador puede programarse según un protocolo para controlar un proceso de separación de extremo a extremo. El controlador está configurado para coordinar el motor y, por lo tanto, la velocidad de rotación y la velocidad de bombeo de la cámara 1180, como se ha descrito anteriormente. El controlador también puede configurarse para operar los actuadores 1140 de válvula para provocar la apertura y el cierre de válvulas individuales en el conjunto 1145 de válvulas según el protocolo de procesamiento. Por ejemplo, para abrir válvulas para la introducción de fluidos desde uno o más recipientes 1190 de fluido externos conectados al colector 1170, la recirculación de fluidos dentro del sistema mediante la reconfiguración de las rutas de flujo a través del colector, o para la recuperación de fluido a una cámara externa. Debe apreciarse que, en algunas realizaciones, el controlador 1110 integrado en el sistema puede configurarse para controlar el funcionamiento de los componentes del sistema de manera coordinada, y estar conectado (a través de una comunicación de datos inalámbrica o por cable adecuada) a un controlador externo (por ejemplo, un sistema informático externo) que controla el control del protocolo de procesamiento de nivel superior. Por ejemplo, se puede proporcionar un sistema informático externo para habilitar la funcionalidad mejorada de la interfaz de usuario y los recursos para funciones, tales como la supervisión, la captura de datos y el análisis. El uso de un sistema informático externo también puede permitir una mayor flexibilidad en el procesamiento del diseño del protocolo y la programación para su ejecución utilizando el sistema. Se puede utilizar un sistema externo para controlar la ejecución del protocolo o para diseñar el protocolo para su descarga al sistema para su ejecución. Ambas realizaciones están previstas y se consideran particularmente adecuadas para entornos de laboratorio y de ensayo. También se considera una realización en donde el sistema esté dedicado a un único protocolo de procesamiento y el controlador del sistema pueda estar programado de forma fija (en lugar de descargarse) o utilizar un procesador dedicado, tal como un circuito integrado específico de la aplicación. La configuración fija del sistema (es decir, el colector, que minimiza los riesgos de variación de la conexión durante la configuración) y el control automatizado pueden permitir una alta coherencia en los resultados del procesamiento. Se puede mejorar aún más el rendimiento de procesamiento haciendo que el mismo dispositivo sea factible tanto para la experimentación en etapas iniciales como para los ensayos clínicos y las operaciones a gran escala.

Debe apreciarse que las realizaciones del presente sistema pueden ofrecer ventajas significativas sobre los sistemas de centrifugación disponibles actualmente. Los principales atributos de una tecnología de lavado de células son: • El mayor volumen de suspensión celular diluida que se puede recolectar.

• La velocidad a la que se puede procesar la suspensión celular diluida mientras se capturan las células.

• Qué tan pequeño es el volumen en el que se pueden entregar las células recolectadas.

• La recuperación de las células: % de células entregadas frente a las células suministradas.

Como centrífuga de flujo inverso, las recuperaciones se producen sistemáticamente en la región del 98 %, sin ser superadas por ninguna otra metodología de manipulación de células.

La velocidad de “ recolección” , tal como se describe comúnmente la etapa de recolección, se rige por el caudal de fluido que el lecho fluidizado puede tolerar sin pérdida de células del lecho fluidizado. Esto se rige por la velocidad de estabilización que se puede lograr en la cámara y que se refleja en las G de aceleración. El diseño que se muestra en la figura 2 y la figura 3 se ha desarrollado para funcionar hasta 4000 G, pero se puede aplicar de forma conservadora a 3000 G, incluso este uso conservador es tres veces la mejor oferta del mercado para la centrifugación de flujo inverso de un solo uso.

Las realizaciones del sistema descrito permiten una recuperación de volúmenes muy pequeños. Una capacidad destacada de este diseño es su capacidad para entregar el producto final en un volumen muy bajo. Un objetivo clave del desarrollo de procesos terapéuticos basados en células es completar todo el proceso dentro de un entorno funcionalmente cerrado de un solo uso. Los pasos finales de muchos protocolos de productos terapéuticos requieren que todo el producto celular se concentre en un volumen pequeño. Por lo general, esto se logra mediante los pasos tradicionales de centrifugación en “cubeta” realizados en salas limpias de alta calidad, con pasos de intervención manual abierta.

Las realizaciones descritas incorporan características dirigidas específicamente a una alta recuperación celular en un volumen reducido. Las realizaciones pueden incluir cualquier combinación de una o más de las características de:

• Acoplamiento giratorio con interfaz directa axial al tubo de alimentación

• Poco espacio ocupado para minimizar la distancia del flujo desde la cámara, pasando por la bomba hasta el recipiente de destino.

• Oportunidad de integrar un sensor de densidad óptica en la línea de salida para la captura selectiva y el apagado. Estas características, combinadas con el control automatizado de este paso, pueden permitir un volumen total de salida de fluido inferior a 2 ml para poblaciones celulares de 10 millones a 10 ml para mil millones de células con alta recuperación.

Las realizaciones están configuradas para permitir una producción rentable. Muchos productos terapéuticos basados en células se basan en la transformación en el agente terapéutico de células extraídas del paciente. Estas terapias autólogas funcionan con poblaciones celulares totales relativamente pequeñas. La capacidad y la funcionalidad de este diseño lo hacen ideal para abordar los desafíos que presentan los productos autólogos. Los productos autólogos suelen fabricarse según las buenas prácticas de fabricación actuales (cGMP, por su siglas en inglés), lo que requiere un escrutinio y una revisión detallados del proceso y pruebas sólidas de garantía de calidad antes de que el producto pueda lanzarse para su administración al paciente. Para que dichos productos sean asequibles, es importante abordar todos los aspectos del coste. Este diseño contribuye al presentar un conjunto de componentes de un solo uso que se pueden entregar a bajo coste.

Algunas realizaciones del sistema son adecuadas para su aplicación en numerosos procesos de separación o acumulación de partículas pequeñas para su recuperación en una suspensión fluida. Algunos ejemplos de aplicaciones en el procesamiento de células para terapias celulares incluyen:

1) Concentración celular

2) Lavado de células

3) Separación celular mediante una combinación de concentración de células más grandes y densas, y elutriación de células y desechos más pequeños y livianos

4) Selección celular mediante la separación de las células adheridas a perlas que pueden ser ligeras o más pesadas que la población celular circundante

5) Formulación añadiendo un volumen controlado de líquido (por ejemplo, crioprotector) a un volumen de salida conocido de células concentradas.

Aunque los ejemplos de aplicación del sistema analizados se refieren al procesamiento celular, las realizaciones del sistema también pueden utilizarse para otras aplicaciones. La referencia a aplicaciones específicas es solo a modo de ejemplo y no debe considerarse como una limitación del alcance de la invención.

El sistema está diseñado para facilitar la carga y minimizar los errores de montaje del operador. Este instrumento está diseñado para procesar células humanas con fines terapéuticos. Es importante que el riesgo de errores en el proceso se minimice en todos los sentidos para evitar la pérdida de valioso material. Este diseño incorpora una gama de características para simplificar la carga del kit desechable, específicamente para minimizar el riesgo de error. Estas características están integradas en el conjunto de la cámara centrífuga y en el colector. El conjunto de la cámara centrífuga y su interfaz con el soporte de la centrífuga presentan una interfaz intuitiva respaldada por un clic audible cuando se engancha el cierre.

Una ventaja significativa del sistema descrito, con respecto a los sistemas comerciales disponibles actualmente, es que la configuración de la cámara de separación tipo tubo de inmersión y el acoplamiento giratorio permiten que este se disponga conectado al colector de suministro de fluido como un kit preensamblado limpio de un solo uso. Además, la cámara de separación requiere un soporte estructural mínimo por parte del soporte del motor. Esta configuración también da como resultado una reducción de la energía cinética durante la operación. Por lo tanto, esta configuración reduce significativamente los requisitos físicos del subsistema reutilizable, lo que permite reducir el tamaño, la complejidad y los costes.

Claims

REIVINDICACIONES

Un sistema (100) centrífugo compacto de flujo inverso que comprende:

un subsistema reutilizable (1200); y

un subsistema (1250) reemplazable de un solo uso,

el subsistema reutilizable (1250) que comprende:

un cabezal (135) de motor giratorio;

una bomba peristáltica (110);

un conjunto (120) de válvulas;

un controlador (1110) de sistema configurado para controlar el funcionamiento del cabezal del motor giratorio, la bomba peristáltica y el conjunto de válvulas, según un protocolo de procesamiento programado; y

carcasa (130) que aloja el cabezal (135) de motor giratorio, la bomba peristáltica (110) y el conjunto (120) de válvulas, y el subsistema (1250) reemplazable de un solo uso, que comprende:

una cámara (140) de separación configurada para un bajo volumen de fluido y un radio de rotación pequeño, que comprende una parte (210) de recinto de fluido sustancialmente cónica conectada a una parte (220) de cuello,

ycaracterizado por

la cámara (140) de separación tiene un tubo (230) de inmersión que se extiende centralmente a través del recinto (210) cónico de fluido desde la parte (220) de cuello hasta una punta (240) de cono del recinto (210) cónico de fluido, para proporcionar una ruta (250) de fluido a la punta (240) del cono del recinto (210) cónico de fluido, comprendiendo además la parte (220) de cuello una ruta (260) de fluido de elución; un colector (150) de suministro de fluido que comprende un primer puerto (170) de fluido y un segundo puerto (175) de fluido configurados para la comunicación de fluido con la cámara (140) de separación, una pluralidad de rutas (180) de fluido configuradas para la conexión a componentes de suministro de fluido externos para el suministro de fluido hacia o desde el primer puerto (170) de fluido y el segundo puerto (175) de fluido, estando al menos una de las rutas (180) de fluido configurada para conectarse al conjunto (120) de válvulas, por lo que las rutas (180) de fluido se pueden abrir o cerrar de manera selectiva operando el conjunto (120) de válvulas, y una parte (190) de acoplamiento de bomba configurada para permitir el acoplamiento operable entre la bomba peristáltica (110) y las rutas (180) de fluido para hacer que el flujo fluya dentro del colector (150) de suministro de fluido operando la bomba peristáltica (110); y

un acoplamiento giratorio (160) que conecta la parte (220) de cuello de la cámara (140) de separación al colector (150) de suministro de fluido y que proporciona, formado en el acoplamiento giratorio, una primera ruta (270) de comunicación de fluido entre el tubo (230) de inmersión y el primer puerto (170) de fluido, y una segunda ruta (275) de comunicación de fluido entre la ruta (260) de fluido de elución y el segundo puerto (175) de fluido, estando el acoplamiento giratorio (160) configurado para permitir la rotación de la cámara (140) de separación alrededor de un eje (280) de rotación a través de la parte (220) de cuello respecto al colector (150) de suministro de fluido, mientras el colector (150) de suministro de fluido se mantiene en una posición fija por la carcasa (130), y en donde la primera ruta (270) de comunicación de fluido que se comunica con el tubo (230) de inmersión está alineada con el eje (280) de rotación;

estando la parte (220) de cuello configurada además para conectarse al cabezal (135) del motor giratorio para hacer que gire la cámara (140) de separación alrededor del eje (280) de rotación, proporcionando el subsistema (1250) reemplazable de un solo uso un entorno cerrado para la ejecución de los procesos de centrifugación de flujo inverso.

Un sistema (100) centrífugo compacto de flujo inverso según la reivindicación 1, en donde la primera ruta (270) de comunicación de fluido la proporciona un tubo a través de un eje del acoplamiento giratorio (160).

Un sistema (100) centrífugo compacto de flujo inverso según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la ruta (260) del fluido de elución a través de la parte de cuello comprende una pluralidad de rutas de fluido desde el recinto (210) cónico de fluido hasta la ruta (260) de elución en la parte (220) de cuello, en comunicación de fluido con la segunda ruta (275) de comunicación de fluido a través del acoplamiento giratorio (160), y la cámara (140) de separación incluye una pared que separa el recinto (210) cónico de fluido desde la parte (220) de cuello, teniendo la pared una o más aberturas formadas en su interior para proporcionar al menos una ruta de fluido hasta la ruta (260) de elución en la parte (220) de cuello, y comprendiendo la segunda ruta (275) de comunicación de fluido una pluralidad de rutas de fluido desde la ruta (260) de elución en la parte (220) de cuello a través del acoplamiento giratorio (160) en comunicación de fluido con la segunda ruta (175) de comunicación de fluido.

Un sistema (100) centrífugo compacto de flujo inverso según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el conjunto (120) de válvulas comprende un conjunto de accionamiento de válvula de pinza que comprende una pluralidad de actuadores (810) de válvula de pinza, cada actuador (810) de válvula de pinza configurado para conectarse a una ruta (735) de fluido del colector (150) de suministro de fluido, y en donde el colector (150) de suministro de fluido incluye al menos una parte flexible en cada ruta (735) de fluido alineada con uno de los actuadores (810) de válvula de pinza, por lo que el operar el actuador (810) de válvula de pinza provoca la apertura o cierre de la ruta (735) de fluido, y en donde el colector (150) de suministro de fluido se configura mediante el accionamiento de los actuadores (810) de válvula de pinza y la conexión de los recipientes (1190) con conexiones 180 de fluido adecuadas para permitir la configuración selectiva de una ruta de fluido recirculante para el establecimiento del lecho fluidizado en la cámara (140) desde el recipiente (395) de suministro de suspensión celular, sin riesgo de pérdidas celulares sistemáticas.

5. Un sistema (100) centrífugo compacto de flujo inverso según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el colector (150) de suministro de fluido está configurado para alinear la parte (190) de acoplamiento de la bomba con la bomba peristáltica (110) cuando el colector (150) de suministro de fluido está colocado en la carcasa (130), y en donde la carcasa (130) está configurada para efectuar el acoplamiento operativo de la parte (190) de acoplamiento de la bomba con la bomba peristáltica (110) cuando la carcasa (130) está cerrada y, opcionalmente, la carcasa (130) se configura de tal modo que la geometría relativa de una puerta (1030) de carcasa y la bisagra (1020) de la puerta de carcasa hagan que un tubo (750) de la parte (190) de acoplamiento de la bomba se acople a un rodillo (1010) de bomba peristáltica para efectuar el acoplamiento operativo con la bomba peristáltica (110).

6. Un sistema (100) centrífugo compacto de flujo inverso según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, configurado para funcionar a velocidades de rotación de hasta 8000 revoluciones por minuto.

7. Un sistema (100) centrífugo compacto de flujo inverso según la reivindicación 6, en donde el recinto (210) cónico de fluido tiene un volumen de 5 ml a 20 ml y un radio de rotación de 50 a 70 mm, y preferiblemente el recinto de fluido tiene un volumen de 10 ml y un radio de rotación de 67 mm de eje a punta.

8. Un sistema (100) centrífugo compacto de flujo inverso según la reivindicación 6 o la reivindicación 7, configurado para la preparación de terapias celulares para permitir la recuperación del volumen de fluido de 1 ml a 10 ml para de 10 millones a 4 mil millones de células.

9. Un sistema (100) centrífugo compacto de flujo inverso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, configurado para funcionar a velocidades de rotación de hasta 200.000 revoluciones por minuto.

10. Un sistema (100) centrífugo compacto de flujo inverso según la reivindicación 9, en donde el recinto (210) cónico de fluido tiene un volumen de 0,1 ml a 0,5 ml y un radio de rotación de la punta de 10 a 30 mm.

11. Una cámara (140) de separación para un sistema (100) centrífugo compacto de flujo inverso, estando la cámara de separación configurada para un volumen de fluido bajo y una rotación de radio pequeño, y que comprende:

una parte (210) de recinto de fluido sustancialmente cónica;

una parte (220) de cuello conectada a la parte (210) de recinto de fluido sustancialmente cónica;caracterizado por

un tubo (230) de inmersión que se extiende centralmente a través del recinto (210) cónico de fluido desde la parte (220) de cuello hasta una punta cónica (240) del recinto (210) cónico de fluido para proporcionar una ruta de fluido a la punta cónica (240) del recinto (210) cónico de fluido;

una ruta (260) de elución a través de la parte (220) de cuello; y

un acoplamiento giratorio (160), conectado a la parte (220) de cuello, para permitir la rotación de la cámara (140) de separación alrededor de un eje (280) de rotación a través de la parte (220) de cuello, siempre que el acoplamiento giratorio (160) en él haya formado:

una primera ruta (270) de comunicación de fluido al tubo (230) de inmersión para la comunicación de fluido entre el tubo (230) de inmersión y un primer puerto (170) de fluido para la conexión a un colector (150) de suministro de fluido, y

una segunda ruta (275) de comunicación de fluido a una ruta (260) de fluido de elución para la comunicación de fluido con un segundo puerto (175) de fluido para la conexión al colector (150) de suministro de fluido, en donde la primera ruta (270) de comunicación de fluido que se comunica con el tubo (230) de inmersión está alineada con el eje (280) de rotación; y

la parte (220) de cuello está configurada además para acoplarse a un cabezal (135) de motor giratorio para hacer que gire la cámara (140) de separación alrededor del eje (280) de rotación.

12. Una cámara (140) de separación según la reivindicación 11, en donde la ruta (260) del fluido de elución a través del cuello comprende una pluralidad de rutas de fluido desde el recinto (210) cónico de fluido hasta la ruta (260) de elución en la parte (220) de cuello, en comunicación de fluido con la segunda ruta (275) de comunicación de fluido a través del acoplamiento giratorio (160), y la cámara (140) de separación incluye una pared que separa el recinto (210) cónico de fluido de la parte (220) de cuello, teniendo la pared aberturas formadas en su interior para proporcionar la pluralidad de rutas de fluido a la ruta (260) de elución en el cuello (220).

13. Una cámara (140) de separación según la reivindicación 11 o la reivindicación 12, en donde la punta (240) del recinto (210) cónico de fluido incluye una estructura (420, 430, 440) de canalización de fluido configurada para provocar la dispersión del fluido introducido a través del tubo (230) de inmersión a través del recinto (210) cónico de fluido, y la estructura (440) de canalización de fluido se forma además para mantener el tubo (230) de inmersión en una posición operativa.

14. Una cámara (140) de separación según una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13, en donde la parte de cono del recinto (210) cónico de fluido tiene una construcción unitaria.

15. Una cámara (140) de separación según la reivindicación 11, que tiene un radio de rotación de 67 mm, un diámetro de cono de 33 mm y una altura de cono de 38 mm.