ES3039485T3 - Vaccine adjuvant formulation - Google Patents

Vaccine adjuvant formulation

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ES3039485T3
ES3039485T3 ES18774978T ES18774978T ES3039485T3 ES 3039485 T3 ES3039485 T3 ES 3039485T3 ES 18774978 T ES18774978 T ES 18774978T ES 18774978 T ES18774978 T ES 18774978T ES 3039485 T3 ES3039485 T3 ES 3039485T3
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ES
Spain
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carbon atoms
substituted
compound
liposome
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Akihisa Fukushima
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Sumitomo Pharmaceuticals Co Ltd
Sumitomo Pharma Co Ltd
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Abstract

Se proporciona un liposoma útil como adyuvante de vacunas. Más específicamente, se proporciona un liposoma que comprende una bicapa lipídica que contiene dimiristoilfosfatidilcolina y fosfatidilglicerol de huevo, y un compuesto conjugado en el que un compuesto de bajo peso molecular que potencia la actividad fisiológica de TLR7 se une al escualeno mediante un enlace, estando dicho compuesto conjugado encapsulado en la bicapa lipídica. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Formulación de adyuvante de vacuna
Campo técnico
La presente invención se refiere a un liposoma útil como un adyuvante de vacuna, a una composición que comprende el liposoma y a un uso de la composición como un adyuvante de vacuna.
Antecedentes de la técnica
Las vacunas que comprenden una proteína o un péptido parcial de la misma a partir de microorganismos pueden producirse usando síntesis química o tecnología de recombinación genética y son ventajosas en términos de seguridad y proceso de producción. Por otro lado, las vacunas de subunidades que comprenden un péptido parcial (epítopo) tienden a tener una capacidad inmunoestimulante menor que la de las vacunas vivas y las vacunas inactivadas. En consecuencia, con el fin de potenciar la inmunogenicidad del epítopo y mejorar la actividad inmunoestimulante de la vacuna, se ha investigado para métodos profilácticos o terapéuticos usando un adyuvante y un antígeno en combinación. Los adyuvantes son un aditivo para mejorar las respuestas inmunitarias humorales y/o celulares a los antígenos, y los adyuvantes como el alumbre y la saponina se han usado como un adyuvante de vacunas. Recientemente, se reveló que el receptor tipo Toll (TLR, por sus siglas en inglés) juega un papel importante en la activación de la inmunidad innata, que es un mecanismo de defensa de los organismos vivos contra los microorganismos. De los diez TLR conocidos identificados en seres humanos, TLR7 se activa por su agonista para activar las células dendríticas (CD) y similares. Como resultado, se potencia la expresión de moléculas coestimuladoras de células T (CD80, CD86, CD40) y se producen citocinas inflamatorias incluyendo interferón tipo I (especialmente IFNa), TNFa, IL-6 o IL-12. Además de dicha activación de DC, se sabía que los agonistas de t LR7 activaban las células B y estimulaban aún más las células NK y las células T para promover la producción de IFNy y, por lo tanto, se espera que tengan actividad adyuvante de vacuna. De hecho, se ha informado actividad adyuvante de los agonistas de TLR7, tales como Resiquimod e Imiquimod (Documento de no Patente 1).
A partir de lo anterior, es necesario desarrollar un nuevo adyuvante de vacuna que active TLR7.
Por otro lado, el escualeno es una sustancia oleosa que se usa como componente de aceite para preparaciones de emulsiones de aceite en agua y de agua en aceite y un adyuvante que contiene escualeno tal como MF59 se ha usado como adyuvante para la vacuna contra la gripe (Documentos de no Patente 2, 3 y 4).
Técnica anterior
Documentos de Patentes
[Documento de Patente 1] WO00/12487
[Documento de Patente 2] WO2009/067081
[Documento de Patente 3] WO2010/133885
[Documento de Patente 4] WO2012/066335
[Documento de Patente 5] WO2012/066336
[Documento de Patente 6] WO2012/067268
[Documento de Patente 7] WO2012/067269
[Documento de Patente 8] WO2013/172479
Documentos no de patente
[Documento no de Patente 1] Vaccine 2011, 29, 3341^M. A. Tomai et al, Exp. Rev. Vaccine, 6, 835
[Documento no de Patente 2] G. Ottet al.Methods in Molecular Medicine, 2000, 42, 211-228
[Documento no de Patente 3] D. T. O'Haganet al.Vaccine 2012, 4341-4348
[Documento no de Patente 4] C.B. Fox, molecules 2009, 14, 3286
Sumario de la invención
Problema a resolver mediante la invención
La presente invención proporciona una composición útil como un adyuvante de vacuna que es excelente en estabilidad a largo plazo y actividad inmunoestimulante.
Medios para resolver el problema
Como resultado de estudios dedicados, los presentes inventores descubrieron que un compuesto en donde un compuesto de bajo peso molecular, que es un agonista de TLR7 que potencia la actividad fisiológica (función) del receptor tipo Toll 7 (TLR7), está unido químicamente al escualeno a través de un espaciador (en lo sucesivo en el presente documento denominado "un compuesto conjugado de la invención") exhibe una excelente actividad adyuvante al encapsularse en un liposoma que comprende un determinado componente lipídico.
La invención es como se define en las reivindicaciones adjuntas. También se describe en el presente documento:
[1] Un liposoma que comprende (1) y (2):
(1) una multicapa lipídica que comprende una mezcla de dos lípidos diferentes seleccionados del grupo que consiste en: fosfatidilcolina de soja hidrogenada (HSPC), dioleoilfosfatidilcolina (DOPC), diestearoilfosfatidilglicerol (DSPG), dioleoilfosfatidilglicerol (DOPG), dimiristoilfosfatidilcolina (DMPC) y fosfatidilglicerol de yema de huevo (EPG), o una mezcla de los dos lípidos diferentes y colesterol (Chol); y
(2) un compuesto conjugado en que un compuesto de bajo peso molecular que potencia la actividad fisiológica de TLR7 está unido químicamente a través de un espaciador al escualeno o a un lípido derivado del escualeno, estando dicho compuesto conjugado encapsulado en la multicapa lipídica de (1).
[2] El liposoma de acuerdo con [1], en donde la relación en peso del compuesto conjugado a los componentes lipídicos es de 1:8 a 1:250.
[3] Un liposoma que comprende el compuesto conjugado de acuerdo con [1] o [2], en donde la multicapa lipídica de (1) es una multicapa lipídica que comprende componentes lipídicos que comprenden una mezcla de dimiristoilfosfatidilcolina (DMPC) y fosfatidilglicerol de yema de huevo (EPG).
[4] El liposoma de acuerdo con uno cualquiera de [1] a [3], en donde la relación molar de dimiristoilfosfatidilcolina (DMPC) a fosfatidilglicerol de yema de huevo (EPG) es de 1:1 a 2:1.
[5] El liposoma de acuerdo con uno cualquiera de [1] a [4] caracterizado por que el compuesto de bajo peso molecular que mejora la actividad fisiológica de t LR7 tiene un peso molecular de 200 a 600 y tiene una cadena principal de adenina, una cadena principal de pirimidina, una cadena principal de imidazoquinolina, una cadena principal de imidazopiridina o una cadena principal de quinazolina.
[6] El liposoma de acuerdo con [5] en donde el compuesto de bajo peso molecular que potencia la actividad fisiológica de TLR7 tiene una cadena principal de pirimidina, una cadena principal de adenina o una cadena principal de imidazoquinolina.
[7] El liposoma de acuerdo con [6] en donde el compuesto de bajo peso molecular que mejora la actividad fisiológica de TLR7 comprende una estructura de fórmula (2), estando dicho compuesto de bajo peso molecular unido al espaciador:
[Fórmula química 1]
en donde
X es metileno, átomo de oxígeno, átomo de azufre, SO, SO2 o NR7 en donde R7 es un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo de 1 a 3 átomos de carbono;
R1 y R2 son independientemente un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo sustituido o no sustituido de 1 a 6 átomos de carbono, con la condición de que cuando el grupo alquilo esté sustituido, está sustituido con 1 a 4 sustituyentes iguales o diferentes seleccionados del grupo que consiste en grupo hidroxi, átomo de halógeno y un grupo alcoxi de 1 a 6 átomos de carbono;
R3 es un grupo alquilo de 1 a 6 átomos de carbono, un grupo alcoxi de 1 a 6 átomos de carbono o un grupo alquiltio de 1 a 6 átomos de carbono;
R4 es un átomo de hidrógeno, un átomo de halógeno, un grupo hidroxi, un grupo alquilo de 1 a 6 átomos de carbono, un grupo alcoxi de 1 a 6 átomos de carbono o un grupo ciano;
Y1 es un enlace sencillo, -(CR9R10)p-, -CH=CH- (CR9R10)q-[Fórmula química 2]
o - (CR9R10)r-O- (CR9'R10> en donde R9, R10, R9' y R10' son independientemente un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo de 1 a 4 átomos de carbono;
Y2 es un enlace sencillo o -C(O)-;
con la condición de que cuando el grupo alquilo esté sustituido, está sustituido con 1 a 4 sustituyentes iguales o diferentes seleccionados del grupo que consiste en grupo hidroxi y átomo de halógeno;
p es un número entero de 1 a 6 ;
q y q' son independientemente un número entero de 0 a 4;
r es un número entero de 0 a 5 y r' es un número entero de 1 a 5, con la condición de que la suma de r y r' sea 5 o menos y con la condición de que r' sea un número entero de 2 o más cuando Y2 es un enlace sencillo; y la línea de flecha representa un enlace al espaciador.
[8] El liposoma de acuerdo con una cualquiera de [1] a [6] en donde el compuesto conjugado es un compuesto de fórmula (1 ) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo:
[Fórmula química 3]
X es metileno, átomo de oxígeno, átomo de azufre, SO, SO2 o NR7 en donde R7 es un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo de 1 a 3 átomos de carbono; R1 y R2 son independientemente un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo sustituido o no sustituido de 1 a 6 átomos de carbono, con la condición de que cuando el grupo alquilo esté sustituido, está sustituido con 1 a 4 sustituyentes iguales o diferentes seleccionados del grupo que consiste en grupo hidroxi, átomo de halógeno y un grupo alcoxi de 1 a 6 átomos de carbono;
R3 es un grupo alquilo de 1 a 6 átomos de carbono, un grupo alcoxi de 1 a 6 átomos de carbono o un grupo alquiltio de 1 a 6 átomos de carbono;
R4 es un átomo de hidrógeno, un átomo de halógeno, un grupo hidroxi, un grupo alquilo de 1 a 6 átomos de carbono, un grupo alcoxi de 1 a 6 átomos de carbono o un grupo ciano;
Y1 es un enlace sencillo, -(CR9R10)p-, -CH=CH- (CR9R10)q-,
[Fórmula química 4]
o -(CR9R10)r-O- (CR9'R10> - en donde R9, R10, R9' y R10' son independientemente un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo de 1 a 4 átomos de carbono;
Y2 es un enlace sencillo o -C(O)-;
L es un alquileno de cadena lineal sustituido o no sustituido de 2 a 6 átomos de carbono o un grupo divalente derivado de un cicloalcano de 4 a 8 miembros, con la condición de que cuando el alquileno de cadena lineal o el cicloalcano esté sustituido, está sustituido con 1 a 4 sustituyentes iguales o diferentes seleccionados del grupo que consiste en un grupo alquilo de 1 a 5 átomos de carbono, grupo hidroxi y átomo de halógeno y con la condición de que uno cualquiera de los grupos metileno en el alquileno de cadena lineal de L esté opcionalmente reemplazado por un grupo carbonilo;
R5 y R6 son independientemente un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo sustituido o no sustituido de 1 a 6 átomos de carbono, o R5 o R6 se toma junto con cualquier átomo de carbono de L para formar un heterociclo saturado que contiene nitrógeno de 4 a 8 miembros, o R5 y R6 se toman juntos para formar un heterociclo saturado que contiene nitrógeno de 5 a 8 miembros sustituido o no sustituido, con la condición de que cuando el grupo alquilo esté sustituido, está sustituido con 1 a 4 sustituyentes iguales o diferentes seleccionados del grupo que consiste en un grupo hidroxi y un átomo de halógeno y con la condición de que cuando el heterociclo saturado que contiene nitrógeno de 4 a 8 miembros o el heterociclo saturado que contiene nitrógeno de 5 a 8 miembros esté sustituido, está sustituido con 1 a 4 sustituyentes iguales o diferentes seleccionados del grupo que consiste en un grupo metilo, un grupo etilo, un grupo propilo, un grupo hidroximetilo, un grupo hidroxietilo, un grupo carbonilo, un grupo hidroxi y un átomo de halógeno;
m es 0 o 1;
p es un número entero de 1 a 6;
q y q' son independientemente un número entero de 0 a 4; y
r es un número entero de 0 a 5 y r' es un número entero de 1 a 5, con la condición de que la suma de r y r' sea 5 o menos y con la condición de que r' sea un número entero de 2 o más cuando Y2 es un enlace sencillo.
[9] El liposoma de acuerdo con uno cualquiera de [1] a [8], en donde la multicapa lipídica es una bicapa lipídica.
[10] Una composición farmacéutica que comprende el liposoma de acuerdo con uno cualquiera de [1] a [9].
[11] Un adyuvante de vacuna que comprende el liposoma de acuerdo con uno cualquiera de [1] a [9].
[12] Una vacuna que comprende el liposoma de acuerdo con uno cualquiera de [1] a [9] y un antígeno.
[13] La vacuna de acuerdo con [12] en donde el antígeno es una sustancia derivada de un patógeno.
Efecto de la invención
El adyuvante de vacuna de la invención permite mejorar la respuesta inmunitaria específica a un antígeno y es estable durante un largo período de tiempo.
Breve descripción de los dibujos
[Fig. 1] La Fig. 1 muestra los resultados de la distribución del tamaño de partícula y la distribución del potencial eléctrico Zeta del liposoma del Ejemplo 5, que se diluyó con agua purificada inmediatamente después de su preparación y se midió mediante el método de dispersión de luz dinámica usando MALVERN Zetasizer Nano. La ordenada representa la intensidad de dispersión y la abscisa representa el tamaño de partícula y el potencial zeta, respectivamente. [Fig.2] La Fig. 2 muestra los resultados de la cuantificación ELISA de IgG2c específica de OVA en suero de ratones inmunizados, que se administraron por vía intramuscular con los liposomas del Ejemplo 1 y del Ejemplo 5. La ordenada representa el título de anticuerpos IgG2c específicos de OVA en suero. La abscisa representa las muestras administradas, que son las siguientes (entre paréntesis se indican las dosis de liposoma o de alumbre administradas).
1: control negativo del Ejemplo 5 (liposoma que no contiene ningún compuesto conjugado, es decir, liposoma vacío cuyo peso lipídico es equivalente al administrado con 50 pg/ratón de compuesto conjugado); 2: liposoma del Ejemplo 5 (50 pg/ratón); 3: liposoma del Ejemplo 5 (10 pg/ratón); 4: liposoma del Ejemplo 5 (2 pg/ratón); 5: control negativo del Ejemplo 1 (liposoma que no contiene compuesto conjugado, como en el anterior 1); 6 : liposoma del Ejemplo 1 (10 pg/ratón); 7: liposoma del Ejemplo 1 (2 pg/ratón); 8: liposoma del Ejemplo 1 (0,4 pg/ratón); 9: Alumbre (hidróxido de aluminio) (150 pg/ratón).
[Fig.3] La Fig. 3 es un gráfico que muestra la proporción de células T colaboradoras tipo 1 en esplenocitos de ratones, que se administraron por vía intramuscular con el liposoma del Ejemplo 1 o del Ejemplo 5. La abscisa representa lo mismo que en la Fig. 2.
[Fig.4] La Fig. 4 es un gráfico que muestra la proporción de células T CD8 positivas al tetrámero OVA en esplenocitos de ratones, que se administraron por vía intramuscular con el liposoma del Ejemplo 1 o del Ejemplo 5. La abscisa representa lo mismo que en la Fig. 2.
[Fig.5] La Fig. 5 es un gráfico que muestra la proporción de células T CD8 de memoria efectoras en esplenocitos de ratones, que se administraron por vía intramuscular con el liposoma del Ejemplo 1 o del Ejemplo 5. La abscisa representa lo mismo que en la Fig. 2.
Descripción de las realizaciones
El liposoma es una microvesícula que comprende una multicapa lipídica, tal como una membrana bicapa de moléculas lipídicas anfífilas (bicapa lipídica), que tiene una fase interna. Los lípidos que constituyen dicha multicapa lipídica pueden denominarse en el presente documento componentes lipídicos. La multicapa lipídica como se usa en el presente documento es preferentemente una bicapa lipídica. En el liposoma que constituye la formulación de la divulgación, los componentes lipídicos de la multicapa lipídica, preferentemente la bicapa lipídica, puede comprender una mezcla de dos lípidos diferentes seleccionados del grupo que consiste en: fosfatidilcolina de soja hidrogenada (HSPC: también denominado fosfolípido de soja hidrogenado), dioleoilfosfatidilcolina (DOPC), diestearoilfosfatidilglicerol (DSPG), dioleoilfosfatidilglicerol (DOPG), dimiristoilfosfatidilcolina (DMPC) y fosfatidilglicerol de yema de huevo (EPG: también conocido como fosfatidilglicerol de huevo), o una mezcla de dichos dos lípidos diferentes y colesterol (Chol).
Si los componentes lipídicos que constituyen el liposoma como se mencionó anteriormente tienen un grupo ácido o un grupo básico, pueden formar una sal farmacéuticamente aceptable tal como una sal de metal alcalino (por ejemplo, sal sódica, sal potásica). El liposoma de la divulgación puede contener otros componentes en una cantidad que no afecte sustancialmente a su estabilidad.
En una determinada realización, los componentes lipídicos que constituyen una bicapa lipídica comprenden una mezcla de DMPC y EPG. La relación molar de DMPC a EPG (DMPC:EPG) es, por ejemplo, 1:10 a 10:1, preferentemente de 1:4 a 4:1, más preferentemente de 1:1 a 2:1. En una realización particular, la relación molar de DMPC a EPG (DMPC:EPG) es 5:3.
En una realización particular, los componentes lipídicos que constituyen una bicapa lipídica comprenden una mezcla de HSPC, Chol y DSPG. La proporción de cada uno de HSPC, Chol y DSPG puede configurarse adecuadamente entre el 10 % y el 60 % para obtener un total del 100 %.
Por ejemplo, la proporción de HSPC:Chol:DSPG puede ser 50-60:25-30:10-25 (con un total de 100). En un ejemplo, HSPC:Chol:DSPG es aproximadamente 53,1:aproximadamente 26,3:aproximadamente 20,5 (con un total de 100).
En una realización particular, los componentes lipídicos que constituyen una bicapa lipídica comprenden una mezcla de DOPC, Chol y DOPG. La proporción de cada uno de DOPC, Chol y DOPG puede configurarse adecuadamente entre el 10 % y el 60 % para obtener un total del 100 %.
Por ejemplo, la proporción de DOPC:Chol:DOPG puede ser 50-60:25-30:10-25 (con un total de 100). En un ejemplo, DOPC:Chol:DOPG es aproximadamente 53,1:aproximadamente 26,3:aproximadamente 20,5 (con un total de 100).
Como se usa en el presente documento, "un compuesto conjugado encapsulado en una multicapa lipídica, preferentemente en una bicapa lipídica" o "un compuesto conjugado encapsulado en un liposoma" se refiere a un compuesto conjugado de la divulgación incluido dentro de una multicapa lipídica, preferentemente una bicapa lipídica, que constituye el liposoma, y también se refiere a un compuesto conjugado de la divulgación que existe en la superficie o dentro de una multicapa lipídica, preferentemente una bicapa lipídica, que constituye el liposoma.
El liposoma de la divulgación puede obtenerse de acuerdo con un método conocido para producir un liposoma, usando un compuesto conjugado y componentes lipídicos de la divulgación. Por ejemplo, una cantidad predeterminada del compuesto conjugado de la divulgación y los componentes lipídicos se disuelven en un disolvente orgánico adecuado (cloroformo, metanol, hexano, etc.) y la solución se coloca en un recipiente. El disolvente se elimina para formar una película fina en la pared del recipiente. La película se seca y a continuación se vierte una solución acuosa adecuada tal como una solución tampón en el recipiente para rehidratarla. Se aplica ultrasonidos para desprender la película, seguido de agitación para formar liposomas. El tamaño de partícula del liposoma puede ajustarse pasando la dispersión de liposomas obtenida a través de una extrusora con un filtro configurado adecuadamente para el tamaño de poro. Adicionalmente, a partir de la dispersión de liposomas obtenida de esta manera, el compuesto conjugado no incorporado al liposoma y los componentes lipídicos pueden eliminarse mediante filtración en gel, ultracentrifugación, diálisis, cromatografía de intercambio iónico o similares.
En una realización de la divulgación, la relación en peso del compuesto conjugado incorporado en un liposoma con respecto al peso total de los componentes lipídicos (compuesto conjugado:componentes lipídicos) es de 1:3 a 1:30, preferentemente de 1:5 a 1:15, más preferentemente de 1:8 a 1:12 y aún más preferentemente 1:10.
Los ejemplos del lípido derivado del escualeno como se usa en el presente documento incluyen (6E,10E,14E)-2,6,10,15,19-pentametilicosa-2,6,10,14,18-pentaeno. Dicho compuesto derivado de escualeno puede unirse apropiadamente a través de un espaciador mediante un método bien conocido en la técnica para proporcionar un compuesto conjugado de la divulgación.
Algunos ejemplos del compuesto de bajo peso molecular de la divulgación, que es un agonista de TLR7 que mejora la actividad fisiológica de TLR7, incluyen aquellos que tienen un peso molecular de 200 a 600, preferentemente un peso molecular de 250 a 500, más preferentemente un peso molecular de 300 a 500, y preferentemente aquellos que tienen una cadena principal de adenina, una cadena principal de pirimidina, una cadena principal de imidazoquinolina, una cadena principal de imidazopiridina o una cadena principal de quinazolina.
Los ejemplos del compuesto que tiene una cadena principal de adenina incluyen compuestos que tienen una cadena principal de 4-amino-8-oxo-purina (8-oxoadenina), tales como compuestos que tienen una cadena principal de 4-amino-8-oxo-purina sustituido en la posición 9 con un grupo alquilo (por ejemplo, un grupo alquilo de cadena lineal que tiene de 1 a 6 átomos de carbono) que puede estar sustituido con un anillo carbocíclico aromático de 5 o 6 miembros, un anillo heterocíclico aromático de 5 o 6 miembros o un anillo heterocíclico alifático que contiene nitrógeno de 4 a 7 miembros.
Los ejemplos específicos incluyen GSK-2245035 (2-[1(S)-metilbutoxi]-9-[5-(1-piperidinil)pentil]-8,9-dihidro-7H-adenin-8-ona) y compuestos como los divulgados en el documento WO98/01448, el documento WO99/28321, el documento WO02/085905, el documento WO2008/114008, el documento WO2008/114819, el documento WO2008/114817, el documento WO2008/114006, el documento WO2010/018131, el documento WO2010/018134, el documento WO2008/101867, el documento WO2010/018133 o el documento WO2009/005687.
Los ejemplos del compuesto que tiene una cadena principal de pirimidina incluyen compuestos que tienen una cadena principal de 2,4-diaminopirimidina tales como, por ejemplo, 2,4-diaminopirimidinas sustituidas apropiadamente en la posición 6 con un sustituyente tal como un grupo alquilo y en la posición 5 con un grupo alquilo (por ejemplo, un grupo alquilo de cadena lineal que tiene de 1 a 6 átomos de carbono) que puede estar sustituido con un anillo carbocíclico aromático de 5 o 6 miembros, un anillo heterocíclico aromático de 5 o 6 miembros o un anillo heterocíclico alifático que contiene nitrógeno de 4 a 7 miembros. Los ejemplos específicos incluyen compuestos como se divulga en el documento WO00/12487, el documento WO2010/133885, el documento WO2013/172479 o el documento WO2012/136834.
Los ejemplos del compuesto que tiene una cadena principal de imidazoquinolina incluyen compuestos que tienen una cadena principal de 4-amino-1H-imidazo[4,5 - c]quinolina, incluyendo imiquimod, resiquimod y 852A (N-[4-(4-amino-2 -etil-1H-imidazo[4,5-c]quinolin-1-il) butil]metanosulfonamida), tal como 4-amino-1H[4,5- c]quinolina sustituida con un grupo alquilo C1-6 o un grupo alcoxi C1-6 en la posición 1 y con un grupo alquilo C1-6 o un grupo alcoxi C1-6 en la posición 2. Los ejemplos específicos incluyen compuestos como se divulga en el documento WO2010/48520, el documento WO2008/135791, el documento US4689338, el documento US4698348 o el documento WO2007/030777.
Los ejemplos del compuesto que tiene una cadena principal de imidazopiridina incluyen compuestos que tienen una cadena principal de 4-amino-1,3-dihidro-2H-imidazo[4,5-c]piridin-2-ona, tales como compuestos que tienen una cadena principal de 4-amino-1,3-dihidro-2H-imidazo[4,5-c]piridin-2-ona sustituido en la posición 6 o 7 con un grupo alquilo C1-6 o un grupo alcoxi C1-6 que puede estar sustituido con halógeno y en la posición 1 con un grupo alquilo (por ejemplo, un grupo alquilo de cadena lineal que tiene de 1 a 4 átomos de carbono) que puede estar sustituido con un anillo carbocíclico aromático de 5 o 6 miembros, un anillo heterocíclico aromático de 5 o 6 miembros o un anillo heterocíclico alifático que contiene nitrógeno de 4 a 7 miembros. Algunos ejemplos específicos incluyen compuestos como se divulgan en el documento WO2007/93901 y el documento PF-4171455 (4-amino-1-bencil-6-(trifluorometil)-1,3-dihidro-2H-imidazo[4,5- c]piridin-2-ona).
Los ejemplos del compuesto que tiene una cadena principal de quinazolina incluyen derivados que tienen una cadena principal de 2,4-diaminoquinazolina, tales como compuestos que tienen una cadena principal de 2,4-diaminoquinazolina sustituido en la posición 4 con un grupo alquilo (por ejemplo, un grupo alquilo de cadena lineal o ramificada que tiene de 1 a 8 átomos de carbono) que puede sustituirse apropiadamente con un grupo hidroxilo o un átomo de halógeno. Los ejemplos específicos incluyen compuestos como se divulgan en el documento WO2012/156498 o el documento WO2014/76221.
Además, los ejemplos del compuesto de bajo peso molecular que es un agonista de TLR7 incluyen besatrimod (4-amino-2-butoxi-8-[[3-[(pirrolidin-1- il)metil]fenil]metil]-7,8-dihidropteridina-6(5H)-ona) y compuestos como se divulgan en el documento Wo 2010/077613.
Los ejemplos del espaciador en el compuesto conjugado de la divulgación incluyen espaciadores químicamente estables y bien conocidos que permiten conectar el compuesto de bajo peso molecular y el escualeno o un lípido derivado del escualeno. Los ejemplos específicos incluyen enlazadores que comprenden uno o una combinación de alquileno C1-4, un enlace amida, un enlace éster, un enlace éter, un enlace tioéter, un enlace urea, un enlace uretano y un enlace sulfonamida.
En una realización de la divulgación, el compuesto de bajo peso molecular de la divulgación que mejora la actividad fisiológica de TLR7 comprende una estructura representada por la fórmula (2) anterior.
En una realización de la invención, el compuesto conjugado de la invención es un compuesto representado por la fórmula (1) anterior o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
A continuación se describen las definiciones de cada término de la fórmula (1) o de la fórmula (2).
La expresión "átomo de halógeno" incluye átomo de flúor, átomo de cloro, átomo de bromo y átomo de yodo y, preferentemente, átomo de flúor y átomo de cloro.
La expresión "alquileno de cadena lineal" incluye un alquileno de cadena lineal de 1 a 6 átomos de carbono. Los ejemplos específicos del alquileno de cadena lineal incluyen, pero no se limitan a, metileno, etileno, n-propileno y nbutileno.
La expresión "grupo alquilo" incluye un grupo alquilo de cadena lineal o ramificada de 1 a 6 átomos de carbono. Los ejemplos específicos del grupo alquilo incluyen, pero no se limitan a, metilo, etilo, propilo, isopropilo, butilo, isobutilo y ferc-butilo.
El término "cicloalcano" incluye cicloalcanos de 4 a 8 miembros, específicamente, ciclobutano, ciclopentano, ciclohexano, cicloheptano y ciclooctano, y preferentemente, ciclopentano, ciclohexano y cicloheptano.
La expresión "grupo divalente derivado del cicloalcano" incluye, pero no limitado a, un grupo divalente capaz de unirse a átomos vecinos en diferentes átomos de carbono del cicloalcano.
La expresión "grupo alcoxi" incluye un grupo alcoxi de cadena lineal o ramificada de 1 a 6 átomos de carbono.
Los ejemplos específicos de grupos alcoxi incluyen, pero no se limitan a, metoxi, etoxi, propoxi, isopropoxilo, butoxi, isobutoxi, terc-butoxi, pentoxi e isopentoxi.
La expresión "heterociclo saturado que contiene nitrógeno de 4 a 8 miembros" incluye heterociclo saturado que contiene nitrógeno de 4 a 8 miembros que contiene de 1 a 3 heteroátomos seleccionados de 2 o 3 átomos de nitrógeno, 0 o 1 átomo de oxígeno y 0 o 1 átomo de azufre en donde al menos dos átomos de nitrógeno están contenidos en el anillo. Los ejemplos específicos incluyen azetidina, pirrolidina, piperidina, perhidroazepina, imidazolidina, piperazina, morfolina, tiomorfolina y perhidro-1,4-diazepina.
El "heterociclo saturado que contiene nitrógeno de 5 a 8 miembros" puede ser uno de 5 a 8 miembros del "heterociclo saturado que contiene nitrógeno de 4 a 8 miembros" mencionado anteriormente.
Los ejemplos del grupo sustituyente para el heterociclo saturado que contiene nitrógeno incluyen preferentemente un grupo metilo, un grupo etilo, un grupo propilo, un grupo hidroximetilo, un grupo hidroxietilo, un grupo carbonilo, un grupo hidroxi y un átomo de halógeno y más preferentemente un grupo hidroxi y un átomo de halógeno. El heterociclo saturado que contiene nitrógeno puede estar sustituido con 1 a 4 de dichos grupos sustituyentes iguales o diferentes. En la Fórmula (1), X representa metileno, átomo de oxígeno, átomo de azufre, SO, SO2 o NR7 en donde R7 representa un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo de 1 a 3 átomos de carbono. R7 representa preferentemente un átomo de hidrógeno o un grupo metilo. X preferentemente representa metileno.
En la Fórmula (1), R1 representa preferentemente un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo de 1 a 4 átomos de carbono. Los ejemplos específicos de R1 incluyen un grupo metilo, un grupo etilo, un grupo propilo y un grupo butilo. En la Fórmula (1), R2 representa un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo sustituido o no sustituido de 1 a 4 átomos de carbono. Cuando el grupo alquilo está sustituido, los ejemplos específicos del grupo sustituyente incluyen el grupo hidroxi.
Los ejemplos específicos de R2 incluyen un átomo de hidrógeno, un grupo metilo, un grupo etilo, un grupo propilo, un grupo hidroximetilo y un grupo hidroxietilo.
En la Fórmula (1), R3 representa preferentemente un grupo alquilo de 1 a 4 átomos de carbono, un grupo alcoxi de 1 a 4 átomos de carbono o un grupo alquiltio de 1 a 4 átomos de carbono, más preferentemente un grupo alquilo de 1 a 3 átomos de carbono o un grupo alcoxi de 1 a 3 átomos de carbono. Los ejemplos específicos de R3 incluyen un grupo metilo, un grupo etilo, un grupo propilo y un grupo butilo y más preferentemente un grupo metilo.
En la fórmula (1), los ejemplos de R4 incluyen preferentemente un átomo de hidrógeno, un grupo alquilo de 1 a 3 átomos de carbono, un grupo alcoxi comprende de 1 a 3 átomos de carbono, un átomo hidroxi y un átomo de halógeno, y más preferentemente un átomo de hidrógeno y un grupo metoxi.
En la Fórmula (1), Y1 representa preferentemente un enlace sencillo, -(CR9R10)p- o - (CR9R10)r-O- (CR9'R10')r'- en donde R9, R10, R9' y R10' son independientemente un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo de 1 a 4 átomos de carbono. R9, R10, R9' y R10' preferentemente son independientemente un átomo de hidrógeno o un grupo metilo, más preferentemente un átomo de hidrógeno. Más preferentemente, Y1 es un enlace sencillo o -(CR9R10)p-.
En la fórmula (1), cuando Y1 es -(CR9R10)p-, p es preferentemente un número entero de 1 a 4, más preferentemente 1, 2 o 3.
En la fórmula (1), cuando Y1 representa -CH=CH- (CR9R10)q- o
[Fórmula química 5]
q y q1 preferentemente son independientemente un número entero de 0 a 3, más preferentemente 0 o 1.
En la fórmula (1), cuando Y1 representa -(CR9R10)r-O- (CR9'R10')r'-, r es preferentemente un número entero de 0 a 3 y r1 es preferentemente de 1 a 4, con la condición de que la suma de r y r1 sea 5 o menos, y más preferentemente r es 0 o 1 y r' es 1 o 2.
En la fórmula (1), cuando Y1 es un enlace sencillo o - (CR9R10)p-, Y2 representa un enlace sencillo o -C(O)-(carbonilo).
En una realización preferida, Y1 representa un enlace sencillo e Y2 representa -C(O)-.
En una realización preferida, Y1 representa -(CR9R10)p- e Y2 representa un enlace sencillo en donde R9 y R10 preferentemente son independientemente un átomo de hidrógeno o un grupo metilo, más preferentemente un átomo de hidrógeno, y p es preferentemente un número entero de 1 a 4, más preferentemente 1, 2 o 3.
En una realización de la presente invención, L en la fórmula (1) es un alquileno de cadena lineal de 2 a 4 átomos de carbono, preferentemente alquileno de cadena lineal de 2 o 3 átomos de carbono y más preferentemente etileno. En una realización de la invención, L en la fórmula (1) representa un grupo divalente derivado de un cicloalcano de 4 a 8 miembros, más preferentemente un grupo divalente derivado de cicloalcano de 5 o 6 miembros. Los ejemplos específicos del grupo divalente incluyen los siguientes grupos divalentes.
[Fórmula química 6]
En una realización de la invención, R5 y R6 en la fórmula (1) representa un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo sustituido o no sustituido de 1 a 3 átomos de carbono, preferentemente de forma independiente un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo de 1 a 3 átomos de carbono, más preferentemente de forma independiente un átomo de hidrógeno o un grupo metilo, y aún más preferentemente un átomo de hidrógeno. Cuando el grupo alquilo está sustituido, está sustituido con 1 a 4 sustituyentes iguales o diferentes seleccionados de un grupo hidroxi o un átomo de halógeno. En una realización de la invención, o bien R5 o R6 en la fórmula (1) puede tomarse junto con cualquier átomo de carbono de L para formar un heterociclo saturado que contiene nitrógeno de 4 a 8 miembros, preferentemente un heterociclo saturado que contiene nitrógeno de 4 a 6 miembros. Los ejemplos específicos del heterociclo saturado que contiene nitrógeno de 4 a 8 miembros formado por R5 en combinación con cualquier átomo de carbono de L incluyen los siguientes.
[Fórmula química 7]
en donde R6 representa un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo sustituido o no sustituido de 1 a 6 átomos de carbono.
Los ejemplos específicos del heterociclo saturado que contiene nitrógeno de 4 a 8 miembros formado por R6 en combinación con cualquier átomo de carbono de L incluyen los siguientes.
[Fórmula química 8]
en donde R5 representa un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo sustituido o no sustituido de 1 a 6 átomos de carbono.
En una realización de la invención, R5 y R6 en la fórmula (1) pueden tomarse juntos para formar un heterociclo saturado que contiene nitrógeno de 5 a 8 miembros, sustituido o no sustituido, preferentemente heterociclo saturado que contiene nitrógeno de 5 o 6 miembros. Los ejemplos específicos de dicho heterociclo saturado que contiene nitrógeno incluyen los heterociclos saturados que contienen nitrógeno de las siguientes fórmulas:
[Fórmula química 9]
Cuando R5 o R6 se toma junto con cualquier átomo de carbono de L para formar un heterociclo saturado que contiene nitrógeno de 4 a 8 miembros sustituido o cuando R5 y R6 se toman juntos para formar un heterociclo saturado que contiene nitrógeno de 5 a 8 miembros sustituido, el grupo sustituyente es preferentemente de 1 a 4 sustituyentes iguales o diferentes seleccionados de un grupo hidroxi o un átomo de halógeno.
En la fórmula (1), m representa preferentemente 1.
En una realización preferida, el compuesto de fórmula (1) es un compuesto en donde X representa metileno, R1 representa un grupo alquilo de 1 a 4 átomos de carbono,
R2 representa un átomo de hidrógeno, un grupo alquilo de 1 a 3 átomos de carbono o un grupo alquilo de 1 a 3 átomos de carbono sustituido con un grupo hidroxi,
R3 representa un grupo alquilo de 1 a 3 átomos de carbono o un grupo alcoxi de 1 a 3 átomos de carbono,
R4 representa un átomo de hidrógeno, un átomo de halógeno, un grupo hidroxi, un grupo alquilo de 1 a 6 átomos de carbono o un grupo alcoxi de 1 a 6 átomos de carbono,
Y1 representa un enlace sencillo o -(CR9R10)p,
Y2 representa -C(O)-,
L representa un alquileno de cadena lineal de 2 a 6 átomos de carbono,
R5 y R6 representan independientemente un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo de 1 a 3 átomos de carbono, o R5 o R6 se toma junto con cualquier átomo de carbono de L para formar un heterociclo saturado que contiene nitrógeno de 4 a 8 miembros, o R5 y R6 se toman juntos para formar un heterociclo saturado que contiene nitrógeno de 4 a 8 miembros sustituido o no sustituido,
m representa 0 o 1 , preferentemente 1.
En una realización preferida, el compuesto de fórmula (1) es un compuesto en donde
X representa metileno,
R1 representa un grupo alquilo de 1 a 4 átomos de carbono,
R2 representa un átomo de hidrógeno, un grupo alquilo de 1 a 3 átomos de carbono o un grupo alquilo de 1 a 3 átomos de carbono sustituido con un grupo hidroxi,
R3 representa un grupo alquilo de 1 a 3 átomos de carbono o un grupo alcoxi de 1 a 3 átomos de carbono,
R4 representa un átomo de hidrógeno, un átomo de halógeno, un grupo hidroxi, un grupo alquilo de 1 a 6 átomos de carbono o un grupo alcoxi de 1 a 6 átomos de carbono,
Y1 representa -(CR9R10)p- Y2 representa un enlace sencillo,
L representa un alquileno de cadena lineal de 2 a 6 átomos de carbono,
R5 y R6 representan independientemente un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo de 1 a 3 átomos de carbono, o R5 o R6 se toma junto con cualquier átomo de carbono de L para formar un heterociclo saturado que contiene nitrógeno de 4 a 8 miembros, o R5 y R6 se toman juntos para formar un heterociclo saturado que contiene nitrógeno de 4 a 8 miembros sustituido o no sustituido,
m representa 0 o 1, preferentemente 1.
En una realización preferida, el compuesto de fórmula (1) es un compuesto en donde
X representa metileno,
R1 representa un grupo alquilo de 1 a 4 átomos de carbono,
R2 representa un átomo de hidrógeno, un grupo alquilo de 1 a 3 átomos de carbono o un grupo alquilo de 1 a 3 átomos de carbono sustituido con un grupo hidroxi,
R3 representa un grupo alquilo de 1 a 3 átomos de carbono o un grupo alcoxi de 1 a 3 átomos de carbono,
R4 representa un átomo de hidrógeno, un átomo de halógeno, un grupo hidroxi, un grupo alquilo de 1 a 6 átomos de carbono o un grupo alcoxi de 1 a 6 átomos de carbono,
Y1 representa un enlace sencillo e Y2 representa -C(O)-, o Y1 representa -(CR9R10)p- e Y2 representa un enlace sencillo, L representa un alquileno de cadena lineal de 2 a 6 átomos de carbono,
R5' y R6' representan independientemente un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo de 1 a 3 átomos de carbono, m representa 0 o 1, preferentemente 1.
Los ejemplos de compuestos conjugados preferidos de la invención incluyen los siguientes compuestos o sales farmacéuticamente aceptables de los mismos:
(4E,8E,12E,16E,20E)-N-{2-[{4-[(2-amino-4-{[1-hidroxihexan-3-il]amino}-6-metilpirimidin-5-il)metil]bencil}(metil)amino]etil}-4,8,12,17,21,25-hexametilhexacosa-4,8,12,16,20,24-hexaenamida;
(4E,8E,12E,16E,20E)-1-(4-{4-[(2-amino-4-{[1-hidroxipentan-2-il]amino}-6-metilpirimidin-5-il)metil]-3-metoxibencil}piperazin-1-il)-4,8,12,17,21,25-hexametilhexacosa-4,8,12,16,20,24-hexaen-1-ona;
(4E,8E,12E,16E,20E)-1-(4-{4-[(2-amino-4-{[1-hidroxipentan-2-il]amino}-6-metilpirimidin-5-il)metil]-3-metoxibenzoil}piperazin-1-il)-4,8,12,17,21,25-hexametilhexacosa-4,8,12,16,20,24-hexaen-1-ona;
4-[(2-amino-4-{[1-hidroxipentan-2-il]amino}-6-metilpirimidin-5-il)metil]-N-(2-{[(4E,8E,12E,16E,20E)-4,8,12,17,21,25-hexametilhexacosa-4,8,12,16,20,24-hexaenoil]amino}etil)-3-metoxibenzamida; y
4-[(2-amino-4-{[1-hidroxipentan-2-il]amino}-6-metilpirimidin-5-il)metil]-N-(2-{[(4E,8E,12E,16E,20E)-4,8,12,17,21,25-hexametilhexacosa-4,8,12,16,20,24-hexaenoil](metil)amino}etil)-3-metoxibenzamida.
Como alternativa,
(4E,8E,12E,16E,20E)-N-{2-[{4-[(2-amino-4-{[(3S)-1-hidroxihexan-3-il]amino}-6-metilpirimidin-5-il)metil]bencil}(metil)amino]etil}-4,8,12,17,21,25-hexametilhexacosa-4,8,12,l6,20,24-hexaenamida;
(4E,8E,12E,16E,20E)-1-(4-{4-[(2-amino-4-{[(2S)-1-hidroxipentan-2-il]amino}-6-metilpirimidin-5-il)metil]-3-metoxibencil}piperazin-1-il)-4,8,12,17,21,25-hexametilhexacosa-4,8,12,16,20,24-hexaen-1-ona;
(4E,8E,12E,16E,20E)-1-(4-{4-[(2-amino-4-{[(2S)-1-hidroxipentan-2-il]amino}-6-metilpirimidin-5-il)metil]-3-metoxibenzoil}piperazin-1-il)-4,8,12,17,21,25-hexametilhexacosa-4,8,12,16,20,24-hexaen-1-ona;
4-[(2-amino-4-{[(2S)-1-hidroxipentan-2-il]amino}-6-metilpirimidin-5-il)metil]-N-(2-{[(4E,8E,12E,16E,20E)-4.8.12.17.21.25- hexametilhexacosa-4,8,12,16,20,24-hexaenoil]amino}etil)-3-metoxibenzamida; y
4-[(2-amino-4-{[(2S)-1-hidroxipentan-2-il]amino}-6-metilpirimidin-5-il)metil]-N-(2-{[(4E,8E,12E,16E,20E)-4.8.12.17.21.25- hexametilhexacosa-4,8,12,16,20,24-hexaenoil](metil)amino}etil)-3-metoxibenzamida.
Los ejemplos de la sal farmacéuticamente aceptable del compuesto de la fórmula (1) como se usa en el presente documento incluyen sales de adición de ácido o sales de adición de base del compuesto de la fórmula (1). Los ejemplos de sales de adición de ácido incluyen sales de adición de ácido con ácidos inorgánicos u orgánicos tales como ácido clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido sulfúrico, ácido trifluoroacético, ácido cítrico y ácido maleico.
Los ejemplos de sales de adición de base incluyen sales de metales alcalinos tales como la sal de sodio y la sal de potasio, sales de metales alcalinotérreos tales como sal de calcio y sal de amonio.
El compuesto de la fórmula (1) puede prepararse mediante los siguientes procesos usando un compuesto conocido como material de partida.
El material de partida puede usarse como una sal. También, los siguientes procesos son meramente ilustrativos y el compuesto puede producirse mediante otro proceso adecuado basándose en el conocimiento de una persona experta en síntesis orgánica.
[Proceso 1 para la preparación del Compuesto (1)]
Puede prepararse un compuesto de fórmula (1) o una sal del mismo, por ejemplo, mediante el siguiente proceso. [Fórmula química 10]
El compuesto (1) puede prepararse haciendo reaccionar el compuesto (3) con el compuesto (2) en un disolvente inerte, usando un agente condensante, opcionalmente en presencia de una base.
La base no está limitada siempre que sea usada por una persona experta en la materia en reacciones químicas orgánicas, y los ejemplos incluyen bases orgánicas tales como N-metilmorfolina, trietilamina, diisopropiletilamina, tributilamina, 1,8-diazabiciclo[4.3.0]non-5-eno, 1,4-diazabiciclo[5.4.0]undec-7-eno, piridina, dimetilaminopiridina y picolina; y bases inorgánicas tales como bicarbonato sódico, bicarbonato potásico, carbonato sódico y carbonato potásico. La base puede usarse generalmente en una cantidad de 0,1 a 100 equivalentes, preferentemente de 1 a 5 equivalentes, al compuesto (3).
El agente condensante puede ser uno de aquellos descritos en el Curso de Química Experimental, Vol. 22, editado por The Chemical Society of Japan, Maruzen Co., Ltd., y los ejemplos incluyen ésteres de ácido fosfórico tales como cianofosfato de dietilo y azida de difenilfosforilo; carbodiimidas tales como clorhidrato de 1-etil-3-(3-dietilaminopropil)-carbodiimida (WSC*h C1) y diciclohexilcarbodiimida (DCC); combinaciones de un disulfuro tales como disulfuro de 2,2'-dipiridilos y una fosfina tal como trifenilfosfina; haluros de fósforo tales como cloruro de N,N'-bis(2-oxo-3-oxazolidinil)fosfínico (BOPC1); combinaciones de un diéster de ácido azodicarboxílico tal como azodicarboxilato de dietilo y una fosfina tal como trifenilfosfina; haluros de 2-halo-1-alquilpiridinio inferior, tales como yoduro de 2-cloro-1-metilpiridinio; 1,1'-carbonildiimidazol (CDI); difenilfosforil azida (DPPA); cianuro de dietilfosforilo (DEPC); tetrafluoroboratos como tetrafluoroborato de 2-(1H-benzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluronio (TBTU) y tetrafluoroborato de 2-cloro-1,3-dimetilimidazolidinio (CIB); fosfatos tales como hexafluorofosfato de 2-(1H-benzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluronio (HBTU), hexafluorofosfato de benzotriazol-1-iloxitris(dimetilamino)fosfonio (BOP), hexafluorofosfato de benzotriazol-1-iloxitris(pirrolidino)fosfonio (PYBOP) y hexafluorofosfato de 2-(7-aza-1H-benzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluronio (HATU).
Los ejemplos del disolvente inerte incluyen disolventes de éter tales como tetrahidrofurano, éter dietílico, 1,4-dioxano, 1.2- dimetoxietano; disolventes de hidrocarburo tales como hexano, heptano, tolueno, benceno y xileno; disolventes de hidrocarburos halogenados tales como diclorometano, cloroformo y dicloroetano; disolventes de cetona tales como acetona; disolventes apróticos tales como acetonitrilo, N,N'-dimetilformamida, dimetilsulfóxido y hexametilfosforamida; y una mezcla de los mismos. La temperatura de reacción se selecciona preferentemente de, pero no limitado a, el intervalo de aproximadamente -70 °C a 100 °C, más preferentemente de 0 °C a 40 °C.
Como alternativa, el Compuesto (3) puede convertirse en un haluro de ácido usando un agente halogenante (por ejemplo, 1-cloro-N,N,2-trimetilpropenilamina, oxicloruro de fósforo, tricloruro de fósforo, cloruro de tionilo, pentacloruro de fósforo) y a continuación hacerse reaccionar con el Compuesto (2) en un disolvente inerte, opcionalmente en presencia de una base, para obtener el Compuesto (1).
Los ejemplos del disolvente inerte incluyen disolventes de éter tales como tetrahidrofurano, éter dietílico, 1,4-dioxano, 1.2- dimetoxietano; disolventes de hidrocarburo tales como hexano, heptano, tolueno, benceno y xileno; disolventes de hidrocarburos halogenados tales como diclorometano, cloroformo y dicloroetano; disolventes de éster tales como acetato de etilo y acetato de isopropilo; disolventes de cetona tales como metiletilcetona y acetona; y disolventes apróticos tales como acetonitrilo, N,N'-dimetilformamida, dimetilsulfóxido y hexametilfosforamida. Los ejemplos de la base incluyen bases orgánicas tales como N-metilmorfolina, trietilamina, diisopropiletilamina, tributilamina, 1,8-diazabiciclo[4.3.0]non-5-eno, 1,4-diazabiciclo[5.4.0]undec- 7-eno, piridina, dimetilaminopiridina, picolina. El agente halogenante puede usarse en una cantidad de 0,1 a 100 equivalentes, preferentemente de 0,8 a 3 equivalentes, al compuesto (3). La temperatura de reacción se selecciona preferentemente de, pero no limitado a, el intervalo de aproximadamente -30 °C a 60 °C.
El Compuesto (3) puede prepararse de acuerdo con un método bien conocido en la técnica (véase Org. Biomol. Chem.
2 011, 9, 4367).
[Proceso 1 para la preparación del Compuesto (2)]
El Compuesto (2a), en donde Y2 en la fórmula (2) es -C(O)-, o una sal del mismo puede prepararse mediante el siguiente proceso.
[Fórmula química 11]
en donde X-, R1, R2, R3, R4, R5, R6, R1 y L son como se han definido anteriormente.
El Compuesto (2a) puede sintetizarse a partir del Compuesto (4) y el Compuesto (5a) de acuerdo con un método como el descrito para la preparación del Compuesto (1).
El Compuesto (4) puede prepararse de acuerdo con un método bien conocido en la técnica, tales como aquellos descritos en el documento WO 2009/067081 y el documento WO 2010/103885.
[Proceso 2 para la preparación del Compuesto (2)]
El Compuesto (2b), en donde Y2 en la fórmula (2) es un enlace sencillo o una sal del mismo, puede prepararse, por ejemplo, mediante el siguiente proceso.
[Fórmula química 12]
en donde X-, R1, R2, R3, R4, R5, R6 y L son como se han definido anteriormente, Y1 es -(CR9R10)p-, -CH=CH- (CR9R10)q-, o
[Fórmula química 13]
en donde p, q y q' son como se definen anteriormente, y
(1) Q1 representa -Y1RNH5 y Q2 representa CHO; o
(2) Q1 representa -Y1'-CHO, en donde Y1' está ausente o representa alquileno e -Y1' - (CR9R10) - corresponde a -Y1-, y Q2 representa -CH2RNH5
El Compuesto (2b) puede prepararse acoplando el Compuesto (6) y el Compuesto (5b) en una condición de aminación reductora bien conocida en la técnica. Específicamente, un compuesto aldehido y un compuesto amina pueden hacerse reaccionar en un disolvente con un agente reductor, tales como triacetoxiborohidruro sódico y cianoborohidruro sódico, en presencia o ausencia de un ácido tal como ácido acético para preparar el Compuesto (2b).
El Compuesto (6) puede prepararse de acuerdo con un método bien conocido en la técnica, tales como aquellos descritos en el documento WO2010/133885, el documento WO2012/066335 y el documento WO2012/066336.
[Proceso 3 para la preparación del Compuesto (2)]
También, el Compuesto (2b) o una sal del mismo puede prepararse de acuerdo con el siguiente proceso.
[Fórmula química 14]
o - (CR9R10)r-O- (CR9'R10>-, en donde R9, R10, R9', R10', p, q, q1, r y r1 son como se definen anteriormente y LG es un grupo saliente.
Etapa 1
El Compuesto (7) puede prepararse de acuerdo con un método bien conocido en la técnica (véase el documento WO 2010/133885, el documento WO 2012/066336, etc.). El grupo saliente LG en el compuesto (8) no está limitado siempre que sea bien conocido como un grupo saliente en la técnica y un átomo de halógeno, un grupo alquilsulfoniloxi, un grupo arilsulfoniloxi o similares pueden usarse apropiadamente. El Compuesto (8) puede prepararse haciendo reaccionar el Compuesto (7) con cloruro de metanosulfonilo, cloruro de p-toluenosulfonilo o similares, en presencia de una base tales como trietilamina, diisopropiletilamina, piridina, dimetilaminopiridina, carbonato sódico, carbonato potásico o similares. La temperatura de reacción se selecciona preferentemente de, pero no limitado a, el intervalo de aproximadamente 0 °C a 120 °C.
Etapa 2
El Compuesto (2b) puede prepararse haciendo reaccionar el Compuesto (8) con el Compuesto (5a) en un disolvente inerte en presencia de una base.
La base no está limitada siempre que se use como una base en una reacción habitual, y los ejemplos incluyen bases orgánicas tales como N-metilmorfolina, trietilamina, diisopropiletilamina, tributilamina, 1,8- diazabiciclo[4.3.0]non-5-eno, 1,4-diazabiciclo[5.4.0]undec- 7-eno, piridina, dimetilaminopiridina; bases inorgánicas tales como bicarbonato sódico, bicarbonato potásico, carbonato sódico, carbonato potásico, carbonato de cesio, hidróxido sódico e hidruro sódico. La base puede usarse generalmente en una cantidad de 0,1 a 100 equivalentes, preferentemente de 1 a 3 equivalentes, al Compuesto (8).
Los ejemplos del disolvente inerte incluyen disolventes de éter tales como tetrahidrofurano, éter dietílico, 1,4-dioxano, 1,2-dimetoxietano; disolventes de hidrocarburo tales como hexano, heptano, tolueno, benceno y xileno; disolventes apróticos tales como acetonitrilo, N, N'-dimetilformamida, N-metil pirrolidona, dimetilsulfóxido; y una mezcla de los mismos. La temperatura de reacción se selecciona preferentemente de, pero no limitado a, el intervalo de aproximadamente 0 °C a 120 °C.
[Proceso 4 para la preparación del Compuesto (2)]
También, el Compuesto (2b) o una sal del mismo puede prepararse de acuerdo con el siguiente proceso.
[Fórmula química 16]
en donde X-, R1, R2, R3, R4, R5 y R6 son como se han definido anteriormente, L es alquileno sustituido o no sustituido de 2 a 6 átomos de carbono, Y1 es un enlace sencillo, -(CR9R10)q-, -CH=CH- (CR9R10)q-,
[Fórmula química 17]
o - (CR9R10)r-O- (CR9'R10>-, en donde R9, R10, R9', R10', q, q', r y r' son como se definen anteriormente y LG es un grupo saliente.
El compuesto (2b) puede prepararse de manera similar a la descrita en la Etapa 2 del Proceso 3 para la preparación del Compuesto (2), usando el Compuesto (9) y el Compuesto (5c).
El Compuesto (9) puede prepararse de acuerdo con un método bien conocido en la técnica, tales como aquellos descritos en el documento WO2010/133885 y el documento WO2012/066336.
[Proceso 5 para la preparación del Compuesto (2)]
el Compuesto (2c) o una sal del mismo puede prepararse de acuerdo con el siguiente proceso.
[Fórmula química 18]
en donde X-, R1, R2, R3, R4, R5 y R6 son como se han definido anteriormente, L' es alquileno sustituido o no sustituido de 1 a 5 átomos de carbono, Y1 es un enlace sencillo, -(CR9R10)p-, -CH=CH- (CR9R10)q-,
[Fórmula química 19]
o - (CR9R10)r-O- (CR9'R10')r'- en donde R9, R10, R9', R10', p, q, r y r' son como se han definido anteriormente.
El Compuesto (2c) puede prepararse como se describe en el proceso para la preparación del Compuesto (1), usando el Compuesto (9) y el Compuesto (5d).
La presente divulgación proporciona intermedios en los procesos descritos anteriormente. Específicamente, dichos intermedios pueden ser un compuesto de fórmula (2):
[Fórmula química 20]
en donde
X es metileno, átomo de oxígeno, átomo de azufre, SO, SO2 o NR7 en donde R7 es un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo de 1 a 3 átomos de carbono;
R1 y R2 son independientemente un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo sustituido o no sustituido de 1 a 6 átomos de carbono, con la condición de que cuando el grupo alquilo esté sustituido, está sustituido con 1 a 4 sustituyentes iguales o diferentes seleccionados del grupo que consiste en grupo hidroxi, átomo de halógeno y un grupo alcoxi de 1 a 6 átomos de carbono;
R3 es un grupo alquilo de 1 a 6 átomos de carbono, un grupo alcoxi de 1 a 6 átomos de carbono o un grupo alquiltio de 1 a 6 átomos de carbono;
R4 es un átomo de hidrógeno, un átomo de halógeno, un grupo hidroxi, un grupo alquilo de 1 a 6 átomos de carbono, un grupo alcoxi de 1 a 6 átomos de carbono o un grupo ciano;
Y1 es un enlace sencillo, -(CR9R10)p-, -CH=CH- (CR9R10)q-,
[Fórmula química 21]
o -(CR9R10)r O-(CR9'R1tV en donde R9, R10, R9' y R10' son independientemente un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo de 1 a 4 átomos de carbono;
Y2 es un enlace sencillo o -C(O)-;
L es un alquileno de cadena lineal sustituido o no sustituido de 2 a 6 átomos de carbono o un grupo divalente derivado de un cicloalcano de 4 a 8 miembros, con la condición de que cuando el alquileno de cadena lineal o el cicloalcano esté sustituido, está sustituido con 1 a 4 sustituyentes iguales o diferentes seleccionados del grupo que consiste en un grupo alquilo de 1 a 5 átomos de carbono, grupo hidroxi y átomo de halógeno y uno cualquiera de los grupos metileno en el alquileno de cadena lineal de L esté opcionalmente reemplazado por un grupo carbonilo;
R5 y R6 son independientemente un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo sustituido o no sustituido de 1 a 6 átomos de carbono, o R5 o R6 se toma junto con cualquier átomo de carbono de L para formar un heterociclo saturado que contiene nitrógeno de 4 a 8 miembros, o R5 y R6 se toman juntos para formar un heterociclo saturado que contiene nitrógeno de 5 a 8 miembros sustituido o no sustituido; con la condición de que cuando el grupo alquilo esté sustituido, está sustituido con 1 a 4 grupos iguales o diferentes seleccionados del grupo que consiste en un grupo hidroxi y un átomo de halógeno; cuando el heterociclo saturado que contiene nitrógeno de 4 a 8 miembros o el heterociclo saturado que contiene nitrógeno de 5 a 8 miembros esté sustituido, está sustituido con 1 a 4 grupos iguales o diferentes seleccionados del grupo que consiste en un grupo metilo, un grupo etilo, un grupo propilo, un grupo hidroximetilo, un grupo hidroxietilo, un grupo carbonilo, un grupo hidroxi y un átomo de halógeno;
p es un número entero de 1 a 6 ;
q y q' son independientemente un número entero de 0 a 4;
r es un número entero de 0 a 5 y r' es un número entero de 1 a 5, con la condición de que la suma de r y r' sea 5 o menos y con la condición de que r' sea un número entero de 2 o más cuando Y2 es un enlace sencillo; y
R8 es un átomo de hidrógeno o un grupo protector amino, y sales de los mismos.
El grupo protector de R8 en la fórmula (2) puede ser, pero no limitado a, un grupo usado comúnmente como grupo protector del grupo amino. Los ejemplos específicos incluyen carbamatos tales como el grupo t-butoxicarbonilo, grupo benciloxicarbonilo y grupo 9-fluorenilmetiloxicarbonilo; grupo bencilo; sulfonas tales como el grupo nosilo; imidas tales como ftalimida.
En un proceso de divulgación, si un grupo funcional específico, tal como un grupo hidroxi o un grupo amino, en un reactivo es necesario que se proteja, la protección/desprotección puede llevarse a cabo con uno o más grupos protectores en una etapa apropiada del proceso de acuerdo con un procedimiento bien conocido en la técnica. La protección/desprotección de grupos funcionales se describe en J. W. F. McOmie, Ed., "Protective Groups in Organic Chemistry", Plenum Press (1973) y T. W. Greene y P. G. M. Wuts, "Protective Groups in Organic Synthesis", 3a edición, Wiley-Interscience (1999).
Los expertos en la materia pueden preparar el compuesto conjugado de la divulgación de acuerdo con un proceso análogo al descrito anteriormente de manera apropiada en combinación con técnicas de síntesis orgánica bien conocidas en la técnica.
En el caso en que el compuesto conjugado de la divulgación exista en una forma ópticamente activa o racémica en virtud de uno o más átomos de carbono asimétricos, la presente divulgación incluye en su alcance dicha forma ópticamente activa o racémica que tiene una actividad fisiológica como se describe a continuación. La síntesis de dichas formas ópticamente activas puede llevarse a cabo mediante técnicas convencionales de química orgánica bien conocidas en la técnica, por ejemplo, una síntesis a partir de materiales de partida ópticamente activos o una resolución de una mezcla racémica. La actividad fisiológica puede evaluarse usando una técnica de laboratorio convencional como se describe a continuación.
El compuesto conjugado de la invención puede existir en forma solvatada o no solvatada tal como un hidrato.
También, el compuesto conjugado de la invención puede estar en forma deuterada, en donde uno o más 1H se reemplazan por 2H(D).
La forma del compuesto conjugado de la invención puede ser, pero no limitado a, amorfo o existir como un cristal. El polimorfismo cristalino puede estar presente en un compuesto cristalino de fórmula (1) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo y, por lo tanto, el compuesto de la presente invención incluye aquellos en cualquier forma cristalina.
En una realización de la invención, se proporciona una composición, en particular una composición farmacéutica, que comprende un liposoma de la invención.
La composición puede usarse como un adyuvante para mantener o mejorar una actividad inmunoestimulante de un principio activo que tiene la actividad inmunoestimulante.
Es decir, la composición que comprende un liposoma de la invención tiene una actividad de inducir o potenciar un anticuerpo específico de antígeno, específicamente una IgG específica de antígeno, más específicamente una IgG específica de antígeno de tipo Th1 (por ejemplo, IgG2c).
Además, la composición que comprende un liposoma de la presente invención tiene una actividad de inducción o potenciación de linfocitos T positivos para CD4 (es decir, restringidos al MHC clase 2) y/o positivos para CD8 (es decir, restringidos al MHC clase 1).
Adicionalmente, la composición que comprende un liposoma de la presente invención tiene una actividad de inducir o potenciar linfocitos T específicos de antígeno restringidos al MHC.
También, la composición que comprende un liposoma de la presente invención tiene una actividad de inducir o potenciar linfocitos T de memoria, específicamente linfocitos T de memoria efectores positivos para CD8.
La composición que comprende un liposoma de la presente invención puede contener un antígeno. Los ejemplos del antígeno incluyen una proteína de antígeno tumoral; un péptido de antígeno tumoral derivado de dicha proteína de antígeno tumoral, tales como NY-ESO-1, MAGE-3, WT1 y Her2/neu; una región hipervariable de un anticuerpo; y un antígeno derivado de un patógeno tal como una proteína o un péptido parcial de la misma derivado de un virus o una bacteria. También, un complejo de dicho antígeno y un portador está incluido en el alcance del antígeno tal como se usa en el presente documento.
Los ejemplos de dicho complejo incluyen aquellos en donde un antígeno (incluyendo, pero no limitado a, proteínas y péptidos) están unidos químicamente a una proteína que sirve como portador a través de un enlazador bien conocido en la técnica; y aquellos en donde un antígeno está contenido en una partícula similar a un virus (VLP, por sus siglas en inglés).
Por lo tanto, la composición que comprende un liposoma de la presente invención, mediante su uso en combinación con el antígeno mencionado anteriormente, es útil como un fármaco para el tratamiento o prevención de cáncer, infección con virus o bacterias.
También, la composición que comprende un liposoma de la presente invención puede usarse como un adyuvante para ayudar a la inmunoestimulación en un tratamiento para inducir otra reacción inmunológica o inmunitaria. Los ejemplos específicos del tratamiento incluyen enfoquesex vivoein vivopara potenciar la inmunogenicidad de las células tumorales de un paciente (por ejemplo, transfección con citocinas tales como interleucina 2, interleucina 4 o factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos), enfoques para reducir la anergia de las células T, enfoques que usan células inmunitarias transfectadas (por ejemplo, células dendríticas transfectadas con citocinas), enfoques que usan líneas de células tumorales transfectadas con citocinas, enfoques para reducir la función de las células inmunosupresoras (por ejemplo, células T reguladoras, células reprimidas derivadas de la médula ósea y células dendríticas que expresan IDO (indolamina 2,3-dioxigenasa) y radioterapia para inducir una respuesta inmunitaria.
Los ejemplos de la vía de administración de la composición incluyen administración parenteral, específicamente administraciones intravasculares (por ejemplo, intravenosas), subcutáneas, intradérmicas, intramusculares, intranasales y percutáneas.
En una realización, la composición que comprende un liposoma de la presente invención puede contener el liposoma de la invención y un diluyente, agente antioxidante, estabilizante, azúcar, tampón o portador farmacéuticamente aceptables en una cantidad que no afecte sustancialmente a la estabilidad del liposoma y a la eficacia del compuesto conjugado.
La forma de dosificación de la composición de la presente invención puede ser una formulación líquida para inyección o gotas nasales o una formulación liofilizada preparada liofilizando la formulación líquida.
Los ejemplos de la formulación líquida para inyección incluyen formulaciones de suspensión acuosa en donde el liposoma de la invención está disperso en agua.
Los ejemplos de la formulación líquida para gotas nasales incluyen formulaciones de suspensión acuosa en donde el liposoma de la invención está disperso en agua.
La formulación de solución acuosa o suspensión acuosa puede ser una solución acuosa o suspensión acuosa que contenga agua destilada para inyección y, apropiadamente, un tampón, un agente de ajuste de pH, un estabilizante, un agente isotónico o un agente emulsionante.
Los ejemplos del agente tampón incluyen fosfato y sal de ácido orgánico.
En la preparación de una formulación liofilizada, puede añadirse un excipiente según sea necesario. El excipiente y su cantidad no están limitados siempre que sean preferibles para formar una buena torta liofilizada o polvo liofilizado y los ejemplos incluyen sacáridos, alcoholes de azúcar, aminoácidos y cloruro sódico, por ejemplo, manitol del 0,1 al 20 %.
La composición de la presente invención puede contener además otros aditivos, y ejemplos de dichos aditivos incluyen antioxidantes, conservantes y agentes calmantes.
El liposoma de la invención puede administrarse simultáneamente con o en cualquier intervalo antes o después de la sustancia antigénica (inmunógeno) en una dosis unitaria que varía generalmente de 5 a 5000 mg/m2 de superficie corporal, es decir, de aproximadamente 0,1 ng/kg a 100 mg/kg, que proporciona una dosis profiláctica o terapéuticamente eficaz. La forma farmacéutica unitaria para inyecciones, comprimidos o cápsulas generalmente contiene, por ejemplo, liposomas que contienen de 1 ng a 250 mg del compuesto conjugado de la invención y, preferentemente, se usa a una dosis que varía de 1 ng a 50 mg/kg del compuesto conjugado por día. Sin embargo, la dosis diaria puede variar dependiendo del hospedador a tratar, la vía de administración y la gravedad de la enfermedad a tratar. Por lo tanto, la dosis óptima puede determinarse por un médico que trate a un paciente individual o a un animal de sangre caliente.
El término "tratamiento" como se usa en el presente documento significa aliviar algunos o todos los síntomas de la enfermedad, en totalidad o en parte, o prevenir o retrasar la progresión de la enfermedad.
El término "prevención" como se usa en el presente documento significa prevención primaria de la enfermedad (prevención de la aparición de la enfermedad) o prevención secundaria de la enfermedad (prevención de la recaída en un paciente cuyos síntomas se han aliviado o la enfermedad se ha curado después de la aparición de la enfermedad, prevención de recidiva).
Dado que el liposoma de la presente invención tiene una actividad adyuvante inmunitariain vitrooin vivo,es útil como adyuvante de vacunas para mantener o mejorar la inmunogenicidad del antígeno.
El liposoma de la presente invención puede usarse para mantener o potenciar el efecto de una sustancia inmunoestimulante (sustancia inmunoestimuladora) que es un agente para tratar o prevenir una enfermedad, es decir, la acción de una sustancia que induce una reacción inmunitaria específica de un antígeno.
Una composición que comprende el liposoma de la invención y una sustancia que mejora una reacción inmunitaria específica de antígeno (también denominada un antígeno) también es una realización de la presente invención. El antígeno puede ser, pero no limitado a, una proteína antigénica, un péptido antigénico (péptido parcial) derivado de dicha proteína antigénica o un complejo del mismo con un portador.
En determinada realización de la invención, el liposoma de la invención puede administrarse en combinación con una proteína de antígeno tumoral o un péptido de antígeno tumoral para inmunoterapia contra el cáncer para tratar o prevenir el cáncer. Los ejemplos de cáncer incluyen cánceres comunes tales como cáncer de vejiga, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de próstata, cáncer de mama, cáncer de pulmón, cáncer ovárico, cáncer pancreático, cáncer de intestino y colon, cáncer de estómago, cáncer de piel y cáncer cerebral; enfermedades neoplásicas malignas (linfoma de Hodgkin y linfoma no Hodgkiniano, etc.) que afectan a la médula ósea (incluyendo leucemia) y el sistema linfoproliferativo. El tratamiento o la prevención de cáncer como se usa en el presente documento puede ser la prevención de la enfermedad metastásica y la recidiva del tumor, y la prevención y el tratamiento del síndrome paraneoplásico.
Los ejemplos del antígeno incluyen, pero no limitado a, MAGE (Science, 254: pág. 1643 (1991)), gp 100 (J. Exp. Med., 179: pág. 1005 (1994)), MART-1 (Proc. Natl. Acad. Sci. EE. UU., 91: p3515 (1994)), tirosinasa (J. Exp. Med., 178: p489 (1993)), proteínas relacionadas con MAGE (J. Exp. Med., 179: p921 (1994)), p-catenina (J. Exp. Med., 183: pll85 (1996)), CDK4 (Science, 269: pl281 (1995)), HER2/neu (J. Exp. Med., 181: p2109 (1995)), p53 mutante (Proc. Natl. Acad. Sci. EE. UU., 93: p14704 (1996)), CEA (J. Natl. Cancer. Inst., 87: p982 (1995)), PSA (J. Natl. Cancer. Inst., 89: p293 (1997)), WT1 (Proc. Natl. Acad. Sci. EE. UU., 101: pl3885 (2004)), antígeno derivado de VPH (J. Immunol., 154: p5934 (1995)) y antígeno derivado del VEB (Int. Immunol., 7: p653 (1995)).
Los ejemplos del péptido antigénico tumoral derivado del antígeno del cáncer incluyen, pero no limitado a, péptido MAg Ea 3168-176 (Coulie PGet al.,Immunol. Rev. 188: 33 (2002)), péptido gp100209-217 (Rosenberg SAet al.,Nat. Med. 4: 321 (1998)), péptido gp100280-288 (Phan GQet al.,Proc. Natl. Acad. Sci. EE. UU. 100: 8372 (2003)), péptido Melan-A 27- 35 (Cormier JNet al.,Cancer J. Sci. Am. 3: 37 (1997)), péptido Melan-A 26-35, péptido Tirosinasa 1-9, péptido Tirosinasa 368-376, péptido gp100 280-288, péptido gp100 457- 466 (Jager Eet al.,Int. J. Cancer 67: 54 (1996)), péptido HER-2369-384, péptido HER-2688-703, péptido HER-2 971- 984 (Knutson KLet al.,J. Clin. Invest.
107: 477 (2001)) y péptido MAGE-A12 170-178 (Bettinotti MPet al.,Int. J. Cancer 105: 210 (2003)).
Además, el liposoma de la presente invención, mediante la administración en combinación con un principio activo de una vacuna para la prevención de enfermedades infecciosas, puede prevenir diversas enfermedades infecciosas tales como verrugas genitales, verruga común, verruga plantar, hepatitis B, hepatitis C, virus del herpes simple, molusco contagioso, viruela, virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), virus del papiloma humano (VPH), virus RS, norovirus, citomegalovirus (CMV), virus de la varicela zóster (VZV), rinovirus, adenovirus, coronavirus, gripe y parainfluenza; enfermedades bacterianas tales como tuberculosis,Mycobacterium aviumy enfermedad de Hansen; infecciones tales como micosis, clamidia,Candida, Aspergillus,meningitis criptocócica,Pneumocystis carini,criptosporidiosis, histoplasmosis, toxoplasmosis, malaria, infección porTrypanosomay leishmaniasis. Los ejemplos del principio activo de la vacuna para prevenir infecciones incluyen, pero no limitado a, sustancias derivadas de microorganismos/patógenos incluyendo bacterias, hongos, protozoos y virus que provocan enfermedades infecciosas, tales como proteína antigénica, péptido antigénico (péptido parcial) de dicha proteína antigénica, polisacárido, lípido y una combinación de los mismos o una combinación de la sustancia derivada de dichos microorganismos/patógenos y un portador.
Los ejemplos del péptido antigénico vírico derivado del antígeno vírico incluyen, pero no se limitan a, péptido de la proteína de la matriz de la gripe 58-66 (Jager Eet al.,Int. J. Cancer 67: 54 (1996)), péptido del VPH16 E786-93 (van Driel WJet al.,Eur. J. Cancer 35:946 (1999)), péptido del VPH E712-20 (Scheibenbogen Cet al.,J. Immunother 23: 275 (2000)), péptido del VPH16 E711-20 (Smith JWIet al.,J. Clin. Oncol. 21: 1562 (2003)), HSV2 gD (Berman PWet al.,Science 227: 1490 (1985)), CMV gB (Frey SEet al.,Infect Dis. 180: 1700 (1999), Gonczol E.et al.,Exp. Opin. Biol. Ther. 1: 401 (2001)) y CMV pp65 (Rosa CLet al.,Blood 100: 3681 (2002), Gonczol E.et al.,Exp. Opin. Biol. Ther. 1: 401 (2001)).
El portador como se usa en el presente documento es una sustancia, tal como proteínas y lípidos, a la que una proteína antigénica o un péptido antigénico está unido química y/o físicamente, y los ejemplos incluyen, pero no se limitan a, CRM 197 (Vaccine. 1 de oct de 2013; 31 (42): 4827-33), KLH (Cancer Immunol Immunother. oct de 2003; 52 (10): 608-16), partículas similares a virus (PLoS ONE 5(3): e9809) y liposomas (J Liposome Res. 2004; 14 (3-4): 175-89). La proteína antigénica puede prepararse mediante clonación de ADNc, que codifica la proteína antigénica y la expresión en una célula hospedadora, de acuerdo con un libro de texto tal como Molecular Cloning 2a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989).
La síntesis del péptido antigénico puede llevarse a cabo de acuerdo con un método generalmente usado en la química de péptidos, por ejemplo, como se describe en la bibliografía (Peptide Synthesis, Interscience, Nueva York, 1966; The Proteins, Vol. 2, Academic Press Inc., Nueva York, 1976).
La presente invención proporciona además un kit que comprende:
a) un liposoma de la invención;
b) un antígeno; y
c) un recipiente o dispositivo para contener una forma farmacéutica unitaria de a) y b) en combinación o por separado. El antígeno no está limitado siempre que sea un antígeno que pueda usarse como un principio activo de las vacunas, y los ejemplos incluyen proteínas antigénicas como las mencionadas anteriormente, péptidos antigénicos (péptidos parciales) derivados de dichas proteínas antigénicas y un complejo de los mismos con un portador.
En una realización de la presente divulgación, se proporciona un uso de un liposoma de la divulgación para la fabricación de un adyuvante de vacuna.
En una realización de la presente divulgación, se proporciona un uso de un liposoma de la divulgación, como un adyuvante de vacuna en la fabricación de una vacuna para el tratamiento de una enfermedad o afección.
También, en una realización de la presente divulgación, se proporciona un método para el tratamiento, la prevención de o la prevención del progreso de las enfermedades, que comprende una etapa de administración de un liposoma de la divulgación, junto con un antígeno, a un paciente.
La presente invención se describirá con más detalle con referencia a los siguientes ejemplos.
[Ejemplos]
THF: tetrahidrofurano
EtOAc: acetato de etilo
NMP: N-metilpirrolidinona
TEA: trietilamina
Las condiciones de medición para la espectrometría de masas por cromatografía liquida de alto rendimiento (CLEM) fueron las siguientes.
Los valores de EM (m/z) observados se mostraron con respecto a M+H.
Detector de EM: CLEM-TI-TOF
HPLC: Shimadzu Nexera X2 LC 30AD
Columna: Kinetex 1,7|j C18 100A Nueva columna 50 x 2,1 mm
Caudal: 1,2 ml/min
Longitud de onda de medición: 254 nm
Fase móvil: Solución A: solución de ácido fórmico acuoso al 0,1 %
Solución B: acetonitrilo
Programa de tiempo:
Tiempo de etapa (min)
1 0,01-1,40 Solución A: Solución B = 90: 10 a 5: 95
2 1,40-1,60 Solución A: Solución B = 5: 95
3 1,61-2,00 Solución A: Solución B = 99: 1
Preparación del compuesto conjugado
(Ejemplo de Preparación 1)
(4E,8E,12E,16E,20E) -N-{2-[{4- [(2-amino-4-{[(3S) -1-hidroxihexan-3-il]amino}- 6-metilpirimidin-5 -il)metil]bencil}(metil)amino]etil}-4,8,12,17,21,25-hexametilhexacosa-4,8,12,16,20,24-hexaenamida
[Fórmula química 22]
Se disolvieron 4-(2-(etoxicarbonil)-3-oxobutil)benzoato de metilo (3,56 g, 12,8 mmol) y carbonato de guanidina (4,61 g, 25,6 mmol) en metanol (23 ml) y la mezcla se calentó a reflujo con agitación durante 7 horas. Después de enfriar la mezcla de reacción, se añadieron agua (30 ml) y ácido acético (0,660 ml, 11,5 mmol). El sólido precipitado se recogió por filtración. El sólido se suspendió en THF y se calentó a reflujo con agitación durante una hora. Después de enfriar, el sólido se recogió por filtración, se lavó con THF y se secó para obtener el producto deseado (1,62 g, 46 %).
RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6) 52,00 (3H, s), 3,71 (2H, s), 3,82 (3H, s), 6,35 (1H, a), 7,31 (2H, d, J = 8,3 Hz), 7,84 (2H, d, J = 8,3 Hz).
Etapa 2
[Fórmula química 24]
El compuesto obtenido en la Etapa 1 (1,62 g, 5,93 mmol) y N,N,NN'-tetrametil-1,3-propanodiamina (1,41 ml, 8,89 mmol) se suspendieron en THF (24 ml) y se añadió cloruro de 2-mesitilenosulfonilo (1,94 g, 8,89 mmol).
La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 20 horas.
Se añadió agua a la mezcla. La mezcla se extrajo con acetato de etilo. La capa orgánica se lavó con salmuera, se secó sobre sulfato sódico anhidro, se filtró y se concentró a presión reducida. El sólido obtenido se lavó con éter y con hexano y se secó para obtener el producto deseado (2,69 g, 99,6 %).
RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6) 52,20 (3H, s), 2,29 (3H, s), 2,48 (6H, s), 3,84 (3H, s), 3,88 (2H, s), 6,35 (1H, a), 7,08 (2H, s), 7,19 (2H, d, J = 8,3 Hz), 7,85 (2H, d, J = 8,3 Hz).
Etapa 3
[Fórmula química 25]
Se disolvió 4-((2-amino-4-((mesitilsulfonil)oxi)-6- metilpirimidin-5-il)metil)benzoato de metilo (3,6 g, 8,0 mmol) en propionitrilo (80 ml). Se añadieron (S)-(+)-3-amino-1- hexanol (5,6 g, 48 mmol) y ácido trifluoroacético (1,2 ml, 16 mmol) y la mezcla se calentó a 110 °C.
Después agitar durante 36 horas, la mezcla se enfrió a temperatura ambiente y se concentró a presión reducida. El residuo se purificó en una columna de gel de sílice (acetato de etilo: metanol = 20: 1 a 5: 1) para obtener el producto deseado (2,1 g, 71 %).
RMN 1H (CDCla) 80,73 (t, J = 7,2 Hz, 3H), 0,90-1,76 (m, 6H), 2,41 (s, 3H), 3,49-3,61 (m, 2H), 3,69-3,87 (m, 2H), 3,90 (s, 3H), 4,24 (m, 1H), 7,17 (d, J = 8,0 Hz, 2H), 7,98 (d, J = 8,0 Hz, 2H).
Etapa 4
[Fórmula química 26]
Se disolvió (S)-4-((2-amino-4-((1-hidroxihexan-3-il)amino)-6-metilpirimidin-5-il)metil)benzoato de metilo (2,1 g, 5,6 mmol) en tetrahidrofurano (56 ml)/metanol (5,6 ml).
Se añadió borohidruro de litio (3 M en tetrahidrofurano, 5,6 ml, 17 mmol) y la mezcla se calentó a 60 °C. Después de agitar durante 2 horas, se añadió borohidruro de litio (3 M en tetrahidrofurano, 5,6 ml, 17 mmol) y la mezcla se agitó más a 60 °C durante 2 horas. Después de enfriar a 0 °C, se añadió ácido clorhídrico 4 N (30 ml).
La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora, se neutralizó con solución acuosa de bicarbonato sódico y a continuación se extrajo con acetato de etilo. La capa orgánica se lavó con salmuera, se secó sobre sulfato de magnesio y se concentró a presión reducida para obtener un producto bruto (1,2 g).
RMN 1H (CD3OD) 80,78 (t, J = 7,2 Hz, 3H), 1,03-1,76 (m, 6H), 2,18 (s, 3H), 3,41-3,48 (m, 2H), 3,76-3,88 (m, 2H), 4,23 (m, 1H), 4,55 (s, 2H), 7,11 (d, J = 8,0 Hz, 2H), 7,26 (d, J = 8,0 Hz, 2H).
Etapa 5
[Fórmula química 27]
Se disolvió (S)-3-((2-amino-5-(4-(hidroximetil)bencil)-6- metilpirimidin-4-il)amino)hexan-1-ol (1,2 g, 3,5 mmol) en cloroformo (35 ml)/metanol (3,5 ml) y se añadió dióxido de manganeso (3,1 g, 35 mmol). La mezcla se agitó durante la noche y se filtró a través de celite. El filtrado se concentró a presión reducida. El residuo se purificó en una columna de gel de sílice (cloroformo: metanol = 99:1 a 4:1) para obtener el producto deseado (0,72 g, 37 % en 2 etapas). RMN 1H (CD3OD) 80,70 (t, J = 7,2 Hz, 3H), 1,05-1,77 (m, 6H), 2,20 (s, 3H), 3,42-3,50 (m, 2H), 3,90-4,03 (m, 2H), 4,32 (m, 1H), 7,35 (d, J = 8,0 Hz, 2H), 7,84 (d, J = 8,0 Hz, 2H), 9,93 (s, 1H).
Etapa 6
[Fórmula química 28]
(S)-4- ((2-Amino-4 -((1-hidroxihexan-3-il)amino)-6 - metilpirimidin-5-il)metil)benzaldehído (0,28 g, 0,82 mmol) se disolvió en cloroformo (8 ml). Se añadieron (2-(metilamino)etil)carbamato de t-butilo (0,29 g, 1,6 mmol), ácido acético (0,23 ml, 4,1 mmol) y triacetoxiborohidruro sódico (0,52 g, 2,5 mmol). La mezcla se agitó durante la noche a temperatura ambiente. Se añadió agua y la mezcla se extrajo con acetato de etilo. La capa orgánica se lavó con salmuera, se secó sobre sulfato de magnesio y se concentró a presión reducida. El residuo se purificó en una columna de gel de sílice amino (acetato de etilo: metanol = 99: 1 a 95: 5) para obtener un producto bruto (0,23 g, 56 %).
RMN 1H (CDCla) 80,66 (t, J = 7,2 Hz, 3H), 0,91-1,77 (m, 6H), 1,40 (s, 9H), 2,12 (s, 3H), 2,26 (s, 3H), 2,39-2,44 (m, 2H), 3,15-3,46 (m, 4H), 3,43 (s, 2H), 3,61-3,86 (m, 2H), 4,05 (m, 1H), 4,67-4,77 (a, 2H), 4,91-5,01 (a, 1H), 7,05 (d, J = 8,0 Hz, 2H), 7,18 (d, J = 8,0 Hz, 2H).
Etapa 7
[Fórmula química 29]
(2-((4-((2-Amino-4-((1-hidroxihexan-3- il)amino)-6-metilpirimidin-5- il)metil)bencil)(metil)amino)etil)carbamato de (S)-butilo (0,150 g, 0,29 mmol) se disolvió en cloroformo (4 ml). Se añadió cloruro de hidrógeno (4 M en ciclopentil metil éter, 2,2 ml, 8,80 mmol). La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora y a continuación se concentró a presión reducida. Ácido (4E,8E,12E,16E,20E)-4,8,12,17,21,25-hexametilhexacosa-4,8,12,16,20,24-hexaenoico (123 mg, 0,262 mmol), 3-óxido hexafluorofosfato de 1-[bis(dimetilamino)metilen]-1H-1,2,3-triazolo[4,5-b]piridin-1-io (150 mg, 0,393 mmol) y N,N-diisopropiletilamina (0,137 ml, 0,787 mmol) se disolvieron en N,N-dimetilformamida (3 ml) y la mezcla se agitó durante 5 min. El producto bruto se disolvió en N,N-dimetilformamida (3 ml) y se añadió a la mezcla. La mezcla se agitó durante la noche a temperatura ambiente. Se añadió agua y la mezcla se extrajo con acetato de etilo. La capa orgánica se lavó con salmuera, se secó sobre sulfato de magnesio y se concentró a presión reducida. El residuo se purificó en una columna de gel de sílice amino (cloroformo: metanol = 99: 1 a 90: 10) para obtener el producto deseado (80 mg, 32 %).
RMN 1H (CDCla) 80,71 (t, J = 7,2 Hz, 3H), 0,92-1,83 (m, 27H), 1,95-2,08 (m, 20H), 2,18-2,32 (m, 10H), 2,46 (t, J = 6,0 Hz, 2H), 3,28-3,43 (m, 4H), 3,46 (s, 2H), 3,64-3,81 (m, 2H), 4,10 (m, 1H), 4,48-4,58 (a, 2H), 5,06-5,17 (m, 6H), 5,94-6,04 (a, 1H), 7,06 (d, J = 8,0 Hz, 2H), 7,20 (d, J = 8,0 Hz, 2H). ESI: [M+H]+ 852,6
(Ejemplo de Preparación 2)
(4E, 8E,12E,16E,20E)-1-(4-{4-[(2-amino-4-{[(2S)-1 - hidroxipentan-2-il]amino}-6-metilpirimidin-5-il)metil]-3 -metoxibencil}piperazin-1-il)-4,8,12,17,21,25- hexametilhexacosa-4,8,12,16,20,24-hexaen-1-ona
[Fórmula química 30]
El producto deseado (96 mg, 23 % en 2 Etapas) se obtuvo de manera similar a la Etapa 6 y la Etapa 7 del Ejemplo de Preparación 1, usando el compuesto conocido (S)-4-( (2- amino-4-((1-hidroxipentan-2-il)amino)-6-metilpirimidin-5-il)metil)-3-metoxibenzaldehído (0,10 g, 0,28 mmol), piperazin-1-carboxilato de t-butilo (0,13 g, 0,71 mmol) y ácido (4E,8E,12E,16E,20E)-4,8,12,17,21,25-hexametilhexacosa- 4,8,12,16,20,24-hexaenoico (72 mg, 0,15 mmol).
RMN 1H (CDCls) 80,77 (t, J = 7,2 Hz, 3H), 1,00-1,44 (m, 4H), 1,57-1,65 (m, 21H), 1,88-2,04 (m, 20H), 2,23-2,38 (m, 11H), 3,38-3,74 (m, 6H), 3,44 (s, 2H), 3,67 (s, 2H), 3,88 (s, 3H), 4,00 (m, 1H), 4,77-4,87 (a, 2H), 5,03-5,11 (m, 6H), 6,79 (d, J = 8,0 Hz, 1H), 6,86 (s, 1H), 6,89 (d, J = 8,0 Hz, 1H).
ESI: [M+H]+ 879,6
(Ejemplo de Preparación 3)
(4E,8E,12E,16E,20E)-1-(4-{4-[(2-amino-4-{[(2S)-1-hidroxipentan-2-il]amino}6- metilpirimidin-5-il)metil]-3 metoxibenzoil}piperazin-1-il)-4,8,12,17,21,25-hexametilhexacosa-4,8,12,16,20,24-hexaen-1-ona
[Fórmula química 31]
Ácido (S)-4-((2-amino-4-((1-hidroxipentan-2-il)amino)-6-metilpirimidin-5-il)metil)-3-metoxibenzoico (190 mg, 0,507 mmol), que se preparó como se describe en el documento WO2012/066336, y 1-BOC-piperazina (142 mg, 0,761 mmol) se disolvieron en N, N-dietilformamida (5 ml). Se añadieron 3-óxido hexafluorofosfato de 1-[Bis(dimetilamino)metileno]-1H-1,2,3-triazolo[4,5- b]piridinio (289 mg, 0,761 mmol) y N, N-diisopropiletilamina (197 mg, 1,52 mmol) y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 10 horas. Se añadió agua a la mezcla y la mezcla se extrajo con cloroformo. La capa orgánica se secó sobre sulfato sódico anhidro, se filtró y se concentró a presión reducida. El residuo resultante se purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice (acetato de etilo/metanol = 20/1 a 5/1) para obtener el producto deseado (202 mg, 73 %) como amorfo incoloro.
MS (ESI+): [M+H]+ 543,4
Etapa 2
[Fórmula química 33]
4-(4-((2-Amino-4-((1-hidroxipentan-2-il)amino)-6-metilpirimidin-5-il)metil)-3-metoxibenzoil)piperazin-1-carboxilato de (S)-terc-butilo (200 mg, 0,369 mmol) se disolvió en cloroformo (3,0 ml). Se añadió una solución de ácido clorhídrico 4 M-ciclopentil metil éter (3 ml, 12,0 mmol) y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora. Se añadió tolueno a la mezcla de reacción y la mezcla se concentró a presión reducida. El residuo se añadió a la solución de ácido (4E,8E,12E,16E,20E)-4,8,12,17,21,25-hexametilhexacosa-4,8,12,16,20,24-hexaenoico (166 mg, 0,355 mmol), 3- óxido hexafluorofosfato de 1-[bis(dimetilamino)metileno]-1H-1,2,3-triazolo[4,5- b]piridinio (202 mg, 0,532 mmol) y N,N-diisopropil etil amina (0,185 ml, 1,065 mmol) en N,N-dimetil formamida (5 ml), y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 6 horas. Se añadió agua a la mezcla y la mezcla se extrajo con cloroformo. La capa orgánica se lavó con salmuera, se secó sobre sulfato sódico anhidro, se filtró y se concentró a presión reducida. El residuo se purificó sobre cromatografía en columna de gel de sílice (cloroformo/metanol 20/1) para obtener el compuesto del título (159 mg, 50 %).
RMN 1H (CDCI3) 80,83 (t, J = 7,3 Hz, 3H), 1,15-1,48 (m, 4H), 1,58-1,68 (m, 21H), 1,94-2,15 (m, 20H), 2,25-2,32 (m, 2H), 2,32 (s, 3H), 2,40-2,48 (m, 2H), 3,37-3,80 (m, 12H), 3,93 (s, 3H), 3,99-4,05 (m, 1H), 4,65 (s a, 2H), 4,80 (a, 1H), 5,07-5,18 (m, 6H), 6,86 (dd, J = 7,8, 1,4 Hz, 1H), 6,97- 7,00 (m, 2H). MS (ESI+): [M+H]+ 893,6
(Ejemplo de Preparación 4)
4- [(2-Amino-4-{[(2S)-1-hidroxipentan-2-il]amino}-6-metilpirimidin-5-il)metil]-N-(2-{[(4E,8E,12E,16E,20E)-4,8,12,17,21,25-hexametilhexacosa-4,8,12,16,20,24- hexaenoil]amino}etil)-3-metoxibenzamida
[Fórmula química 34]
Se obtuvo el compuesto del título (216 mg, 78%), de manera similar a la Etapa 1 del Ejemplo de Preparación 3, usando ácido (S)-4-((2-amino-4-((1-hidroxipentan-2-il)amino)-6-metilpirimidin-5-il)metil)-3-metoxibenzoico (0,14 g, 0,41 mmol), que se preparó como se describe en el documento WO2012/066336, y (2-aminoetil)carbamato deterc-butilo (137 mg, 0,855 mmol).
RMN 1H (CDCla) 80,81 (t, J = 7,3 Hz, 3H), 1,07-1,40 (m, 4H), 1,47 (s, 9H), 2,32 (s, 3H), 3,37-3,45 (m, 3H), 3,52-3,57 (m, 2H), 3,63-3,67 (m, 1H), 3,74 (s, 2H), 3,97 (s, 3H), 3,97- 4,03 (m, 1H), 4,58 (a, 2H), 4,75-4,77 (a, 1H), 4,97-4,99 (a, 1H), 6,95-6,98 (m, 1H), 7,22-7,23 (m, 1H), 7,27-7,31 (a, 1H), 7,47-7,49 (m, 1H).
Etapa 2
[Fórmula química 36]
Se obtuvo el compuesto del título (84,0 mg, 24 %), de manera similar a la Etapa 2 del Ejemplo de Preparación 3, usando el compuesto obtenido en la Etapa 1 (205 mg, 0,397 mmol).
RMN 1H (CDCla) 80,81 (t, J = 7,3 Hz, 3H), 1,07-1,46 (m, 4H), 1,55-1,70 (m, 21H), 1,90-2,10 (m, 20H), 2,26-2,30 (m, 4H), 2,33 (s, 3H), 3,38-3,44 (m, 1H), 3,46-3,58 (m, 4H), 3,62- 3,67 (m, 1H), 3,74 (s, 2H), 3,97 (s, 3H), 3,97-4,03 (m, 1H), 4,54-4,57 (a, 2H), 4,76-4,79 (a, 1H), 5,06-5,15 (m, 6H), 6,10-6,14 (a, 1H), 7,00 (d, J = 8,0 Hz, 1H), 7,24 (dd, J = 8,0, 1,6 Hz, 1H), 7,38-7,41 (a, 1H), 7,45 (d, J = 1,6 Hz, 1H). MS (ESI+): [M+H]+ 867,6.
(Ejemplo de Preparación 5)
4-[(2-amino-4-{[(2S) -1-hidroxipentan-2-il]amino}-6-metilpirimidin-5-il)metil]-N-(2-{[(4E,8E,12E,16E,20E)-4,8,12,17,21,25-hexametilhexacosa-4,8,12,16,20,24-hexaenoil](metil)amino}etil)-3-metoxibenzamida
[Fórmula química 37]
[Fórmula química 38]
Se obtuvo el compuesto del título (242 mg, 81 %), de manera similar a la Etapa 1 del Ejemplo de Preparación 3, usando ácido (S)-4-((2-amino-4-((1-hidroxipentan-2-il)amino)-6-metilpirimidin-5-il)metil)-3-metoxibenzoico (0,14 g, 0,41 mmol), que se preparó como se describe en el documento WO2012/066336, y ácido N-(2-aminoetil)-N-metil carbámico (98 mg, 0,561 mmol).
RMN 1H (CDCla) 80,84 (t, J = 7,3 Hz, 3H), 1,07-1,41 (m, 4H), 1,43 (s, 9H), 2,31 (s, 3H), 2,91 (s, 3H), 3,39-3,44 (m, 1H), 3,45-3,55 (m, 2H), 3,56-3,61 (m, 2H), 3,62-3,67 (m, 1H), 3,73 (s, 2H), 3,96 (s, 3H), 3,97-4,02 (m, 1H), 4,55-4,59 (a, 2H), 4,74-4,78 (a, 1H), 6,94-6,97 (m, 1H), 7,21-7,24 (m, 1H), 7,47-7,50 (m, 2H).
Etapa 2
[Fórmula química 39]
Se obtuvo el compuesto del título (149 mg, 38%), de manera similar a la Etapa 2 del Ejemplo de Preparación 3, usando el compuesto obtenido en la Etapa 1 (236 mg, 0,445 mmol).
RMN 1H (CDCla) 80,80 (t, J = 7,3 Hz, 3H), 1,06-1,45 (m, 4H), 1,56-1,68 (m, 21H), 1,90-2,09 (m, 20H), 2,21-2,31 (m, 2H), 2,33 (s, 3H), 2,37-2,43 (m, 2H), 3,08 (s, 3H), 3,37-3,45 (m, 1H), 3,55-3,69 (m, 5H), 3,73 (s, 2H), 3,96 (s, 3H), 3,97 4,03 (m, 1H), 4,55-4,58 (a, 2H), 4,77-4,80 (a, 1H), 5,06-5,14 (m, 6H), 7,00 (d, J = 8,0 Hz, 1H), 7,24 (dd, J = 8,0, 1,2 Hz, 1H), 7,44 (d, J = 1,6 Hz, 1H), 7,53-7,55 (a, 1H).
MS (ESI+): [M+H]+ 881,6
Preparación de liposomas
Se prepararon las soluciones que contenían los componentes lipídicos y el compuesto del Ejemplo de Preparación 1 como se muestra en la Tabla 1 en cloroformo. Cada solución se colocó en un matraz de berenjena y se agitó durante 30 minutos a 37 °C. En atmósfera de nitrógeno, el disolvente se eliminó a 37 °C y se secó al vacío. Se añadió el residuo con PBS y se rehidrató. La película delgada se desprendió mediante ultrasonidos de tipo discontinuo y a continuación se agitó a 37 °C durante 1 hora. Los liposomas se obtuvieron después de la extrusión (temperatura ambiente, 400 nm) y se esterilizaron a través de un filtro de 0,22 pm.
continuación
HSPC: Fosfatidilcolina de soja hidrogenada (Nippon Yushi; COATSOME NC-21E)
DOPC: Dioleoilfosfatidilcolina (Nippon Yushi; COATSOME MC-8181)
DSPG: Diestearoilfosfatidilglicerol, sal sódica (Nippon Yushi; COATSOME MG-8080LS)
DOPG: Dioleoilfosfatidilglicerol, sal sódica (Nippon Yushi; COATSOME MG-8181LS)
DMPC: Dimiristoilfosfatidilcolina (Nippon Yushi; COATSOME MC-4040)
EPG: Fosfatidilglicerol de yema de huevo (Nippon Yushi; COATSOME NG-50LS)
Chol: colesterol (Nippon Yushi; Cholesterol (HP))
(Ejemplo de Prueba 1)
Se observó visualmente la apariencia de los liposomas de los Ejemplos. Se observó formación de crema en el liposoma del Ejemplo 3 y precipitación en los liposomas del Ejemplo 4 y el Ejemplo 6. Los liposomas de los Ejemplos inmediatamente después de la preparación se diluyeron 5 veces con agua purificada y la distribución del tamaño de partícula y la carga superficial se midieron mediante dispersión de luz dinámica usando MALVERN Zetasizer Nano (véase la Tabla 2). La distribución del tamaño de partícula y la distribución del potencial zeta del liposoma del Ejemplo 5 se muestran en la Fig. 1. Los liposomas del Ejemplo 1 y del Ejemplo 5, cuyo índice de polidispersidad era relativamente pequeño, se dejaron reposar durante 6 semanas en una nevera (4 °C) y se diluyeron 5 veces con agua purificada, seguido de mediciones de distribución del tamaño de partículas y carga superficial mediante dispersión de luz dinámica usando MALVERN Zetasizer Nano. Se confirmó que la distribución del tamaño de partícula y la carga superficial eran casi equivalentes a las del liposoma inmediatamente después de la preparación. Para cada ejemplo, el contenido del compuesto conjugado en el liposoma se determinó mediante un método de patrón externo. Es decir, el contenido se determinó usando una curva de calibración, que se preparó basándose en las absorbancias en la longitud de onda de absorción máxima de 288 nm de la muestra patrón.
A partir de los resultados anteriores, se demuestra que los liposomas del Ejemplo 1 y del Ejemplo 5 tienen alta monodispersidad y alta estabilidad.
En los siguientes ejemplos experimentales, los liposomas del Ejemplo 1 y del Ejemplo 5 se usaron en las seis semanas siguientes a la preparación de los mismos.
(Ejemplo de Prueba 2)
Para la primera inmunización, se administró por vía intramuscular una solución mixta (100 pl/ratón) de igual volumen de ovoalbúmina (OVA) (2 mg/ml) y el compuesto del Ejemplo de preparación 1 (0,008 a 1 mg/ml) al músculo gastrocnemio de ratones macho C57BL/6 (de 7 u 8 semanas de edad). Dos semanas después, se administró una cantidad igual de la misma mezcla por vía intramuscular en el músculo gastrocnemio para la inmunización de refuerzo. Una semana después de la vacunación de refuerzo, la sangre cardíaca se recogió en anestesia por inhalación de isoflurano y el suero se recogió mediante centrifugación. Los valores de IgG2c específicas de OVA en el suero se determinaron mediante el método ELISA. Específicamente, se añadió solución OVA (SIGMA) a una placa de 96 pocillos, seguido de bloqueo con leche desnatada al 1 % (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) y se añadió la muestra de suero diluida con tampón fosfato y a continuación se añadió un anticuerpo secundario (IgG1 de cabra anti ratón (Jackson) o IgG2c (Southern Bio)). Se añadió el sustrato de peroxidasa de micropocillos SureBlue™ TMB (KPL) y el producto de la reacción enzimática se midió con un lector de microplacas (véase la FIG. 2).
Los liposomas del Ejemplo 1 y del Ejemplo 5 indujeron IgG2c específica de OVA, que se potenció significativamente en comparación con el grupo de control negativo. En particular, el liposoma del Ejemplo 5 indujo una producción significativamente mejorada de IgG2c específica de OVA, en comparación con el grupo de control negativo.
(Ejemplo de Prueba 3)
Las células del bazo se prepararon a partir del ratón del Ejemplo de Prueba 2. Las células se añadieron con OVA y Brefeldin A (eBioscience) y se cultivaron durante la noche. Las células cultivadas se recogieron, se tiñeron con anticuerpo anti-CD3e de ratón marcado con APC, anticuerpo anti-CD4 de ratón marcado con FITC y colorante de viabilidad fijable Fluor® 450 (eBioscience), y se fijaron en tampón de Fijación/Permeabilización (eBioscience). Después del tratamiento en tampón de permeabilización (eBioscience), las células se tiñeron con un cóctel de anticuerpos anticuerpo anti-IFN-Y marcado con PerCP-Cy5.5, anticuerpo anti-IL-2 marcado con PE-Cy7 y TNF-a marcado con PE (eBioscience). La adquisición y el análisis de datos se realizaron usando FACS Cant II (BD Biosciences) y el software FLOWJO (TreeStar). Los resultados se mostraron en la FIG. 3.
Las células del bazo también se tiñeron con anticuerpo anti-CD3e de ratón marcado con eFluor 450, anticuerpo anti-CD8 de ratón marcado con Alexa Fluor® 647, H-2Kb marcado con PE Tetrámero OVA- SINFEKL (MBL) y colorante de viabilidad flexible eFluor 520 (eBioscience). La adquisición y el análisis de datos se realizaron usando FACS Cant II (BD Biosciences) y el software FLOWJO (TreeStar). Los resultados se muestran en la FIG. 4.
Las células del bazo se incubaron aún más con un cóctel de anticuerpos anticuerpo anti-CD3e de ratón marcado con eFluor450, anticuerpo anti-CD8 de ratón marcado con Alexa Fluor647, anticuerpo anti-CD44 de ratón marcado con PE-Cy7, anticuerpo anti-CD62L de ratón marcado con PerCP-Cy5.5 y colorante de viabilidad fijable 520 (eBioscience).
La adquisición y el análisis de datos se realizaron usando FACS Cant II (BD Biosciences) y el software FLOWJO (TreeStar).
Los resultados se mostraron en la FIG. 5.
El liposoma del Ejemplo 1 y del Ejemplo 5 aumentaron significativamente la proporción de células T colaboradoras tipo 1 específicas de OVA, particularmente linfocitos T positivos para CD4 multifuncionales específicos de OVA, la proporción de linfocitos T positivos para CD8 específicos de OVA restringidos por MHC (células T positivas para CD8 tetrámero de OVA en la Fig. 3) y la proporción de linfocitos T de memoria efectores positivos para CD8, en comparación con el grupo de control negativo. En particular, el liposoma del Ejemplo 5 aumentó significativamente la proporción de linfocitos T positivos para CD4 multifuncionales específicos de OVA y la proporción de linfocitos T positivos para CD8 específicos de OVA restringidos por MHC en comparación con el grupo de control negativo.
Aplicabilidad industrial
El liposoma de la presente invención es útil como un adyuvante, que se añade a una preparación de vacuna, para potenciar el efecto inmunoestimulante.

Claims (13)

  1. REIVINDICACIONES 1. Un liposoma que comprende (1) y (2): (1) una multicapa lipídica que comprende una mezcla de dos lípidos diferentes seleccionados del grupo que consiste en: fosfatidilcolina de soja hidrogenada (HSPC), dioleoilfosfatidilcolina (DOPC), diestearoilfosfatidilglicerol (DSPG), dioleoilfosfatidilglicerol (DOPG), dimiristoilfosfatidilcolina (DMPC) y fosfatidilglicerol de yema de huevo (EPG), o una mezcla de los dos lípidos diferentes y colesterol (Chol); y (2) un compuesto conjugado en que un compuesto de bajo peso molecular que potencia la actividad fisiológica de TLR7 está unido químicamente a través de un espaciador al escualeno o a un lípido derivado del escualeno, estando dicho compuesto conjugado encapsulado en la multicapa lipídica de (1); en donde el compuesto conjugado es un compuesto de fórmula (1) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo: [Fórmula química 3]
    X es metileno, átomo de oxígeno, átomo de azufre, SO, SO2 o NR7 en donde R7 es un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo de 1 a 3 átomos de carbono; R1 y R2 son independientemente un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo sustituido o no sustituido de 1 a 6 átomos de carbono, con la condición de que cuando el grupo alquilo esté sustituido, está sustituido con 1 a 4 sustituyentes iguales o diferentes seleccionados del grupo que consiste en grupo hidroxi, átomo de halógeno y un grupo alcoxi de 1 a 6 átomos de carbono; R3 es un grupo alquilo de 1 a 6 átomos de carbono, un grupo alcoxi de 1 a 6 átomos de carbono o un grupo alquiltio de 1 a 6 átomos de carbono; R4 es un átomo de hidrógeno, un átomo de halógeno, un grupo hidroxi, un grupo alquilo de 1 a 6 átomos de carbono, un grupo alcoxi de 1 a 6 átomos de carbono o un grupo ciano; Y1 es un enlace sencillo, -(CR9R10)p-, -CH=CH- (CR9R10)q-, [Fórmula química 4]
    o - (CR9R10)r-O- (CR9'R10> en donde R9, R10, R9' y R10' son independientemente un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo de 1 a 4 átomos de carbono; Y2 es un enlace sencillo o -C(O)-; L es un alquileno de cadena lineal sustituido o no sustituido de 2 a 6 átomos de carbono o un grupo divalente derivado de un cicloalcano de 4 a 8 miembros, con la condición de que cuando el alquileno de cadena lineal o el cicloalcano esté sustituido, está sustituido con 1 a 4 sustituyentes iguales o diferentes seleccionados del grupo que consiste en un grupo alquilo de 1 a 5 átomos de carbono, grupo hidroxi y átomo de halógeno y con la condición de que uno cualquiera de los grupos metileno en el alquileno de cadena lineal de L esté opcionalmente reemplazado por un grupo carbonilo; R5 y R6 son independientemente un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo sustituido o no sustituido de 1 a 6 átomos de carbono, o R5 o R6 se toma junto con cualquier átomo de carbono de L para formar un heterociclo saturado que contiene nitrógeno de 4 a 8 miembros, o R5 y R6 se toman juntos para formar un heterociclo saturado que contiene nitrógeno de 5 a 8 miembros sustituido o no sustituido, con la condición de que cuando el grupo alquilo esté sustituido, está sustituido con 1 a 4 sustituyentes iguales o diferentes seleccionados del grupo que consiste en un grupo hidroxi y un átomo de halógeno y con la condición de que cuando el heterociclo saturado que contiene nitrógeno de 4 a 8 miembros o el heterociclo saturado que contiene nitrógeno de 5 a 8 miembros esté sustituido, está sustituido con 1 a 4 sustituyentes iguales o diferentes seleccionados del grupo que consiste en un grupo metilo, un grupo etilo, un grupo propilo, un grupo hidroximetilo, un grupo hidroxietilo, un grupo carbonilo, un grupo hidroxi y un átomo de halógeno; m es 0 o 1; p es un número entero de 1 a 6; q y q' son independientemente un número entero de 0 a 4; y r es un número entero de 0 a 5 y r' es un número entero de 1 a 5, con la condición de que la suma de r y r' sea 5 o menos y con la condición de que r' sea un número entero de 2 o más cuando Y2 es un enlace sencillo.
  2. 2. El liposoma de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la relación en peso del compuesto conjugado a los componentes lipídicos es de 1:8 a 1:250.
  3. 3. El liposoma que comprende un compuesto conjugado de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en donde la multicapa lipídica de (1) es una multicapa lipídica que comprende componentes lipídicos que comprenden una mezcla de dimiristoilfosfatidilcolina (DMPC) y fosfatidilglicerol de yema de huevo (EPG).
  4. 4. El liposoma de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde la relación molar de dimiristoilfosfatidilcolina (DMPC) a fosfatidilglicerol de yema de huevo (EPG) es de 1:1 a 2:1.
  5. 5. El liposoma de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 en donde el compuesto conjugado es (4E,8E,12E,16E,20E)-N- {2 -[{4 -[(2-amino-4- {[(3S)-1-hidroxihexan-3-il]amino}-6 - metilpirimidin-5-il)metil]bencil}(metil)amino]etil}- 4,8,12,17,21,25-hexametilhexacosa-4,8,12,16,20,24- hexaenamida o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
  6. 6. El liposoma de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la multicapa lipídica de (1) es una multicapa lipídica que comprende componentes lipídicos que comprenden una mezcla de dimiristoilfosfatidilcolina (DMPC) y fosfatidilglicerol de yema de huevo (EPG), y el compuesto conjugado que está encapsulado en la multicapa lipídica de (1) es un compuesto de fórmula (1) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo como se define en la reivindicación 5.
  7. 7. El liposoma de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la multicapa lipídica de (1) es una multicapa lipídica que comprende componentes lipídicos que comprenden una mezcla de dimiristoilfosfatidilcolina (DMPC) y fosfatidilglicerol de yema de huevo (EPG), y el compuesto conjugado que está encapsulado en la multicapa lipídica de (1) es (4E,8E,12E,16E,20E)-N-{2- [{4- [(2-amino-4- {[(3S)-1- hidroxihexan-3-il]amino}-6- metilpirimidin-5 -il)metil]bencil}(metil)amino]etil}- 4,8,12,17,21,25- hexametilhexacosa-4,8,12,16,20,24-hexaenamida o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
  8. 8. El liposoma de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde la multicapa lipídica es una bicapa lipídica.
  9. 9. Una composición farmacéutica que comprende el liposoma de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.
  10. 10. Un adyuvante de vacuna que comprende el liposoma de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.
  11. 11. Una vacuna que comprende el liposoma de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 y un antígeno.
  12. 12. La vacuna de acuerdo con la reivindicación 11 en donde el antígeno es una sustancia derivada de un patógeno.
  13. 13. Un kit que comprende: a) un liposoma como se define en la reivindicación 1; b) un antígeno; y c) un recipiente o dispositivo para contener una forma farmacéutica unitaria de a) y b) en combinación o por separado.
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