ES3039237T3 - Modifying soybean oil composition through targeted knockout of the fad3a/b/c genes - Google Patents

Modifying soybean oil composition through targeted knockout of the fad3a/b/c genes

Info

Publication number
ES3039237T3
ES3039237T3 ES17704311T ES17704311T ES3039237T3 ES 3039237 T3 ES3039237 T3 ES 3039237T3 ES 17704311 T ES17704311 T ES 17704311T ES 17704311 T ES17704311 T ES 17704311T ES 3039237 T3 ES3039237 T3 ES 3039237T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
fad3a
fad2
plant
soybean
sec
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
ES17704311T
Other languages
English (en)
Inventor
Luc Mathis
Zachary Demorest
Feng Zhang
William Haun
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Cellectis SA
Original Assignee
Cellectis SA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Cellectis SA filed Critical Cellectis SA
Application granted granted Critical
Publication of ES3039237T3 publication Critical patent/ES3039237T3/es
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • C12N15/8243—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine
    • C12N15/8247—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine involving modified lipid metabolism, e.g. seed oil composition
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H1/00—Processes for modifying genotypes ; Plants characterised by associated natural traits
    • A01H1/06—Processes for producing mutations, e.g. treatment with chemicals or with radiation
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H5/00—Angiosperms, i.e. flowering plants, characterised by their plant parts; Angiosperms characterised otherwise than by their botanic taxonomy
    • A01H5/10—Seeds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H6/00—Angiosperms, i.e. flowering plants, characterised by their botanic taxonomy
    • A01H6/54—Leguminosae or Fabaceae, e.g. soybean, alfalfa or peanut
    • A01H6/542—Glycine max [soybean]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23D—EDIBLE OILS OR FATS, e.g. MARGARINES, SHORTENINGS OR COOKING OILS
    • A23D9/00—Other edible oils or fats, e.g. shortenings or cooking oils
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
    • C12N15/8202—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation by biological means, e.g. cell mediated or natural vector
    • C12N15/8205—Agrobacterium mediated transformation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8274—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for herbicide resistance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8279—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance
    • C12N15/8286—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance for insect resistance
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A40/00—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production
    • Y02A40/10—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in agriculture
    • Y02A40/146—Genetically Modified [GMO] plants, e.g. transgenic plants

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Physiology (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • Natural Medicines & Medicinal Plants (AREA)
  • Insects & Arthropods (AREA)
  • Pest Control & Pesticides (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Se proporcionan materiales y métodos para elaborar variedades de soja que tienen una composición de aceite alterada como resultado de mutaciones en los genes FAD3A, FAD3B y/o FAD3C solos o en combinación con mutaciones en los genes FAD2-1A y FAD2-1B. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Modificación de la composición del aceite de soja mediante la eliminación selectiva de los genes fad3a/b/c
CAMPO TÉCNICO
Este documento se refiere a materiales y métodos para fabricar plantas de soja que puedan utilizarse para producir aceite con una composición modificada en comparación con las plantas de tipo salvaje.
ANTECEDENTES
La soja(Glycine max)es un importante cultivo de leguminosas en todo el mundo debido a su capacidad para fijar el nitrógeno atmosférico. La soja también es una importante fuente de proteínas para la alimentación animal, y su aceite tiene usos que van desde la cocción y fritura hasta la producción de biodiésel. Normalmente, se utiliza un procedimiento de hidrogenación para aumentar la estabilidad térmica y mejorar la vida útil y el sabor del aceite de soja. Sin embargo, la hidrogenación aumenta el coste de producción y da lugar a la formación de ácidos grasos trans, que se han relacionado con enfermedades cardiovasculares en humanos.
SUMARIO
Se proporcionan aquí materiales y métodos para modificar la composición del aceite de soja reduciendo o eliminando la expresión del gen de la delta-fifteen fatty acid desaturase 3 (FAD3) A sin el uso de transgénesis.
Los métodos descritos en el presente documento utilizan endonucleasas efectoras TAL específicas de secuencia para introducir mutaciones en la secuencia codificante de FAD3A, anulando así la función génica. Estos métodos pueden mediar el silenciamiento de FAD3A sin la inserción de un transgén. Las plantas que contienen transgenes están muy reguladas en determinadas jurisdicciones, incluida Europa, y los costes para obtener la aprobación reglamentaria pueden ser muy elevados. Los métodos descritos en el presente documento pueden agilizar la producción de nuevas variedades y pueden resultar más rentables que los métodos transgénicos o tradicionales de obtención.
La presente invención proporciona un método para hacer una planta de soja que contenga una mutación en: uno o más alelos FAD2-1A, uno o más alelos FAD2-1B, y uno o más alelos FAD3A; el método comprende: (a) proporcionar partes de plantas o células de plantas de soja, en las que las partes de plantas o células de plantas comprenden una mutación en uno o más alelos FAD2-1A y una mutación en uno o más alelos FAD2-1B, en las que cada alelo FAD2-1A tiene una secuencia según se establece en SEC ID NO: 100, o tiene una secuencia con al menos un 95 % de identidad con SEC ID NO: 100; en el que cada alelo FAD2-1B tiene una secuencia como la establecida en SEC ID NO:101, o tiene una secuencia con al menos un 95 % de identidad con SEC ID NO:101; y en el que las partes de la planta o las células de la planta comprenden al menos un alelo FAD3A funcional, (b) poner en contacto las partes de la planta o las células de la planta con una o más endonucleasas efectoras TAL dirigidas a una secuencia FAD3A endógena, en el que cada una de las endonucleasas efectoras TAL está dirigida a un par de secuencias según se establece en SEC ID NOS 8 y 9, (c) regenerar las partes de la planta o las células de la planta en plantas de soja enteras, y (d) seleccionar de las plantas de soja enteras una planta de soja que comprenda una mutación en uno o más alelos de FAD3A, en la que cada alelo de FAD3A mutado comprenda una deleción del nucleótido de citosina en la posición 515 de SEC ID NO:24. Las partes de la planta de soja o las células vegetales pueden seleccionarse del grupo formado por células de cotiledón, semillas, embriones, células de callo embriogénico y células de polen. El contacto puede incluir la transformación de las células vegetales de soja con uno o más vectores que codifican la una o más endonucleasas de corte raro. La una o más endonucleasas de corte raro pueden ser endonucleasas efectoras TAL. Cada alelo de FAD3A mutado puede tener una secuencia como se establece en cualquiera de las SEC ID NOS:64-71, 73-90 y 102-106, o una secuencia con al menos un 95 % de identidad con cualquiera de las SEC ID NOS:64-71, 73-90 y 102-106. El método puede incluir la introducción en las células vegetales de una o más proteínas endonucleasas efectoras TAL, el cultivo de las células vegetales para generar líneas vegetales, y/o el aislamiento, a partir de las células vegetales, de ADN genómico que contenga al menos una porción del locus FAD3A.
A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos utilizados en el presente documento tienen el mismo significado que comúnmente se entiende por una persona con conocimientos ordinarios en la técnica a la que pertenece esta invención.
Los detalles de una o más realizaciones de la invención se exponen en los dibujos adjuntos y en la descripción que figura a continuación.
DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
La FIG. 1 muestra secuencias de ADN para varios sitios diana de endonucleasas efectoras TAL en FAD3A (SEC ID NO: 1). Las secuencias subrayadas indican los sitios diana para las endonucleasas efectoras TAL, designadas T01 a T03. Los lugares designados T01 y T03 se refieren a ejemplos comparativos.
La FIG. 2 muestra secuencias de ADN para varios sitios diana de endonucleasas efectoras TAL en FAD3B (SEC ID NO:2). Las secuencias subrayadas indican los sitios diana para las endonucleasas efectoras TAL, designadas T01 a T03.
La FIG. 3 muestra secuencias de ADN para varios sitios diana de endonucleasas efectoras TAL en FAD3C (SEC ID NO:3). Las secuencias subrayadas indican los sitios diana para las endonucleasas efectoras TAL, designadas T01 a T03.
La FIG. 4 muestra secuencias de ADN para varios sitios diana de endonucleasas efectoras TAL en FAD2-1A (SEC ID NO:4). Las secuencias subrayadas indican los sitios diana de las endonucleasas efectoras TAL. Las letras minúsculas indican los sitios de endonucleasas de restricción utilizados para detectar mutaciones inducidas por endonucleasas efectoras TAL.
La FIG. 5 muestra secuencias de ADN para varios sitios diana de endonucleasas efectoras TAL en FAD2-1B (SEC ID NO:5). Las secuencias subrayadas indican los sitios diana de las endonucleasas efectoras TAL. Las letras minúsculas indican los sitios de endonucleasas de restricción utilizados para detectar mutaciones inducidas por endonucleasas efectoras TAL.
La FIG. 6 es un gráfico que representa la actividad de la endonucleasa efector TAL en relación con el número de SNPs presentes en los sitios de unión de la endonucleasa efector TAL predicha.
La FIG. 7 muestra secuencias representativas de ADN FAD3A y FAD3B de varios perfiles mutantes confirmados de plantas T0 regeneradas. Las secuencias subrayadas indican los sitios diana de las endonucleasas efectoras TAL. La secuencia FAD3A de tipo salvaje se muestra en SEC ID NO:45, y las secuencias mutantes se muestran en SEC ID NOS:46-52. La secuencia FAD3B de tipo salvaje se muestra en SEC ID NO:53, y las secuencias mutantes se muestran SEC ID NOS: 54-60).
La FIG. 8 muestra secuencias representativas de ADN FAD2-1A y FAD2-1B de varios perfiles mutantes confirmados de plantas T0 regeneradas. Las secuencias subrayadas indican los sitios diana de las endonucleasas efectoras TAL. Las secuencias FAD2-1A y FAD2-1B de tipo salvaje se muestran en SEC ID NO:61, la secuencia FAD2-1A mutante se muestra en Se C ID NO:62, y la secuencia FAD2-1B mutante se muestra en SEC ID NO:63.
La FIG. 9 es un gráfico que representa el perfil de ácidos grasos de plantas de soja mutantesfad2-1a fad2-1b fad3a. Las barras de error representan la desviación estándar de cuatro o más réplicas biológicas. Se analizó el aceite de la semilla T2 de cuatro líneas mutantes diferentes T1fad2-1a fad2-1b fad3a. Los genotipos de las líneas de plantasfad2-1a fad2-1b fad3aen el sitio diana de la endonucleasa efectora TALfad3afueron -7 pb/-7 pb (Gm183-4-3), -43 pb/-43 pb (Gm183-5-4), -43 pb/-43 pb (Gm183-5-5) y -43 pb/-43 pb (Gm183-5-9). El genotipo de la línea de plantasfad3afue -4 pb/-4 pb (Gm184-3-20).
La FIG. 10 muestra los sitios diana de la endonucleasa efectora TAL para FAD2.
La FIG. 11 muestra las características de plantas eliminadas FAD2-1A FAD2-1B cultivadas en el campo comparadas con un homólogo de tipo salvaje de control.
La FIG. 12 muestra resultados de análisis de ésteres metílicos de ácidos grasos (FAME) de aceite de semillas de plantas de soja cultivadas en campo de genotipofad2-1a fad2-1b fad3a..
DESCRIPCIÓN DETALLADA
El aceite de soja se compone principalmente de cinco ácidos grasos: ácido palmítico (10 %), ácido esteárico (4 %), ácido oleico (18 %), ácido linoleico (55 %) y ácido linolénico (13 %). Los aceites vegetales con bajo contenido en ácido linolénico pueden aumentar la estabilidad oxidativa y de fritura del aceite de soja. Estos aceites también pueden ser más saludables, sobre todo porque la hidrogenación (una reacción de reducción inducida químicamente que satura los ácidos grasos) reducirá los niveles de ácidos grasostrans, que se sabe que aumentan el riesgo de enfermedades cardiacas. Se han utilizado estrategias tradicionales de mejora genética, mutagénesis y siRNA para generar variedades de soja con niveles reducidos de ácido linolénico.Véase,por ejemplo, Flores et al., Transgenic Res 17:839-850, 2008. Sin embargo, los transgenes que expresan construcciones de ARNi están sujetos a variaciones en la expresión del transgén, y los esfuerzos de mejora convencionales pueden ser un procedimiento largo y costoso.
Se han identificado las enzimas responsables de la progresión biosintética del ácido palmítico al linolénico. Por ejemplo, las enzimas FAD3 son responsables de convertir los precursores del ácido linoleico en precursores del ácido linolénico durante la acumulación de aceite en las semillas de soja en desarrollo. Debido a una antigua poliploidización y a múltiples eventos de duplicación, existen tres copias de FAD3 (FAD3A, FAD3B y FAD3C) en el genoma de la soja. FAD3A y FAD3B tienen un 86 % de identidad de secuencia a nivel de ADN, y las proteínas codificadas tienen un 93 % de identidad de secuencia a nivel de aminoácidos. FAD3A y FAD3C tienen un 89 % de identidad de secuencia a nivel de ADN, y las proteínas codificadas tienen un 77 % de identidad de secuencia a nivel de aminoácidos. FAD3B y FAD3C tienen un 88 % de identidad de secuencia a nivel de ADN, y las proteínas codificadas tienen un 77 % de identidad de secuencia a nivel de aminoácidos. Las plantas homocigóticas para alelos mutantes FAD3A de origen natural pueden tener una modesta disminución en la composición de ácido linolénico (hasta aproximadamente el 4 % del contenido total de ácidos grasos), como se describe en otro lugar (Chappel et al., Crop Sci. 47:1705-1710, 2007). Los mutantes dobles de FAD3 han mostrado una disminución del ácido linolénico (3 %) en el aceite total de la semilla, mientras que las mutaciones en FAD3A, FAD3B y FAD3C resultaron en una disminución adicional (1 %) del contenido de ácido linolénico (Bilyeu et al., Crop Sci. 51:259-264, 2011).
La presente invención proporciona un método para generar plantas de soja que tienen actividad FAD3A reducida (por ejemplo, disminuida o completamente abolida). En algunas realizaciones, los métodos descritos en el presente documento pueden utilizarse para generar variedades de soja que tengan aceite con un componente de ácido linolénico disminuido que sea del 3 % o menos (por ejemplo, 2.5 % o menos, 2 % o menos, 1.5 % o menos, 1 % o menos, o 0.5 % o menos) del contenido total de ácidos grasos. En algunas realizaciones, esta modificación de la composición del aceite de soja puede lograrse eliminando completamente la expresión de los genes FAD3A. Según algunos de los métodos proporcionados en el presente documento, ambos alelos de los genes FAD3A se inactivan utilizando técnicas no transgénicas. La eliminación de los productos génicos de FAD3A puede reducir drásticamente la conversión de precursores del ácido linoleico en precursores del ácido linolénico en las semillas de soja.
En el presente documento, los términos "contenido de ácidos grasos" y "composición de ácidos grasos" se refieren a los niveles de ácidos grasos específicos en relación con los ácidos grasos totales. "Contenido en ácidos grasos" y "Composición en ácidos grasos" pueden representarse en porcentaje. Por ejemplo, el contenido global de ácidos grasos/la composición de ácidos grasos del aceite de plantas de soja de tipo salvaje es de aproximadamente un 10 % de ácido palmítico, un 4 % de ácido esteárico, un 18 % de ácido oleico, un 55 % de ácido linoleico y un 13 % de ácido linolénico. El contenido de determinados ácidos grasos también puede describirse en relación con los ácidos grasos totales. Por ejemplo, el "contenido de ácido linolénico" es el nivel de ácido linolénico en relación con el total de ácidos grasos, de forma que el "contenido de ácido linolénico" en el aceite de plantas de soja de tipo salvaje es de aproximadamente el 13 %. Del mismo modo, el "contenido de ácido oleico" en el aceite de las plantas de soja de tipo salvaje es de aproximadamente el 18 %, y el "contenido de ácido linoleico" en el aceite de las plantas de soja de tipo salvaje es de aproximadamente el 55 %.
Para lograr la eliminación reducida o incluso completa de la expresión de FAD3A, FAD3B y/o FAD3C, por ejemplo, se puede diseñar una nucleasa de corte raro (por ejemplo, una endonucleasa efector similar a un activador de la transcripción (TAL)) para reconocer una región conservada de todos los genes FAD3 y crear una rotura de doble cadena. Una reparación incorrecta debida a la unión de extremos no homólogos (NHEJ) en cada sitio de rotura del ADN puede generar mutaciones sin sentido y/o sin sentido en las regiones codificantes de FAD3A, FAD3B y/o FAD3C, lo que hace que los transcritos de ARN de FAD3A, FAD3B y/o FAD3C sean inestables y se destinen a la degradación antes de la traducción. El método de la presente invención comprende poner en contacto las partes de la planta o las células de la planta con una o más endonucleasas efectoras TAL dirigidas a una secuencia FAD3A endógena, en la que cada una de las endonucleasas efectoras TAL está dirigida a un par de secuencias como se establece en SEC ID NOS 8 y 9.
En la soja, hay al menos tres miembros (A, B y C) de la familia de genes FAD3. En la TABLA 2 (SEC ID NOS:24, 25 y 26) se muestran ejemplos representativos de secuencias nucleotídicas de FAD3A, FAD3B y FAD3C de soja. Las plantas de soja, células, partes de plantas, semillas y progenie de las mismas descritas en el presente documento pueden tener una mutación en cada uno de los alelos endógenos de FAD3A, de forma que la expresión de cada gen se reduzca o se suprima por completo. Alternativamente, las plantas, células, partes de plantas, semillas y progenie de soja descritas en el presente documento pueden tener una mutación en al menos un alelo de FAD3A, de forma que la expresión de cada gen se reduzca o se suprima por completo. Las plantas, células, partes, semillas y progenie de soja pueden tener niveles reducidos de ácido linolénico en comparación con las plantas, células, partes, semillas y progenie de soja de tipo salvaje.
En el presente documento, los términos "plantas" y "partes de plantas" se refieren a células, tejidos, órganos, semillas y partes separadas (por ejemplo, raíces, hojas y flores) que conservan las características distintivas de la planta madre. "Semilla" se refiere a cualquier estructura vegetal que se forma por diferenciación continua del óvulo de la planta, tras su punto de maduración normal en la apertura de la flor, independientemente de si se forma en presencia o ausencia de fecundación y de si la estructura de la semilla es fértil o infértil.
El término "gen", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a una secuencia de ácido nucleico que incluye una región promotora asociada a la expresión de un producto génico. "Gen" también abarca regiones de intrones y exones asociadas con la expresión del producto génico, así como regiones no traducidas 5' o 3' asociadas con la expresión del producto génico.
El término "alelo(s)" significa cualquiera de una o más formas alternativas de un gen en un locus particular. En una célula diploide (o anfidiploide) de un organismo, los alelos de un gen determinado se localizan en un lugar o locus específico de un cromosoma. Un alelo está presente en cada cromosoma del par de cromosomas homólogos. Los alelos "heterocigotos" son dos alelos diferentes que residen en un locus específico, situados individualmente en pares correspondientes de cromosomas homólogos. Los alelos "homocigotos" son dos alelos idénticos que residen en un locus específico, situados individualmente en pares correspondientes de cromosomas homólogos en la célula.
Un alelo o gen de "tipo salvaje" se refiere a un alelo o gen que ocurre más comúnmente en la naturaleza, y típicamente se asocia con el fenotipo de tipo salvaje. Por ejemplo, un "alelo FAD3A de tipo salvaje" es un alelo FAD3A natural (por ejemplo, como se encuentra en las plantas de soja naturales) que codifica una proteína FAD3A funcional. Los términos "mutante" y "mutación" se utilizan en relación con alelos, genes y fenotipos de plantas que son diferentes de los alelos, genes y fenotipos de plantas convencionales o de tipo salvaje que se dan más comúnmente en la naturaleza. Una planta o alelo mutante puede ocurrir en la población natural o puede ser producido por intervención humana (por ejemplo, por mutagénesis), y un "alelo mutante" se refiere a un alelo que tiene uno o más cambios en su secuencia de ácido nucleico en comparación con el alelo de tipo salvaje, de tal manera que puede dar lugar a un fenotipo mutante, ya sea solo o en combinación con otro alelo mutante. En algunas realizaciones, por ejemplo, un "alelo FAD3A mutante" puede ser un alelo FAD3A que no codifica una proteína FAD3A funcional; un "alelo FAD3A mutante" puede incluir una o más mutaciones en su secuencia de ácido nucleico que dan lugar a una cantidad no detectable de proteína FAD3A funcional en la planta o célula vegetalin vivo..
"Mutagénesis", tal y como se utiliza en el presente documento, se refiere a procedimientos en los que se introducen mutaciones en una secuencia de ADN seleccionada. Las mutaciones pueden incluir una o más deleciones, inserciones y/o sustituciones. Las mutaciones inducidas por endonucleasas suelen ser el resultado de una rotura de doble cadena, que puede dar lugar a inserciones o deleciones ("indels") detectables mediante análisis de secuenciación profunda. Estas mutaciones suelen ser deleciones de al menos varios pares de bases y pueden tener el efecto de inactivar el alelo mutado. Una deleción que dé lugar a un desplazamiento de marco, por ejemplo, puede inactivar un alelo. En algunos casos, las mutaciones pueden incluir grandes deleciones que eliminan todo o parte de un gen de interés. El tamaño de las deleciones puede variar de uno a 1000 pb o más (por ejemplo, de uno a diez pb, de 10 a 20 pb, de 20 a 50 pb, de 50 a 100 pb, de 100 a 200 pb, de 200 a 300 pb, de 300 a 500 pb, de 500 a 1000 pb, o más de 1000 pb). También pueden introducirse mutaciones en una región promotora para disminuir o inactivar la expresión del gen correspondiente. En los métodos descritos en el presente documento, por ejemplo, la mutagénesis puede producirse a través de roturas de ADN de doble cadena realizadas por endonucleasas efectoras TAL dirigidas a secuencias de ADN seleccionadas en una célula vegetal. Dicha mutagénesis da lugar a "mutaciones inducidas por endonucleasas efectoras TAL" (por ejemplo, eliminados inducidos por endonucleasas efectoras TAL) y a una expresión reducida del gen diana. Tras la mutagénesis, las plantas pueden regenerarse a partir de las células tratadas utilizando técnicas conocidas (por ejemplo, plantando semillas de acuerdo con los procedimientos de cultivo convencionales, seguido de autopolinización).
Como se utiliza en el presente documento, la frase "mutación en uno o más alelos FAD" se refiere a uno o más alelos FAD (por ejemplo, FAD2 o FAD3) con secuencias que están alteradas de tal manera que su expresión se reduce, o de tal manera que la actividad de la proteína FAD codificada se reduce, en comparación con el correspondiente alelo o proteína de tipo salvaje. Esto puede ocurrir ya sea por el alelo mutante FAD que codifica una proteína FAD no funcional (por ejemplo, una proteína FAD que no tiene actividad biológica, o una proteína FAD con actividad biológica significativamente modificada o reducida, en comparación con la correspondiente proteína FAD de tipo salvaje), o por el alelo mutante FAD que expresa una cantidad significativamente reducida de proteína FAD funcional, o ninguna proteína FAD. Tal como se utiliza en el presente documento, "significativamente" indica que un resultado es reproduciblemente diferente, normalmente con un valor P < 0.05.
Una mutación en una secuencia de ácido nucleico FAD puede ser, por ejemplo, una mutación sin sentido, una mutación sin sentido, una mutación de inserción, una mutación de deleción, una mutación de desplazamiento de marco o una mutación de sitio de empalme, o una combinación de las mutaciones mencionadas.
El término "expresión", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a la transcripción de una secuencia particular de ácido nucleico para producir ARNm en sentido o antisentido, y/o la traducción de una molécula de ARNm en sentido para producir un polipéptido, con o sin eventos postraduccionales posteriores.
El término "reducido", tal como se utiliza en el presente documento, con respecto a la expresión de un alelo FAD o la actividad de un polipéptido FAD codificado, se refiere a cualquier disminución en la expresión o actividad en comparación con la de un alelo o polipéptido FAD de tipo salvaje correspondiente. Por ejemplo, la expresión o la actividad pueden disminuir al menos en un 1 %, al menos en un 3 %, al menos en un 5 %, al menos en un 10 %, al menos en un 20 %, al menos en un 25 %, al menos en un 50 %, al menos en un 75 %, al menos en un 80 %, al menos en un 90 %, al menos en un 95 %, o al menos en un 99 %, o entre un 1 y un 5 %, entre un 5 y un 10 %, entre un 10 y un 20 %, entre un 20 y un 30 %, entre un 30 y un 50 %, entre un 50 y un 70 %, entre un 70 y un 80 %, entre un 80 y un 90 %, entre un 90 y un 95 %, o entre un 95 y un 100 %. La "reducción de la expresión" de un gen o polipéptido en una planta o célula vegetal puede lograrse inhibiendo, interrumpiendo, eliminando o derribando el gen o polipéptido, de forma que la transcripción del gen y/o la traducción del polipéptido codificado se reduzcan en comparación con una planta o célula vegetal correspondiente de tipo salvaje. Los niveles de expresión pueden evaluarse utilizando métodos tal como, por ejemplo, la transcripción inversa-reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR), Northern blotting, hibridación dot-blot, hibridación in situ, flujo continuo nuclear y/o flujo de salida nuclear, protección con RNasa, o métodos inmunológicos y enzimáticos tal como ELISA, radioinmunoensayo y western blotting.
El término "reducido" en relación con el contenido de ácidos grasos se refiere a un nivel de ácidos grasos inferior al del aceite de una planta de soja de tipo salvaje. Por ejemplo, "contenido reducido de ácido linolénico" se refiere a un contenido de ácido linolénico que es menor que el contenido de ácido linolénico encontrado en el aceite de una planta de soja de tipo salvaje, y "contenido reducido de ácido linoleico" es un contenido de ácido linoleico que es menor que el contenido de ácido linoleico encontrado en el aceite de una planta de soja de tipo salvaje. El contenido de un ácido graso concreto puede disminuir al menos un 1 %, al menos un 3 %, al menos un 5 %, al menos un 10 %, al menos un 20 %, al menos un 25 %, al menos un 50 %, al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, o al menos un 99 %, o entre un 1 y un 5 %, entre un 5 y un 10 %, entre un 10 y un 20 %, entre un 20 y un 30 %, entre un 30 y un 50 %, entre un 50 y un 70 %, entre un 70 y un 80 %, entre un 80 y un 90 %, entre un 90 y un 95 %, o entre un 95 y un 100 % en comparación con el contenido de ese ácido graso en el aceite de una planta de soja de tipo salvaje. Así, el nivel de ácido linoleico en el aceite de una planta de soja, una parte de la planta o una célula de la planta, tal como se proporciona en el presente documento, puede ser del 54 % o menos, 53 % o menos, 52 % o menos, 51 % o menos, 50 % o menos, 49 % o menos, 48 % o menos, 45 % o menos, 40 % o menos, 35 % o menos, 30 % o menos, 25 % o menos, 20 % o menos, 15 % o menos, 10 % o menos, 5 % o menos o 3 % o menos del contenido total de ácidos grasos. El nivel de ácido linolénico en el aceite de una planta, parte de una planta o célula vegetal de soja, según se indica en el presente documento, puede ser del 12.8 % o menos, del 12.5 % o menos, del 12.3 % o menos, del 12 % o menos, del 11.5 % o menos, del 11 % o menos, del 105 % o menos, 10 % o menos, 9 % o menos, 8 % o menos, 7 % o menos, 6 % o menos, 5 % o menos, 4 % o menos, 3 % o menos, 2.5 % o menos, 2 % o menos, 1.5 % o menos, 1 % o menos, o 0.5 % o menos del contenido total de ácidos grasos.
Tal como se utiliza en el presente documento, el término "aumentado" con respecto al contenido de ácidos grasos se refiere a un nivel de ácidos grasos superior al del aceite de una planta de soja de tipo salvaje. Por ejemplo, "aumentar el contenido de ácido oleico" se refiere a un contenido de ácido oleico superior al contenido de ácido oleico encontrado en el aceite de una planta de soja de tipo salvaje. El contenido de un ácido graso concreto puede aumentar al menos un 1 %, al menos un 3 %, al menos un 5 %, al menos un 10 %, al menos un 20 %, al menos un 25 %, al menos un 50 %, al menos un 75 %, al menos un 80 %, o al menos un 90 %, o entre un 1 y un 5 %, entre un 5 y un 10 %, entre un 10 y un 20 %, entre un 20 y un 30 %, entre un 30 y un 50 %, entre un 50 y un 75 %, entre un 75 y un 100 %, o más de un 100 % en comparación con el contenido de ese ácido graso en el aceite de una planta de soja de tipo salvaje. Así, el nivel de ácido oleico en el aceite de una planta de soja, una parte de la planta o una célula de la planta, tal como se proporciona en el presente documento, puede ser igual o superior al 18.2 %, igual o superior al 18.5 %, igual o superior al 18.8 %, igual o superior al 19 %, igual o superior al 19 %.5 % o más, 20 % o más, 21 % o más, 22 % o más, 23 % o más, 25 % o más, 30 % o más, 35 % o más, 40 % o más, 45 % o más, 50 % o más, 55 % o más, 60 % o más, 65 % o más, 70 % o más, 75 % o más, 80 % o más, u 85 % o más del contenido total de ácidos grasos.
Como se utiliza en el presente documento, un alelo "eliminado" o "inactivo" se refiere a un alelo mutante que no se expresa, o a un alelo mutante que codifica una proteína sin su actividad funcional normal. Los alelos FAD eliminados incluyen, por ejemplo, mutaciones de deleción de toda la región codificante o de una parte sustancial de la misma, o mutaciones sin sentido o mutación del codón de terminación que conducen a una deleción sustancial o a la deleción completa de la proteína. Los alelos FAD eliminados también incluyen alelos con mutaciones en el sitio de empalme, deleciones o inserciones en la región promotora y, con respecto a FAD3, alelos con una mutación que elimina o sustituye cualquiera de los ocho residuos de histidina conservados que están presentes en las proteínas FAD3.
Los ocho residuos de histidina conservados se encuentran en las regiones Ia, Ib y II de las proteínas FAD3. Los aminoácidos conservados que incluyen los residuos de histidina dentro de la región Ia de los genes FAD3 de la soja son HDCGH (SEC ID NO:4909), que están codificados por los nucleótidos que comienzan en la posición 286 de SEC ID NO:24 (FAD3A), los nucleótidos que comienzan en la posición 298 de SEC ID NO:25 (FAD3B), y los nucleótidos que comienzan en la posición 289 de SEC ID NO:26 (FAD3C). La secuencia de aminoácidos conservada que contiene las histidinas dentro de la región Ib de las proteínas FAD3 de la soja es HRTHH (SEC ID NO:4910), codificada por los nucleótidos 885-899 de SEC ID NO:24 (FAD3A), los nucleótidos 946-960 de SEC ID NO:25 (FAD3B) y los nucleótidos 680-694 de SEC ID NO:26 (FAD3C). La secuencia de aminoácidos conservada que contiene las histidinas dentro de la región II de las proteínas FAD3 de la soja es HVIHH (SEC ID NO:4911), codificada por los nucleótidos 2959-2973 de SEC ID NO:24 (FAD3A), los nucleótidos 3034-3048 de SEC ID NO:25 (FAD3B) y los nucleótidos 2012-2026 de SEC ID NO:26 (FAD3C). Las mutaciones que alteran cualquiera de estas histidinas pueden dar lugar a un alelo FAD3 eliminado. Por ejemplo, una deleción dentro del marco que abarque cualquiera de los nucleótidos que codifican una histidina conservada, una mutación de cambio de marco que se produzca antes de la última histidina conservada y una mutación sin sentido que se produzca en cualquiera de los codones que codifican una histidina conservada darán lugar a un alelo FAD3 eliminado.
En la presente invención, cada alelo FAD3A mutado comprende una deleción de la citosina en la posición 515 de SEC ID NO:24. Tales deleciones pueden dar lugar a la eliminación del gen FAD3, tal como cuando se incluyen dentro de una mutación sin sentido, o cuando se incluyen en una deleción en el marco que elimina al menos un residuo conservado de histidina u otra porción conservada de la proteína, por ejemplo.
El término "endonucleasas de corte raro" se refiere aquí a proteínas naturales o de ingeniería que tienen actividad endonucleasa dirigida a secuencias de ácido nucleico que tienen una secuencia de reconocimiento (secuencia diana) de aproximadamente 12-40 pb de longitud (por ejemplo, 14-40 pb de longitud). Las endonucleasas de corte raro típicas provocan la escisión dentro de su sitio de reconocimiento, dejando un corte escalonado de 4 nt con salientes 3'OH o 5'OH. Estas endonucleasas de corte raro pueden ser el resultado de proteínas de fusión que asocian un dominio de unión al ADN y un dominio catalítico con actividad de corte. Las endonucleasas efectoras TAL son ejemplos de fusiones de dominios de unión al ADN con el dominio catalítico de la endonucleasaFokI.Las endonucleasas efectoras TAL personalizadas están disponibles comercialmente con el nombre comercial TALEN™ (Cellectis, París, Francia). Para una revisión de las endonucleasas de corte raro, véase Baker, Nature Methods 9:23-26, 2012.
En la presente invención, las plantas, células vegetales, partes de plantas, semillas y progenie de plantas proporcionadas por el método aquí descrito se generan utilizando un sistema de endonucleasas efectoras TAL para realizar eliminaciones dirigidas en el gen FAD3A. Por ejemplo, los ácidos nucleicos que codifican endonucleasas efectoras TAL dirigidas a un par de secuencias como las establecidas en SEC ID NOS 8 y 9 (véase FIG. 1 y TABLA 1) pueden transformarse en células vegetales (por ejemplo, células de cotiledones), donde pueden expresarse. Por lo tanto, esta divulgación proporciona materiales y métodos para utilizar endonucleasas efectoras TAL para generar plantas y productos relacionados (por ejemplo, semillas y partes de plantas) que son particularmente adecuados para la producción de aceite de soja con contenido de ácido linolénico disminuido.
En la presente invención, las plantas, partes de plantas y células vegetales descritas en el presente documento también incluyen una mutación en uno o más alelos FAD2-1A y una mutación en uno o más alelos FAD2-1B. Los genes FAD2 son responsables de la conversión de precursores del ácido oleico en precursores del ácido linoleico durante la acumulación de aceite en las semillas de soja en desarrollo. En el genoma de la soja existen dos copias de FAD2 (FAD2-1A y FAD2-1B). Estos genes tienen aproximadamente un 95 % de identidad de secuencia a nivel de ADN, y las proteínas codificadas tienen aproximadamente un 99 % de identidad de secuencia a nivel de aminoácidos. Las plantas homocigotas para alelos mutantes FAD2-1B de origen natural pueden tener un modesto aumento (20.5 % a 29.4 %) en la composición de ácido oleico, como se describe en otro lugar (Pham et al., BMC Plant Biol. 10:195, 2010). Se han desarrollado mutaciones en FAD2-1A mediante mutagénesis de rayos X y TILLING, para producir semillas que contienen hasta un 50 % de ácido oleico (Sandhu et al., JAOCS 84:229-235, 2007), y mutando tanto el alelo FAD2-1A como el FAD2-1B se obtuvo aceite con un contenido de ácido oleico del 82.2 % (Pham et al.,supra).
Así, el método de la presente invención proporciona plantas de soja que tienen actividad reducida (por ejemplo, carecen) de FAD2-1A y FAD2-1B además de actividad reducida de FAD3A. Esto se consigue eliminando FAD3A en mutantes de FAD2. Se puede utilizar un sistema de endonucleasas de corte raro (por ejemplo, una endonucleasa efectora TAL) para realizar eliminaciones dirigidas en los genes FAD2-1A y/o FAD2-1B. En algunas realizaciones, las plantas de soja, células, partes de plantas, semillas y progenie de las mismas descritas en el presente documento pueden tener una mutación en cada uno de los alelos endógenos FAD2-1A y FAD2-1B (además de una mutación en uno o más de los alelos endógenos FAD3A), de tal manera que la expresión de cada gen se reduce o se suprime por completo. Alternativamente, las plantas de soja, células, partes de plantas, semillas y progenie de las mismas proporcionadas en el presente documento pueden tener una mutación en al menos un alelo FAD2-1A y en al menos un alelo FAD2-1B (además de una mutación en uno o más de los alelos FAD3A endógenos), de tal manera que la expresión de cada gen se reduce o se suprime por completo. Las plantas, células, partes, semillas y progenie de soja pueden tener niveles reducidos de ácido linolénico, niveles aumentados de ácido oleico y niveles reducidos de ácido linoleico en comparación con las plantas, células, partes, semillas y progenie de soja de tipo salvaje.
En algunas realizaciones, los métodos proporcionados en el presente documento pueden utilizarse para producir partes de plantas (por ejemplo, semillas) o productos vegetales (por ejemplo, aceite) con mayor contenido de ácido oleico, menor contenido de ácido linoleico y menor contenido de ácido linolénico, en comparación con las correspondientes partes de plantas o productos de plantas de tipo salvaje. Por ejemplo, los métodos descritos en el presente documento pueden emplearse para generar variedades de soja cuyo aceite tenga un componente de ácido linolénico reducido del 3%o menos (por ejemplo, 2.5%o menos, 2%o menos, 1.5%o menos, 1%o menos, o 0.5 % o menos) del contenido total de ácidos grasos, así como un componente de ácido oleico aumentado de al menos el 30 % (por ejemplo, al menos el 35 %, al menos el 40 %, al menos el 45 %, al menos el 50 %, al menos el 55 %, al menos el 60 %, al menos el 65 %, al menos el 70 %, al menos el 75 % o al menos el 80 %) del contenido total de ácidos grasos, y un componente reducido de ácido linoleico del 10 % o menos (por ejemplo, 8 % o menos, 5 % o menos, 4 % o menos, 3 % o menos, 2 % o menos, 1 % o menos, o 0.5 % o menos) del contenido total de ácidos grasos.
Como se describe en el presente documento, las endonucleasas efectoras TAL pueden utilizarse para generar plantas y productos relacionados (por ejemplo, semillas y partes de plantas) que son particularmente adecuados para la producción de aceite de soja con mayor contenido de ácido oleico y menor contenido de ácido linoleico, así como menor contenido de ácido linolénico. Por ejemplo, los ácidos nucleicos que codifican endonucleasas efectoras TAL dirigidas a secuencias FAD2-1A o FAD2-1B seleccionadas (por ejemplo, las secuencias FAD2-1A mostradas en la FIG. 4 y la TABLA 3, o las secuencias FAD2-1B mostradas en la FIG. 5 y la TABLA 3) pueden transformarse en células vegetales (por ejemplo, células en cotiledones), donde pueden expresarse. Para lograr la eliminación completa de la expresión de FAD2-1A y FAD2-1B, por ejemplo, se puede diseñar una nucleasa de corte raro que reconozca una región conservada de ambos genes FAD2-1 y cree una rotura de doble cadena. Una reparación incorrecta debida a NHEJ en el lugar de rotura del ADN puede generar mutaciones sin sentido y/o sin sentido en las regiones codificantes de FAD2-1A/1B, lo que hace que los transcritos de ARN de FAD2-1A/1B sean inestables y se destinen a la degradación antes de la traducción. En la TABLA 4 (SEC ID NOS:43 y 44) se muestran ejemplos representativos de secuencias nucleotídicas de FAD2-1A y FAD2-1B naturales de soja, y también en SEC ID NOS: 100 y 101. Las plantas de soja, partes de plantas y/o células vegetales resultantes pueden analizarse posteriormente para determinar si se han introducido mutaciones en el sitio o sitios diana.
El método de la presente invención proporciona plantas, partes de plantas y células vegetales deGlycine maxcon mutaciones en los genes FAD2-1A, FAD2-1B y FAD3A. Los genotipos de estas plantas, partes de plantas y células de plantas pueden describirse como sigue:fad2-1a fad2-1b fad3a FAD3B FAD3C, fad2-1a fad2-1b fad3a fad3b FAD3C, fad2-1a fad2-1b fad3a FAD3B fad3c,yfad2-1a fad2-1b fad3a fad3b fad3c..
En algunas realizaciones, las plantas descritas en el presente documento también pueden contener uno o más transgenes. Un transgén puede integrarse en el genoma de la soja mediante protocolos de transformación estándar(véase,por ejemplo, Rech et al., Nat Protoc 3:410-418, 2008; Haun et al., Plant Biotech J 12:934-940, 2014; y Curtin et al., Plant Physiol 156:466-473, 2011). En algunos casos, un transgén puede codificar una proteína que confiere tolerancia o resistencia a uno o más herbicidas (por ejemplo, glufonsinato, mesotriona, imidazolinona, isoxaflutol, glifosato, 2.4-D, herbicidas inhibidores de la hidroxifenilpiruvato dioxigenasa o dicamba). En algunos casos, un transgén puede codificar una proteína 5-enolpiruvilsiquimato-3-fosfato sintasa (EPSPS) vegetal, o una proteína EPSPS vegetal modificada, donde la EPSPS vegetal modificada contiene una sustitución de aminoácidos dentro de la secuencia conservada TAMRP (SEC ID NO:4908). La sustitución puede ser, por ejemplo, de treonina a isoleucina, de prolina a serina o de prolina a adenina. En algunas realizaciones, un transgén puede codificar una proteína EPSPS bacteriana, una proteína EPSPS CP4 de agrobacterium, una proteína ariloxialcanoato dioxigenasa (AAD), una proteína fosfinotricina N-acetiltransferasa (PAT), una proteína acetohidroxiácido sintasa subunidad grande, una proteína p-hidroxifenilpiruvato dioxigenasa (hppd) o una proteína dicamba monooxigenasa (DMO).
En algunos casos, un transgén puede codificar un producto que aumente la resistencia a los insectos (por ejemplo, insectos lepidópteros). Por ejemplo, un transgén puede codificar una proteína deBacillus thuringiensis,tal como una proteína Cry (por ejemplo, una proteína Cry1Ac delta-endotoxina, una proteína Cry1F delta-endotoxina, una proteína Cry2Ab delta-endotoxina, o una proteína Cry1Ac delta-endotoxina). En algunas realizaciones, un transgén puede mejorar la resistencia al virus. Por ejemplo, un transgén puede contener una secuencia de un genoma vírico, tal como una secuencia antisentido de un genoma vírico.
En algunas realizaciones, un transgén puede causar esterilidad masculina. Por ejemplo, un transgén puede incluir un gen asesino de polen (por ejemplo, un gen alfa amilasa, un gen S24 o un gen S35). Un transgén puede incluir además un marcador seleccionable, tal como una proteína fluorescente (por ejemplo, GFP, YFP, RFP, BFP o luciferasa) o un gen implicado en la regulación del tamaño de la semilla. En algunos casos, un transgén puede incluir además un factor restaurador (por ejemplo, un gen funcional de esterilidad masculina (EM)).
También se describen en el presente documento moléculas de ácido nucleico FAD2 y FAD3. Como se describe en el presente documento, un ácido nucleico puede tener una secuencia de nucleótidos con al menos aproximadamente un 95 por ciento de identidad de secuencia con una secuencia de nucleótidos representativa de FAD3A, FAD3B, FAD3C, FAD2-1A o FAD2-1B. Por ejemplo, una secuencia de nucleótidos puede tener al menos un 95, al menos un 96, al menos un 97, al menos un 98 o al menos un 99 por ciento de identidad de secuencia con una secuencia de nucleótidos FAD3A, FAD3B o FAD3C representativa y natural como se establece en la TABLA 2, o con una secuencia de nucleótidos FAD2-1A o FAD2-1B representativa y natural como se establece en la TABLA 4 (SEC ID NOS:43 y 44). Como se describe en el presente documento, al menos aproximadamente el 1%(por ejemplo, al menos el 3 %, el 5 %, el 10%o más del 10 %) de la secuencia de nucleótidos de un gen diana puede eliminarse al generar el mutante.
El porcentaje de identidad de secuencia entre una secuencia particular de ácido nucleico o aminoácido y una secuencia referenciada por un número de identificación de secuencia particular se determina como sigue. En primer lugar, se compara una secuencia de ácido nucleico o aminoácido con la secuencia establecida en un determinado número de identificación de secuencia utilizando el programa BLAST 2 Sequences (Bl2seq) de la versión independiente de BLASTZ que contiene BLASTN versión 2.0.14 y BLASTP versión 2.0.14. Esta versión independiente de BLASTZ puede obtenerse en línea en fr.com/blast o en ncbi.nlm.nih.gov. Encontrará instrucciones sobre cómo utilizar el programa Bl2seq en el archivo Léame que acompaña a BLASTZ. Bl2seq realiza una comparación entre dos secuencias utilizando el algoritmo BLASTN o BLASTP BLASTN se utiliza para comparar secuencias de ácidos nucleicos, mientras que BLASTP se utiliza para comparar secuencias de aminoácidos. Para comparar dos secuencias de ácidos nucleicos, las opciones se establecen de la siguiente manera: -i se establece en un archivo que contiene la primera secuencia de ácido nucleico que se va a comparar (por ejemplo, C:\seq1.txt); -j se establece en un archivo que contiene la segunda secuencia de ácido nucleico que se va a comparar (por ejemplo, C:\seq2.txt); -p se establece en blastn; -o se establece en cualquier nombre de archivo deseado (por ejemplo, C:\output.txt); -q se establece en -1; -r se establece en 2; y todas las demás opciones se dejan en su configuración predeterminada. Por ejemplo, se puede utilizar el siguiente comando para generar un archivo de salida que contenga una comparación entre dos secuencias: C:\Bl2seq -i c:\seq1.txt -j c:\seq2.txt -p blastn -o c:\output.txt -q -1 -r 2. Para comparar dos secuencias de aminoácidos, las opciones de Bl2seq son las siguientes: -i se establece en un archivo que contiene la primera secuencia de aminoácidos a comparar (por ejemplo, C:\seq1.txt); -j se establece en un archivo que contiene la segunda secuencia de aminoácidos a comparar (por ejemplo, C:\seq2.txt); -p se establece en blastp; -o se establece en cualquier nombre de archivo deseado (por ejemplo, C:\put.txt); y todas las demás opciones se dejan en su configuración predeterminada. Por ejemplo, se puede utilizar el siguiente comando para generar un archivo de salida que contenga una comparación entre dos secuencias de aminoácidos: C:\Bl2seq -i c:\seql.txt -j c:\seq2.txt -p blastp -o c:\output.txt. Si las dos secuencias comparadas comparten homología, el archivo de salida designado presentará esas regiones de homología como secuencias alineadas. Si las dos secuencias comparadas no comparten homología, el archivo de salida designado no presentará secuencias alineadas.
Una vez alineadas, el número de coincidencias se determina contando el número de posiciones en las que se presenta un residuo de nucleótido o aminoácido idéntico en ambas secuencias. El porcentaje de identidad de secuencia se determina dividiendo el número de coincidencias por la longitud de la secuencia establecida en la secuencia identificada (por ejemplo, SEC ID NO:1), o por una longitud articulada (por ejemplo, 100 nucleótidos consecutivos o residuos de aminoácidos de una secuencia establecida en una secuencia identificada), seguido de multiplicar el valor resultante por 100. Por ejemplo, una secuencia de ácido nucleico que tiene 900 coincidencias cuando se alinea con la secuencia establecida en SEC ID NO:1 es 95.6 por ciento idéntica a la secuencia establecida en SEC ID NO:1 (es decir, 900 941 x 100 = 95.6). Cabe señalar que el valor del porcentaje de identidad de secuencia se redondea a la décima más próxima. Por ejemplo, 75.11, 75.12, 75.13 y 75.14 se redondean a 75.1, mientras que 75.15, 75.16, 75.17, 75.18 y 75.19 se redondean a 75.2. También se observa que el valor de la longitud siempre será un número entero.
Las moléculas de ácido nucleico FAD descritas en el presente documento pueden incluir secuencias diana para endonucleasas de corte raras (por ejemplo, endonucleasas efectoras TAL). Los métodos para seleccionar secuencias diana endógenas y generar endonucleasas efectoras TAL dirigidas a dichas secuencias pueden realizarse como se describe en otro lugar.Véase,por ejemplo, la publicación PCT n° WO 2011/072246. Los efectores TAL se encuentran en bacterias fitopatógenas del géneroXanthomonas.Estas proteínas desempeñan funciones importantes en la enfermedad, o desencadenan la defensa, al unirse al ADN del huésped y activar genes efectores específicos del huésped(véase,por ejemplo, Gu et al., Nature 435:1122-1125, 2005; Yang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103:10503-10508, 2006; Kay et al. Science 318:648-651, 2007; Sugio et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 104:10720-10725, 2007; y Romer et al. Science 318:645-648, 2007). La especificidad depende de un número efector-variable de imperfecciones, normalmente 34 repeticiones de aminoácidos (Schornack et al., J. Plant Physiol. 163:256-272, 2006; y WO 2011/072246). Los polimorfismos están presentes principalmente en las posiciones de repetición 12 y 13, que en el presente documento se denominan diresido variable de repetición (RVD).
Los RVDs de los efectores TAL corresponden a los nucleótidos en sus sitios diana de forma directa y lineal, un RVD a un nucleótido, con cierta degeneración y sin dependencia aparente del contexto. Este mecanismo de reconocimiento proteína-ADN permite la predicción de sitios diana para nuevos efectores TAL específicos, así como la selección de sitios diana y la ingeniería de nuevos efectores TAL con especificidad de unión para los sitios seleccionados.
Los dominios de unión al ADN de los efectores TAL pueden fusionarse a otras secuencias, tal como secuencias de endonucleasas, dando lugar a endonucleasas quiméricas dirigidas a secuencias de ADN específicas y seleccionadas, y dando lugar al posterior corte del ADN en las secuencias dirigidas o cerca de ellas. Tales cortes (es decir, roturas de doble cadena) en el ADN pueden inducir mutaciones en la secuencia de ADN de tipo salvaje a través de NHEJ o recombinación homóloga, por ejemplo. En algunos casos, las endonucleasas efectoras TAL pueden utilizarse para facilitar la mutagénesis dirigida en genomas complejos, eliminando o alterando la función génica con gran precisión y eficacia. Como se describe en los Ejemplos siguientes, las endonucleasas efectoras TAL dirigidas a los alelos FAD3A, FAD3B y FAD3C de la soja pueden utilizarse para mutagenizar los genes endógenos, dando lugar a plantas con expresión reducida (por ejemplo, sin expresión detectable) de estos genes. El hecho de que algunas endonucleasas (por ejemplo,FokI)funcionen como dímeros puede utilizarse para mejorar la especificidad de diana de la endonucleasa efectora TAL. Por ejemplo, en algunos casos puede utilizarse un par de monómeros de endonucleasas efectoras TAL dirigidas a diferentes secuencias de ADN (por ejemplo, las secuencias diana subrayadas que se muestran en las FIGS. 1, 2 y 3). Cuando los dos sitios de reconocimiento de la endonucleasa efectora TAL están muy próximos, como se muestra en las FIGS. 1-3, los monómeros inactivos pueden unirse para crear una enzima funcional que escinde el ADN. Al requerir la unión del ADN para activar la nucleasa, se puede crear una enzima de restricción altamente específica.
Los métodos para utilizar endonucleasas efectoras TAL para generar plantas, células vegetales o partes de plantas con mutaciones en genes endógenos incluyen, por ejemplo, los descritos en los Ejemplos del presente documento. Por ejemplo, los ácidos nucleicos que codifican endonucleasas efectoras TAL dirigidas a secuencias FAD3A, FAD3B o FAD3C seleccionadas (por ejemplo, las secuencias FAD3A mostradas en la FIG. 1 y la TABLA 1, las secuencias FAD3B mostradas en la FIG. 2 y la TABLA 1, y/o las secuencias FAD3C mostradas en la FIG. 3 y la TABLA 1) pueden transformarse en células vegetales (por ejemplo, células en cotiledones), donde pueden expresarse. Posteriormente, las células pueden analizarse para determinar si se han introducido mutaciones en el sitio o sitios diana, mediante ensayos basados en ácidos nucleicos o ensayos basados en proteínas para detectar los niveles de expresión, como se ha descrito anteriormente, por ejemplo, o utilizando ensayos basados en ácidos nucleicos (por ejemplo, PCR y secuenciación de ADN, o PCR seguida de un ensayo T7E1; Mussolino et al., Nucleic Acids Res 39:9283-9293, 2011) para detectar mutaciones en los loci genómicos.
La población mutagenizada, o una generación posterior de esa población, puede ser examinada para uno o más rasgos deseados (por ejemplo, composición alterada del aceite) que resultan de las mutaciones. Alternativamente, la población mutagenizada, o una generación posterior de esa población, puede ser examinada para detectar una mutación en un gen FAD3A, FAD3B o FAD3C. Por ejemplo, la generación de progenie M<2>de plantas M<1>puede evaluarse para detectar la presencia de una mutación en un gen FAD3A, FAD3B o FAD3C. Una "población" es cualquier grupo de individuos que comparten un acervo genético común. En el presente documento, "M<0>" se refiere a células vegetales (y plantas cultivadas a partir de ellas) expuestas a una nucleasa efectora TAL, mientras que "M<1>" se refiere a semillas producidas por plantas M<0>autógamas, y plantas cultivadas a partir de dichas semillas. "M<2>" es la progenie (semillas y plantas) de plantas autógamas M<1>, "M<3>" es la descendencia de plantas autógamas M<2>, y "M<4>" es la descendencia de plantas autógamas M<3>. "M<5>" es la progenie de plantas autógamas M<4>. "Ma", "M<7>", etc. son cada una la progenie de plantas autógamas de la generación anterior. El término "autofecundado" utilizado en el presente documento significa autopolinizado.
Pueden obtenerse una o más plantas de soja M<1>a partir de células vegetales Mo mutagenizadas individuales (y plantas cultivadas a partir de ellas), y puede identificarse que al menos una de las plantas contiene una mutación en un gen FAD3A, FAD3B o FAD3C. Una planta de soja M<1>puede ser heterocigótica para un alelo mutante en un locus FAD3A, FAD3B, y/o FAD3C y, debido a la presencia del alelo de tipo salvaje, presentar actividad desaturasa de ácidos grasos delta-quince. Alternativamente, una planta de soja M<1>puede tener un alelo mutante en un locus FAD3A, FAD3B o FAD3C y presentar el fenotipo de carecer de actividad delta-fifteen desaturasa de ácidos grasos. Dichas plantas pueden ser heterocigóticas y carecer de actividad desaturasa de ácidos grasos delta-quince debido a fenómenos como una supresión dominante negativa, a pesar de la presencia del alelo de tipo salvaje, o pueden ser homocigóticas debido a mutaciones inducidas independientemente en ambos alelos en el locus FAD3A, FAD3B o FAD3C.
Una planta de soja portadora de alelos mutantes FAD3A, FAD3B y FAD3C puede utilizarse en un programa de fitomejoramiento para crear líneas y variedades novedosas y útiles. Así, en algunas realizaciones, una planta de soja M<1>, M<2>, M<3>, o de generación posterior que contiene al menos una mutación en un gen FAD3A, al menos una mutación en un gen FAD3B, y al menos una mutación en un gen FAD3C puede cruzarse con una segunda planta de soja, y puede identificarse la progenie del cruce en la que están presentes las mutaciones de los genes FAD3A, FAD3B y FAD3C. Se aprecia que la segunda planta de soja puede contener las mismas mutaciones FAD3A, FAD3B y FAD3C que la planta con la que se cruza, diferentes mutaciones FAD3A, FAD3B y FAD3C, o puede ser de tipo salvaje en los loci FAD3A, FAD3B y/o FAD3C.
También debe apreciarse que la población de soja mutagenizada puede combinarse con otras mutaciones previamente identificadas, para obtener rasgos de mayor valor agronómico. Por ejemplo, un mutante FAD3A, FAD3B y/o FAD3C puede combinarse con una planta de soja mutante FAD2. Un mutante combinatorio de este tipo puede aumentar aún más el valor del perfil de aceite. Esta combinación puede obtenerse utilizando plantas mutantes como material para la mutagénesis de FAD3A, FAD3B y/o FAD3C, o mediante programas de cría.
La cría puede llevarse a cabo mediante procedimientos conocidos. Las tecnologías de huellas de ADN, SNP o similares pueden utilizarse en un programa de mejora de selección asistida por marcadores (MAS) para transferir o criar alelos mutantes de FAD3A, FAD3B y FAD3C en otras plantas de soja. Por ejemplo, un obtentor puede crear poblaciones segregantes a partir de hibridaciones de un genotipo que contenga un alelo mutante con un genotipo agronómicamente deseable. Las plantas de las generaciones F<2>o retrocruzadas pueden examinarse utilizando marcadores desarrollados a partir de las secuencias FAD3A, FAD3B y FAD3C o fragmentos de las mismas. Las plantas identificadas como poseedoras del alelo mutante pueden retrocruzarse o autopolinizarse para crear una segunda población que se someterá a cribado. En función del patrón de herencia esperado o de la tecnología MAS utilizada, puede ser necesario autopolinizar las plantas seleccionadas antes de cada ciclo de retrocruzamiento para facilitar la identificación de las plantas individuales deseadas. El retrocruzamiento u otro procedimiento de cría puede repetirse hasta que se recupere el fenotipo deseado del progenitor recurrente.
Los cruces exitosos producen plantas F<1>que son fértiles y que pueden retrocruzarse con uno de los parentales si se desea. En algunas realizaciones, una población de plantas en la generación F<2>puede examinarse para determinar la expresión de los genes FAD3A, FAD3B y FAD3C. Por ejemplo, puede identificarse una planta que no exprese FAD3A, FAD3B y FAD3C debido a la presencia de mutaciones dentro de los genes FAD3A, FAD3B y FAD3C, utilizando métodos estándar tal como, por ejemplo, un método PCR con cebadores basados en la información de la secuencia de nucleótidos para FAD3A, FAD3B y FAD3C descrita en el presente documento. A continuación, las plantas seleccionadas pueden cruzarse con uno de los parentales y las plantas de la primera generación de retrocruces (BC<1>) se autopolinizan para producir una población BC<1>F<2>que se examina de nuevo en busca de variantes de la expresión de los genes FAD3A, FAD3B y FAD3C (por ejemplo, versiones nulas de los genes FAD3A, FAD3B y FAD3C). El procedimiento de retrocruzamiento, autopolinización y selección se repite, por ejemplo, al menos cuatro veces hasta que la selección final produce una planta que es fértil y razonablemente similar al parental recurrente, de forma que tiene un rendimiento agronómico aceptable. Esta planta, si se desea, puede autopolinizarse, y la progenie posteriormente puede examinarse de nuevo para confirmar que la planta carece de la expresión de los genes FAD3A, FAD3B y FAD3C. Opcionalmente, puede realizarse un análisis citogenético de las plantas seleccionadas para confirmar el complemento cromosómico y las relaciones de emparejamiento cromosómico. Las semillas de reproducción de la planta seleccionada pueden producirse utilizando métodos estándar que incluyen, por ejemplo, pruebas de campo, confirmación de la condición nula para FAD3A, FAD3B y FAD3C, y/o análisis del aceite para determinar el nivel de ácido linolénico.
En situaciones en las que el híbrido F<1>original resultante del cruce entre un primer progenitor de soja mutante y un segundo progenitor de soja de tipo salvaje, se hibrida o retrocrusta con el progenitor de soja mutante, la progenie del retrocruzamiento puede autopolinizarse para crear una generación BC<1>F<2>que se criba para los alelos mutantes FAD3A, FAD3B y FAD3C.
Un programa de fitomejoramiento que utilice las plantas mutantes de soja descritas en el presente documento puede dar lugar a líneas y variedades novedosas y útiles. Tal y como se utiliza en el presente documento, el término "variedad" se refiere a una población de plantas que comparten características constantes que las separan de otras plantas de la misma especie. A menudo, aunque no siempre, se comercializa una variedad. Aunque posea uno o más rasgos distintivos, una variedad puede caracterizarse además por una variación global muy pequeña entre los individuos de esa variedad. Una variedad de "línea pura" puede crearse mediante varias generaciones de autopolinización y selección, o mediante propagación vegetativa a partir de un único progenitor utilizando técnicas de cultivo de tejidos o células. Una variedad puede derivarse esencialmente de otra línea o variedad. Tal como se define en el Convenio Internacional para la Protección de las Obtenciones Vegetales (2 de diciembre de 1961, revisado el 10 de noviembre de 1972, el 23 de octubre de 1978 y el 19 de marzo de 1991), una variedad es "esencialmente derivada" de una variedad inicial si a) se deriva principalmente de la variedad inicial, o de una variedad que se deriva principalmente de la variedad inicial, conservando la expresión de los caracteres esenciales que resultan del genotipo o de la combinación de genotipos de la variedad inicial, b) se distingue claramente de la variedad inicial, y c) salvo por las diferencias resultantes del acto de derivación, es conforme a la variedad inicial en la expresión de los caracteres esenciales que resultan del genotipo o de la combinación de genotipos de la variedad inicial. Las variedades esencialmente derivadas pueden obtenerse, por ejemplo, por selección de un mutante natural o inducido, una variante somaclonal, un individuo variante a partir de plantas de la variedad inicial, retrocruzamiento o transformación. Una "línea", a diferencia de una variedad, suele designar un grupo de plantas utilizadas con fines no comerciales, por ejemplo en la investigación vegetal. Una línea suele mostrar poca variación global entre individuos para uno o más rasgos de interés, aunque puede haber cierta variación entre individuos para otros rasgos.
Los métodos descritos en el presente documento pueden utilizarse para producir partes de plantas (por ejemplo, semillas) o productos vegetales (por ejemplo, aceite) con un contenido reducido de ácido linolénico, en comparación con las correspondientes partes de plantas o productos de plantas de tipo salvaje. El contenido de ácidos grasos de una parte de la planta o de un producto vegetal puede evaluarse utilizando métodos estándar, tal como los descritos en el Ejemplo 6 del presente documento, por ejemplo.
La invención se describirá con más detalle en los siguientes ejemplos, que no limitan el alcance de la invención descrita en las reivindicaciones.
EJEMPLOS
Ejemplo 1 - Ingeniería de nucleasas de secuencia específica para mutagenizar los genes FAD3A*, FAD3B y FAD3C ("requerido por la presente invención)
Para inactivar o eliminar completamente los alelos de los genes FAD3A, FAD3B y FAD3C enG. max, sediseñaron nucleasas específicas de secuencia que se dirigen a la secuencia de ácido nucleico que codifica los motivos conservados del clúster de histidina necesarios para la actividad catalítica. Se diseñaron nueve pares de endonucleasas efectoras TAL para dirigirse a la familia de genes FAD3 (es decir, tres pares de endonucleasas efectoras TAL para cada gen FAD3), utilizando software que identifica específicamente los sitios de reconocimiento de endonucleasas efectoras TAL, tal como TALE-NT 2.0 (Doyle et al., Nucleic Acids Res 40:W117-122, 2012). Los sitios de reconocimiento de endonucleasas efectoras TAL para el gen FAD3A están subrayados en la FIG. 1, los sitios de reconocimiento de endonucleasas efectoras TAL para el gen FAD3B están subrayados en la FIG. 2, y los sitios de reconocimiento de endonucleasas efectoras TAL para el gen FAD3C están subrayados en la FIG. 3; estos también se enumeran en la TABLA 1. Las endonucleasas efectoras TAL se sintetizaron utilizando métodos similares a los descritos en otros lugares (Cermak et al., Nucleic Acids Res 39:e82, 2011; Reyon et al., Nat Biotechnol 30:460-465, 2012; y Zhang et al., Nat Biotechnol 29:149-153, 2011). Los pares de endonucleasas efectoras TAL dirigidas a la secuencia FAD3 se denominan GmFAD3_T01, GmFAD3_T02 y GmFAD3_T03, en la que GmFAD3A_T01 y GmFAD3A_T03 ejemplos comparativos y GmFAD3B_T02 según la presente invención. GmFAD3_T01 también puede denominarse GmFAD3_T01.1. GmFAD3_T02 también puede denominarse GmFAD3_T02.1. GmFAD3_T03 también puede denominarse GmFAD3_T03.1.
Ejemplo 2 - Actividad endonucleasa del efector TAL de FAD3A en protoplastos de soja
Para evaluar la actividad de las endonucleasas efectoras TAL dirigidas al gen FAD3A, se evaluaron las frecuencias de NHEJ mediante secuenciación profunda de protoplastos de soja transformados. La actividad de las endonucleasas efectoras TAL en sitios diana endógenos enG. maxse midió expresando las endonucleasas efectoras TAL en protoplastos y examinando los sitios diana de las endonucleasas efectoras TAL en busca de mutaciones introducidas por NHEJ. Brevemente, se tomaron semillas inmaduras deG. maxde plantas de 60 a 80 días de edad en condiciones de alta luminosidad. Los protoplastos se aislaron siguiendo los métodos descritos por Dhir et al., Plant Cell Reports 10:39-43, 1991.
Los plásmidos que codifican endonucleasas efectoras TAL, junto con un plásmido que codifica YFP, se introdujeron en protoplastos deG. maxmediante transformación mediada por PEG como se describe en otro lugar (Yoo et al., Nature Protocols 2:1565-1572, 2007). Veinticuatro horas después del tratamiento, se midió la eficiencia de la transformación evaluando una alícuota de los protoplastos transformados utilizando un microscopio fluorescente para monitorizar la fluorescencia de YFP Se determinó que la eficacia de la transformación era del 90 %. El resto de los protoplastos transformados se cosecharon y el ADN genómico se preparó mediante un método basado en la extracción de sales (Ajanabi et al., Nucl. Acids Res. 25(22):4692-4693,1997).Utilizando el ADN genómico preparado a partir de los protoplastos como molde, se amplificó por PCR un fragmento que abarcaba el sitio de reconocimiento de la endonucleasa del efector TAL. A continuación, el producto de la PCR se sometió a pirosecuenciación 454. Las lecturas de secuenciación con mutaciones de inserción/deleción (indel) en la región espaciadora se consideraron derivadas de la reparación imprecisa de un sitio de reconocimiento de una endonucleasa efectora TAL escindida por NHEJ. La frecuencia de mutagénesis se calculó como el número de lecturas de secuenciación con mutaciones NHEJ sobre el total de lecturas de secuenciación. A continuación, los valores se normalizaron por la eficacia de la transformación.
La actividad bruta de los pares de endonucleasas efectoras de GmFAD3 TAL, GmFAD3A_T01, GmFAD3A _T02, y GmFAD3A_T03, contra FAD3A, FAD3B, y FAD3C se resumen en la TABLA 5. Las endonucleasas efectoras TAL GmFAD3A_T02 presentaron la mayor actividad en la diana prevista FAD3A (14.48 %) y una menor actividad en FAD3B y FAD3C (8.81 % y 0.01 %, respectivamente).
Se observó una correlación entre el número de SNPs dentro de los sitios de unión de la endonucleasa efectora TAL y las frecuencias de mutación relativas (FIG. 6). Las frecuencias de mutación brutas en los sitios diana de FAD3A (que contienen 0 SNPs) para los pares de endonucleasas efectoras TAL GmFAD3_T01, GmFAD3_T02, GmFAD3_T03 fueron del 10.15 %, 14.48 % y 2.39 %, respectivamente. Tras normalizar las frecuencias de mutación de la endonucleasa efectora TAL en FAD3A, se determinaron las frecuencias de mutación relativas en FAD3B y FAD3C. Los sitios diana con uno o dos SNP disminuyeron las frecuencias de mutación a ~53 o 63 %, respectivamente, en relación con la actividad de la correspondiente endonucleasa efectora TAL en FAD3A; los sitios diana con cuatro SNP disminuyeron las frecuencias de mutación a 14 %; los sitios diana con cinco SNP disminuyeron las frecuencias de mutación a 0.041 %, y los sitios diana con más de cinco SNP disminuyeron las frecuencias de mutación a niveles indetectables. Aunque estos datos no tienen en cuenta la posición relativa de los SNPs, proporcionan pruebas de la especificidad del sitio diana de la endonucleasa efectora TAL, indicando que es poco probable que los sitios diana con cinco o más SNPs sean reconocidos y escindidos.
Las mutaciones de FAD3 en protoplastos de soja, que se introdujeron utilizando los pares de nucleasas FAD3A TALE, se analizaron posteriormente. Se observaron tanto inserciones como deleciones, siendo la mayoría de las mutaciones deleciones. La SEC ID NOS:109-4901 proporciona una lista de las mutaciones FAD3 inducidas por endonucleasas efectoras TAL identificadas en células de soja. Las mutaciones específicas introducidas en FAD3A por GmFAD3_T01.1 se establecen en las secuencias de SEC ID NOS:109-1140. Las mutaciones específicas introducidas en FAD3B por GmFAD3_T01.1 se establecen en las secuencias de SEC ID NOS:1141-1372. Las mutaciones específicas introducidas en FAD3A por GmFAD3_T02.1 se establecen en las secuencias de SEC ID NOS:1373-3116. Las mutaciones específicas introducidas en FAD3B por GmFAD3_T02.1 se establecen en las secuencias de SEC ID NOS:3117-4048. Las mutaciones específicas introducidas en FAD3A por GmFAD3_T03.1 se exponen en las secuencias de SEC ID NOS: 4049-4607. Las mutaciones específicas introducidas en FAD3B por GmFAD3_T03.1 se establecen en las secuencias de SEC ID NOS:4608-4884. Las mutaciones específicas introducidas en FAD3C por GmFAD3_T03.1 se exponen en las secuencias de SEC ID NOS: 4885-4901. Se observó que la mayoría de las mutaciones incluían una deleción del nucleótido en la posición 9 del espaciador de 17 nucleótidos. En concreto, utilizando el par de endonucleasas TAL GmFAD3_T01.1, se observó una deleción del nucleótido de adenina en la posición 459 de SEC ID NO:24 (FAD3A). Utilizando el par de endonucleasas TAL GmFAD3_T02.1, se observó una deleción del nucleótido citosina en la posición 515 de SEC ID NO:24 (FAD3A). Utilizando el par de endonucleasas TAL GmFAD3_T03.1, se observó una deleción del nucleótido de adenina en la posición 894 de SEC ID NO:24 (FAD3A). Utilizando el par de endonucleasas TAL GmFAD3_T01.1, se observó una deleción del nucleótido de adenina en la posición 496 de SEC ID NO:25 (FAD3B). Utilizando el par de endonucleasas TAL GmFAD3_T02.1, se observó una deleción del nucleótido citosina en la posición 552 de SEC ID NO:25 (FAD3B). Utilizando el par de endonucleasas TAL GmFAD3_T03.1, se observó una deleción del nucleótido de adenina en la posición 952 de SEC ID NO:25 (FAD3B). Utilizando el par de endonucleasas TAL GmFAD3_T03.1, se observó una deleción del nucleótido de adenina en la posición 686 de SEC ID NO:26 (FAD3C).
Ejemplo 3 - Regeneración de plantas de soja con mutaciones inducidas por endonucleasas efectoras TAL en los genes FAD3
Tras verificar que la endonucleasa efectora FAD3 TAL creaba modificaciones dirigidas en sitios diana endógenos, se realizaron experimentos para crear plantas de soja con mutaciones en FAD3A, FAD3B y FAD3C. Para ello, cada uno de los pares de endonucleasas efectoras TAL FAD3 se clonó en un vector bacteriano, con expresión de endonucleasas efectoras TAL dirigida por el promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor. Estos vectores pueden suministrarse en las células vegetales mediante transformación mediada por Agrobacterium o por biolística.
Las plantas transgénicas de soja que expresan las endonucleasas efectoras TAL se generaron mediante protocolos de transformación estándar (Rech et al., Nat Protoc 3:410-418, 2008; Haun et al., Plant Biotech J 12:934-940, 2014; y Curtin et al., Plant Physiol 156:466-473, 2011). Tras la transformación de medios cotiledones de soja (variedad Bert) con secuencias que codifican la endonucleasa efector TAL GmFAD3_T02, se regeneraron plantas putativamente transgénicas. Se transformaron líneas de soja WT y mutantes FAD2-1A, FAD2-1B. Las plantas se transfirieron al suelo y, tras aproximadamente 4 semanas de crecimiento, se cosechó una pequeña hoja de cada planta para la extracción de ADN y el genotipado. A partir de cuatro transformaciones independientes (designadas como experimentos Gm183, Gm184, Gm205 y Gm206), se generó un total de 72 eventos. A continuación, todas las plantas T0 transgénicas positivas se sometieron a un ensayo con la endonucleasa 1 T7 (T7E1) para identificar plantas con mutaciones en los sitios de reconocimiento de las endonucleasas efectoras TAL FAD3A, FAD3B y/o FAD3C (Kim et al., Genome Res. 19:1279-1288, 2009). Brevemente, se generó un producto PCR que abarcaba el sitio de reconocimiento de la endonucleasa del efector TAL, se desnaturalizó y se dejó reanudar. Se añadió T7E1 a los productos de hibridación para escindir los heterodúplex generados cuando un fragmento de ADN de tipo salvaje se hibridaba con un fragmento portador de una mutación inducida por una endonucleasa efectora TAL, y los productos de hibridación se visualizaron mediante electroforesis en gel de agarosa. Alternativamente, los amplicones de la PCR podrían secuenciarse directamente para evaluar si se han producido mutaciones en los sitios diana de FAD3A, F<a>D3B y/o FAD3C.
El ensayo T7E1 reveló que de las 72 plantas transgénicas positivas examinadas, 16 dieron positivo para mutaciones en el sitio diana. A continuación, los amplicones de PCR de FAD3A y FAD3B de las 16 plantas positivas se insertaron en vectores de clonación y se sometieron a secuenciación Sanger para confirmar y caracterizar los perfiles mutantes. Las lecturas resultantes se alinearon con las secuencias de tipo salvaje para determinar los tipos de alelos. Los resultados se resumen en la TABLA 6, y las secuencias representativas se muestran en la FIG. 7. En conjunto, estos resultados confirmaron el éxito de la mutagénesis de FAD3 en plantas de soja T0, con frecuencias de mutagénesis de la endonucleasa efectora TAL GmFAD3_T02 en FAD3A de alrededor del 22 por ciento.
Para confirmar que las mutaciones inducidas por endonucleasas efectoras de TAL pueden transmitirse de forma estable a generaciones posteriores, se examinaron las plantas candidatas T1 derivadas del experimento Gm183 en busca de mutaciones dentro de FAD3A mediante amplificación por PCR y secuenciación de clones. A partir de tres eventos T0 diferentes (Gm183-4, Gm183-5 y Gm183-6), se identificaron plantas T1 que albergaban mutaciones heterocigóticas u homocigóticas dentro de FAD3A, lo que indicaba que las mutaciones se transmitían de forma estable a la siguiente generación. No se identificaron plantas con combinaciones de mutaciones en FAD3A y FAD3B, lo que indica que la frecuencia de mutagénesis enFAD3Bfue <1.4%(es decir, menos de 1 de cada 72 eventos).
Las lecturas de secuenciación de Sanger que contenían mutaciones en FAD3A se alinearon con las secuencias de tipo salvaje para determinar los tipos de alelos. Los resultados se resumen en la TABLA 7. En los SEC ID NOS 64-71, 73-90 y SEC ID NOS:102-106 se muestra un listado de las mutaciones identificadas en FAD3A.
Ejemplo 4 - Regeneración de plantas de soja con mutaciones inducidas por endonucleasas efectoras TAL en los genes FAD2 y FAD3
Un enfoque alternativo para eliminar los genes FAD2 y FAD3 consiste en suministrar simultáneamente dos endonucleasas efectoras TAL dirigidas a la secuencia dentro de los genes FAD2-1A, FAD2-1B (una endonucleasa efectora TAL) y FAD3 (la otra endonucleasa efectora TAL). Tras la verificación de que las endonucleasas efectoras FAD2 y FAD3 TAL crearon modificaciones dirigidas en sitios diana endógenos, se realizan experimentos para crear plantas de soja con mutaciones en FAD2-1A, FAD2-1B, FAD3A, FAD3B y FAD3C. Para conseguirlo, cada una de las endonucleasas efectoras TAL FAD2 y FAD3 se clonan en un vector de ADN-T, y la expresión de la endonucleasa efectora TAL está dirigida por el promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor (Zuo et al,supra)..El vector de ADN-T también contiene un marcador seleccionable que confiere resistencia al glufosinato. Estos vectores se suministran en las células vegetales mediante transformación mediada por Agrobacterium o biolística.
Las plantas de soja transgénicas que expresan las endonucleasas efectoras TAL se generan utilizando protocolos estándar de transformación conAgrobacterium rhizogenes(Curtin et al.,supra).Tras el cultivo de las cepas deA. rhizogenesque contienen ADN-T con medios cotiledones de soja (variedad Bert), se regeneran plantas putativamente transgénicas. Las plantas se transfieren al suelo y, tras aproximadamente 4 semanas de crecimiento, se recolecta una pequeña hoja de cada planta para la extracción de ADN y el genotipado. Cada muestra de ADN se analiza primero mediante PCR para detectar la presencia de ADN-T. A continuación, todas las plantas con ADN-T positivo se someten a un ensayo con la endonucleasa 1 T7 (T7E1) para identificar plantas con mutaciones en los sitios de reconocimiento de la endonucleasa efectora TAL FAD2-1A, FAD2-1B, FAD3A, FAD3B y/o FAD3C (Kim et al., Genome Res. 19:1279-1288, 2009). Brevemente, se genera un producto de PCR que abarca el sitio de reconocimiento de la endonucleasa del efector TAL, se desnaturaliza y se deja reanudar. Se añade T7E1 a los productos de hibridación para escindir los heterodúplex generados cuando un fragmento de ADN de tipo salvaje se hibridó con un fragmento portador de una mutación inducida por una endonucleasa efectora TAL, y los productos de hibridación se visualizan mediante electroforesis en gel de agarosa. Alternativamente, los amplicones PCR pueden secuenciarse directamente para evaluar si se han producido mutaciones en los sitios diana FAD2-1A, FAD2-1B, FAD3A, FAD3B y/o FAD3C.
Ejemplo 5 - Cruce de plantas de soja con mutaciones inducidas por endonucleasas efectoras TAL en los genes FAD2 y/o FAD3 para producir mutantes combinatorios.
Tras verificar que se han generado plantas de soja con mutaciones en FAD2-1A, FAD2-1B (FIG. 8), FAD3A, FAD3B y FAD3C, las plantas mutantes se someten a cruzamiento para producir mutantes combinatorios de FAD2-1A, FAD2-1B, FAD3A, FAD3B y/o FAD3C. Esto se consigue adquiriendo polen de una flor joven que se ha abierto por primera vez; la flor se separa y se recoge para transferir el polen deseado al estigma. La progenie resultante se genotipa para confirmar el éxito de los cruces.
Ejemplo 6 - Análisis del perfil de ácidos grasos en semillas producidas a partir de mutaciones inducidas por endonucleasas efectoras TAL en los genes FAD3 de la soja
Las líneas de soja se cultivan hasta la madurez y se dejan autofecundar, dando lugar a semillas que son mutantes homocigóticas en FAD3A (designadas aaBBCC), FAD3B (designadas AAbbCC), FAD3C (designadas AABBcc), FAD3A y FAD3B (designadas aabbCC), FAD3B y FAD3C (designadas AAbbcc), o FAD3A, FAD3B y FAD3C (designadas aabbcc). Se analiza la composición de ácidos grasos de estas semillas. Brevemente, se pulverizan semillas individuales de soja y se prepara ADN a partir de una porción del tejido molido, que se analiza para establecer el genotipo de cada semilla. El tejido pulverizado restante de semillas FAD3A homocigotas (aaBBCC), FAD3B homocigotas (AAbbCC), FAD3C homocigotas (AABBcc), FAD3A y FAD3B homocigotas (aabbCC), FAD3B y FAD3C homocigotas (AAbbcc), o FAD3A, FAD3B y FAD3C homocigotos (aabbcc) se utiliza para determinar la composición de ácidos grasos mediante cromatografía de gases de ésteres metílicos de ácidos grasos (FAME) (Beuselinck et al., Crop Sci. 47:747-750, 2006). Los resultados del análisis muestran probablemente que el mutante simple tiene una reducción modesta de ácido linolénico, mientras que los mutantes doble y triple probablemente muestren una reducción más significativa.
Ejemplo 7 - El aceite de las semillas de soja mutantes homocigóticas FAD2-1A FAD2-1B FAD3A contiene un alto contenido en ácido oleico, un bajo contenido en ácido linoleico y un bajo contenido en ácido linolénico.
Se evaluó el perfil de aceite de semillas de plantas de soja mutantes FAD3A (designadas comofad3a)y plantas de soja mutantes homocigotas FAD2-1A FAD2-1B FAD3A (designadas comofad2-1a fad2-1b fad3a)(FIG. 9). Se recogieron semillas de las líneas mutantes homocigóticas T1 y se evaluó la composición del aceite mediante análisis cromatográfico de gases de ésteres metílicos de ácidos grasos (Análisis GC FAME). Se observaron cambios significativos en los niveles de ácido linolénico y linolénico en el aceite de las plantasfad3a, en relación con el aceite de las plantas WT: los niveles de ácido linolénico disminuyeron de 8.2 ± 0.4 % a 3.9 ± 0.3 %, mientras que los niveles de ácido linoleico aumentaron de 51.1 ± 0.2 % a 61.9 ± 1.2 %. Sorprendentemente, también se observaron cambios significativos en los niveles de ácido oleico y esteárico: los niveles de ácido oleico disminuyeron del 23.2 ± 0.8 % al 17.9 ± 1.6 %, y los niveles de ácido esteárico disminuyeron del 4 ± 0.01 % al 3.2 ± 0.1 %.
En concreto, cinco réplicas biológicas de semillas de plantasfad3apresentaron niveles de ácido linolénico del 3.8 %, 4.3 %, 3.9 %, 3.8 % y 3.5 %; niveles de ácido linoleico del 63.0 %, 63.2 %, 61.2 %, 60.4 % y 61.9 %; niveles de ácido oleico del 17.2 %, 15.6 %, 18.6 %, 19.4 % y 18.9 %; niveles de ácido esteárico del 3.2 %, 3.4 %, 3.0 %, 3.0 % y 3.1 %; y niveles de ácido palmítico del 12.0 %, 12.6 %, 12.4 %, 12.6 % y 11.7 %.
Cuatro réplicas biológicas de semillas WT presentaron niveles de ácido linolénico del 8.2 %, 8.2 %, 8.1 % y 8.2 %; niveles de ácido linoleico del 51.2 %, 51.0 %, 50.9 % y 51.4 %; niveles de ácido oleico del 23.2 %, 23.3 %, 23.2 % y 23.3 %; niveles de ácido esteárico del 4.0 %, 4.0 %, 4.0 % y 4.0 %; y niveles de ácido palmítico del 12.4 %, 12.5 %, 12.8 % y 12.0 %.
También se observaron cambios significativos en los niveles de ácidos grasos dentro del aceite de semilla de las plantas de sojafad2-1a fad2-1b fad3aen comparación con los niveles de ácidos grasos dentro de las plantas de sojafad2-1a fad2-1b(FIG. 9). El nivel medio de ácido linolénico en el aceite de las plantasfad2-1a fad2-1b fad3afue del 2.5 ± 0.4 %, significativamente inferior al del aceite de las plantas de sojafad2-1a fad2-1b(4.7 ± 0.1 %). Además, y sorprendentemente, los niveles de ácido linoleico disminuyeron del 5.1 ± 0.7 % en las líneasfad2-1a fad2-1bal 2.7 ± 0.9 % en las líneasfad2-1a fad2-1b fad3a, y los niveles de ácido oleico aumentaron de 77.5 ± 0.8 % en las líneasfad2-1a fad2-1ba 82.2 ± 1.6 % en las líneasfad2-1a fad2-1b fad3a. En conjunto, estos resultados indican que las mutaciones de apilamiento dentro de los genesFAD2-1yFAD3Apueden disminuir los niveles de ácido linolénico y linoleico por debajo del 3 %, y aumentar los niveles de ácido oleico por encima del 80 %.
Específicamente, 20 réplicas biológicas de semillas de plantasfad2-1a fad2-1b fad3apresentaban niveles de ácido linolénico de 1,9%, 3,1%, 2,2%, 2,8%, 3,2%, 2,6%, 2,8%, 3,0%, 2,7%, 2,1%, 2,0%, 2,1%, 2,2%, 2,3%, 2,5%, 2,9%, 2,8%, 2,3%, 2,5%, y 2,3%; niveles de ácido linoleico de 1,6%, 4,6%, 2,5%, 2,6%, 2,5%, 2,6%, 2,3%, 2,0%, 2,2%, 2,3%, 1,8%, 2,1%, 2,1%, 3,0%, 2,9%, 5,0%, 4,3%, 2,6%, 3,2% y 2,3%; niveles de ácido oleico de 84,3%, 78,9%, 82,0%, 82,1%, 82,2%, 82,0%, 83,1%, 82,5%, 82,4%, 83,2%, 84,2%, 83,7%, 83,6%, 82,3%, 81,9%, 78,6%, 79,5%, 82,7%, 81,5% y 83,2%; niveles de ácido esteárico de 3,4%, 3,5%, 4,6%, 3,3%, 3,1%, 3,5%, 2,7%, 3,1%, 3,0%, 3,3%, 3,1%, 3,2%, 3,1%, 3,6%, 3,6%, 3,7%, 3,7%, 3,4%, 3,5% y 3,0%; y palmítico niveles de ácido 7,5%, 8,6%, 7,3%, 8,0%, 8,1%, 8,0%, 8,0%, 8,1%, 8,4%, 7,7%, 7,7%, 7,5%, 7,6%, 7,4%, 7,7%, 8,6%, 8,5%, 7,6%, 7,9% y 7,8%.
Veinte réplicas biológicas de semillas de plantasfad2-1a fad2-1btenían unos niveles de ácido linolénico de 4,8%, 4,9%, 4,9%, 4,9%, 4,8%, 4,8%, 4,9%, 4,8%, 4,7%, 4,7%, 4,8%, 4,8%, 4,7%, 4,7%, 4,7%, 4,7%, 4,6%, 4,6%, 4,6% y 4,6%; niveles de ácido linoleico de 3,7%, 4,4%, 4,5%, 4,7%, 5,6%, 5,3%, 5,9%, 6,4%, 4,1%, 4,8%, 4,9%, 4,4%, 5,7%, 5,7%, 5,5%, 5,3%, 4,9%, 5,0%, 5,3% y 5,3%; niveles de ácido oleico de 79,4%, 78,2%, 77,8%, 77,8%, 76,7%, 77,0%, 76,4%, 76,5%, 78,6%, 78,3%, 78,0%, 78,6%, 76,9%, 77,2%, 77,4%, 77,1%, 77,5%, 77,4%, 77,1% y 77,1%; niveles de ácido esteárico de 3,4%, 3,3%, 3,3%, 3,3%, 3,3%, 3,3%, 3,3%, 3,2%, 3,3%, 3,3%, 3,4%, 3,4%, 3,3%, 3,3%, 3,3%, 3,3%, 3,5%, 3,5%, 3,5% y 3,5%; y palmítico niveles de ácido 7,5%, 8,0%, 8,3%, 8,1%, 8,4%, 8,3%, 8,4%, 8,0%, 8,0%, 7,6%, 7,8%, 7,6%, 8,2%, 8,0%, 8,0%, 8,5%, 8,2%, 8,2%, 8,3% y 8,3%.
Ejemplo 8 - Generación de líneas de soja mutante sin transgén
Para obtener líneas de soja que tengan las mutaciones FAD3 pero carezcan de la construcción de la endonucleasa efectora FAD3 TAL y su marcador seleccionable asociado, se criba la progenie para el genotipo aabbcc. A continuación, se buscan segregantes mutantes libres de transgenes mediante una estrategia de PCR que utiliza dos conjuntos de pares de cebadores: uno abarca la secuencia codificante de la endonucleasa efectora TAL y el otro el gen de la alcohol deshidrogenasa endógena de la soja (un control para la reacción de PCR). Estos resultados indican la viabilidad de crear líneas libres de transgenes con mutaciones en los genes FAD3A, FAD3B y FAD3C.
Además, las plantas T1 que contenían mutaciones FAD3A en el fondo FAD2 KO se evaluaron mediante PCR para detectar la presencia de la secuencia transgénica (TABLA 7). De las 17 plantas T1 ensayadas, 15 fueron positivas para la secuencia del transgén y dos fueron negativas (es decir, segregantes nulos para el transgén de la endonucleasa efectora TAL). Es importante destacar que las dos plantas T1 sin transgén albergaban mutaciones enFAD3A..Estas dos plantas se autopolinizaron para producir plantas de sojafad2-1a fad2-1b fad3ahomocigóticas mutantes y libres de transgenes.
Ejemplo 9 - Generación de líneas de soja con mutaciones en los genes FAD2-1A y FAD2-1B
Para inactivar o eliminar completamente los alelos de los genes FAD2-1A y FAD2-1B en la soja, se diseñaron nucleasas de secuencia específica dirigidas a la región codificante de la proteína en las proximidades del codón de inicio. Se diseñaron ocho pares de endonucleasas efectoras TAL para dirigirse a la familia génica FAD2-1 dentro de los primeros 500 pb de la secuencia de codificación utilizando software que identifica específicamente los sitios de reconocimiento de endonucleasas efectoras TAL, tal como TALE-NT 2.0 (Doyle et al., Nucleic Acids Res 40:W117-122, 2012). Los sitios de reconocimiento de endonucleasas efectoras<t>A<l>para los genes FAD2-1 se enumeran en la FIG. 10. Las endonucleasas efectoras TAL se sintetizaron utilizando métodos similares a los descritos en otros lugares (Cermak et al., Nucleic Acids Res 39:e82, 2011; Reyon et al., Nat Biotechnol 30:460-465, 2012; y Zhang et al., Nat Biotechnol 29:149-153, 2011). La actividad de TA<l>E<n>se verificó mediante un ensayo con levaduras, y se eligió el par TALEN FAD2_T04 para la transformación estable en plantas de soja.
Las plantas transgénicas candidatas se regeneraron y se transfirieron al suelo. Tras aproximadamente 4 semanas de crecimiento, se cosechó una pequeña hoja de cada planta para la extracción de ADN y el genotipado. Cada muestra de ADN se analizó primero mediante PCR para detectar la presencia de ADN transgénico. A continuación, todas las plantas transgénicas positivas se sometieron a un ensayo T7E1 para identificar plantas con mutaciones en el sitio de reconocimiento de las endonucleasas efectoras TAL FAD2-1A y FAD2-1B (Kim et al., Genome Res.
19:1279-1288, 2009). Brevemente, se generó un producto PCR que abarcaba el sitio de reconocimiento de la endonucleasa del efector TAL, se desnaturalizó y se dejó reanudar. Se añadió la endonucleasa T7E1 a los productos de hibridación para cortar los heterodúplex generados cuando un fragmento de ADN de tipo salvaje se hibridaba con un fragmento portador de una mutación inducida por una endonucleasa efectora TAL, y los productos de hibridación se visualizaron mediante electroforesis en gel de agarosa. Cuatro plantas mostraron evidencias de mutaciones inducidas por endonucleasas efectoras TAL (Gm026-18, Gm026-23, Gm027-06 y Gm027-07). Además, las cuatro plantas presentaban mutaciones tanto en FAD2-1A como en FAD2-1B, lo que indica que ambos genes fueron mutagenizados simultáneamente.
Para determinar si las mutaciones introducidas por las endonucleasas efectoras TAL en el tejido foliar se transmitían a la siguiente generación, se recogieron semillas de las plantas T0 Gm026-18, Gm026-23 y Gm027-06. En cada población T1, se genotipificaron 20-60 plantas individuales para confirmar la transmisión de las mutaciones. Ambas mutaciones FAD2-1A y FAD2-1B segregaron en la progenie T1 de GM026-18. En cambio, sólo las mutaciones FAD2-1A o FAD2-1B se transmitieron a la progenie T1 de GM-026-23 y GM027-6, respectivamente. Las mutaciones hereditarias dentro de GM026-18 se muestran en la FIG. 8.
Ejemplo 10 - Fenotipo de las líneas GM026-18 de soja
Se evaluó el contenido en proteínas y la composición en ácidos grasos de las semillas de soja GM026-18 cultivadas en el campo (FIG. 11). Las plantas de soja GM026-18 se compararon directamente con plantas de control,Glycine max(L.) Merr. cultivar Bert, que no contienen las mutaciones FAD2-1A o FAD2-1B. Se evaluaron 27 propiedades diferentes, incluido el contenido de humedad (mediante evaluación en horno de tiro forzado), así como proteínas, grasa bruta, triptófano, cisteína, metionina, alanina, arginina, ácido aspártico, ácido glutámico, glicina, histidina, isoleucina, leucina, fenilalanina, prolina, serina, treonina, lisina total, tirosina, valina, ácido palmítico, ácido esteárico, ácido oleico, ácido linoleico, ácido alfa linolénico y contenido total de ácidos grasos. Inesperadamente, se observó un aumento del contenido de proteínas en las líneas GM026-18 en comparación con el control de tipo salvaje (comparar 37.93 a 34.49; comparar 40.8 a 39.11; comparar 38.4 a 37.6).
Ejemplo 11 - Combinaciones de mutaciones FAD2 y FAD3
Se producen plantas que contienen combinaciones de mutaciones que eliminan la actividad de uno o más genes o proteínas FAD2 y FAD3, ya sea dirigiéndose a un gen o a varios genes mediante endonucleasas efectoras TAL, o cruzando plantas con mutaciones en diferentes genesFAD2y/oFAD3. Se producen plantas que contienen una serie de combinaciones de mutaciones. Por ejemplo, la combinación 1 esFAD2-14(WT)FAD2-1B(WT)fad3a(mutante) FAD3B (WT) FAD3C (WT). Esta combinación de mutaciones y genes WT también se escribe comoFAD2-1A FAD2-1B fad3a FAD3B FAD3C..La combinación 1 y otras combinaciones se exponen en la TABLA 8, donde las combinaciones no incluidas en las reivindicaciones anexas se indican mediante un asterisco (*).
Ejemplo 12 - Datos de ensayos de campo de plantas con mutaciones FAD2 y FAD3
Las plantas con mutaciones en los genes FAD2 y FAD3 se cultivaron en condiciones de campo en Minnesota y se fenotipificaron. Las plantas analizadas contenían el genotipofad2-1afad2-1b fad3a FAD3B FAD3C..Se analizaron varias plantas con diferentes mutaciones en FAD3A, incluidas aquellas con una deleción de -43 pb, una deleción de -4 pb y una combinación de las deleciones de -43 pb y -4 pb (es decir, un mutante heterocigoto compuesto). El aceite de semilla producido por las plantas cultivadas en el campo se evaluó mediante FAME. Los resultados de las pruebas FAME se muestran en la FIG. 12.
TABLA 1
TABLA 2
TABLA 3
TABLA 4
*las secuencias de intrones están en minúsculasTABLA 5
TABLA 6
El fondo FAD2 KO incluía los alelos Gm026-18 FAD2-1A (SEC ID y FAD2-1B (SEC ID NO:101).
TABLA 7
TABLA 8
OTRAS REALIZACIONES
Debe entenderse que, si bien la invención se ha descrito junto con la descripción detallada de la misma, la descripción anterior pretende ilustrar y no limitar el alcance de la invención, que se define por el alcance de las reivindicaciones adjuntas.

Claims (7)

REIVINDICACIONES
1. Un método para fabricar una planta de soja que comprende una mutación en:
uno o más alelos FAD2-1A, uno o más alelos FAD2-1B y uno o más alelos FAD3A;
el método comprende:
(a) proporcionar partes de plantas o células vegetales de soja, en las que las partes de plantas o células vegetales comprenden una mutación en uno o más alelos FAD2-1A y una mutación en uno o más alelos FAD2-1B,
en el que cada alelo FAD2-1A tiene una secuencia como la establecida en SEC ID NO: 100, o tiene una secuencia con al menos un 95 % de identidad con SEC ID NO: 100;
en el que cada alelo FAD2-1B tiene una secuencia como la establecida en SEC ID NO:101, o tiene una secuencia con al menos un 95 % de identidad con SEC ID NO:101;
y en el que las partes de la planta o las células vegetales comprenden al menos un alelo FAD3A funcional, (b) poner en contacto las partes de la planta o las células de la planta con una o más endonucleasas efectoras TAL dirigidas a una secuencia FAD3A endógena, en la que cada una de las endonucleasas efectoras TAL está dirigida a un par de secuencias según se establece en SEC ID NOS 8 y 9,
(c) regenerar las partes de la planta o las células vegetales en plantas de soja enteras, y
(d) seleccionar de entre todas las plantas de soja una planta de soja que contenga una mutación en uno o más alelos FAD3A,
en el que cada alelo FAD3A mutado comprende una deleción del nucleótido citosina en la posición 515 de SEC ID NO:24.
2. El método de la reivindicación 1, en el que las partes de la planta de soja o las células vegetales se seleccionan del grupo que consiste en células de cotiledón, semillas, embriones, células de callo embriogénico y células de polen.
3. El método de la reivindicación 1, en el que el contacto comprende transformar las células vegetales de soja con uno o más vectores que codifican la una o más endonucleasas efectoras TAL.
4. El método de la reivindicación 1, en el que cada alelo FAD3A mutado tiene una secuencia como se establece en cualquiera de las SEC ID NOS:64-71, 73-90 y 102-106, o tiene una secuencia con al menos un 95 % de identidad con cualquiera de las SEC ID NOS:64-71, 73-90 y 102-106.
5. El método de la reivindicación 1, que comprende introducir en las células vegetales una o más proteínas endonucleasas efectoras TAL.
6. El método de la reivindicación 1, que comprende además el cultivo de las células vegetales para generar líneas vegetales.
7. El método de la reivindicación 1, que comprende además aislar ADN genómico que comprende al menos una porción del locus FAD3A de las células vegetales.
ES17704311T 2016-02-02 2017-02-02 Modifying soybean oil composition through targeted knockout of the fad3a/b/c genes Active ES3039237T3 (en)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201662290154P 2016-02-02 2016-02-02
US201662398246P 2016-09-22 2016-09-22
PCT/IB2017/050574 WO2017134601A1 (en) 2016-02-02 2017-02-02 Modifying soybean oil composition through targeted knockout of the fad3a/b/c genes

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES3039237T3 true ES3039237T3 (en) 2025-10-20

Family

ID=58010135

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES17704311T Active ES3039237T3 (en) 2016-02-02 2017-02-02 Modifying soybean oil composition through targeted knockout of the fad3a/b/c genes

Country Status (5)

Country Link
US (2) US10550402B2 (es)
EP (2) EP3410843B1 (es)
ES (1) ES3039237T3 (es)
UY (1) UY37108A (es)
WO (1) WO2017134601A1 (es)

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
BR112020008919A2 (pt) * 2017-11-21 2020-10-20 Monsanto Technology Llc plantas modificadas com traços aprimorados
US11390876B2 (en) 2018-03-09 2022-07-19 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Compositions and methods for modification of fatty acids in soybean
US12559763B2 (en) 2018-04-04 2026-02-24 Cibus Us Llc FAD2 genes and mutations
CN114787364A (zh) * 2019-11-27 2022-07-22 卡里克特公司 用于基因编辑的tal效应物核酸酶
CN112680465A (zh) * 2020-12-28 2021-04-20 浙江农林大学 用于改造大豆脂肪酸组分的基因突变体及其应用

Family Cites Families (92)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4179337A (en) 1973-07-20 1979-12-18 Davis Frank F Non-immunogenic polypeptides
US4535060A (en) 1983-01-05 1985-08-13 Calgene, Inc. Inhibition resistant 5-enolpyruvyl-3-phosphoshikimate synthetase, production and use
US4761373A (en) 1984-03-06 1988-08-02 Molecular Genetics, Inc. Herbicide resistance in plants
US4683195A (en) 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
US4940835A (en) 1985-10-29 1990-07-10 Monsanto Company Glyphosate-resistant plants
CA1293460C (en) 1985-10-07 1991-12-24 Brian Lee Sauer Site-specific recombination of dna in yeast
US4810648A (en) 1986-01-08 1989-03-07 Rhone Poulenc Agrochimie Haloarylnitrile degrading gene, its use, and cells containing the gene
ES2018274T5 (es) 1986-03-11 1996-12-16 Plant Genetic Systems Nv Celulas vegetales resistentes a los inhibidores de glutamina sintetasa, preparadas por ingenieria genetica.
US4975374A (en) 1986-03-18 1990-12-04 The General Hospital Corporation Expression of wild type and mutant glutamine synthetase in foreign hosts
US5276268A (en) 1986-08-23 1994-01-04 Hoechst Aktiengesellschaft Phosphinothricin-resistance gene, and its use
US5273894A (en) 1986-08-23 1993-12-28 Hoechst Aktiengesellschaft Phosphinothricin-resistance gene, and its use
US5013659A (en) 1987-07-27 1991-05-07 E. I. Du Pont De Nemours And Company Nucleic acid fragment encoding herbicide resistant plant acetolactate synthase
US4957748A (en) 1987-03-23 1990-09-18 The Board Of Regents Of The University Of Nebraska Ruminant feed, method of making and method of using
US5006333A (en) 1987-08-03 1991-04-09 Ddi Pharmaceuticals, Inc. Conjugates of superoxide dismutase coupled to high molecular weight polyalkylene glycols
US5162602A (en) 1988-11-10 1992-11-10 Regents Of The University Of Minnesota Corn plants tolerant to sethoxydim and haloxyfop herbicides
US5501967A (en) 1989-07-26 1996-03-26 Mogen International, N.V./Rijksuniversiteit Te Leiden Process for the site-directed integration of DNA into the genome of plants
US5484956A (en) 1990-01-22 1996-01-16 Dekalb Genetics Corporation Fertile transgenic Zea mays plant comprising heterologous DNA encoding Bacillus thuringiensis endotoxin
US5204253A (en) 1990-05-29 1993-04-20 E. I. Du Pont De Nemours And Company Method and apparatus for introducing biological substances into living cells
US5219596A (en) 1990-08-24 1993-06-15 Cargill, Incorporated Composition and method thereof for increasing milk production in dairy cattle
US5100679A (en) 1990-10-03 1992-03-31 Cargill B.V. Method of making a modified proteinaceous product and composition thereof
US5767366A (en) 1991-02-19 1998-06-16 Louisiana State University Board Of Supervisors, A Governing Body Of Louisiana State University Agricultural And Mechanical College Mutant acetolactate synthase gene from Ararbidopsis thaliana for conferring imidazolinone resistance to crop plants
US5487994A (en) 1992-04-03 1996-01-30 The Johns Hopkins University Insertion and deletion mutants of FokI restriction endonuclease
US5436150A (en) 1992-04-03 1995-07-25 The Johns Hopkins University Functional domains in flavobacterium okeanokoities (foki) restriction endonuclease
US5792640A (en) 1992-04-03 1998-08-11 The Johns Hopkins University General method to clone hybrid restriction endonucleases using lig gene
US5356802A (en) 1992-04-03 1994-10-18 The Johns Hopkins University Functional domains in flavobacterium okeanokoites (FokI) restriction endonuclease
US5591616A (en) 1992-07-07 1997-01-07 Japan Tobacco, Inc. Method for transforming monocotyledons
CA2154581C (en) 1993-02-12 2008-12-16 Srinivasan Chandrasegaran Functional domains in flavobacterium okeanokoites (foki) restriction endonuclease
US6808904B2 (en) 1994-06-16 2004-10-26 Syngenta Participations Ag Herbicide-tolerant protox genes produced by DNA shuffling
US7285416B2 (en) 2000-01-24 2007-10-23 Gendaq Limited Regulated gene expression in plants
US6326166B1 (en) 1995-12-29 2001-12-04 Massachusetts Institute Of Technology Chimeric DNA-binding proteins
US5853973A (en) 1995-04-20 1998-12-29 American Cyanamid Company Structure based designed herbicide resistant products
US6084155A (en) 1995-06-06 2000-07-04 Novartis Ag Herbicide-tolerant protoporphyrinogen oxidase ("protox") genes
US5936069A (en) 1995-12-06 1999-08-10 Iowa State University Research Foundation Process for producing improved soy protein concentrate from genetically-modified soybeans
US5844086A (en) 1996-01-31 1998-12-01 Stilts Corporation Oil seed protein extraction
JPH10117776A (ja) 1996-10-22 1998-05-12 Japan Tobacco Inc インディカイネの形質転換方法
US6146669A (en) 1998-05-14 2000-11-14 Cargill Incorporated Method for processing oilseed material
GB9819693D0 (en) 1998-09-10 1998-11-04 Zeneca Ltd Glyphosate formulation
US7013219B2 (en) 1999-01-12 2006-03-14 Sangamo Biosciences, Inc. Regulation of endogenous gene expression in cells using zinc finger proteins
US7070934B2 (en) 1999-01-12 2006-07-04 Sangamo Biosciences, Inc. Ligand-controlled regulation of endogenous gene expression
US6534261B1 (en) 1999-01-12 2003-03-18 Sangamo Biosciences, Inc. Regulation of endogenous gene expression in cells using zinc finger proteins
EP1147209A2 (en) 1999-02-03 2001-10-24 The Children's Medical Center Corporation Gene repair involving the induction of double-stranded dna cleavage at a chromosomal target site
US6156227A (en) 1999-03-01 2000-12-05 Cargill, Incorporated Deicer composition which includes a plant material which is a corrosion inhibitor
US6451732B1 (en) 1999-06-04 2002-09-17 Syngenta, Limited Herbicidal compositions of glyphosate trimesium
US7067722B2 (en) 1999-08-26 2006-06-27 Monsanto Technology Llc Nucleic acid sequences and methods of use for the production of plants with modified polyunsaturated fatty acids
ATE353361T1 (de) 2000-04-28 2007-02-15 Sangamo Biosciences Inc Gezielten modifikation der chromatinstruktur
US6368227B1 (en) 2000-11-17 2002-04-09 Steven Olson Method of swinging on a swing
AU2002243645A1 (en) 2001-01-22 2002-07-30 Sangamo Biosciences, Inc. Zinc finger proteins for dna binding and gene regulation in plants
US7262054B2 (en) 2002-01-22 2007-08-28 Sangamo Biosciences, Inc. Zinc finger proteins for DNA binding and gene regulation in plants
WO2009095742A1 (en) 2008-01-31 2009-08-06 Cellectis New i-crei derived single-chain meganuclease and uses thereof
US20030232410A1 (en) 2002-03-21 2003-12-18 Monika Liljedahl Methods and compositions for using zinc finger endonucleases to enhance homologous recombination
US7361635B2 (en) 2002-08-29 2008-04-22 Sangamo Biosciences, Inc. Simultaneous modulation of multiple genes
EP2522723B1 (en) 2003-01-28 2014-12-03 Cellectis Custom-made meganuclease and use thereof
US7888121B2 (en) 2003-08-08 2011-02-15 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for targeted cleavage and recombination
US7189691B2 (en) 2004-04-01 2007-03-13 The Administrators Of The Tulane Educational Fund Methods and compositions for treating leukemia
CN100339481C (zh) 2005-03-17 2007-09-26 东北师范大学 应用基因沉默技术提高大豆和花生的种子油酸含量的方法
WO2007060495A1 (en) 2005-10-25 2007-05-31 Cellectis I-crei homing endonuclease variants having novel cleavage specificity and use thereof
US20090060921A1 (en) 2006-01-17 2009-03-05 Biolex Therapeutics, Inc. Glycan-optimized anti-cd20 antibodies
CA2645148C (en) * 2006-03-10 2018-05-22 Monsanto Technology Llc Soybean seed and oil compositions and methods of making same
WO2008010009A1 (en) 2006-07-18 2008-01-24 Cellectis Meganuclease variants cleaving a dna target sequence from a rag gene and uses thereof
US20100154081A1 (en) 2007-05-21 2010-06-17 Bayer Bioscience N.V. Methods and means for producing glycoproteins with altered glycosylation pattern in higher plants
US8563314B2 (en) 2007-09-27 2013-10-22 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for modulating PD1
AU2008304459B2 (en) 2007-09-28 2013-10-03 Two Blades Foundation Bs3 resistance gene and methods of use
WO2010054348A2 (en) 2008-11-10 2010-05-14 Two Blades Foundation Pathogen-inducible promoters and their use in enhancing the disease resistance of plants
EP2206723A1 (en) 2009-01-12 2010-07-14 Bonas, Ulla Modular DNA-binding domains
US20110239315A1 (en) 2009-01-12 2011-09-29 Ulla Bonas Modular dna-binding domains and methods of use
DE112010000876T5 (de) 2009-02-03 2012-09-13 Wisconsin Alumni Research Foundation Steuerung Kälte-induzierten Süßens und Verringerung von Acrylamid-Niveaus in Kartoffeln oder Süßkartoffeln
US8772008B2 (en) 2009-05-18 2014-07-08 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for increasing nuclease activity
CA2765287C (en) 2009-06-15 2018-12-11 Bayer Bioscience N.V. Nicotiana benthamiana plants deficient in xylosyltransferase activity
CN102753684B (zh) 2009-06-22 2014-07-30 国立大学法人佐贺大学 增加大豆油脂中的油酸含量的突变体及其原因基因
CN103002727B (zh) 2009-07-08 2016-04-27 密苏里大学管委会 利用传统大豆育种技术培育高油酸大豆的方法
US20120178647A1 (en) 2009-08-03 2012-07-12 The General Hospital Corporation Engineering of zinc finger arrays by context-dependent assembly
KR20170125406A (ko) 2009-08-11 2017-11-14 상가모 테라퓨틱스, 인코포레이티드 표적화 변형에 대한 동형접합성 유기체
EP2722392B1 (en) 2009-10-22 2017-11-22 Dow AgroSciences LLC Engineered zinc finger proteins targeting plant genes involved in fatty acid biosynthesis
US8956828B2 (en) 2009-11-10 2015-02-17 Sangamo Biosciences, Inc. Targeted disruption of T cell receptor genes using engineered zinc finger protein nucleases
CA2781835A1 (en) 2009-11-27 2011-06-03 Basf Plant Science Company Gmbh Chimeric endonucleases and uses thereof
DE112010004582T5 (de) 2009-11-27 2012-11-29 Basf Plant Science Company Gmbh Optimierte Endonukleasen und Anwendungen davon
WO2011064750A1 (en) 2009-11-27 2011-06-03 Basf Plant Science Company Gmbh Chimeric endonucleases and uses thereof
DK2816112T3 (en) 2009-12-10 2018-11-19 Univ Minnesota TAL effector-mediated DNA modification
US20110203012A1 (en) 2010-01-21 2011-08-18 Dotson Stanton B Methods and compositions for use of directed recombination in plant breeding
DK2534173T3 (da) 2010-02-08 2019-10-14 Sangamo Therapeutics Inc Manipulerede spaltnings-halvdomæner
WO2011100058A1 (en) 2010-02-09 2011-08-18 Sangamo Biosciences, Inc. Targeted genomic modification with partially single-stranded donor molecules
JP2013526844A (ja) 2010-03-22 2013-06-27 フィリップ・モーリス・プロダクツ・ソシエテ・アノニム 植物の酵素活性の改変
US8771985B2 (en) 2010-04-26 2014-07-08 Sangamo Biosciences, Inc. Genome editing of a Rosa locus using zinc-finger nucleases
WO2011146121A1 (en) 2010-05-17 2011-11-24 Sangamo Biosciences, Inc. Novel dna-binding proteins and uses thereof
EP2392208B1 (en) 2010-06-07 2016-05-04 Helmholtz Zentrum München Deutsches Forschungszentrum für Gesundheit und Umwelt (GmbH) Fusion proteins comprising a DNA-binding domain of a Tal effector protein and a non-specific cleavage domain of a restriction nuclease and their use
EP2580331A4 (en) 2010-06-14 2013-11-27 Univ Iowa State Res Found Inc NUCLEASE ACTIVITY OF THE TAL EFFECTOR AND FUSION PROTEIN FOKI
UY33868A (es) 2011-01-14 2012-04-30 Univ Missouri Un método para desarrollar soja de alto contenido en ácido oleico mediante técnicas de cultivo de soja convencionales
EP2764105B1 (en) 2011-10-04 2017-03-15 Icon Genetics GmbH Nicotiana benthamiana plants deficient in fucosyltransferase activity
US9914930B2 (en) * 2012-09-07 2018-03-13 Dow Agrosciences Llc FAD3 performance loci and corresponding target site specific binding proteins capable of inducing targeted breaks
UA118090C2 (uk) 2012-09-07 2018-11-26 ДАУ АГРОСАЙЄНСІЗ ЕлЕлСі Спосіб інтегрування послідовності нуклеїнової кислоти, що представляє інтерес, у ген fad2 у клітині сої та специфічний для локусу fad2 білок, що зв'язується, здатний індукувати спрямований розрив
JP6591898B2 (ja) * 2013-03-15 2019-10-16 セレクティス Ｆａｄ２−１ａ／１ｂ遺伝子の標的化ノックアウトを介した、大豆油組成物の改変
US10113162B2 (en) * 2013-03-15 2018-10-30 Cellectis Modifying soybean oil composition through targeted knockout of the FAD2-1A/1B genes

Also Published As

Publication number Publication date
EP3410843C0 (en) 2025-06-18
US20200149056A1 (en) 2020-05-14
EP3410843A1 (en) 2018-12-12
WO2017134601A1 (en) 2017-08-10
EP4646936A2 (en) 2025-11-12
UY37108A (es) 2017-08-31
EP3410843B1 (en) 2025-06-18
US20190024103A1 (en) 2019-01-24
EP4646936A3 (en) 2025-11-19
US10550402B2 (en) 2020-02-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES3039237T3 (en) Modifying soybean oil composition through targeted knockout of the fad3a/b/c genes
US10113162B2 (en) Modifying soybean oil composition through targeted knockout of the FAD2-1A/1B genes
JP6591898B2 (ja) Ｆａｄ２−１ａ／１ｂ遺伝子の標的化ノックアウトを介した、大豆油組成物の改変
TW201825678A (zh) 用於建立靶向重組及中斷性狀之間之連鎖的方法及組成物
AU2019247403B2 (en) FAD2 genes and mutations
JP2023526035A (ja) 標的突然変異生成によって変異体植物を得るための方法
AU2019312814B2 (en) CYSDV resistance in members of the cucurbitaceae family
KR20260007366A (ko) 아세틸-코엔자임 a 카복실레이스 돌연변이체
CA3105331A1 (en) Canola with high oleic acid
WO2022144877A1 (en) Herbicide resistant cannabis plant
CN115667529A (zh) 黄瓜植物习性
CN117925633A (zh) 甘蓝BoCENH3基因及其在单倍体诱导中的应用
JP2023519087A (ja) ダイズにおける飽和脂肪の増加
CA3159737A1 (en) Tal-effector nucleases for gene editing
NZ711145B2 (en) Methods and compositions for increasing efficiency of targeted gene modification using oligonucleotide-mediated gene repair
NZ711145A (en) Methods and compositions for increasing efficiency of targeted gene modification using oligonucleotide-mediated gene repair